CN115724760B - 一种三环二萜类似物及其合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种式(I)所示三环二萜类似物及其制备方法，以睾酮为原料通过甲基化、乙二醇保护、氧化、Bayer‑Villiger氧化、还原、水解等反应以及经氰基化、Wittig反应增长碳链，分别获得相应的母核化合物；然后母核化合物通过酰胺化反应制得该类三环二萜类似物。本发明还公开了所述三环二萜类似物在抑制Smoothened(SMO)蛋白和抗肿瘤中的应用，所述三环二萜类似物通过和SMO蛋白N端的Cysteine Rich Domain(CRD)结合，抑制Hedgehog(Hh)信号通路的活性，进而抑制肿瘤细胞的生长，具有良好的抗肿瘤应用前景，并且可以解决现有临床上SMO抑制剂的耐药性问题，为相关疾病的治疗提供了一个新的解决方案。
Description
技术领域
本发明属于医药化工技术领域，涉及一种三环二萜类似物及其合成和在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
癌症治疗已成为全世界面临的重要问题。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担表明，中国新发癌症人数及中国癌症死亡人数均居全球第一。除了手术治疗外，药物治疗是最为重要的治疗方式。因此，研究新型抗肿瘤药物一直是医药领域的研究热点。
Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎发育、组织再生以及肿瘤发生中起着至关重要的作用。Hh信号通路异常激活会引起一系列的疾病，包括基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腺癌以及结肠癌等。Smoothened(SMO)蛋白在Hh信号通路上起着十分关键的作用，抑制SMO蛋白的活性是抑制Hh信号通路的重要手段之一(NatRevMol CellBiol.2013,14,416-29)。近年来，针对SMO的药物研发已经取得了跨越式的发展，三种SMO的抑制剂，如诺华公司的索尼德吉(LDE225/Sonidegib，Drugs.2015,5,1559-66)、罗氏制药的维莫德吉(GDC0449/Vismodegib，Drug Discovery.2012,11,437-438)及辉瑞制药的格拉德吉(Glasdegib，Clin Cancer Res.2019,25,6021-6025)均已被美国FDA批准上市，其中索尼德吉和维莫德吉在治疗基底细胞癌(BCC)的病人上有着非常显著的效果，格拉德吉在治疗急性髓性白血病(AML)的病人上可以明显的延长病人的寿命。针对其他癌症，目前一些SMO抑制剂也正处于临床研究中，因此SMO抑制剂在癌症治疗方面具有十分广阔的应用前景(Cell Chem Biol.2017,24,252-280)。但研究表明，大部分SMO抑制剂，包括已上市的索尼德吉、维莫德吉和格拉德吉均作用于SMO的7次跨膜结构域上，属非保守区，该区域极易产生耐药性突变(D473H&E518K等)。近期研究发现，SMO的N端Cysteine Rich Domain(CRD)不仅可以结合胆固醇(Nature.2016,535,17-522；Cell.2016,166,1176-1187)，还可以发生胆固醇修饰(Molecular Cell.2017,66,154–162)，并且该区域相对比较保守，不易产生突变。抑制SMO的CRD和胆固醇的结合可以很好的抑制Hh信号通路，进而起到抗肿瘤作用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种三环二萜类似物，并提供了该类似物的制备方法及其应用。
本发明公开了一种作用于SMO-CRD的SMO抑制剂，不仅能介导Hh信号通路的抑制，起到抗肿瘤作用，还可以解决临床上现有靶向SMO药物(维莫德吉；索尼德吉；格拉德吉)的耐药性问题，为相关癌症的治疗提供一个新的解决方案。
本发明提供了一种三环二萜类似物，其结构通式如下：
其中，
R1选自羰基、羟基；
R2选自各种烷烃胺、杂环胺、芳香胺或羟基；
n选自自然数；
优选地，
R1选自羰基、β-羟基；
R2选自羟基–OH；烷烃胺如 者杂环胺如或者芳香胺如
n选自自然数2～5。
本发明提供的一种三环二萜类似物，其结构式如式(2)～式(32)所示，
本发明还提供了一种制备三环二萜类似物的合成方法，包括以下：
(一)：式(2)～式(25)所示三环二萜类似物的制备：
以睾酮为起始原料，经甲基化、乙二醇保护、还原、氧化、Bayer-Villger氧化、还原、脱保护、乙酰化、消除、水解、氧化等反应得到母核化合物Q12，然后Q12经酰胺化得到式(2)所示三环二萜类似物即化合物2；或，以母核化合物Q12为原料，还原得到式(3)所示三环二萜类似物即化合物3，然后式(3)化合物经酰胺化得到式(4)～式(25)所示三环二萜类似物，即化合物4～25，所述制备方法的总路线如(J)所示：
具体地，所述方法包括以下步骤：
a：4,4-二甲基化反应
将化合物睾酮(Testosterone)溶于有机溶剂中，加入甲基化反应所用的甲基化试剂和碱，进行甲基化反应，得到化合物Q1。
步骤(a)中，所述有机溶剂选自t-BuOH、苯、四氯化碳、四氢呋喃等中的任意一种或多种；优选地，为t-BuOH。
步骤(a)中，所述碱选自t-BuOK、KOC(Et)Me2等中的任意一种或多种；优选地，为t-BuOK。
步骤(a)中，所述甲基化试剂为CH3Cl、CH3Br、CH3I等中的任意一种或多种；优选地，为CH3I。
步骤(a)中，所述化合物睾酮与碱的摩尔比为1：(2～8)；优选地，为1：3。
步骤(a)中，所述化合物睾酮与甲基化试剂的摩尔比为1：(2～10)；优选地，为1：6。
步骤(a)中，所述加入甲基化试剂期间反应的温度为0℃。
步骤(a)中，所述甲基化反应的温度为0～60℃；优选地，为45℃。
步骤(a)中，所述甲基化反应的时间为2～12h；优选地，为4h。
b：乙二醇保护反应
将化合物Q1溶于有机溶剂，加入催化剂、吸水剂，反应得到化合物Q2。
步骤(b)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、四氢呋喃和乙二醇的混合溶液等中的任意一种或多种；优选地，为四氢呋喃和乙二醇的混合溶液。
所述四氢呋喃与乙二醇的体积比为3：(1～3)；优选地，为3：1。
步骤(b)中，所述乙二醇既做为溶剂也作为反应物。
步骤(b)中，所述催化剂选自对甲苯磺酸、浓硫酸等中的任意一种或多种；优选地，为对甲苯磺酸。
步骤(b)中，所述吸水剂选自原甲酸三乙酯、原甲酸三甲酯等中的任意一种或多种；优选地，为原甲酸三乙酯。
步骤(b)中，所述化合物Q1与催化剂、脱水剂的摩尔比为1：(0.2～0.5)：(5～10)；优选地，为1：0.35：5。
步骤(b)中，所述乙二醇保护反应的时间为2～12h；优选地，为3h。
步骤(b)中，所述乙二醇保护反应的温度为25～60℃；优选地，为45℃。
c：还原反应
将化合物Q2溶于有机溶剂中，加入还原试剂，加压下进行还原反应得到化合物Q3。
步骤(c)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯等中的一种或多种；优选地，为四氢呋喃和甲醇的混合溶液。
所述四氢呋喃和甲醇混合溶液的体积比为2：(1～3)；优选地，为2：1
步骤(c)中，所述还原试剂选自钯碳、雷尼镍等中的一种或多种；优选地，为钯碳。
步骤(c)中，所述化合物Q2与还原试剂的质量比为1：(0.2～1)；优选地，为1：0.3。
步骤(c)中，所述反应压力为4MPa。
步骤(c)中，所述还原反应的温度为10～60℃；优选地，为25℃。
步骤(c)中，所述还原反应的时间为24～72h；优选地，为48h。
d：氧化反应
将化合物Q3溶于有机溶剂，加入氧化剂，反应得到化合物Q4。
步骤(d)中，所述有机溶剂选自DMSO、甲苯、四氢呋喃等中的任意一种或多种；优选地，为DMSO和四氢呋喃的混合溶液。
所述四氢呋喃和DMSO混合溶液的体积比为2：(1～3)；优选地，为2：1。
步骤(d)中，所述氧化剂为IBX、PCC、DDQ、PDC等中的任意一种或多种；优选地，为IBX。
步骤(d)中，化合物Q3与氧化剂的摩尔比为1：(1～3)；优选地，为1：2。
步骤(d)中，所述氧化反应的温度为0～50℃；优选地，为25℃。
步骤(d)中，所述氧化反应的时间为3～8h；优选地，为5h。
e：Bayer-Villiger氧化反应
将化合物Q4溶于有机溶剂，加入氧化剂、碱，反应得到化合物Q5。
步骤(e)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷等中的任意一种或多种；优选地，为二氯甲烷。
步骤(e)中，所述氧化剂为间氯过氧苯甲酸、过氧乙酸、过硫酸氢钾、双氧水等中的任意一种或多种；优选地，为间氯过氧苯甲酸。
步骤(e)中，所述碱选自NaHCO3、Na2CO3、NaH2PO4等中任意一种或多种；优选地，为NaHCO3。
步骤(e)中，所述化合物Q4与氧化剂的摩尔比为1：(1～10)；优选地，为1：2.5。
步骤(e)中，所述化合物Q4与碱的摩尔比为1：(1～10)；优选地，为1：2.7。
步骤(e)中，所述氧化反应的温度为10～50℃；优选地，为25℃。
步骤(e)中，所述氧化反应的时间为3～12h；优选地，为5h。
f：还原反应
将化合物Q5溶于有机溶剂，加入还原剂，反应得到化合物Q6。
步骤(f)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙醚、甲醇、乙醇等中的任意一种或多种；优选地，为四氢呋喃。
步骤(f)中，所述还原剂为LiAlH4、红铝、二异丁基氢化铝等中的任意一种或多种；优选地，为LiAlH4。
步骤(f)中，所述化合物Q5与还原剂的摩尔比为1：(2～10)；优选地，为1：3。
步骤(f)中，所述还原反应的温度为0～25℃；优选地，为0℃。
步骤(f)中，所述还原反应的时间为0.5～2h；优选地，为0.5h。
g：脱乙二醇保护基
将化合物Q6溶于有机溶剂，加入酸，反应得到化合物Q7。
步骤(g)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃等中的一种或多种；优选地，为四氢呋喃。
步骤(g)中，所述酸选自稀硫酸、稀盐酸、盐酸气、对甲苯磺酸等中的一种或多种；优选地，为2mol/L稀盐酸。
步骤(g)中，所述有机溶剂与2mol/L稀盐酸的体积比为5：(1～2)；优选地，为5：1。
步骤(g)中，所述脱乙二醇保护基反应的温度为0～60℃；优选地，为25℃。
步骤(g)中，所述脱乙二醇保护基反应的时间为1～10h；优选地，为5h。
h：乙酰化反应
将化合物Q7溶于有机溶剂，加入乙酰化试剂，反应得到化合物Q8。
步骤(h)中，所述有机溶剂选自吡啶、三乙胺、二乙胺、二异丙基乙基胺、四氢呋喃、DMF等中的一种或多种；优选地，为吡啶。
步骤(h)中，所述乙酰化试剂选自乙酸酐、乙酰氯等中的一种或多种；优选地，为乙酸酐。
步骤(h)中，所述Q7和乙酰化试剂的摩尔比为1：(1～5)；优选地，为1：1.5。
步骤(h)中，所述乙酰化反应的温度为0～25℃；优选地，为0℃。
步骤(h)中，所述乙酰化反应的时间为1～24h；优选地，为18h。
i：消除反应
将化合物Q8溶于有机溶剂，加入脱水剂、吸水剂，反应得到化合物Q9。
步骤(i)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、丙酮、甲苯等中的一种或多种；优选地，为二氯甲烷。
步骤(i)中，所述脱水剂选自浓硫酸、磷酸、三甲硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)等中的一种或多种；优选地，为三甲硅基三氟甲磺酸酯。
步骤(i)中，所述吸水剂为乙酸酐。
步骤(i)中，所述Q8和脱水剂的摩尔比为1：(0.1～0.4)；优选地，为1：0.12。
步骤(i)中，所述Q8和吸水剂的摩尔比为1：(1～5)；优选地，为1：5。
步骤(i)中，所述消除反应的温度为-10℃～25℃；优选地，为0℃。
步骤(i)中，所述消除反应的时间为0.25～1h；优选地，为0.5h。
j：水解反应
将化合物Q9溶于有机溶剂，加入碱，反应得到化合物Q10。
步骤(j)中，所述有机溶剂选自甲醇、四氢呋喃、乙醇等中的任意一种或多种；优选地，为甲醇。
步骤(j)中，所述碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等中的任意一种或多种；优选地，为碳酸钾。
步骤(j)中，所述化合物Q9与碱的摩尔比为1：(1～5)；优选地，为1：4。
步骤(j)中，所述水解反应的温度为10～70℃；优选地，为25℃。
步骤(j)中，所述水解反应的时间为1～12h；优选地，为3h。
k：氧化反应
将化合物Q10溶于有机溶剂，加入氧化剂，反应得到化合物Q11。
步骤(k)中，所述有机溶剂选自DMSO、甲苯、四氢呋喃等中的任意一种或多种；优选地，为DMSO和四氢呋喃的混合溶液。
所述四氢呋喃和DMSO混合溶液的体积比为2：(1～3)；优选地，为2：1。
步骤(k)中，所述氧化剂为IBX、PCC、DDQ、PDC等中的任意一种或多种；优选地，为IBX。
步骤(k)中，化合物Q10与氧化剂的摩尔比为1：(1～2)；优选地，为1：2。
步骤(k)中，所述氧化反应的温度为0～50℃；优选地，为25℃。
步骤(k)中，所述氧化反应的时间为1～3h；优选地，为1h。
l：氧化反应
将化合物Q11溶于有机溶剂，加入氧化剂，反应得到化合物Q12。
步骤(l)中，所述有机溶剂选自吡啶、三氯甲烷、二氯乙烷、1，2-二氯丙烷等中的任意一种或多种；优选地，为吡啶。
步骤(l)中，所述氧化剂选自四丁基高锰酸铵、高锰酸钾、重铬酸钾、O3等中的任意一种或多种；优选地，为四丁基高锰酸铵。
步骤(l)中，所述Q11与氧化剂的摩尔比为1：(1～4)；优选地，为1：2。
步骤(l)中，所述氧化反应的温度为0～60℃；优选地，为0℃。
步骤(l)中，所述氧化反应的时间为1～2h；优选地，为1h。
m：酰胺化反应
将化合物Q12溶于有机溶剂中，加入HATU、DIPEA及相应的胺，得到化合物2。
步骤(m)中，所述有机溶剂选自DCM、DMF、四氢呋喃、氯仿等中的任意一种或多种；优选地，为DCM。
步骤(m)中，所述HATU、DIPEA的作用为促进酰胺化反应。
步骤(m)中，所述化合物Q12、HATU、DIPEA及相应的胺的摩尔比为1：(1～2)：(1～2)：(2～4)；优选地，为1：1.2：1.5：2。
步骤(m)中，所述酰胺化反应的温度为0～40℃；优选地，为25℃。
步骤(m)中，所述酰胺化反应的时间为0.5～2h；优选地，为1h。
n：还原反应
化合物Q12溶于有机溶剂，加入还原剂，反应得到化合物3。
步骤(n)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和甲醇的混合溶液等中的一种或多种；优选地，为甲醇和二氯甲烷的混合溶液。
所述甲醇和二氯甲烷的混合溶液的体积比为1：(0.5～3)；优选地；为1：2。
步骤(n)中，所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化钾等中的一种或多种；优选地，为硼氢化钠。
步骤(n)中，所述化合物Q12与还原剂的摩尔比为1：(5～20)；优选地，为1：10。
步骤(n)中，所述还原反应的温度为0～50℃；优选地，为0℃。
步骤(n)中，所述还原反应的时间为0.5～4h；优选地，为0.5h。
o:酰胺化反应
化合物4～25的合成类似于路线(J)步骤(m)中化合物2的酰胺化方法。
所述路线(J)还包含路线(A)、路线(E)、路线(F)，具体如下：
(二)：式(26)所示三环二萜类似物的制备
本发明还提出了一种三环二萜类似物的制备方法，以化合物Q10为起始原料，经过磺酰化、取代(氰基化)、水解、还原、酰胺化反应得到式(26)所示三环二萜类似物，即化合物26，所述制备方法如路线(K)所示：
具体地，所述方法包括以下步骤：
a：磺酰化反应
化合物Q10溶于有机溶剂，加入甲磺酰氯、缚酸剂，反应得到化合物Q13。
步骤(a)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃等中的一种或多种；优选地，为二氯甲烷。
步骤(a)中，所述缚酸剂选自三乙胺、三丁胺、吡啶等中的一种或多种；优选地，为三乙胺。
步骤(a)中，所述化合物Q10与甲磺酰氯的摩尔比为1：(1～5)；优选地，为1：3。
步骤(a)中，所述化合物Q10与缚酸剂的摩尔比为1：(1～5)；优选地，为1：4。
步骤(a)中，所述磺酰化反应的温度为-10～25℃；优选地，为0℃。
步骤(a)中，所述磺酰化反应的时间为1～4h；优选地，为1h。
b：取代(氰基化)反应
化合物Q13溶于有机溶剂，加入氰基化试剂、四丁基氟化铵，反应得到化合物Q14。
步骤(b)中，所述有机溶剂选自DMF、四氢呋喃、乙腈等中的一种或多种；优选地，为乙腈。
步骤(b)中，所述氰基化试剂选自氰化钠、三甲基硅氰等中的一种或多种；优选地，为三甲基硅氰。
步骤(b)中，四丁基氟化铵的作用为促进TMS基团离去，促进氰基化反应。
步骤(b)中，所述化合物Q13与氰基化试剂的摩尔比为1：(1～10)；优选地，为1：1.5。
步骤(b)中，所述化合物Q13与四丁基氟化铵的摩尔比为1：(1～10)；优选地，为1：1.5。
步骤(b)中，所述氰基化反应的温度为0～85℃；优选地，为82℃。
步骤(b)中，所述氰基化反应的时间为0.5～4h；优选地，为0.5h。
c：水解反应
化合物Q14溶于有机溶剂，加入碱，反应得到化合物Q15。
步骤(c)中，所述有机溶剂选自乙醇、乙二醇、甲醇等中的一种或多种；优选地，为乙二醇。
步骤(c)中，所述碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等中的任意一种或多种；优选地，为氢氧化钾。
步骤(c)中，所述化合物Q14与碱的摩尔比为1：(5～15)；优选地，为1：10。
步骤(c)中，所述水解反应的温度为60～170℃；优选地，为170℃。
步骤(c)中，所述水解反应的时间为6～24h；优选地，为12h。
d：还原反应
化合物Q16的合成类似于路线(J)步骤(n)中化合物3的还原反应方法。
e：酰胺化反应
化合物26的合成类似于路线(J)步骤(m)中化合物2的酰胺化方法。
所述路线(K)还包含路线(B)、路线(G)，具体如下：
(三)：式(27)～式(29)所示三环二萜类似物的制备
本发明还提出了一种三环二萜类似物的制备方法，以化合物Q11为起始原料，经过Wittig反应、还原、水解、酰胺化反应得到式(27)～式(29)所示三环二萜类似物，即化合物27～29，所述制备方法如路线(L)所示：
具体地，所述方法包括以下步骤：
a：Wittig反应
化合物Q11溶于有机溶剂，加入碱、Wittig试剂，反应得到化合物Q17。
步骤(a)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲苯、石油醚等中的任意一种或多种；优选地，为四氢呋喃。
步骤(a)中，所述碱为甲醇钠、乙醇钠、氢化钠(60％)中的一种或多种；优选地，为氢化钠(60％)。
步骤(a)中，所述Wittig试剂优选为磷酰基乙酸三乙酯。
步骤(a)中，所述化合物Q11与碱、Wittig试剂的摩尔比为1：(3～8)：(3～8)；优选地，为1：5.5：5。
步骤(a)中，所述Wittig反应的温度为-10℃～25℃；优选地，为0℃。
步骤(a)中，所述Wittig反应的时间为20～60min；优选地，为20min。
b：还原反应
将化合物Q17溶于有机溶剂中，加入还原剂，反应得到化合物Q18。
步骤(b)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯等中的一种或多种；优选地，为四氢呋喃。
步骤(b)中，所述还原剂选自钯碳、雷尼镍等中的一种或多种；优选地，为钯碳。
步骤(b)中，所述化合物Q17与还原剂的质量比为1：(0.05～1)；优选地，为1：0.1。
步骤(b)中，所述反应压力为1atm。
步骤(b)中，所述还原反应的温度为10～60℃；优选地，为25℃。
步骤(b)中，所述还原反应的时间为0.5～10h；优选地，为1h。
c：还原反应
化合物Q19的合成类似于路线(J)步骤(n)中化合物3的还原反应方法。
d：水解反应
将化合物Q19溶于有机溶剂中，加入碱，反应得到化合物Q20。
步骤(d)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃等中的一种或多种；优选地，为甲醇。
步骤(d)中，所述碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等中的任意一种或多种；优选地，为氢氧化钠。
步骤(d)中，所述化合物Q19与碱的摩尔比为1：(1～10)；优选地，为1：10。
步骤(d)中，所述水解反应的温度为10～60℃；优选地，为25℃。
步骤(d)中，所述水解反应的时间为5～12h；优选地，为9h。
e：酰胺化反应
化合物27～29的合成类似于路线(J)步骤(m)中化合物2的酰胺化反应方法。
所述路线(L)还包含路线(C)、路线(H)，具体如下：
(四)：式(30)～式(32)所示三环二萜类似物的制备
本发明还提出了一种三环二萜类似物的制备方法，以化合物Q10为起始原料，经过乙二醇保护、氧化、Wittig反应、还原、脱保护、还原、酰胺化反应得到式(30)～式(32)所示三环二萜类似物，即化合物30～32，所述制备方法如路线(M)所示：
具体地，所述方法包括以下步骤：
a：乙二醇保护反应
将化合物Q10溶于有机溶剂，加入催化剂、吸水剂、乙二醇，反应得到化合物Q21。
步骤(a)中，所述乙二醇只作为反应物。
步骤(a)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲苯等中的一种或多种；优选地，为甲苯。
步骤(a)中，所述催化剂选自为对甲苯磺酸、浓硫酸等中的任意一种或多种；优选地，为对甲苯磺酸。
步骤(a)中，所述吸水剂选自原甲酸三乙酯、原甲酸三甲酯等中的任意一种或多种；优选地，为原甲酸三乙酯。
步骤(a)中，所述化合物Q10与乙二醇、催化剂、吸水剂的摩尔比为1：(1～10)：(0.01～0.5)：(1～10)；优选地，为1：3：0.05：3。
步骤(a)中，所述乙二醇保护反应的温度为25～60℃；优选地，为25℃。
步骤(a)中，所述乙二醇保护反应的时间为1～12h；优选地，为1h。
b：氧化反应
化合物Q22的合成类似于路线(J)步骤(k)中Q11的氧化反应方法。
c：Wittig反应
将季磷盐、碱溶于有机溶剂中，向其中滴加Q22的溶液，经Wittig反应得到化合物Q23。
步骤(c)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲苯、石油醚等中的任意一种或多种；优选地，为四氢呋喃。
步骤(c)中，所述季磷盐为(2-羧乙基)三苯基溴化膦。
步骤(c)中，所述碱选自三乙胺、氢氧化钠、六甲基二硅胺钠(NaHDMS)等中的任意一种或多种，优选地，为六甲基二硅胺钠。
步骤(c)中，所述化合物Q22与季磷盐、碱的摩尔比为1：(1～5)：(1～5)；优选地，为1：3.5：3。
步骤(c)中，所述Wittig反应的时间为5～30min；优选地，为10min。
步骤(c)中，所述Wittig反应的温度为-20℃～25℃；优选地，为-20℃。
d：还原反应
化合物Q24的合成类似于路线(L)步骤(b)中Q18的合成方法。
e：脱乙二醇保护基
将化合物Q24溶于有机溶剂中，加入酸，反应得到化合物Q25。
步骤(e)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃等中的一种或多种；优选地，为四氢呋喃。
步骤(e)中，所述酸选自稀硫酸、稀盐酸、盐酸气、对甲苯磺酸等中的一种或多种；优选地，为2mol/L稀盐酸。
步骤(d)中，所述有机溶剂与2mol/L稀盐酸的体积比为1：(1～2)；优选地，为1：1。
步骤(e)中，所述脱乙二醇保护基反应的时间为1～5h；优选地，为4h。
步骤(e)中，所述脱乙二醇保护基反应的温度为0～60℃；优选地，为25℃。
f：还原反应
化合物Q26的合成方法类似于路线(J)步骤(n)中化合物3的还原方法。
g：酰胺化反应
化合物30～32的合成类似于路线(J)步骤(m)中化合物2的合成方法。
所述路线(M)还包含路线(D)、路线(I)，具体如下：
本发明制备方法中，上述反应通过薄板层析法跟踪测定反应的进度，反应完毕后采用的后处理方法包括浓缩、萃取、柱层析分离等步骤，最终产物以核磁共振谱及高分辨质谱来验证。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所述的三环二萜类似物，及药学上可接受的载体。
本发明还提供了所述SMO抑制剂三环二萜类似物或药物组合物在制备SMO抑制剂中的应用。
所述三环二萜类似物或药物组合物用于抑制野生型SMO蛋白和耐药性SMO蛋白(D473H；E518K；N219D；L221R；D384N；S387N)的活性。
本发明还提供了所述三环二萜类似物或药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述三环二萜类似物或药物组合物用于抑制肿瘤的生长、增殖、转移，或用于促进肿瘤的凋亡和灭亡。
所述肿瘤包括髓母细胞瘤、基底细胞癌等。
本发明涉及的三环二萜类似物通过抑制SMO活性从而抑制Hh信号通路，对相关髓母细胞瘤细胞的生长也有较好抑制能力，具有良好的抗肿瘤应用前景。
本发明涉及的抗肿瘤三环二萜类似物及其制备方法的优点包括，在自有化合物库中筛选得到了具有SMO活性的三环二萜先导物，并进行了结构修饰，通过酰胺化、延长碳链等反应合成了一系列结构新颖的三环二萜类似物；本发明提供的化合物不仅可以抑制野生型SMO蛋白，而且可以抑制耐药性SMO蛋白的活性，可解决现有临床上SMO抑制剂的耐药性问题。
附图说明
图1为本发明化合物8对耐药性SMO蛋白的胆固醇修饰的影响及IC50的测定。其中，图a为SMO跨膜区段的拓朴结构图，深灰色为WT序列，浅灰色为突变序列。图b为SMO的D95N突变对SMO抗药突变的胆固醇修饰的影响。图c为化合物8对SMO抗药突变的胆固醇修饰的影响。图d和图e为维莫德吉，索尼德吉以及化合物8对耐药性SMO蛋白的IC50的测定。
图2为本发明化合物8结合SMO蛋白N端的半胱氨酸富集区段。其中，图a为化合物8可以体外抑制SMO和胆固醇的结合。图b为化合物8可以抑制SMO的胆固醇修饰。图c和图d为化合物8不影响Bodipy-Cyclopamine和SMO的结合。图e为化合物8和SMO 7TM抑制剂(维莫德吉，索尼德吉，环靶眀)的联合用药。图f为化合物8抑制SMO和胆固醇结合的模型图。
图3为本发明化合物8抑制小脑神经元祖细胞和髓母细胞瘤细胞的生长。其中，图a为c GNP细胞生长实验的流程图。图b为化合物8抑制小脑神经元祖细胞生长的免疫荧光图片。图c和图d为图b的相关定量分析。图e为化合物8抑制髓母细胞瘤细胞生长的免疫荧光图片。图f和图g为图e的相关定量分析。
图4为本发明化合物8对Hh依赖型的髓母细胞瘤的抑制效果。其中，图a为给药期间肿瘤大小的测定。图b为给药期间小鼠体重的测定。图c和图d为给药后提取的小鼠肿瘤的Gli1 mRNA和蛋白质印迹的结果。图e为给药后提取的小鼠肿瘤的图片。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
下述实施例中化合物结构由核磁共振仪测定；试剂主要由上海国药化学试剂公司提供；产品纯化主要通过柱色谱，硅胶(200-300目)由青岛海洋化工厂生产。
实施例1化合物Q1～Q5的制备
将化合物睾酮(50g，0.173mol)溶于t-BuOH(500mL)，冰浴下，分批加入t-BuOK(58.36g，0.52mol)，缓慢滴加CH3I(64mL，1.04mol)，移去冰浴，加热至45℃搅拌反应4h，TLC检测原料反应完全后，加入1L水搅拌，过滤，滤饼用饱和亚硫酸钠溶液洗涤(50mL)，干燥，得到化合物Q1，未经纯化直接投下一步。
将化合物Q1溶于四氢呋喃(250mL)和乙二醇(100mL)中，加入原甲酸三乙酯(117g，0.790mol)，45℃下，搅拌45min后，加入p-TsOH·H2O(10.5g，0.055mol)，搅拌反应3h，TLC检测原料反应完全后，加入饱和碳酸氢钠调节pH至弱碱性。加入二氯甲烷(500mL)萃取分液，水相用二氯甲烷(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相分别用水(100mL×3)、饱和氯化钠溶液(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，打浆纯化(Et2O：EA＝15mL：15mL)，得化合物Q2(白色固体，30.5g，两步产率48.8％)。
将化合物Q2(5g，13.88mmol)置于高压釜中，四氢呋喃(75mL)和甲醇(25mL)搅拌溶解，加入10％钯碳(1.5g)，密封高压釜，N2置换3次，充氢气至4MPa下搅拌反应48h，TLC检测原料反应完全后，抽滤，滤饼用DCM(20mL×3)洗涤，减压浓缩得到化合物Q3，未经纯化，直接投下一步。
将化合物Q3(4.95g，0.0154mol)溶于四氢呋喃(70mL)和DMSO(35mL)中，加入IBX(8.65g，0.0309mmol)，25℃搅拌反应5h，TLC检测原料反应完全后，加水，抽滤，滤液中加入DCM(100mL)萃取分液，水相用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相。有机相分别用氢氧化钠溶液(10mL×3)、水(10mL×3)、饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到化合物Q4，直接投下一步。
将化合物Q4(5.68g，0.0158mol)溶于二氯甲烷(50mL)中，加入m-CPBA(5.46g，0.0317mol)，NaHCO3(2.9g，0.0348mol)，25℃搅拌反应5h，TLC检测原料反应完全后，加入饱和亚硫酸氢钠溶液淬灭反应至淀粉碘化钾试纸不变色，加入DCM(100mL)萃取分液，水相用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相。有机相分别用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)、水(10mL×3)、饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q5(白色固体，4.1g，三步产率78.8％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.01–3.87(m,4H),2.71–2.50(m,2H),2.03–1.87(m,3H),1.83–1.69(m,2H),1.63–1.58(m,2H),1.54–1.40(m,3H),1.37–1.31(m,3H),1.28(s,4H),1.20–1.11(m,2H),0.94(s,4H),0.92(s,1H),0.85(d,J＝13.9Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.66,113.00,83.37,64.92,64.81,54.87,52.26,46.37,42.02,39.15,37.48,36.21,35.57,31.38,28.67,26.92,22.93,21.44,21.17,20.10,20.07,19.80,14.10.
实施例2化合物Q6～Q7的制备
将化合物Q5(8.55g，22.70mmol)溶于四氢呋喃(80mL)中，于0℃下，缓慢加入LiAlH4(2.58g，67.98mmol)，0℃下搅拌反应0.5h，TLC检测原料反应完全后，分别加入，2.6mL水、5.2mL 15％氢氧化钠溶液，7.8mL水淬灭反应。搅拌0.5h后，过滤，滤液减压浓缩得化合物Q6，未经纯化直接投下一步。
将上述化合物Q6溶于四氢呋喃(80mL)中，加入2mol/L稀盐酸(16mL)，25℃搅拌反应5h，TLC检测反应完全，加入乙酸乙酯(200mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(20mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用水(20mL×3)、饱和氯化钠溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)得到化合物Q7(白色固体，5.91g，81％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.66(d,J＝20.9Hz,2H),2.63–2.46(m,3H),2.37–2.27(m,1H),2.06(d,J＝13.0Hz,1H),1.99–1.90(m,1H),1.73(d,J＝10.8Hz,3H),1.61(t,J＝12.3Hz,2H),1.46–1.38(m,3H),1.32(d,J＝12.4Hz,1H),1.25–1.13(m,3H),1.09(s,3H),1.04(d,J＝9.1Hz,6H),0.97(s,3H),0.94–0.77(m,2H).
实施例3化合物Q8的制备
将化合物Q7(2.1g，6.24mmol)溶于吡啶(20mL)中，冰浴下，缓慢滴加乙酸酐(0.956g，9.36mmol)，搅拌反应18h，TLC检测原料反应完全后，加入2mol/L稀盐酸调节pH为4～5，加入乙酸乙酯(50mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用水(10mL×3)、饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q8(白色固体，1.99g，产率84％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.04(s,2H),2.68–2.53(m,1H),2.41–2.27(m,1H),2.04(s,4H),1.99–1.91(m,1H),1.76(d,J＝12.3Hz,2H),1.63(d,J＝8.8Hz,5H),1.45–1.30(m,4H),1.25–1.12(m,3H),1.07(d,J＝6.7Hz,6H),1.03(s,3H),0.98(s,3H),0.94–0.90(m,1H),0.81(t,J＝11.7Hz,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ217.16,171.26,73.24,64.82,54.93,54.80,53.51,47.60,42.42,40.07,37.97,36.53,34.58,32.64,30.08,25.84,24.60,22.71,22.48,21.79,21.14,21.06,13.93.
实施例4化合物Q9的制备
将化合物Q8(316.9mg，0.837mmol)溶于二氯甲烷(12mL)中，25℃下，加入乙酸酐(0.37mL，4.18mmol)，将0.02mLTMSOTf溶于二氯甲烷(2mL)中，取1mL滴入体系中，25℃下搅拌反应0.5h。TLC检测原料反应完全后，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，DCM(20mL)萃取，分液，水相用DCM(5mL×3)洗涤，合并有机相，有机相分别用水(5mL×3)、饱和氯化钠(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝80：1)得到化合物Q9(无色油状物，148mg，产率43.9％)。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ5.21(dd,J＝6.8,2.0Hz,1H),4.10–3.93(m,2H),2.20–2.11(m,5H),2.09(t,J＝7.2Hz,1H),2.05(d,J＝4.0Hz,3H),2.04–1.97(m,1H),1.97–1.88(m,2H),1.85(dd,J＝16.8,2.0Hz,1H),1.79–1.67(m,2H),1.67–1.61(m,2H),1.59(d,J＝13.3Hz,3H),1.47–1.39(m,1H),1.37–1.31(m,1H),1.26(d,J＝18.2Hz,1H),1.20–1.11(m,1H),1.01(d,J＝4.8Hz,3H),0.96–0.89(m,7H),0.88–0.80(m,1H).
实施例5化合物Q10的制备
将化合物Q9(2.11g，0.0052mol)溶于甲醇(20mL)中，加入碳酸钾(2.90g，0.021mol)，25℃搅拌反应3h，TLC检测原料反应完全后，加2mol/L稀盐酸淬灭反应，乙酸乙酯(50mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤三次，合并有机相。有机相分别用水(10mL×3)、饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝7：1)得到化合物Q10(无色油状物，1.44g，产率86.7％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ3.63(d,J＝4.5Hz,2H),2.66–2.56(m,1H),2.41–2.34(m,1H),2.21–2.14(m,2H),2.12–1.97(m,4H),1.96–1.88(m,1H),1.62(s,6H),1.57–1.51(m,1H),1.49–1.40(m,2H),1.37(dd,J＝12.4,2.8Hz,1H),1.17–1.09(m,1H),1.05(d,J＝13.4Hz,6H),0.96(s,5H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ217.80,132.43,127.62,63.23,54.78,53.38,47.68,38.19,37.77,36.50,34.65,33.58,31.79,31.61,26.07,25.44,23.27,22.35,21.57,19.64,13.99.
实施例6化合物Q11～Q12的制备
将化合物Q10(1.40g，4.4mmol)溶于四氢呋喃(30mL)和DMSO(15mL)中，加入IBX(2.46g，8.8mmol)，25℃下搅拌反应1h，TLC检测原料反应完全后，加水，抽滤。滤液用乙酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(5mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液(5mL×3)、水(5mL×3)、饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到化合物Q11，未经纯化直接投下一步。
将化合物Q11(1.12g，0.0035mol)溶于吡啶(30mL)中，冰浴下，加入四丁基高锰酸铵(2.56g，0.0074mol)，搅拌反应0.5h后，移去冰浴，反应1h，TLC检测原料反应完全后，加入饱和亚硫酸氢钠溶液至反应液紫红色褪去，加入2mol/L稀盐酸调节pH至4～5，加入酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(5mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用水(5mL×3)、饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q12(白色固体，657mg，产率56.6％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ2.65–2.57(m,1H),2.49–2.28(m,5H),2.20–2.13(m,1H),2.07–1.97(m,3H),1.95–1.87(m,1H),1.71–1.64(m,2H),1.63(s,3H),1.51–1.40(m,2H),1.37(dd,J＝12.5,2.8Hz,1H),1.25(s,1H),1.18–1.11(m,1H),1.06(s,3H),1.04(s,3H),0.97(s,3H),0.95–0.92(m,1H).13C NMR(125MHz,)δ202.79,169.18,126.91,125.38,60.42,59.17,54.25,45.95,45.55,44.46,42.85,41.88,41.71,40.30,35.37,34.03,32.88,31.99,31.44,29.68,24.81.
实施例7化合物2的制备
将化合物Q12(50mg，0.15mmol)、HATU(68.7mg，0.18mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入DIPEA(0.04mL，0.225mmol)搅拌均匀，加入甲胺盐酸盐(20.3mg，0.3mmol)，25℃搅拌1h，TLC检测原料反应完全，加入盐酸淬灭反应。用DCM(5mL×3)萃取水相，合并有机相。有机相分别用水(5mL×3)、饱和NaCl溶液(5mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，经减压浓缩后硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物2(白色固体，36.4mg，产率70.2％)。
实施例8化合物3的制备
将化合物Q12(0.9g，0.0026mol)溶于二氯甲烷(15mL)和甲醇(7mL)中，冰浴下，加入硼氢化钠(0.98g，0.026mol)，搅拌反应0.5h，TLC检测原料反应完全后，加入2mol/L稀盐酸调节pH至3～4，乙酸乙酯(20mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(5mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用水(5mL×3)、饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物3(白色固体，870mg，产率96.1％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ3.25(dd,J＝11.6,4.6Hz,1H),2.49–2.29(m,4H),2.20–2.12(m,1H),2.03–1.87(m,3H),1.81–1.76(m,1H),1.73–1.67(m,2H),1.67–1.62(m,4H),1.42–1.34(m,1H),1.27(d,J＝2.6Hz,1H),1.14–1.03(m,2H),0.98(s,3H),0.94–0.89(m,1H),0.89–0.86(m,1H),0.85(dd,J＝6.0,2.2Hz,1H),0.83(s,3H),0.81(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ179.29,131.21,128.74,79.17,54.28,53.90,38.80,37.93,36.92,36.49,33.48,33.27,32.02,28.04,27.54,24.43,21.89,21.72,19.45,15.39,14.26.
实施例9化合物4～25的制备
将化合物3(870mg，2.60mmol)、HATU(1.29g，3.12mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，加入DIPEA(0.7mL，3.9mmol)搅拌均匀，加入相应的胺(5.2mmol)，25℃搅拌1h，TLC检测原料反应完全，加入盐酸淬灭反应。用DCM(20mL×3)萃取水相，合并有机相。有机相分别用水(5mL×3)、饱和NaCl溶液(5mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，经减压浓缩后硅胶柱层析，得到相应的化合物4～25。
化合物4，白色固体，产率40％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ5.52(s,1H),3.21(dd,J＝11.7,4.5Hz,1H),2.79(d,J＝4.8Hz,3H),2.43–2.30(m,2H),2.26–2.20(m,1H),2.17–2.06(m,2H),1.97–1.92(m,1H),1.89(dd,J＝17.3,5.2Hz,1H),1.77–1.73(m,1H),1.71–1.63(m,3H),1.61(d,J＝2.6Hz,3H),1.59–1.56(m,1H),1.37–1.31(m,1H),1.24(s,1H),1.08–0.99(m,2H),0.95(s,3H),0.90–0.86(m,1H),0.84–0.82(m,1H),0.81(d,J＝3.2Hz,1H),0.80(s,3H),0.78(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ173.78,131.97,128.56,79.17,54.41,54.06,38.94,38.15,37.06,36.62,35.71,33.63,32.24,28.17,27.73,26.45,25.35,22.02,21.91,19.63,15.50,14.40.
化合物5，白色固体，产率58.5％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ5.46(s,1H),3.34–3.24(m,2H),3.21(dd,J＝11.7,4.5Hz,1H),2.46–2.39(m,1H),2.36–2.29(m,1H),2.26–2.18(m,1H),2.18–2.06(m,2H),2.03–1.89(m,3H),1.80–1.73(m,2H),1.72–1.64(m,3H),1.62(s,3H),1.38–1.32(m,1H),1.25(d,J＝2.9Hz,1H),1.12(t,J＝7.3Hz,3H),1.08–1.00(m,2H),0.96(s,3H),0.91–0.86(m,1H),0.84(dd,J＝3.5,1.9Hz,1H),0.80(s,3H),0.78(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ172.97,132.01,128.62,79.18,54.42,54.07,38.95,38.04,37.06,36.63,35.70,34.46,33.67,32.24,28.17,27.74,25.26,22.03,21.92,19.69,15.50,15.03,14.41.
化合物6，白色固体，产率65.9％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.75(t,J＝5.7Hz,1H),4.33(d,J＝5.1Hz,1H),3.04–2.97(m,2H),2.97–2.86(m,1H),2.32–2.23(m,1H),2.16–2.09(m,2H),2.09–2.04(m,1H),2.00–1.89(m,3H),1.86–1.79(m,1H),1.66(t,J＝3.6Hz,1H),1.65–1.57(m,3H),1.55(s,3H),1.53–1.45(m,2H),1.42–1.33(m,3H),1.02–0.91(m,3H),0.87(s,3H),0.82(t,J＝7.4Hz,3H),0.78(s,1H),0.76(s,3H),0.68(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.70,132.29,126.67,76.92,53.92,53.52,40.21,38.47,37.43,36.58,34.74,33.08,31.70,28.19,27.44,25.12,22.45,21.59,21.40,19.30,15.82,14.10,11.43.
化合物7，白色固体，产率60.6％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.74(t,J＝5.9Hz,1H),4.32(d,J＝5.1Hz,1H),3.05–2.98(m,1H),2.93–2.87(m,1H),2.83–2.76(m,1H),2.35–2.28(m,1H),2.19–2.08(m,3H),2.05–1.99(m,1H),1.98–1.89(m,2H),1.86–1.79(m,1H),1.69–1.59(m,5H),1.56(s,3H),1.53–1.47(m,2H),1.38–1.30(m,1H),1.03–0.93(m,3H),0.88(s,3H),0.82(d,J＝6.7Hz,6H),0.79–0.76(m,4H),0.69(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.79,132.28,126.65,76.93,53.92,53.51,45.95,38.48,37.31,36.58,36.10,34.67,33.11,31.70,28.20,28.13,27.45,25.12,21.59,21.38,20.12,19.34,15.83,14.11.
化合物8，白色固体，产率50.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(s,1H),4.33(d,J＝4.7Hz,1H),2.99(s,3H),2.34–2.22(m,1H),2.19–2.02(m,3H),2.00–1.88(m,3H),1.87–1.79(m,1H),1.62(q,J＝9.7,6.2Hz,3H),1.55(s,3H),1.49(q,J＝6.5,5.5Hz,2H),1.33(q,J＝7.0,6.4Hz,3H),1.25(q,J＝7.3,6.8Hz,2H),1.02–0.91(m,2H),0.90–0.81(m,6H),0.76(s,6H),0.68(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.04,131.98,128.56,79.10,54.37,54.01,39.33,38.91,37.96,37.02,36.58,35.65,33.65,32.19,31.84,28.15,27.69,25.23,21.99,21.86,20.18,19.67,15.49,14.37,13.88.
化合物9，白色固体，产率68.3％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.71(t,J＝5.7Hz,1H),3.20(s,1H),3.06–2.92(m,3H),2.32–2.25(m,1H),2.18–2.10(m,2H),2.10–2.04(m,1H),2.00–1.89(m,3H),1.86–1.80(m,1H),1.67–1.58(m,3H),1.55(s,3H),1.50(s,2H),1.39–1.33(m,3H),1.30–1.19(m,4H),1.02–0.92(m,2H),0.88–0.84(m,6H),0.82–0.72(m,6H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.64,132.29,126.64,76.91,53.91,53.51,38.46,38.36,37.39,36.58,36.08,34.72,33.09,31.69,28.89,28.62,28.17,27.43,25.05,21.87,21.58,21.39,19.29,15.80,14.09,13.90.
化合物10，白色固体，产率96.1％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.71(t,J＝5.6Hz,1H),4.31(dd,J＝5.2,1.8Hz,1H),3.08–2.92(m,3H),2.69(d,J＝1.8Hz,1H),2.32–2.23(m,1H),2.18–2.10(m,2H),2.10–2.04(m,1H),2.00–1.89(m,3H),1.86–1.79(m,1H),1.68–1.59(m,3H),1.55(s,3H),1.50(t,J＝5.7Hz,2H),1.37–1.33(m,2H),1.29–1.21(m,6H),1.02–0.90(m,3H),0.91–0.85(m,5H),0.84(d,J＝1.9Hz,1H),0.80–0.74(m,5H),0.68(s,3H).13CNMR(150MHz,DMSO)δ171.62,132.31,126.63,76.90,53.90,53.51,38.45,38.38,37.39,36.57,36.07,34.72,33.07,31.68,31.02,29.15,28.17,27.43,26.07,25.05,22.04,21.58,21.38,19.28,15.79,14.09,13.90.
化合物11，无色油状物，产率75.9％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.70(t,J＝5.7Hz,1H),4.30(s,1H),3.07–2.91(m,3H),2.33–2.25(m,1H),2.18–2.10(m,2H),2.10–2.03(m,1H),2.00–1.89(m,3H),1.83(dd,J＝16.4,5.0Hz,1H),1.67–1.58(m,4H),1.55(s,3H),1.50–1.48(m,1H),1.38–1.33(m,3H),1.28–1.19(m,10H),0.98–0.93(m,2H),0.87(d,J＝5.4Hz,3H),0.85(d,J＝7.1Hz,2H),0.79–0.77(m,1H),0.76(s,4H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.63,132.30,126.63,76.90,53.90,53.51,38.46,38.37,37.39,36.57,36.08,34.71,33.08,31.69,31.24,29.19,28.44,28.17,27.43,26.36,25.04,22.06,21.58,21.39,19.29,15.80,14.10,13.94.
化合物12，无色油状物，产率30％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.71(t,J＝5.6Hz,1H),4.31(d,J＝5.1Hz,1H),3.09–2.89(m,3H),2.36–2.22(m,1H),2.19–2.03(m,3H),2.01–1.88(m,3H),1.87–1.78(m,1H),1.68–1.57(m,3H),1.55(s,3H),1.52–1.45(m,2H),1.39–1.32(m,3H),1.27–1.20(m,11H),1.00–0.92(m,2H),0.87(d,J＝3.9Hz,3H),0.85(d,J＝7.1Hz,2H),0.81–0.74(m,6H),0.68(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.63,132.29,126.62,76.91,53.91,53.51,38.45,38.38,37.39,36.58,36.07,34.72,33.09,31.69,31.26,29.19,28.77,28.67,28.16,27.43,26.41,25.04,22.11,21.59,21.40,19.28,15.78,14.09,13.93.
化合物13，无色油状物，产率55％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ5.45(d,J＝6.7Hz,1H),3.29–3.12(m,3H),2.47–2.39(m,1H),2.37–2.29(m,1H),2.27–2.20(m,1H),2.18–2.08(m,2H),2.02–1.87(m,3H),1.79–1.73(m,1H),1.69–1.65(m,3H),1.62(s,3H),1.59(d,J＝3.6Hz,1H),1.47(t,J＝7.1Hz,3H),1.40–1.32(m,2H),1.30–1.24(m,11H),1.08–1.02(m,2H),0.96(s,3H),0.89–0.87(m,2H),0.87–0.85(m,1H),0.85–0.83(m,1H),0.83–0.81(m,1H),0.81(s,3H),0.78(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.02,132.02,128.59,79.14,54.41,54.06,39.67,38.94,38.00,37.05,36.61,35.69,33.68,32.23,31.97,29.79,29.62,29.44,29.36,28.16,27.73,27.06,25.26,22.77,22.02,21.91,19.69,15.49,14.40,14.22.
化合物14，无色油状物，产率54.8％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.47(d,J＝5.8Hz,1H),3.21(q,J＝6.2Hz,3H),2.48–2.29(m,2H),2.28–2.06(m,3H),2.05–1.92(m,2H),1.93–1.85(m,1H),1.78–1.72(m,2H),1.69–1.65(m,2H),1.62(s,3H),1.50–1.43(m,2H),1.42–1.33(m,2H),1.33–1.26(m,7H),1.25(s,8H),1.03(t,J＝8.8Hz,2H),0.96(s,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,4H),0.84(s,1H),0.80(s,3H),0.78(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.02,132.01,128.53,79.09,54.39,54.03,39.65,38.91,37.98,37.04,36.59,35.66,33.66,32.20,31.98,29.76,29.64,29.42,29.40,28.15,27.70,27.05,25.24,22.77,22.00,21.88,19.66,15.48,14.37,14.21.
化合物15，无色油状物，产率43％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.49(t,J＝5.7Hz,1H),3.29–3.12(m,3H),2.47–2.37(m,1H),2.37–2.27(m,1H),2.27–2.18(m,1H),2.17–2.08(m,2H),2.03–1.87(m,3H),1.83–1.70(m,3H),1.69–1.64(m,3H),1.61(s,3H),1.45(q,J＝7.0Hz,2H),1.36(dd,J＝13.0,3.7Hz,1H),1.27(d,J＝5.3Hz,5H),1.24(s,13H),1.07–1.01(m,2H),0.96(s,3H),0.87(t,J＝6.9Hz,4H),0.84–0.82(m,1H),0.80(s,3H),0.78(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.01,132.02,128.57,79.13,54.41,54.05,39.66,38.93,37.99,37.05,36.61,35.68,33.68,32.22,32.02,29.78,29.76,29.74,29.70,29.66,29.46,29.44,28.16,27.72,27.06,25.26,22.79,22.02,21.90,19.68,15.49,14.39,14.23.
化合物16，白色固体，产率97％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ4.31(d,J＝5.2Hz,1H),3.45–3.40(m,1H),3.40–3.34(m,3H),3.02–2.97(m,1H),2.33–2.21(m,2H),2.21–2.14(m,2H),2.10–2.05(m,1H),1.94(q,J＝7.5,4.0Hz,2H),1.88–1.81(m,1H),1.65–1.59(m,2H),1.59–1.53(m,5H),1.52–1.44(m,4H),1.42–1.37(m,2H),1.35–1.28(m,1H),1.28–1.21(m,2H),1.02–0.93(m,2H),0.87(s,3H),0.81(dd,J＝12.1,4.3Hz,1H),0.78–0.75(m,4H),0.68(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ170.06,132.41,126.77,76.91,53.89,53.48,46.01,41.85,38.46,37.58,36.58,36.07,33.02,31.72,31.58,28.19,27.43,26.18,25.29,24.70,24.08,21.57,21.37,19.27,15.80,14.10.
化合物17，白色固体，产率99％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ4.30(s,1H),3.56–3.51(m,4H),3.42(d,J＝11.1Hz,4H),3.00(dd,J＝9.5,6.5Hz,1H),2.69(s,1H),2.34–2.28(m,1H),2.28–2.23(m,1H),2.22–2.16(m,2H),2.07(dd,J＝12.6,3.5Hz,1H),1.98–1.90(m,2H),1.85(dd,J＝16.1,5.1Hz,1H),1.64–1.59(m,2H),1.56(s,3H),1.52–1.46(m,2H),1.40–1.31(m,1H),1.28–1.17(m,1H),1.03–0.91(m,2H),0.87(s,3H),0.81(dd,J＝12.6,4.0Hz,1H),0.77(s,4H),0.68(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ170.70,132.30,126.83,76.91,66.16,66.09,53.89,53.47,45.43,41.41,38.46,37.55,36.57,36.07,33.02,31.70,31.26,28.19,27.43,24.40,21.56,21.38,19.28,15.80,14.10.
化合物18，白色固体，产率99％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ4.44(d,J＝13.0Hz,1H),4.32(d,J＝5.1Hz,1H),3.89(d,J＝13.5Hz,1H),3.46–3.23(m,2H),3.05–2.91(m,2H),2.59(s,3H),2.49–2.44(m,1H),2.31(dd,J＝14.1,8.0Hz,1H),2.28–2.21(m,1H),2.21–2.14(m,2H),2.08(d,J＝12.5Hz,1H),1.99–1.91(m,2H),1.88–1.70(m,3H),1.67–1.45(m,12H),1.41(s,2H),1.34(dd,J＝12.9,3.4Hz,1H),1.27(d,J＝40.2Hz,2H),1.04–0.92(m,2H),0.88(s,3H),0.86–0.81(m,1H),0.80–0.74(m,5H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ170.13,132.38,132.33,126.82,76.91,61.88,53.89,53.49,53.46,49.44,48.58,44.33,40.37,40.06,38.46,37.66,37.52,36.58,36.07,33.03,31.72,31.53,31.45,28.19,27.43,24.62,21.58,21.37,19.28,15.80,14.10.
化合物19，淡黄色固体，产率63.5％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.48(d,J＝8.1Hz,2H),7.31(t,J＝7.8Hz,3H),7.09(t,J＝7.4Hz,1H),3.22(dd,J＝11.7,4.4Hz,1H),2.59–2.50(m,1H),2.48–2.39(m,2H),2.37–2.28(m,1H),2.18(dd,J＝12.9,3.5Hz,1H),2.02(d,J＝13.3Hz,2H),1.94(dd,J＝17.0,4.7Hz,1H),1.80–1.73(m,1H),1.71–1.69(m,1H),1.69–1.67(m,1H),1.66(s,3H),1.62(q,J＝4.0Hz,1H),1.40–1.34(m,1H),1.25(s,1H),1.11–1.01(m,2H),0.97(s,3H),0.95–0.91(m,1H),0.87–0.83(m,2H),0.80(s,3H),0.79(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ171.38,138.15,131.85,129.33,129.15,124.27,119.77,79.19,54.41,54.07,38.96,38.01,37.06,36.64,36.54,33.75,32.28,28.18,27.74,25.04,22.03,21.95,19.77,15.50,14.41.
化合物20，白色固体，产率54％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.69(s,1H),7.53–7.42(m,2H),6.95–6.77(m,2H),4.32(d,J＝5.1Hz,1H),3.70(s,3H),3.06–2.96(m,1H),2.42–2.34(m,1H),2.33–2.22(m,2H),2.22–2.16(m,2H),1.96(q,J＝15.2,13.5Hz,2H),1.87–1.80(m,1H),1.67–1.55(m,6H),1.52–1.43(m,2H),1.39–1.28(m,1H),1.03–0.92(m,2H),0.88(s,3H),0.86–0.82(m,1H),0.80–0.76(m,2H),0.75(s,3H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ170.44,154.96,132.54,132.14,126.96,120.57,120.46,113.73,113.71,76.92,55.11,53.92,53.53,38.47,37.52,36.57,36.08,35.61,33.08,31.73,28.17,27.44,24.91,21.60,21.41,19.33,15.80,14.08.
化合物21，白色固体，产率80.3％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.08(s,1H),7.81(d,J＝2.2Hz,1H),7.43(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),7.30(t,J＝8.1Hz,1H),7.06(dd,J＝7.9,2.1Hz,1H),4.30(s,1H),3.00(dd,J＝9.7,6.2Hz,1H),2.42–2.32(m,2H),2.29–2.20(m,2H),2.16(dd,J＝12.6,3.6Hz,1H),1.99–1.90(m,2H),1.83(dd,J＝16.8,5.0Hz,1H),1.66–1.57(m,6H),1.53–1.44(m,2H),1.36–1.28(m,1H),0.99–0.91(m,2H),0.87(s,3H),0.84–0.81(m,1H),0.80–0.72(m,5H),0.68(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.43,140.78,132.99,131.97,130.31,127.17,122.60,118.50,117.35,76.92,53.91,53.52,38.46,37.51,36.56,36.07,35.78,33.08,31.72,28.17,27.44,24.67,21.59,21.39,19.33,15.79,14.05.
化合物22，白色固体，产率58.3％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,1H),7.95(t,J＝2.0Hz,1H),7.48–7.45(m,1H),7.27–7.18(m,2H),4.31(d,J＝5.1Hz,1H),3.04–2.96(m,1H),2.44–2.31(m,2H),2.30–2.20(m,2H),2.19–2.13(m,1H),1.99–1.90(m,2H),1.87–1.80(m,1H),1.66–1.57(m,6H),1.52–1.46(m,2H),1.37–1.28(m,1H),1.00–0.93(m,2H),0.88(s,3H),0.83(dd,J＝13.2,3.9Hz,1H),0.79–0.75(m,2H),0.74(s,3H),0.68(s,3H).13CNMR(150MHz,DMSO)δ171.39,140.89,131.96,130.64,127.18,125.52,121.49,121.36,117.73,76.91,53.90,53.51,38.46,37.49,36.56,36.07,35.79,33.07,31.72,28.17,27.43,24.66,21.59,21.39,19.32,15.79,14.05.
化合物23，白色固体，产率89.7％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.75(s,1H),7.43(s,1H),7.38(d,J＝8.2Hz,1H),7.17(t,J＝7.8Hz,1H),6.86(d,J＝7.6Hz,1H),4.32(s,1H),3.04–2.97(m,1H),2.55(q,J＝7.6Hz,2H),2.42–2.29(m,2H),2.29–2.15(m,3H),1.96(q,J＝15.2,11.9Hz,2H),1.84(dd,J＝17.1,4.9Hz,1H),1.67–1.62(m,2H),1.59(s,3H),1.53–1.46(m,2H),1.38–1.29(m,1H),1.24(d,J＝14.3Hz,1H),1.15(t,J＝7.6Hz,3H),1.01–0.93(m,2H),0.88(s,3H),0.84(dd,J＝13.0,3.2Hz,1H),0.76(d,J＝17.6Hz,5H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ170.94,144.11,139.33,132.15,128.51,127.02,122.46,118.44,116.53,76.92,53.91,53.54,39.52,37.54,36.57,36.08,35.78,33.07,31.73,28.27,28.18,27.43,24.84,21.60,21.39,19.32,15.80,15.52,14.07.
化合物24，白色固体，产率73.7％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.22(t,J＝6.0Hz,1H),7.14(d,J＝8.2Hz,2H),6.86(d,J＝8.1Hz,2H),4.33(d,J＝5.2Hz,1H),4.25–4.07(m,2H),3.72(s,3H),3.03–2.93(m,1H),2.37–2.27(m,1H),2.21–2.09(m,3H),2.11–2.00(m,2H),1.94(t,J＝12.5Hz,2H),1.86–1.79(m,1H),1.61(d,J＝14.6Hz,2H),1.55(s,3H),1.50(d,J＝9.0Hz,2H),1.35–1.28(m,1H),1.24(d,J＝11.3Hz,1H),0.96(dd,J＝12.6,5.1Hz,2H),0.87(s,3H),0.80–0.72(m,5H),0.68(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.76,158.15,132.19,131.65,128.51,126.81,113.63,76.93,55.06,53.92,53.51,41.44,39.52,37.38,36.58,36.10,34.63,33.09,31.70,28.21,27.45,25.11,21.59,21.37,19.33,15.84,14.11.
化合物25，淡黄色固体，产率66.6％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.97(s,1H),9.72(s,1H),7.95(s,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,1H),7.23(t,J＝2.7Hz,1H),7.01(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),6.33(t,J＝2.4Hz,1H),4.32(d,J＝5.1Hz,1H),3.04–2.97(m,1H),2.46–2.39(m,1H),2.39–2.33(m,1H),2.30(d,J＝12.2Hz,1H),2.26(t,J＝4.2Hz,1H),2.25–2.20(m,1H),2.04–1.92(m,2H),1.84(dd,J＝16.8,4.8Hz,1H),1.67–1.59(m,6H),1.54–1.47(m,2H),1.41–1.32(m,1H),1.01–0.92(m,2H),0.89(s,3H),0.84(dd,J＝12.5,3.8Hz,1H),0.81–0.75(m,5H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ170.51,135.90,133.52,132.22,126.93,124.71,123.69,119.64,112.29,102.11,100.86,76.95,53.94,53.56,38.48,37.51,36.59,36.10,35.78,33.11,31.76,28.20,27.45,24.98,21.63,21.44,19.38,15.82,14.12.
实施例10化合物Q13～Q14的制备
将化合物Q10(2.46g，7.72mmol)溶于二氯甲烷(75mL)中，加入三乙胺(4.3mL，30.89mmol)。冰浴下，加入甲磺酰氯(1.8mL，23.17mmol)，搅拌反应1h，TLC检测原料反应完全后，加水淬灭，二氯甲烷(50mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤三次，合并有机相。有机相分别用饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(DCM：CH3OH＝100：1)得到化合物Q13(无色油状物，2.94g，产率96％)。
将化合物Q13(808mg,2.04mmol)溶于乙腈(20mL)，加入TMSCN(0.4mL，3.06mmol)，TBAF·3H2O(965.5mg，3.06mmol)，82℃下搅拌反应30min，TLC检测原料反应完全后，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝10：1)得到化合物Q14(无色油状物，389mg，产率58.3％)。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ2.66–2.56(m,1H),2.41–2.35(m,1H),2.33–2.27(m,2H),2.25–2.18(m,2H),2.15–2.10(m,1H),2.04–1.98(m,2H),1.97–1.94(m,1H),1.78–1.72(m,1H),1.71–1.65(m,2H),1.64–1.61(m,3H),1.50–1.46(m,1H),1.45–1.42(m,1H),1.41(s,1H),1.36(dd,J＝12.5,2.8Hz,1H),1.13(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),1.06(s,3H),1.03(s,3H),0.97(s,3H),0.96–0.94(m,1H),0.94–0.92(m,1H),0.89–0.81(m,1H).
实施例11化合物Q15的制备
将化合物Q14(1.48g，4.5mmol)溶于乙二醇(11mL)，加入4mol/L氢氧化钾溶液(21mL)，170℃下，反应12h，TLC检测原料反应完全后，待反应冷却至室温，加2mol/L稀盐酸调节pH至1～2，析出白色固体，乙酸乙酯(40mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q15(无色油状物，736mg，产率49％)。
实施例12化合物Q16的制备
将化合物Q15(595mg，1.72mmol)溶于二氯甲烷(10mL)和甲醇(5mL)，冰浴下，加入硼氢化钠(649.6mg，17.2mmol)，搅拌反应0.5h，TLC检测原料反应完全后，加入2mol/L稀盐酸调pH至4～5，乙酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q16(无色油状物，287mg，产率48％)。
实施例13化合物26的制备
将化合物Q16(46mg，0.132mmol)、HATU(60.3mg，0.159mmol)溶于四氢呋喃(1mL)和二氯甲烷中(1mL)，加入DIPEA(0.04mL，0.26mmol)搅拌均匀，加入正己胺(0.03mL，0.264mmol)，25℃搅拌反应1h，TLC检测原料反应完全后，加入2mol/L稀盐酸淬灭反应，DCM(15mL)萃取，分液，水相用DCM(5mL×3)洗涤，合并有机相。有机相用饱和氯化钠(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物26(白色固体，36mg，产率63.3％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ4.31(d,J＝5.2Hz,1H),3.05–2.95(m,3H),2.11(dd,J＝12.6,3.5Hz,1H),2.04–1.79(m,7H),1.68–1.58(m,3H),1.54(d,J＝1.7Hz,4H),1.52–1.46(m,2H),1.36(p,J＝7.3Hz,3H),1.29(d,J＝6.0Hz,1H),1.28–1.20(m,7H),1.04–0.92(m,2H),0.89–0.83(m,6H),0.82–0.73(m,6H),0.68(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.07,132.67,127.60,79.17,54.41,54.06,39.66,38.92,37.97,37.07,36.82,36.61,33.65,32.20,31.61,29.78,28.72,28.16,27.74,26.72,24.73,22.66,22.03,21.96,19.70,15.49,14.39,14.13.
实施例14化合物Q17～Q18的制备
将NaH(246.9mg，10.29mmol)加入无水四氢呋喃(20mL)中，氮气保护，冰浴下加入膦酰基乙酸三乙酯(2.04mL，10.29mmol)，再加入5mL的化合物Q11(592mg，1.87mmol)的四氢呋喃溶液，冰浴下搅拌反应20min，TLC检测原料反应完全后，加入5mL饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤三次，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得化合物Q17(无色油状物，582mg)，直接进行下一步。
将化合物Q17(582mg，1.61mmol)溶于四氢呋喃(12mL)中，加入58.2mg 10％Pd/C，氮气置换3次，氢气压力为1atm，25℃下搅拌反应1h，TLC检测原料反应完全后，抽滤，滤液减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝10：1)得到化合物Q18(无色油状物，434mg，产率74％)。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ4.09(q,J＝7.2Hz,2H),2.62–2.51(m,1H),2.38–2.31(m,1H),2.26(q,J＝6.9,6.3Hz,2H),2.13–2.07(m,1H),2.04–1.92(m,4H),1.91–1.84(m,1H),1.66–1.49(m,7H),1.45–1.35(m,3H),1.34(dd,J＝5.8,2.5Hz,1H),1.28–1.17(m,5H),1.14–1.07(m,1H),1.02(d,J＝5.2Hz,3H),1.00(s,3H),0.97(d,J＝2.1Hz,1H),0.93(s,3H),0.91–0.88(m,1H).
实施例15化合物Q19的制备
将化合物Q18(434mg，1.117mmol)溶于二氯甲烷(4mL)和甲醇(2mL)中，冰浴下加入硼氢化钠(422.5mg，11.17mmol)，搅拌反应0.5h，TLC检测原料反应完全后，加入2mol/L稀盐酸淬灭反应，DCM(20mL)萃取，分液，水相用DCM(5mL×3)洗涤，合并有机相，有机相分别用饱和碳酸氢钠(5mL×3)、水(5mL×3)、饱和氯化钠(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝10：1)得到化合物Q19(无色油状物，346mg，产率79.3％)。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ4.10(q,J＝7.2,3.1Hz,2H),3.19(dd,J＝11.6,4.5Hz,1H),2.27(q,J＝7.8Hz,2H),2.12–2.05(m,1H),2.04–1.82(m,4H),1.76–1.71(m,1H),1.70–1.55(m,9H),1.42–1.29(m,2H),1.28–1.20(m,4H),1.20–1.09(m,1H),1.08–0.97(m,2H),0.94(s,3H),0.85(dd,J＝12.7,4.1Hz,1H),0.83–0.80(m,1H),0.80(s,1H),0.78(s,3H),0.76(s,3H).
实施例16化合物Q20的制备
将化合物Q19(274mg，0.7mmol)溶于甲醇(3mL)中，加入氢氧化钠(28mg，7.01mmol)，25℃搅拌反应9h，TLC检测原料反应完全后，加入2mol/L稀盐酸调节pH至4～5，乙酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤三次，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝4：1)得到化合物Q20(白色固体，160mg，产率63％)。
实施例17化合物27～29的制备
将化合物Q20(40mg，0.11mmol)、HATU(83.90mg，0.22mmol)溶于1mL二氯甲烷和1mL四氢呋喃中，加入DIPEA(0.04mL，0.24mmol)搅拌均匀，加入相应的胺(0.22mmol)25℃搅拌1h，TLC检测原料反应完全，加入盐酸淬灭反应。用DCM(10mL×3)萃取水相，合并有机相。有机相分别用水(10mL)、饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压浓缩后硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)，得到相应的化合物27～29。
化合物27，白色固体，产率86.9％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.70(t,J＝5.6Hz,1H),4.31(d,J＝5.1Hz,1H),3.08–2.95(m,3H),2.11–2.01(m,3H),2.00–1.75(m,5H),1.69–1.58(m,3H),1.54(d,J＝1.7Hz,3H),1.52–1.42(m,4H),1.38–1.33(m,2H),1.32(t,J＝3.9Hz,1H),1.30–1.23(m,3H),1.20–1.10(m,1H),1.03–0.91(m,2H),0.89–0.83(m,6H),0.81–0.72(m,6H),0.68(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.81,132.96,125.85,76.90,53.91,53.52,38.44,38.02,37.66,36.58,36.03,35.32,33.02,31.79,31.35,28.56,28.14,27.76,27.42,25.61,21.64,21.46,19.57,19.30,15.76,14.06,13.67.
化合物28，白色固体，产率99.7％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.71(t,J＝5.6Hz,1H),4.31(d,J＝5.1Hz,1H),3.04–2.95(m,3H),2.11–1.83(m,7H),1.63(dd,J＝18.1,13.4Hz,3H),1.57–1.52(m,3H),1.53–1.39(m,5H),1.36(t,J＝7.0Hz,2H),1.30–1.21(m,8H),1.15(d,J＝7.3Hz,1H),1.01–0.92(m,2H),0.90–0.83(m,6H),0.81–0.72(m,6H),0.68(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.80,132.97,125.88,76.90,53.90,53.52,38.45,38.34,37.65,36.58,36.04,35.30,33.01,31.80,31.04,29.19,28.56,28.16,27.70,27.42,26.10,25.60,22.08,21.65,21.45,19.32,15.79,14.07,13.92.
化合物29，无色油状物，产率67％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.43(q,J＝6.9,5.8Hz,1H),3.28–3.15(m,3H),2.16(t,J＝7.6Hz,2H),2.12–2.07(m,1H),2.05–1.84(m,4H),1.78–1.72(m,1H),1.73–1.55(m,10H),1.51–1.45(m,2H),1.42–1.35(m,2H),1.31–1.23(m,11H),1.10–0.99(m,2H),0.97(d,J＝8.2Hz,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,4H),0.83(d,J＝2.5Hz,1H),0.81(d,J＝5.8Hz,4H),0.78(s,3H).
实施例18化合物Q21的制备
将化合物Q10(500mg，1.57mmol)溶于甲苯(4mL)，再加入乙二醇(0.26mL，4.7mmol)，原甲酸三乙酯(0.78mL，4.7mmol)，搅拌20min后，加入一水合对甲苯磺酸(13.5mg，0.078mmol)，搅拌1h，TLC检测原料反应完全后，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，DCM(20mL)萃取，分液，水相用DCM(5mL×3)洗涤，合并有机相，有机相分别用水(5mL×3)、饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝10：1)得到化合物Q21(无色油状物，381mg，产率67％)。
实施例19化合物Q22～Q23的制备
将化合物Q21(381mg，1.05mmol)溶于DMSO(2mL)和四氢呋喃(2mL)，加入IBX(588.9mg，2.10mmol)，25℃搅拌1h，TLC检测原料反应完全后，加水，抽滤。滤液用乙酸乙酯(20mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(5mL×3)洗涤，合并有机相。有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液(5mL×3)、水(5mL×3)、饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝20：1)得到化合物Q22(无色油状物，300mg，产率79.2％)。
将(2-羧乙基)三苯基溴化膦(927.9mg，2.234mmol)加入四氢呋喃(10mL)中形成悬浊液，氮气保护，-20℃下，加入NaHDMS(0.96mL，1.975mmol)，搅拌至橙黄色，加入Q22(230mg，0.638mmol)的10mL四氢呋喃的溶液，溶液黄色褪去，TLC检测原料反应完全后，加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤三次，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q23(无色油状物，255mg，产率96％)。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ5.64–5.55(m,1H),5.55–5.43(m,1H),4.03–3.80(m,4H),3.20–3.02(m,2H),2.13–2.07(m,3H),2.07–2.00(m,1H),1.99–1.92(m,2H),1.91–1.79(m,2H),1.68–1.62(m,2H),1.60–1.55(m,3H),1.55–1.49(m,1H),1.39–1.35(m,1H),1.34–1.29(m,3H),1.28(s,1H),1.27–1.24(m,1H),1.10–1.00(m,1H),0.96–0.91(m,4H),0.87–0.79(m,6H).
实施例20化合物Q24～Q25的制备
将化合物Q23(295mg，0.708mmol)溶于四氢呋喃(6mL)中，加入29.5mg 10％Pd/C，氢气压力为1atm，25℃下搅拌反应1h，TLC检测原料反应完全后，过滤，滤液减压浓缩得化合物Q24，未经纯化直接进行下一步。
将化合物Q24溶于四氢呋喃(4mL)中，加入2mol/L稀盐酸(4mL)，25℃搅拌反应4h，TLC检测原料反应完全后，乙酸乙酯(30mL)萃取，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)洗涤三次，合并有机相。有机相分别用饱和碳酸氢钠(10mL×3)、水(10mL×3)、饱和氯化钠溶液(10mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝6：1)得到化合物Q25(无色油状物，197.5mg，两步产率74％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ2.68–2.56(m,1H),2.39–2.32(m,2H),2.17–2.11(m,1H),2.08–1.95(m,4H),1.91(dd,J＝16.4,5.3Hz,1H),1.74–1.61(m,4H),1.59(d,J＝1.6Hz,3H),1.52–1.40(m,3H),1.39–1.33(m,2H),1.32(s,1H),1.29–1.24(m,2H),1.13(dd,J＝12.1,5.3Hz,1H),1.06(d,J＝3.5Hz,3H),1.04(s,3H),1.00(s,1H),0.97(s,3H),0.95–0.90(m,2H).
实施例21化合物Q26的制备
将化合物Q25(183mg，0.489mmol)溶于二氯甲烷(6mL)和甲醇(3mL)，冰浴下，加入硼氢化钠(185mg，4.89mmol)，搅拌反应5min，TLC检测原料反应完全后，加水淬灭反应，2mol/L稀盐酸调节pH至4～5，二氯甲烷(15mL)萃取，分液，水相用二氯甲烷(5mL×3)洗涤，合并有机相，有机相分别用水(5mL×3)、饱和氯化钠(5mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压浓缩硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)得到化合物Q26(白色固体，110mg，产率59.8％)。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ3.23(dd,J＝11.7,4.5Hz,1H),2.34(t,2H),2.14–2.08(m,1H),2.03–1.84(m,4H),1.79–1.74(m,1H),1.69–1.60(m,5H),1.58(d,J＝1.9Hz,3H),1.39–1.36(m,1H),1.35(d,J＝4.0Hz,1H),1.33(s,2H),1.28(s,2H),1.25(s,1H),1.08–1.00(m,2H),0.97(d,J＝9.0Hz,3H),0.90–0.85(m,1H),0.84(d,J＝2.4Hz,1H),0.82(d,J＝2.5Hz,1H),0.81(s,3H),0.79(s,3H).
实施例22化合物30～32的制备
将化合物Q26(40mg，0.106mmol)溶于二氯甲烷(1mL)和四氢呋喃(1mL)中，加入HATU(48.5mg，0.128mmol)，DIPEA(0.04mL，0.213mmol)搅拌均匀，再加入相应的胺(0.213mmol)，25℃搅拌反应1h，TLC检测原料反应完全，加入盐酸淬灭反应。用二氯甲烷(10mL×3)萃取水相，合并有机相。有机相分别用水(10mL)、饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压浓缩后硅胶柱层析，得到相应的化合物30～32。
化合物30，白色固体，产率87.1％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.70(t,J＝5.6Hz,1H),4.31(d,J＝5.1Hz,1H),3.08–2.91(m,3H),2.10–2.05(m,1H),2.02(t,J＝7.3Hz,2H),1.99–1.89(m,3H),1.84(dd,J＝17.1,4.9Hz,1H),1.68–1.58(m,3H),1.54(s,3H),1.51–1.42(m,4H),1.38–1.32(m,3H),1.30(dd,J＝9.2,3.7Hz,1H),1.28–1.22(m,3H),1.22–1.13(m,3H),1.02–0.89(m,3H),0.91–0.83(m,6H),0.79–0.73(m,5H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.86,133.05,125.83,76.93,53.92,53.54,38.47,38.02,37.66,36.60,36.06,35.41,33.04,31.83,31.31,28.89,28.68,28.18,27.94,27.44,25.27,21.64,21.49,19.56,19.33,15.81,14.09,13.68.
化合物31，无色油状物，产率50.5％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.70(t,J＝5.6Hz,1H),4.31(s,1H),3.00(q,J＝6.7Hz,3H),2.08(dd,J＝12.7,3.8Hz,1H),2.02(t,J＝7.2Hz,2H),1.98–1.88(m,3H),1.84(dd,J＝17.1,4.9Hz,1H),1.68–1.57(m,3H),1.54(s,3H),1.52–1.42(m,4H),1.39–1.32(m,3H),1.31–1.29(m,1H),1.28–1.21(m,8H),1.19–1.13(m,2H),1.03–0.90(m,2H),0.86(s,6H),0.81(d,J＝4.1Hz,1H),0.80–0.73(m,5H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.81,133.04,125.81,76.90,53.91,53.52,38.45,38.31,37.65,36.58,36.05,35.42,33.02,31.82,31.01,29.14,28.87,28.68,28.16,27.94,27.43,26.08,25.26,22.08,21.63,21.47,19.31,15.79,14.07,13.91.
化合物32，无色油状物，产率：52.9％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ5.44(d,J＝20.9Hz,1H),3.32–3.15(m,3H),2.15(t,J＝7.5Hz,2H),2.13–2.08(m,1H),2.03–1.84(m,4H),1.79–1.73(m,1H),1.70–1.60(m,7H),1.60–1.56(m,3H),1.48(t,J＝7.1Hz,2H),1.39–1.35(m,1H),1.33(s,2H),1.31–1.24(m,13H),1.08–1.01(m,2H),0.97(s,3H),0.90–0.85(m,4H),0.84(d,J＝2.5Hz,1H),0.82–0.77(m,6H).
由于化合物2-32的基础母核结构类似，在图1-4中，本发明以化合物8的应用效果为例可以体现本发明中化合物的效果。
实施例23SMO抑制剂抑制SMO蛋白活性测试
采用荧光素报告法对NIH3T3细胞进行SMO蛋白抑制活性测试。
1.实验方法：(1)将NIH3T3细胞以每盘1.5×106的细胞量接种到10cm的细胞培养皿中，用DMEM培养基(含有10％新生牛血清，双抗)培养于37℃、5％CO2培养箱中24小时。(2)用脂质体LTX(英杰)将GliSBS和pEGFP-N1(按9：1，总转染量为6μg)转染进NIH3T3细胞中，转染6小时换回DMEM培养基(含有10％新生牛血清，双抗)；待细胞汇合度达到80％时，用0.25％胰酶(含有EDTA)消化吹匀后以每孔1×105的细胞量接种到24孔板中。(3)继续培养24小时后，吸掉原有的培养基，用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4)洗一遍，换上含有不同浓度的本发明实施例制备的化合物(2-32)的饥饿培养基(含有本发明制备的Shh-N(人的音猬因子的cDNA 1-198)培养上清液)。在Shh-N的刺激下，可以最大程度上激活Hh信号通路。(4)培养24小时后，吸掉培养基，用PBS缓冲液洗一遍，每孔加入100μL配置好的裂解缓冲液(普洛麦格E166A)，放置于-80℃冰箱中冻结5min(或者过夜)，再室温解冻后，放置于涡旋仪上，以800rpm振荡混匀30min，达到充分裂解细胞的目的。(5)裂解好的细胞用萤火虫萤光素酶试剂盒(普洛麦格E1501)测定自发光的数值，用Cytation3多功能酶标仪测定EGFP的数值(激发光为485，接收光为528)，以自发光的读值和EGFP的读值的比值，即单位荧光值作为各测试化合物对Hh信号通路的抑制能力。IC50值见表1，表1为本发明所述化合物2-32在NIH3T3细胞上抑制Hh信号通路活性数据(IC50)。实验重复三次，IC50取其平均值。各测试化合物对Hh信号通路抑制IC50值见表1。
实验结果表明：本发明制备的一系列三环二萜类似物(2-32)对SMO蛋白均有较好的抑制效果，如表1所示，化合物14抑制效果最佳。
实施例24SMO胆固醇修饰实验
实验方法：(1)将NIH3T3细胞以每盘1×106的细胞量接种到60mm的细胞培养皿中，用10％FCS培养基培养于37℃、5％CO2培养箱中24小时；(2)用脂质体2000将质粒(总转染量为6μg)转染进NIH3T3细胞中，转染6小时换回10％FCS培养基；(3)继续培养24小时后，吸去原有的培养基，用PBS洗一次，换上胆固醇饥饿培养基(DMEM+P/S，5％LPPS，1μM洛伐他汀，10μM甲羟戊酸)并含有相关测试的化合物(维莫德吉，索尼德吉，化合物8)培养过夜。(4)吸去原有培养基，换上含有化合物(维莫德吉，索尼德吉，化合物8)的胆固醇饥饿培养基继续处理8小时；(5)刮下细胞，4℃，1000g，离心5min；(6)弃去上清，加入800μl预冷的PBS，并转移至1.5mL ep管中，1000rpm，4℃，离心5min；(7)弃去上清，用200μl RIPA裂解液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，150mM NaCl，0.1％SDS，1.5％NP-40，2mM MgCl2，0.5％脱氧胆酸钠，5μg/mL抑肽素，10μg/mL亮肽素，5μM MG132，1mM苯甲基磺酰氟，50mM二硫苏糖醇)重悬细胞，用7号针头来回吸吹10次，132000rpm，4℃，离心10min；(8)取一定量的上清到新的EP管中，按顺序逐步加入biotin(终浓度100μM)、CuSO4(终浓度1mM)及维生素C钠盐(终浓度2.5mM)，加完之后来回混匀一下后，再加入TBTA(终浓度1mM)，全部加完后再来回混匀一下。27℃，水平震荡仪上震荡反应1.5hrs；(9)反应完后的样品，13200rpm，4℃离心10min，取一定量上清到10k的透析管中，4℃透析两小时或过夜，透析两次；(10)透析完后的样品，取一定量上清到含有20μL树脂包被的中性亲和素磁珠(beads使用前用RIPA裂解缓冲液洗一次)，IP 6小时或者过夜；(11)IP完后的样品用RIPA裂解缓冲液洗3次，后用2×蛋白上样缓冲液，95℃，离心10min后，取上清，并加入等体积的跨膜蛋白溶解缓冲液，-20℃保存。实验结果如图1所示。
2.实验结果表明：本发明实施例制备的三环二萜类似物(8)对SMO的胆固醇修饰有很好的抑制效果，且具有浓度梯度效应。
实施例25MTT细胞毒性测试
1.实验方法：(1)将293T细胞以每孔5×103的细胞量接种到96孔板中，用10％FBS培养基培养于37℃、5％CO2培养箱中24小时。(2)吸掉原有的培养基，用PBS缓冲液洗一遍，换上含有不同浓度的本发明实施例制备的化合物(2-32)的DMEM培养基(含有Shh-N培养上清液，双抗)处理24小时。(3)每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。(4)终止培养，小心吸去孔内培养液。(5)每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。实验结果如表1(细胞毒性)所示。
2.实验结果表明：本发明实施例制备的一系列三环二萜类似物(2-32)大多数都不具有细胞毒性。
实施例26氟硼荧-环靶眀细胞结合实验
1.实验方法：(1)将293T细胞以每孔6×106的细胞量接种到12孔板(内含有细胞爬片)中，用10％FBS培养基培养于37℃、5％CO2培养箱中24小时；用LPEI将质粒(Hus-SMO-C-mCherry，总转染量为1μg)转染进293T细胞中，转染6小时后换回10％FBS培养基；(2)待细胞汇合度达到80％左右时，吸掉原有的培养基，用PBS缓冲液洗一遍，换上含有不同浓度本发明实施例制备的化合物8和对照化合物(环靶眀)的DMEM培养基(含有10％FBS，100unit/mL双抗，10μM氟硼荧-环靶眀)处理1小时。实验结果如图2所示。
2.实验结果表明：本发明三环二萜类似物(8)不会竞争抑制氟硼荧-环靶眀和SMO的结合，说明本发明实施例制备的三环二萜类似物与传统的SMO抑制剂的结合位点不一样。
实施例27小鼠小脑的神经元祖细胞(cGNP)分离实验和髓母细胞瘤小鼠移植实验
1.小鼠小脑的神经元祖细胞(cGNP)分离实验
方法：(1)准备刚出生6天的幼鼠(一般6只左右)；(2)用剪刀减掉脑子，并用镊子撕开头骨上的外皮，用剪刀从中心缝的位置剪开头盖骨(注意：不要破坏了小脑的结构)，取出小脑，并置于预冷的PBS里；(3)用体视镜观察，小心的取掉小脑背面的红丝带，并将剩余部分的小脑转移至一个新的预冷1.5mL的管里(里面装有PBS)；(注意：每操作一只小鼠时，小脑的分离应小于6分钟)(4)用枪吸走尽可能多的上清(PBS)，(注意：枪先来回吸取FBS两次。)；(5)加入1mL胰酶和DNA酶的混合液。37℃孵育5-10min；(6)用枪吸走尽可能多的上清(注意：枪先来回吸取FBS两次。)；(7)加入1mL DNA酶溶液，用枪反复吸吹10次即可。(注意不要有气泡)；(8)使悬浮液静置1min，将上清转移至新的1.5mL EP管中(不要吸到底部沉淀部分)；(9)800g，4℃，5min。速度调至最低；(10)去掉上清，加入50μLDNA酶，2mL神经细胞培养基(0.1mL 500X双抗，0.5mL 100X谷氨酰胺，0.5mL浓度为45％的D+-葡萄糖，0.5mL of 100XSPITE，0.5mL of 100X油酸白蛋白/亚油酸，1mL50X B27，50μL 1000XN-乙酰半胱氨酸，用神经基础培养基补平至50mL)重悬细胞；(11)用尼龙网过滤细胞；(12)在多聚右旋赖氨酸(Millipore)包被的10cm培养皿里预培养20min，5％CO2，37℃培养箱。轻拍平皿。并吸取上清至新的培养皿里；(13)5％CO2，37℃，预培养20min；(14)将上清收集后，200g，5min，离心。用神经细胞培养基重悬细胞；(15)铺板。实验结果如图3所示。
2.髓母细胞瘤小鼠移植实验
实验方法：(1)冻存的肿瘤块或长有肿瘤的小鼠致死后，用工具剪碎并切细。(在预冷的PBS中)；(2)迅速将组织转移至50％细胞消化液中，进一步剪碎，切细3min；(3)将剪碎后的样品(一般至于皿中)，放置培养箱中，4min；(4)用1ml的移液枪来回吸吹4min；(5)将消化后的组织悬液转移到15mL的离心管中，加入3倍体积的PBS，1000g/5min；(6)去上清，用预冷的PBS重悬沉淀，计数；(7)调整细胞浓度到1×105K/mL。(计数可以稀的记，然后往高浓度浓缩)；(8)加入等体积的生长因子人工基质(BD)，混匀并置于冰上；(9)以每只小鼠0.2mL/只的量，打在小鼠的右前肢下的肢夹窝处。(打之前用酒精先擦拭一下)；(10)每隔两天观察一下小鼠的成瘤情况。实验结果如图4所示。
3.细胞生长实验
实验方法：(1)将分离的小鼠小脑的神经元祖细胞或者分离培养的髓母细胞瘤细胞以每盘1×106的细胞量接种到12孔板(内含有细胞爬片)中，用神经细胞培养液培养于37℃、5％CO2培养箱中24小时；(2)吸去原有的培养基，换上含有不同浓度本发明制备的化合物(8)的神经细胞培养基(加上本发明制备的Shh-N培养上清液)继续培养24小时。(3)吸去原有的培养基，换上含有不同浓度本发明实施例制备的化合物(8)和BrdU(10μM，Thermo)的神经细胞培养基(加上本发明制备的Shh-N培养上清液)继续培养12小时。(4)弃去细胞培养液，加入200μL/每孔4％PFA/PBS，室温固定15分钟。(5)弃去固定液，200μL每孔3％BSA/PBS洗细胞2遍，每遍5分钟。(6)弃去清洗液，加入200μL每孔0.2％Triton X-100/PBS透化，室温孵化20分钟。(7)弃去透化液，500μL每孔3％BSA/PBS洗细胞2遍，每遍5分钟。(8)EdU的点击化学反应。1×Click-iT缓冲液215μL，CuSO410μL，Alexa Fluor叠氮化物0.6μL，添加剂25μL，总体积/孔250μL。弃去清洗液，加入250μL每孔1×Click-iT反应液，轻轻晃匀，室温避光孵育30分钟。(9)弃去反应液，500μL每孔3％BSA/PBS洗细胞1遍，每遍5分钟。(10)去离子水润洗一次。(11)封片。
实验表明，本发明式(I)三环二萜类似物(以本发明制备的8号化合物为例)不仅能很好的抑制野生型SMO蛋白活性，也可以抑制维莫德吉&索尼德吉&格拉德吉药物抵抗型SMO蛋白的活性。这些三环二萜类似物(以本发明制备的8号化合物为例)能有效地抑制肿瘤细胞增殖，且对于Hedgehog依赖型的髓母细胞瘤具有较好抑制能力，具有良好的应用前景。
表1本发明实施例制备的化合物抑制SMO蛋白的活性数据
a：化合物有细胞毒性时，无IC50，以—表示
b：+表示化合物有细胞毒性，—为无细胞毒性
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (14)
1.一种三环二萜类似物，其特征在于，其结构如式(Ⅰ)所示：
其中，
R1选自氧代基、羟基；
R2选自羟基、烷烃胺、杂环胺、芳香胺；其中，所述烷烃胺选自
所述杂环胺选自
所述芳香胺选自
n选自自然数2～5。
2.如权利要求1所述的三环二萜类似物，其特征在于，所述三环二萜类似物选自如式(2)～式(32)所示的三环二萜类似物：
3.一种三环二萜类似物的制备方法，其特征在于，以睾酮为原料，通过甲基化、乙二醇保护、还原、氧化、Bayer-Villger氧化、还原、脱保护、乙酰化、消除、水解、氧化得到Q12，然后所述Q12经还原反应得到式(3)所示的母核化合物；或，以所述Q10为原料，经磺酰化、取代、水解、还原反应得到Q16所示的母核化合物；或，以所述Q11为原料，经Wittig、还原、水解反应得到Q20所示的母核化合物；或，以所述Q10为原料，经乙二醇保护、氧化、Wittig、还原、脱保护、还原反应得到Q26所示的母核化合物，所述制备方法的反应路线如下：
4.一种三环二萜类似物的制备方法，其特征在于，以如权利要求3所述的方法中的所述母核化合物Q12所示的三环二萜类似物为原料，在HATU、DIPEA催化下，通过酰胺化反应得到式(2)所示的三环二萜类似物，所述制备方法的反应路线如下：
5.一种三环二萜类似物的制备方法，其特征在于，以如权利要求3所述的方法中的所述式(3)所示三环二萜类似物为原料，在HATU、DIPEA催化下，通过酰胺化反应分别得到式(4)～式(25)所示的三环二萜类似物，所述制备方法的反应路线如下：
6.一种三环二萜类似物的制备方法，其特征在于，以如权利要求3所述的方法中的所述母核化合物Q16所示的三环二萜类似物为原料，在HATU、DIPEA催化下，通过酰胺化反应得到式(26)所示的三环二萜类似物，所述制备方法的反应路线如下：
7.一种三环二萜类似物的制备方法，其特征在于，以如权利要求3所述的方法中的所述母核化合物Q20所示的三环二萜类似物为原料，在HATU、DIPEA催化下，通过酰胺化反应分别得到如式(27)～式(29)所示的三环二萜类似物，所述制备方法的反应路线如下：
8.一种三环二萜类似物的制备方法，其特征在于，以如权利要求3所述的方法中的所述母核化合物Q26所示的三环二萜类似物为原料，在HATU、DIPEA催化下，通过酰胺化反应分别得到式(30)～式(32)所示的三环二萜类似物，所述制备方法的反应路线如下：
9.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的三环二萜类似物，及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1或2所述的三环二萜类似物或如权利要求9所述的药物组合物在制备SMO抑制剂中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述三环二萜类似物或药物组合物用于抑制野生型SMO蛋白和耐药性SMO蛋白的活性，抑制Hedgehog信号通路活性。
12.如权利要求1或2所述的三环二萜类似物或如权利要求9所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述三环二萜类似物或药物组合物用于抑制肿瘤的生长、增殖、转移，或用于促进肿瘤的凋亡和灭亡。
14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括髓母细胞瘤、基底细胞癌、白血病、其它Hedgehog通路依赖型肿瘤。
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