CN105213366B

CN105213366B - 藤黄酮化合物的医药用途及其药物组合物

Info

Publication number: CN105213366B
Application number: CN201410315118.3A
Authority: CN
Inventors: 徐宏喜; 徐林峰; 劳远至; 付文卫; 张宝军; 谭红胜
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2034-07-03
Also published as: CN105213366A

Abstract

本发明涉及天然化合物领域，特别是涉及五个可从藤黄中提取获得的具有如下结构式的藤黄酮类化合物的医药用途及其药物组合物：其中，R₁选自‑CHO、‑COOH或‑CH₃。本发明的上述化合物可用于制备防治脑胶质瘤、胰腺癌和肺癌等肿瘤的药物和保健品。

Description

藤黄酮化合物的医药用途及其药物组合物

技术领域

本发明涉及天然化合物领域，特别是涉及一种藤黄酮类化合物的医药用途及其药物组合物。

背景技术

恶性肿瘤是当前威胁人类健康和生命的主要疾病。在大多数发达国家，肿瘤是仅次于心血管病的第二大死亡原因。肿瘤也是严重危害我国人民健康的重大疾病，我国的肿瘤研究也受到政府的重视，控制肿瘤已成为我国卫生战略重点之一。

肿瘤的治疗方法包括外科手术和放化疗。当前临床应用的抗肿瘤药物的突出问题是有效率低、选择性差(毒性大)和对耐药性肿瘤的不敏感。另外，复发和转移也是肿瘤治疗的难点。因此，研究选择性好、疗效高、靶点明确以及对非靶器官无副作用的抗肿瘤药物是药学工作者的重大研究课题。

藤黄(Garcinia morella Desv)是我国的特有植物。产于印度、越南等地，国内产地在云南、湖南及湖北一带。

发明内容

本发明的目的旨在提供五个可从藤黄中提取获得的藤黄酮类化合物的医药用途及其药物组合物。

具体地说，本发明的第一方面是提供了具有下列结构式(Ⅰ)的化合物A在制备Caspase酶激活剂中的应用，所述化合物A可从藤黄中提取获得，且所述Caspase酶选自Caspase3或Caspase7：

本发明的第二方面是提供了上述化合物A在制备Jak家族酶抑制剂中的应用，所述化合物A可从藤黄中提取获得，且所述Jak家族酶自Jak2或Jak3：

本发明的第三方面是提供了上述化合物A在制备预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用，所述化合物A可从藤黄中提取获得，且所述肿瘤选自脑胶质瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、白血病、膀胱癌、子宫癌、肾上腺癌、阴道癌、皮肤癌和骨瘤中的一种或一种以上。

本发明的第四方面是提供了一种可用于防治肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的可从藤黄中提取获得的上述化合物A：

本发明的第五方面是提供了具有下列结构式(Ⅱ)的化合物B在制备Caspase酶激活剂中的应用，所述化合物B可从藤黄中提取获得，且所述Caspase酶选自Caspase3或Caspase7：

本发明的第六方面是提供了上述化合物B在制备Jak家族酶抑制剂中的应用，所述化合物B可从藤黄中提取获得，且所述Jak家族酶选自Jak2或Jak3：

本发明的第七方面是提供了上述化合物B在制备预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用，所述化合物B可从藤黄中提取获得，且所述肿瘤选自脑胶质瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、白血病、膀胱癌、子宫癌、肾上腺癌、阴道癌、皮肤癌和骨瘤中的一种或一种以上：

本发明的第八方面是提供了一种可用于防治肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的可从藤黄中提取获得的上述化合物B：

本发明的第九方面是提供了具有下列结构式(Ⅲ)的化合物在制备Caspase酶激活剂中的应用，所述化合物可从藤黄中提取获得，且所述Caspase酶选自Caspase3或Caspase7：

其中，R₁选自-CHO、-COOH或-CH₃。

本发明的第十方面是提供了上述结构式(Ⅲ)化合物在制备预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用，所述化合物可从藤黄中提取获得，且所述肿瘤选自脑胶质瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、白血病、膀胱癌、子宫癌、肾上腺癌、阴道癌、皮肤癌和骨瘤中的一种或一种以上：

本发明还提供了一种可用于防治肿瘤的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的可从藤黄中提取获得的上述结构式(Ⅲ)化合物：

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明：

图1为实施例二中A、B、C、D和E五个化合物孵育8小时检测结果图。

图2为实施例二中A、B、C、D和E五个化合物孵育24小时检测结果图。

图3为实施例四中NCI-H1560细胞与化合物A和B作用后的效果图。

图4为实施例四中IL-6刺激HepG2细胞后，化合物A和B作用后的效果图。

其中，GB39代表化合物A，GB40代表化合物B，GB49代表化合物C，GB63代表化合物D，GB32代表化合物E。

具体实施方式

本发明的问世是基于这样一个意外发现：从藤黄(Garcinia morella Desv)中提取的五种藤黄酮类化合物可以显著抑制多种肿瘤细胞的生长并通过激活Caspase3/7的活性引起肿瘤细胞凋亡，其中部分化合物还可抑制Jak-Stat信号通路中Jak2和Jak3激酶的活性。因此，上述化合物有望开发成为一种可预防或者治疗肿瘤的药物或保健品。

如本发明所用，上述从藤黄(Garcinia morella Desv)中提取的五个藤黄酮类化合物的其中两种具有如下结构式：

另外三种化合物则具有如下结构式(Ⅲ)：

其中，R₁选自-CHO、-COOH或-CH₃。

具体而言，上述结构式(Ⅲ)中所包含的三种化合物具体如下：

本发明的上述化合物A、B、C、D和E可通过本领域的常规方法如醇提、层析等从藤黄(Garcinia morella Desv)等中提取获得，亦可通过商业途径购买或者利用市售原料，通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知技术可以合成本发明的上述化合物。合成的本发明的上述化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。

本发明的上述化合物可以有效地抑制多种肿瘤细胞的生长，故而本发明的上述化合物可用于制备防治肿瘤的药物和保健品。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括本发明的化合物与药学上可接受的载体，该药物组合物可用于防治肿瘤。

本发明还提供了一种药物制剂，该药物制剂包括本发明的化合物，该药物制剂可用于治疗肿瘤。

本发明的化合物在组合物或药物制剂中的含量例如0.0001-50wt％；较佳的0.001-30wt％；更佳的0.01-20wt％。

治疗有效量(即可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量)的本发明的化合物与药学上可以接受的载体(用于治疗给药的载体，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性)可以组成药物制剂，这些药物制剂可以制备成口服制剂、注射剂、片剂、粉制剂、胶囊剂、分散片、缓释制剂等。

治疗有效量的本发明的药物组合物的用量介于0.001-500mg/kg体重/天之间，任何介于上述范围之内的用量皆为本发明的药物组合物的有效量。优选的，本发明的药物组合物的用量介于0.005-300mg/kg体重/天之间；更优选的，本发明的药物组合物的用量介于0.0l-100mg/kg体重/天之间。所述的“治疗有效量”可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。本领域的专业人员能够理解，在实际给药时的用量可高于或低于上述剂量范围。针对某一对象(如哺乳动物—人)的“治疗有效量”和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括所用本发明的化合物，或其前药的药效活性、给药对象的年龄、体重、一般情况、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程以及收治医师的判断等。所述的“治疗”指的是给予机体(含有肿瘤、具有肿瘤的症状或者具有肿瘤的前兆)本发明的化合物，以治疗、减轻、减缓、改变、治愈、影响、改善其肿瘤、肿瘤的症状或肿瘤的前兆。

本发明的化合物或其组合物或其药物制剂可以通过口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直肠内等途径给药。固体载体如：淀粉、乳糖、磷酸二醇、微晶纤维素、黑糖和白陶土，而液态载体如：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需要的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，如，调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物如细菌和真菌的污染和影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇、它们的适当混合物和植物油。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例一、从藤黄中提取并鉴定化合物A、B、C、D和E

1.藤黄干燥树脂5.0Kg,粉碎后用无水乙醇冷浸提取(5.0L×3)过滤,合并滤液并减压回收溶剂,得稠浸膏(277g)。取硅胶(200～300目)4.0Kg装填色谱柱，以石油醚-丙酮(100:0→0:100)梯度洗脱,每流分1000ml，采用薄层色谱检测并合并相似流分，共得7个组分(F01-F07).

2.F02部分5.0g进一步采用硅胶柱层析分离：取硅胶(200～300目)300g装填色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯(30:1→4:1)混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测并合相似流份，共得6个组分F02a-F02f。F02d组分进一步以半制备HPLC进行纯化，得到化合物desoxygambogenin(化合物E，110mg)。纯化方法如下：采用waters 2535 Series，色谱柱Xbridge Prep C18 OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是乙腈与水按94:6的体积，流速为16ml/min；F02f组分进一步以半制备HPLC进行纯化，得到化合物isogambogenin(化合物C，40mg)。纯化方法如下：采用waters 2535 Series，色谱柱Xbridge Prep C18 OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是乙腈与水(94:6，以体积计)的混合溶液，流速为16ml/min。

3.F05部分285g取其中200g进一步采用硅胶柱层析分离：取硅胶(200～300目)4.0Kg装填色谱柱，二氯甲烷与丙酮(100:0→4:1)混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测并合相似流份，共得7个组分F05a-F05g。F05f组分通过Sephadex LH-20纯化，并进一步以半制备HPLC分离，得到化合物B(8mg)。纯化方法如下：采用waters 2535 Series，色谱柱XbridgePrep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是甲醇与0.1％甲酸水溶液(92:8，以体积计)的混合液，流速为16ml/min；F05g组分通过Sephadex LH-20纯化，并进一步以半制备HPLC分离，得到化合物A(6mg)。纯化方法如下：采用waters 2535 Series，色谱柱XbridgePrep C18 OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是甲醇与0.1％甲酸水溶液(90:10，以体积计)的混合液，流速为16ml/min。

4.F06部分50g进一步采用硅胶柱层析分离：取硅胶(200～300目)2.0Kg装填色谱柱，以二氯甲烷与甲醇(100:0→4:1)混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测并合相似流份，共得4个组分F06a-F06d。F06d组分通过Sephadex LH-20纯化，并进一步以半制备HPLC分离，得到化合物isogambogenic acid(化合物D，200mg)。纯化方法如下：采用waters 2535Series，色谱柱Xbridge Prep C18 OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是甲醇与0.1％甲酸水溶液(86:14，以体积计)的混合液，流速为16ml/min。

5.上述化合物通过与实验室已有化合物的质谱数据和HPLC保留时间比对而确定：

实施例二、化合物A、B、C、D和E的细胞凋亡试验

实验材料：

人肿瘤细胞株及其培养：肺癌细胞(NCI-H1650)购自美国ATCC细胞库。细胞于含ATCC推荐的培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。

五个化合物通过实施例提取获得或者通过商业途径购买获得；DMSO等均为Sigma公司产品。Caspase3/7Glo试剂购自美国Promega公司。

实验方法：

五个化合物对上述肿瘤细胞株的细胞凋亡通过测定Caspase3/7的活性测得。具体步骤如下：

1.样品制备：将化合物分别溶解于二甲亚砜中，得到浓度为4mM的溶液；然后3倍稀释，共5个浓度点。

2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含各自细胞培养基中，经胎盘蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至0.8×10⁵细胞/ml。

3.在平底96孔板中，每孔加入100微升细胞，每孔中细胞总数为0.8×10⁴。配制两套板，一套用于8小时，一套用于24小时，均于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

4.每孔加入0.5微升稀释好的样品，化合物作用浓度分别为20，6.66，2.22，0.74，0.24μM，同时将相应量的DMSO加入不加药的细胞中作为对照，不含细胞孔作为背景。

5.将加药细胞在37℃、5％CO₂细胞培养箱中各自保温8小时或24小时。

6.取出细胞板，平衡至室温，每孔中加入100μl Caspase3/7-Glo试剂溶液，混匀。置于摇床上以150rpm摇动15分钟，测定化学发光值。

7.根据化学发光值计算化合物处理后细胞相对存活率。计算公式如下：

细胞凋亡诱导倍数＝(药物处理组的信号-DMSO处理组的信号)/(DMSO处理组的信号–背景值)

实验结果：

检测结果显示：上述五个化合物在8小时和24小时，均能明显诱导产生Caspase3/7，进而导致细胞凋亡，产生杀灭肿瘤细胞的作用(图1和图2)。

实施例三化合物A和B体外选择性抑制Jak2和Jak3酶活性试验

实验材料：

Jak家族酶(Jak1，Jak2，Jak3和Tyk2)及Fam标记的多肽底物均购自CarnaBioscience Inc.。

化合物A和B由实施例1提取获得或通过商业途径购买获得；ATP，DMSO等均为Sigma公司产品。

实验方法：

化合物A和B对Jak家族酶活性的测定具体步骤如下：

1.化合物配制：将化合物A和B分别溶解于二甲亚砜中，得到浓度为2mM的溶液；然后用实验缓冲液(100mM HEPES,10mM MgCl2,1.5mM betaine,0.015％Brij,25mMβ-glycerophosphate)3倍稀释，得到5X的工作浓度，共7个浓度点。

2.底物溶液的配制：将Fam标记的多肽底物及ATP分别加于实验缓冲液中，得到2.5X的工作浓度。

3.酶溶液的配制：将各自的激酶加入实验缓冲液中，得到2.5X的工作浓度。

4.将稀释好的5微升化合物加入384孔板中，随后加入10微升底物溶液，然后加10微升酶溶液以启动酶反应，化合物作用浓度分别为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625μM。室温反应1小时后，加入25微升终止液(500mM EDTA)终止酶反应。

5.在Caliper LabChip EZreader(美国)读板器读取信号。

6.根据信号值计算抑制百分率及IC50值。计算公式如下：

抑制百分率＝100×(DMSO处理组的信号-药物处理组的信号)/(DMSO处理组的信号–背景值)，然后通过XLfit软件计算化合物A和B的IC₅₀。

实验结果：

由下表可见，化合物A和B较明显地作用于jak2和jak3，尤其对jak2，相对于jak1及Tyk2有近十倍左右的差别。说明化合物A和B是jak2或jak3的选择性抑制剂。

表1 化合物式A和B抑制Jak家族酶的IC₅₀值。

IC₅₀[μM]	A	B
			Jak1	12.2±0.3	14.2±0.4
Jak2	1.7±0.1	1.4±0.1
			Jak3	3.8±0.3	3.2±0.2
Tyk2	13±1.6	12.9±0.9

实施例四化合物A和B抑制白介素6刺激的Jak-Stat3信号通路

实验材料：

人肿瘤细胞株及其培养：肺癌细胞(NCI-H1650，能自分泌白介素6)、肝癌细胞HepG2购自美国ATCC细胞库。细胞于含ATCC推荐的培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。化合物通过商业途径购买获得；DMSO、缓冲液等均购自Sigma公司。抗体购自美国Cell signaltechnology公司。转膜系统及仪器购自美国Invitrogen Life Science公司。

实验方法：

选取NCI-H1650细胞及HepG2细胞，用化合物A或B与NCI-H1650细胞作用6小时后，直接收细胞，PBS洗两次，裂解。细胞裂解得到的蛋白用Western免疫印迹方法检测磷酸化的STAT3。对HepG2细胞，用化合物A或B与细胞作用2小时后，加入白介素6，刺激15分钟，收细胞，PBS洗两次，裂解。细胞裂解得到的蛋白用Western免疫印迹方法检测磷酸化的STAT3。

实验结果：

结果显示：化合物A和B抑制了内在组成型及外界刺激的jak-stat3通路中的Stat3的磷酸化。磷酸化Stat3的被抑制，致使Jak-Stat3通路被阻挡，导致了随后细胞凋亡的发生，致使肿瘤细胞死亡(图3和图4)。

实施例五、检测化合物A、B、C、D和E对多种肿瘤细胞的生长抑制作用

实验材料：

人肿瘤细胞株及其培养：肺癌细胞(A498)等细胞均购自美国ATCC细胞库。细胞于含ATCC推荐的培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。五个化合物通过实施例一提取获得或者商业途径购买获得；二甲基亚枫(DMSO)等均为Sigma公司产品。CTG试剂购自美国Promega公司。

实验方法：

五个化合物对上述肿瘤细胞株的细胞毒性通过CTG法测得。具体步骤如下：

1.样品制备：将五个化合物分别溶解于二甲亚砜中，得到浓度为4mM的溶液；

2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含各自细胞培养基中，经胎盘蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至0.5×10⁵细胞/ml。

3.在平底96孔板中，每孔加入100微升细胞，每孔中细胞总数为0.5×10⁴。于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。

4.每孔加入0.5微升4mM的化合物样品至细胞培养板中，此时化合物的作用浓度为20μM。同时将相应量的DMSO加入不加药的细胞中作为对照，不含细胞孔作为背景。

5.将加药细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中保温72小时。

6.取出细胞板，平衡至室温，每孔中加入100μl CTG溶液，混匀。置于摇床上以150rpm摇动15分钟，测定化学发光值。

细胞存活抑制率＝100×(DMSO处理组的信号-药物处理组的信号)/(DMSO处理组的信号–背景值)

实验结果：

1.化合物A、B、C、D和E的体外抗肿瘤作用结果，在20μM针对肿瘤细胞的抑制百分率如表2所示：

表2 五个化合物在20μM针对肿瘤细胞的抑制百分率

由上表可见，化合物A、B、C、D和E在20μM时对上述肿瘤细胞株的生长均具有明显抑制作用，抑制百分率都大于99％。上述五个化合物具有一定的杀伤肿瘤细胞的潜能，有进一步进行抗肿瘤研究的必要。

实施例六、检测化合物A、B、C、D和E在肿瘤细胞水平上的IC₅₀值

实验材料：

人肿瘤细胞株及其培养：肺癌细胞(A549)等细胞均购自美国ATCC细胞库。细胞于含ATCC推荐的培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。

五个化合物通过商业途径购买获得；DMSO等均为Sigma公司产品。CTG试剂购自美国Promega公司。

实验方法：

五个化合物对上述肿瘤细胞株的细胞毒性通过CTG法测得。方法同实施例二类似，不同的是将五个化合物进行三倍稀释，形成十个浓度点。然后通过XLfit软件计算五个化合物对各肿瘤细胞的IC₅₀，检测结果如表3所示。

表3 IC₅₀μM

由上表可见：化合物A、B、C、D和E对所选的肿瘤细胞株的生长均具有明显抑制杀灭肿瘤作用；其所测定的IC₅₀值均小于10μM，显示了很好的抗肿瘤活性。故而本发明的五个化合物具有显著的抗肿瘤活性，可望作为活性成分用于制备抗肿瘤药物制剂，具有药用前景。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims

1.具有下列结构式(Ⅰ)的化合物A在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，所述化合物A可从藤黄中提取获得，且所述肿瘤选自脑胶质瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、白血病、膀胱癌、子宫癌、肾上腺癌、阴道癌、皮肤癌和骨瘤中的一种或一种以上：

2.一种可用于防治肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的具有下列结构式(Ⅰ)且可从藤黄中提取获得的化合物A：

3.具有下列结构式(Ⅱ)的化合物B在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，所述化合物B可从藤黄中提取获得，且所述肿瘤选自脑胶质瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、白血病、膀胱癌、子宫癌、肾上腺癌、阴道癌、皮肤癌和骨瘤中的一种或一种以上：

4.一种可用于防治肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的具有下列结构式(Ⅱ)且可从藤黄中提取获得的化合物B：