TWI542348B

TWI542348B - 含４－乙醯基－安卓奎諾－ｂ之組合物用於製備抑制癌細胞生長之藥物的用途

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Publication number: TWI542348B
Application number: TW103135386A
Authority: TW
Inventors: 黃俊智; 曾耀銘; 葉淇臺; 吳駿翃
Original assignee: 麗豐實業股份有限公司
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2016-07-21
Also published as: TW201613574A

Description

含4-乙醯基-安卓奎諾-B之組合物用於製備抑制癌細胞生長之藥物的用途

本發明關於一種組合物用於製備抑制癌細胞生長之藥物的用途，其中該組合物主要包含式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)。

癌症一般可以視為惡性腫瘤，是一種疾病。其特徵為惡性組織的不正常團塊，起因於過度地細胞分裂。癌症細胞不具有正常細胞生長之限制，會侵入與佔領正常留給其他細胞的範圍。癌症治療的種類包括化學治療、手術、放射線以及這些治療的結合。化學治療通常包括使用一個或多個抑制癌細胞生長的化合物。

大腸直腸癌(Colorectal cancer，CRC，簡稱大腸癌)是全球盛行率最高的癌症之一，每年全球新增120萬名大腸直腸癌新病例、有超過60萬名病患因大腸癌而死亡；以性別區分：大腸直腸癌位居全球男性癌症排名的第三名(僅次於肺癌與前列腺癌)，女性癌症排名第二名(僅次於乳癌)。目前第一線的抗癌用藥是5-FU，但是其中的缺點是復發率高，腫瘤可能是一種幹細胞疾病，這是近年來對腫瘤的一種全新認識，即腫瘤是功能異質性的細胞群體，只有小部分腫瘤幹細胞(cancer stem cells，CSCs) 才有致瘤及維持惡性表型的作用。雖然目前已經發展了許多癌症化療藥劑，但仍然需要更有效的化學治療。

本發明是基於發現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)或其醫藥上可接受鹽，其可用於抑制癌細胞生長，甚至治療或預防癌症，特別是大腸直腸癌。特定言之，本發明係提供一種用於抑制癌細胞生長，甚至治療或預防癌症之醫藥組合物，包括有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體。

本發明係提供一種用於抑制癌細胞生長之醫藥組合物為主，經實驗證實式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對不同癌症細胞株(包括：大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1；肝癌細胞株-Malavu、J5或SK-Hep1；肺腺癌細胞株-PC9或H441)具高度抑制性。但對正常HS68纖維母細胞則幾乎不具細胞毒性；其中又以大腸直腸癌幹細胞具有較佳之抑制作用。然而，目前4-乙醯基-安卓奎諾-B影響大腸直腸癌幹細胞的作用機制尚未明確。研究結果發現4-乙醯基-安卓奎諾-B能明顯抑制人類大腸直腸癌幹細胞球體的增生能力。4-乙醯基-安卓奎諾-B亦可以有效抑制大腸直腸癌幹細胞標記ALDH1活性、降低癌幹細胞球體自我更新能力、細胞侵襲力及降低抗藥性。為了釐清其分子機制，我們藉由大腸直腸癌幹基因SOX-2、Wnt/β-連環蛋白(beta-catenin)分子及刺蝟訊號傳導路徑(Hedgehog signal pathway)的抑制路徑證實，4-乙醯基-安卓奎諾-B經由調節癌幹基因的訊息路徑有效的抑制DLD-1大腸直腸癌幹細胞的轉移及侵襲作用。

此外，本發明持續探討4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)、5-氟尿嘧啶(5-FU)對大腸癌細胞株的影響。實驗分為4-乙醯基-安卓奎諾-B(2.5、5、10、20μM)；5-氟尿嘧啶(2.5、5、10μM)及4-乙醯基-安卓奎諾-B(20μM)+5-氟尿嘧啶(2.5、5μM)聯合組及控制組。以SRB分析方法檢測細胞存活率。結果顯示，僅使用4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)比使用5-氟尿嘧啶(5-FU)單獨治療的效果更佳。4-乙醯基-安卓奎諾-B對於DLD-1細胞具有較好的毒殺作用，相同條件下對於HT-29及HCT-116則較不敏感。4-乙醯基-安卓奎諾-B聯合5-氟尿嘧啶使用後，對於大腸癌細胞株的治療效果明顯更強(CI<1)，顯示4-乙醯基-安卓奎諾-B與5-氟尿嘧啶聯用具有協同作用。綜合上述，4-乙醯基-安卓奎諾-B應為潛力標靶大腸直腸癌幹細胞特性之化學治療物質。

本發明提供一種組合物用於製備抑制癌細胞生長之醫藥組合物之用途，其中該組合物包含有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B) 或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體。

本發明之組合物另可包含一抗癌藥物，該抗癌藥物包含5- 氟尿嘧啶(Fluorouracil)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)或5-氟尿嘧啶與奧沙利鉑之組合。

本發明亦提供一種組合物用於製備抑制癌細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)或其醫藥上可接受鹽、一抗癌藥物及一醫藥上可接受載體，其中該抗癌藥物包含5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)或5-氟尿嘧啶與奧沙利鉑之組合。本發明之組合物可防止個體因服用抗癌藥物造成之體重降低。

在一實施例中，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.01μM至1000μM。5-氟尿嘧啶的濃度為每毫升5毫克至每毫升300毫克；奧沙利鉑的濃度為每毫升0.5毫克至每毫升50毫克。

在另一實施例中，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.5μM至50μM。

式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可擁有一或多個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及之式I化合物包括所有此等異構物。式I化合物具有選擇性抑制癌症細胞生長的功效。由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的式I化合物及其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，即可得到所欲的治療效果。本發明為一抑制癌細胞生長，甚至治療或預防癌症的醫藥組合物，係將一有效量之式I化合物及其醫藥上可接受鹽，用於抑制癌細胞、或投予所需之病患(此病患具有癌症、癌症的症狀或傾向於癌症的體質)以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的「有效量(an effective amount)」指有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及其醫藥上可接受鹽，具有抑制或治療功效的量。有效量的改變是根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其他共同使用(co-usage)的活性藥劑。

此處之「癌症」意指細胞腫瘤。癌症細胞具有自主生長(autonomous growth)的能力，即在不正常的狀態或條件下迅速增殖細胞生長。此處所指之癌症係包含所有種類之細胞不當增生(cancerous growth)或致癌過程(oncogenic processes)、轉移性的組織或惡性轉換之細胞、組織或器官(與組織病理學型態無關)或侵入階段。癌症的例子包括，但不限定於：癌症(carcinoma)與惡性肉瘤(sarcoma)，例如乳癌(breast cancer)、血癌(leukemia)、惡性肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphomas)、惡性骨肉瘤(osteosarcoma)、神經膠質瘤(glioma)、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma)、肝惡性腫瘤(hepatoma)、黑色素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、皮膚癌(skin cancer)、大腸癌(colorectal cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腎臟癌(renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、睪丸癌(testicular cancer)、頭部與頸部的癌症(Head and neck cancer)、腦癌(brain cancer)、食道癌(esophageal cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、腎上腺皮質癌(adrenal cortical cancer)、肺癌(lung cancer)、支氣管癌(bronchus cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、子宮頸癌(cervical cancer)、肝癌(cervical or liver cancer)或未知起始位置的癌症。

式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體(一真菌類)，並經矽膠管柱分離純化製備而得；或另以化學合成方法製備而得。例如：由「牛樟芝菌絲體萃取」指自較適成長程度之牛樟芝菌絲體所萃取出的牛樟芝菌絲體萃取物。為取得該牛樟芝菌絲體萃取物，可使用本技術領域中眾所周知的萃取技術，例如可將經乾燥與研磨之該牛樟芝菌絲體懸浮在一溶劑或者兩種或多種溶劑之混合液於一足夠長的時間；適合的溶劑的例子包括，但不限定為：水、甲醇、乙醇、二氯甲烷(methylene chloride)、三氯甲烷(chloroform)、丙酮(acetone)、醚類(ether)(例如乙醚(diethyl ether))與乙酸乙酯酯類(ethyl acetate)與己烷(hexane)。之後移除固體殘餘物(例如藉由過濾)得到該牛樟芝菌絲體萃取物溶液，其可經矽膠管柱純化製備得式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B。基本上，全世界近二十餘年在牛樟芝所含天然化合物的研究，除多醣體等大分子外，總共發表了七十八個小分子化合物，其中包括三十一個三萜類化合物且大都有相關藥理活性研究報告，尤其著重在該等之抗癌活性，惟三萜類化合物各別分子仍須在較高使用量，才能達到癌症臨床化學治療藥物的效果【Geethangili M and Tzeng YM,Review of pharmacological effects of Antrodia camphorata and its bioactive compounds，Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，Aug.17,2009；doi：10.1093/ecam/nep108】。同時，本發明發現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對不同癌症細胞株(大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1；肝癌細胞株-Malavu、J5或SK-Hep1；肺腺癌細胞株-PC9或H441)具高度抑制性。在此必須再強調的是，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B乃是牛樟芝所含各種天然化合物中，經實驗證實抑制癌細胞效果較優之少數牛樟芝所含天然化合物之一。

在使用本發明之組合物治療時，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類可同時給藥或分開給藥，以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。此處所使用之「非口服」係指皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔內(intrathecal)、疾病部位內(intraleaional)與頭顱內(intracranial)注射以及灌注技術。

本發明所使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及/或其醫藥上可接受鹽類可與至少一種固體、液體或半液體狀之賦形劑或輔助劑一同形成適當的藥劑形式。其形式包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。藥錠一般所使用的載體(carrier)包括乳糖與玉米澱粉。一般也將潤滑劑(lubricating agent)，例如硬脂酸鎂(magnesium stearate)加至藥錠中。用於膠囊形式的稀釋劑(diluents)包括乳糖與經乾燥的玉米澱粉。當口服給藥為水性懸浮液或乳劑時，可懸浮或溶解有效成分(active ingredient)於與乳化或懸浮劑結合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、調味與著色劑。

本發明所使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類亦可配製成無菌注射成分(例如，水或油的懸浮液)，例如利用本技術領域中已知的技術使用適合的分散或增溼劑(例如Tween 80)與懸浮劑。無菌注射調劑也可以將無菌注射溶液或懸浮液加入無毒性非口服之稀釋劑或溶劑，例如1,3丁二醇(1,3-Butanediol)中。可使用的載具(vehicles)與溶劑包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)與等滲透壓氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油常作為溶劑或懸浮媒介(例如合成的單-或雙-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸(oleic acid)與其甘油酯衍生物亦可用在注射劑的調製，其為天然藥學上可接受的油，例如橄欄油、蓖麻油(castor oil)，特別是於其聚氧乙基化的(polyoxyethylated)變化形式。這些油溶液或懸浮液也可包含一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或者羧基甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)或類似的分散劑。

本發明所使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類亦可根據此技術領域中所熟知的技術來配製成吸入成分。例如可製成鹽類溶液，利用苯甲醇(benzyl alcohol)或其他適合的防腐劑、增強生物可利用性(bioavailability)的吸附促進劑、碳氟化合物(fluorocarbon)或其他本技術領域中熟知的助溶或分散劑來配製。

用於醫藥組合物的載體必須是「可接受的」，其與配方的有效成分相容(以及較佳為具有穩定有效成分之能力)以及不對病患有害。例如，助溶劑(例如環狀糊精(cyclodextrins))(其與一個或多個萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的複合物)，為了有效成分的傳送而作為藥理學上的輔藥。其他載體的例子包括膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸鎂、纖維素與烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate)。

另外，由於抗癌劑如以高劑量投予病患易產生毒性。是以，本發明之醫藥組合物為含有安全有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾 -B，用於抑制癌細胞生長，其中該安全有效量為0.01μM至1000μM，較佳為0.5μM至50μM。施予個別病人的特定劑量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用之特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、進食狀況、施用時間與路徑、排泄率、醫藥物質之組合、以及所欲治療之疾病的嚴重程度等。

圖一、以SRB分析評估式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對不同癌症細胞株(包括：大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1；肝癌細胞株-Malavu、J5或SK-Hep1；肺腺癌細胞株-PC9或H441)之細胞毒性。

圖二、以SRB分析評估式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對正常纖維母細胞-HS68之細胞毒性。

圖三、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸直腸癌細胞及其癌症幹細胞生長之影響。

圖四、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸癌細胞株(DLD1)型態的改變。

圖五、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸癌細胞株(DLD1)的細胞週期改變並造成sub G1期的細胞增多。

圖六A、B、將惡性大腸直腸癌DLD1癌幹細胞施打於小鼠下背部右側之皮下，於施打腫瘤細胞一週後，開始投予待測藥物，每週觀察其腫瘤生長情況。

圖七、動物模式中，4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)對惡性大腸直腸癌DLD1癌幹細胞生長之影響。

圖八、動物模式中，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)對小鼠體重之影響。

以下實施例僅用於解釋本發明，但本發明的保護範圍並不僅限以下實施例。為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明如下：

實施例一、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之製備

牛樟芝菌絲體3公斤以95%乙醇10公升加熱回流萃取四次，萃取液經過濾後濃縮，減壓乾燥得乙醇萃取物384公克，將乙醇萃取物懸浮於水以等量乙酸乙酯進行分配(partition)劃分，乙酸乙酯層經減壓濃縮可得乙酸乙酯層劃分部157.57公克及水層劃分部159.51公克。

上述乙酸乙酯層劃分部157.57公克以矽膠管柱(10cm i.d x 30cm)進行層析，依次以正己烷→正己烷-乙酸乙酯(10：1→10：2→10：3→10：4→10：5→1：1→1：2，v/v)→乙酸乙酯→甲醇每種比例各10L進行沖提，每1L收集成一劃分部。其中正己烷-乙酸乙酯(10：4)沖提之劃分部56-63(3.015g)，以逆相製備級管柱Tosoh ODS-80Ts(21.5mm x 300mm,10μm)進行層析，以H₂O-CH₃CN(20：80)為移動相，流速10ml/min進行層析，以265nm為檢測波長，管柱控溫40℃，可獲得4-乙醯基-安卓奎諾-B(131mg)。

實施例二、生物活性分析方法

1、冷凍細胞之活化

冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其他蛋白質)。冷凍的細胞快速解凍的方法為：將冷凍管由液氮或乾冰容器中取出，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在3分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管的外部，移入無菌操作台內。取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1：10~1：15)，混合均勻，放入CO₂培養箱培養。在解凍培養後隔日更換培養基。

2. 人類癌症細胞之培養

此實驗選用各種不同的人類癌症細胞株，分別為大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1；肝癌細胞株-Malavu、J5或SK-Hep1；肺腺癌細胞株-PC9或H441。肝癌細胞株Malavu、J5或SK-Hep1培養於5%胎牛血清(FBS)、2mM麩醯胺酸(glutamine)，100μg/mL鏈黴素(streptomycin)和100U/mL盤尼西林(penicillin)的DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)中；PC9或H441細胞株培養於10%胎牛血清、2mM麩醯胺酸，100μg/mL鏈黴素和100U/ml盤尼西林、0.01mg/mL胰島素(insulin)的DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)中；HCT116、RKO、SW480或DLD1細胞株培養於10%胎牛血清、4mM麩醯胺酸、100μg/mL鏈黴素和100U/mL盤尼西林、0.01mg/mL胰島素的RPMI中。細胞株放置於37℃，5% CO₂，溼度95%的培養箱中培養。

3. 細胞藥物處理：

所有實驗的細胞皆培養於含10%胎牛血清的培養液中，待細胞長到約八成滿時，將舊培養液抽乾並以PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝液)溶液清洗細胞後，加入10毫升不含血清之培養液。依實驗目的不同加入不同的藥物，於37℃恆溫培養箱中進行反應。

4、細胞毒性實驗(cytotoxicity)：

將大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1；肝癌細胞株-Malavu、J5或SK-Hep1；肺腺癌細胞株-PC9或H441。肝癌細胞株Malavu、J5或SK-Hep1放置於96孔培養盤(culture plate)(2000細胞/孔)，以及將其隔夜培養於100μl的完全DMEM中。將50μl包含式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(0.5-50μM)之完全DMEM等量樣品加入培養盤的不同孔中。另外，控制組則只加入100μl的完全DMEM。於培養2天之後，以磺酰羅丹明B(sulforhodamine B)(一蛋白質結合染劑)分析測定每孔中的細胞數目。簡單地說，固定細胞於10%三氯醋酸(trichloroacetic acid)中，與以0.4%磺酰羅丹明B將其染色。染色20分鐘後再以1%乙酸清洗，之後，將與細胞結合的磺酰羅丹明B溶解於10mM的Tris base中。以微量滴定盤檢測器(microtiter plate reader)在562nm下測定吸光值(optical density)。

5、細胞型態變化的分析

細胞凋亡(apoptosis)與細胞壞死(necrosis)在型態學上有很大的差異，特徵有細胞萎縮、脫落，染色質濃縮等現象。將大腸直腸癌細胞DLD1放置於petri dish培養盤(皮氏培養皿)，待細胞貼底後，給予適當包含式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(0.5-50μM)之藥物濃度，至於培養箱中一段時間後，以倒立顯微鏡觀察細胞型態，並拍照紀錄之。

6、細胞週期與細胞凋亡檢測

大腸直腸癌幹細胞DLD1經式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理後，以胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)處理細胞，與培養液一起收集，離心後去掉上清液，並以4℃磷酸鹽緩衝液清洗後，加入1毫升冰冷的75%酒精，放入4℃冰箱過夜，以固定細胞。離心後，續以1毫升PBS懸浮，加入適量的核糖核酸A(RNase A)，於37℃作用30分鐘，最後加入40mg/mL之碘化丙錠(propidium iodide)(PI,Sigma Chemical Co.,cat.No P-4170)避光作用半小時，以35mm尼龍網(nylon mesh)過濾後，以495nm波長激發後，於637nm波長偵測細胞螢光含量，以流式細胞儀進行分析。

實施例三、生物活性測定之結果

1、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可抑制不同腫瘤細胞之生長。

挑選不同腫瘤細胞株包括：大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1；肝癌細胞株-Malavu、J5或SK-Hep1；肺腺癌細胞株-PC9或H441；肝癌細胞株Malavu、J5或SK-Hep1來探討式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對不同癌細胞之毒殺作用。結果發現式I化合物可顯著抑制不同腫瘤細胞之生長，對腫瘤細胞所造成之半抑制濃度(IC50值)分別介於7~30μM之間，其中又以對惡性大腸直腸癌幹細胞(DLD1)之毒殺效果最強(圖一)。值得注意的是，以纖維母細胞(HS68)進一步分析式I化合物對正常細胞生長之影響，則發現式I化合物並不會造成正常纖維母細胞(HS68)細胞之生長抑制(圖二)。由此得知，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B的確具有選擇性毒殺癌細胞之能力，其中又以大腸直腸癌幹細胞的毒殺效果最為顯著。

2、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸癌細胞及正常纖維母細胞(HS68)細胞生長之影響。

由實驗結果得知I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B的確對惡性大腸癌細胞具有較佳之抑制作用。因此進一步將惡性大腸癌細胞(HCT116、DLD1、RKO或SW620)利用Sulforhodamine B(SRB assay)分析的方法測定式I化合物對於細胞生長之影響。SRB分析法的原理是利用染劑(Sulforhodamine B，SRB)與細胞質蛋白質的鹼性氨基酸鍵結而呈色，主要用於量測細胞的增生與存活率。結果發現，投與藥物48小時後，惡性大腸癌細胞(HCT116、DLD1、RKO或SW620)隨著式I化合物濃度的上升其細胞毒性顯著增加，在式I化合物濃度10μM處理下分別可抑制64%、60%、53%及78%細胞存活率(表一、表二、表三及表四)。值得注意的是，正常纖維母細胞(HS68)之細胞存活率並未隨著式I化合物濃度的增加而有所影響(圖二)。故由此可知式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對於惡性大腸癌細胞(HCT116、DLD1、RKO或SW620)有很高的細胞毒性反而對於正常纖維母細胞(HS68)並無太高的細胞毒性。

相對細胞存活率(%)=(化合物處理組織吸光值)/(控制組之吸光值)×100

表四、以SRB分析評估化合物對大腸癌細胞(SW620)之細胞毒性

3、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸直腸癌細胞及其癌症幹細胞生長之影響。

由實驗結果得知，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B的確對大腸直腸癌細胞具有較佳之抑制作用(圖三)。研究結果發現4-乙醯基-安卓奎諾-B能明顯抑制人類大腸直腸癌幹細胞球體的增生能力。4-乙醯基-安卓奎諾-B亦可以有效抑制大腸直腸癌幹細胞標記ALDH1活性、降低癌幹細胞球體自我更新能力、細胞侵襲力及降低抗藥性。為了釐清其分子機制，我們藉由大腸直腸癌幹基因SOX-2、血管內皮生長因數(VEGF)、Wnt/β-連環蛋白(beta-catenin)分子及SMO刺蝟訊號傳導路徑(Hedgehog signal pathway)的抑制路徑證實，4-乙醯基-安卓奎諾-B經由調節癌幹基因的訊息路徑有效的抑制DLD-1大腸直腸癌幹細胞的轉移及侵襲作用(圖三)。綜合上述，4-乙醯基-安卓奎諾-B應為潛力標靶大腸直腸癌幹細胞特性之化學治療物質。

4、測定式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸癌細胞株(DLD1)型態的影響。

本發明進一步辨別式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B引起惡性大腸癌細胞株(DLD1)的細胞毒殺現象是否為經由細胞凋亡所引起。首先就細胞型態而言，由於細胞凋亡活化了許多內生性的蛋白酵素，會顯著導致細胞骨架的破壞(cytoskeletal disruption)、細胞萎縮(cell shrinkage)、細胞膜上會有泡狀物(membrance blebbing)的產生，並且有染色質濃縮(chromatin condensation)的現象。由實驗結果中，清楚觀察到將式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B給予惡性大腸癌細胞株(DLD1)後，細胞型態上有明顯萎縮的變化，並且可明顯的觀察到凋亡小體(apoptotic body)。此與未加式I化合物處理的控制組細胞相比，外觀有顯著的不同。此外，也可觀察到許多細胞有脫落現象(detachment)而懸浮於培養液中(圖四)。

5、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對惡性大腸癌細胞株(DLD1)細胞凋亡的分析以及其對細胞週期的影響

由於正常人體的DNA是雙套的(2N)，而凋亡細胞DNA斷裂成小片斷，因此會比正常G0/G1期細胞有較低的染色密度(stainability)，經碘化丙碇(propidium iodide，PI)染色後，以流式細胞儀分析後，可將凋亡細胞顯現出來，而形成G1亞峰(sub G1 peak)。因此，本發明進一步對惡性大腸癌細胞株(DLD1)細胞進行PI染色，利用流式細胞儀分析4-乙醯基-安卓奎諾-B對細胞週期的影響。由實驗結果發現，4-乙醯基-安卓奎諾-B(1μM和5μM)作用48小時後，會些微增加G0/G1的比例。相對的，隨著時間和濃度的增加，經式I化合物處理的細胞，G1亞峰(subG1)的比例亦跟著明顯增加(圖五)。

實施例四、動物試驗方法

實驗動物

免疫缺陷小鼠由樂斯科生物科技股份公司購得(約4-6週大之NOD/SCID小鼠)，經馴養一週後，開始進行試驗。

細胞培養

選用的腫瘤細胞為惡性大腸直腸癌幹細胞(DLD1)，為一貼附型之細胞株，且具很強的轉移能力。以培養液DMEM內含10%胎牛血清(FBS)，1%非必需氨基酸(NEAA)和1%抗生素(anti-anti)培養於37℃、5%二氧化碳之培養箱中，約3~4天繼代一次。

將細胞以0.05%胰蛋白酶(trypsin)-EDTA作用3~5分鐘，使呈懸浮狀態，加入含血清之培養基中和胰蛋白酶(trypsin)之作用，1000rpm、20℃、離心5分鐘。去除上清液，輕輕打散細胞沈澱，將細胞回溶於適當體積之培養液，混合均勻後，取少許細胞液，以血球計數器進行細胞計數。將細胞稀釋成每毫升含10⁷個細胞之濃度，取約0.15毫升分裝於1.5毫升小離心管中。

藥物配製

以DMSO為溶劑，將4-乙醯基-安卓奎諾-B配置成每毫升250毫克之溶液，待完全溶解後，進行分裝，為儲存液(stock)，保存於4℃，取stock加入無菌之生理實驗水做500倍稀釋，混合均勻，即可進行腹腔注射。目前臨床標準化學療法用藥(5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)+奧沙利鉑(Oxaliplatin))(FOLFOX)則為針劑，其濃度分別為每毫升50毫克及每毫升5毫克，兩藥物皆取原液進行靜脈注射。

腫瘤細胞注射

注射腫瘤細胞的前一天，將小鼠以10倍稀釋的舒泰50(zoletil 50)及若朋(rompun)2%經1：1混合後，每隻小鼠腹腔注射0.25毫升進行麻醉，待其完全睡著後，進行放射線照射，以抑制其免疫力，照射劑量為0.75Gy。

小鼠以2.5%之異氟烷(isoflurane)進行麻醉，並將欲注射部位之毛髮剔除，注射前用75%酒精及優碘消毒注射部位，選用29G胰島素針進行腫瘤細胞注射，注射時，先用鑷子將小鼠表皮拉起，再將腫瘤細胞注射到皮下之處，注射，細胞數為10⁶個，體積為0.1毫升，注射完畢後，確認細胞液無漏出，即可將小鼠移回籠中，待其甦醒，注意其保溫。持續觀察腫瘤生長狀況。

實施例五、動物試驗測定之結果

腫瘤大小測定

將惡性大腸直腸癌DLD1癌幹細胞施打於小鼠下背部右側之皮下，於施打腫瘤細胞一週後，開始投予待測藥物，每週觀察其腫瘤生長情況(圖六A、B)。每週測量一次腫瘤大小，利用游標量尺測量腫瘤之最長徑和最短徑，為確保量測之準確度，實驗期間由同一人進行腫瘤大小的量測。腫瘤體積計算公式：最長徑為a、最短徑為b；腫瘤大小=(a×b²)/2，最後，將小鼠犧牲，取其腫瘤組織，拍照存檔，再以福馬林固定。腫瘤大小的變化以倍數計算製成圖表顯示。腫瘤大小改變倍數(fold change in tumor volume)=腫瘤大小(N)/腫瘤大小(N-1)。N為周數。

動物模式中，4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B，4-AAQB)對惡性大腸直腸癌DLD1癌幹細胞生長之影響。每週游標量尺量測腫瘤大小，以腫瘤大小變化之倍率表示之。單獨投予4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)、5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)+奧沙利鉑(Oxaliplatin)(FOLFOX)及共同投予4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)和FOLFOX的小鼠之腫瘤皆小於對照組小鼠(圖7)。其中以單獨投予FOLFOX及同時投予4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)和FOLFOX抑制腫瘤生長的效果最佳。兩實驗組之腫瘤體積僅增長約3倍大，而對照組之腫瘤則可增長到約9倍的體積。腫瘤抑制效果排序：4-AAQB+FOLFOX=FOLFOX>單獨施用4-AAQB。

每週監測各組小鼠之體重變化

單獨投予5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)+奧沙利鉑(Oxaliplatin)(FOLFOX)之小鼠體重呈現持續下降，由原本接近26克下降到約21克，但當同時投予4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)和FOLFOX，其小鼠體重與對照組間並無顯著差異。對照其腫瘤生長狀況，單獨投予Fluorouracil+Oxaliplatin(FOLFOX)及同時給予4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)和FOLFOX皆可有效的抑制惡性大腸直腸癌DLD1癌幹細胞的生長，但投予5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)+奧沙利鉑(Oxaliplatin)(FOLFOX)時，輔以4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-AAQB)卻可防止小鼠體重過度下降，降低5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)+奧沙利鉑(Oxaliplatin)(FOLFOX)對個體造成的傷害(圖八)。

Claims

一種組合物用於製備抑制大腸直腸癌細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B) 或其醫藥上可接受鹽、一抗癌藥物及一醫藥上可接受載體，其中該抗癌藥物為5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)或5-氟尿嘧啶與奧沙利鉑(Oxaliplatin)之組合。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物可治療癌症。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該大腸直腸癌細胞包括大腸直腸癌細胞-HCT116、RKO、SW480或DLD1。
根據申請專利範圍第2項所述之用途，其中該癌症包括大腸直腸癌。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體，並經矽膠管柱純化製備而得。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.01μM至1000μM。
根據申請專利範圍第6項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.5μM至50μM。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該5-氟尿嘧啶的濃度為每毫升5毫克至每毫升300毫克。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該奧沙利鉑的濃度為每毫升0.5毫克至每毫升50毫克。
根據申請專利範圍第2項所述之用途，其中該組合物可防止個體因服用抗癌藥物造成之體重降低。