WO2011085523A1 - 18元或14元大环内酯类埃博霉素化合物及其应用 - Google Patents

18元或14元大环内酯类埃博霉素化合物及其应用 Download PDF

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WO2011085523A1
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epothilone
compound
macrolide
compounds
formula
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PCT/CN2010/000116
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鲁春华
李越中
刘新利
李鹏飞
朱敬
沈月毛
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山东大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a group of macrolide-type epothilone compounds (18 or 14-membered macrolide-type epothilone compounds), a process for the preparation thereof, a pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient, and the same
  • a pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient and the same
  • Epothi lone is a class of 16-membered macrolides with significant antitumor activity.
  • the first compounds of this type, such as angstrom A and B, have the following structural formula:
  • R CH,, Ebomycin B, Soulium cellulosum
  • Myxobacteria the subgenus, the genus Ascomycete, a slidable single-cell gram-negative Bacillus, widely present in the soil. It is capable of synthesizing a variety of secondary metabolites, and the diversity of the chemical structure and biological mechanism of its metabolites can be compared with that of Streptomyces.
  • the epothilones synthesized by the genus Fibrosus are mainly Epothilones A and B. From their biosynthesis, they can be presumed to be complex by multi-module polyketide synthase and single-module non-ribosomal peptide synthase. Multi-enzyme complex catalyzed synthesis.
  • Epothilone has a similar effect to paclitaxel (TAX0O microtubule-synthesis and microtubule-stab lining), induces tubulin multimers to form an ultra-stable state, hinders mitosis, and blocks tumor cells.
  • the molecular structure of epothilone is much simpler than that of paclitaxel; it has better water solubility and good chemical modification potential; it is also highly active against paclitaxel-resistant tumor cells; Produced by Sorangium cellulosum in myxobacteria, it has the potential for large-scale fermentation production. Due to the above various characteristics, epothilone is considered to be a product of paclitaxel replacement, and is a novel antitumor drug with great market potential.
  • epothilone analogs have been introduced into different clinical evaluation stages and even marketed, such as ixabepi lone (aza-epothi lone B BMS 247550), BMS-310705 (a water-soluble analog of epothi lone B), patupi Lone (epothi lone B, EP0906, developed by Novatis), Epothi lone D (KOS-862, Kosan/Sloan-Kettering/Roche), ZK-EPO and C20-desmethyl-C20-methylsulfanyl-Epo B (ABJ879, No vat is).
  • ixabepi lone aza-epothi lone B BMS 247550
  • BMS-310705 a water-soluble analog of epothi lone B
  • patupi Lone epothi lone B, EP0906, developed by Novatis
  • Epothi lone D KOS-862, Kos
  • An object of the present invention is to provide a group of macrolide-type epothilone compounds (18 or 14-membered macrolide-type epothilone compounds), and a preparation method thereof, and a pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient And its use in the preparation of a medicament for the treatment and prevention of liver cancer, lung cancer and breast cancer.
  • the macrolide-type epothilone compound of the present invention comprises an 18-membered macrolide-type epothilone compound and a 14-membered macrolide-type epothilone compound, which are characterized by:
  • the macrolide-type epothilone compound of the present invention has a preventive and therapeutic effect on liver cancer, lung cancer, and breast cancer. Both the compounds and pharmaceutical compositions of the invention can be used in the preparation of related drugs.
  • the macrolide-type epothilone compound is preferably epothilone M.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating liver cancer according to the present invention comprises a therapeutically effective amount of a 18 or 14 membered macrolide-based epothilone compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating lung cancer according to the present invention comprises a therapeutically effective amount of a 18 or 14 membered macrolide-type epothilone compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating breast cancer according to the present invention comprises a therapeutically effective amount of a 18 or 14 membered macrolide epothilone compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the macrolide-type epothilone compound is preferably epothilone M.
  • the above pharmaceutically acceptable carrier means a conventional pharmaceutical carrier in the pharmaceutical field, for example, a diluent, an excipient such as water, a filler such as starch, sucrose, etc., a binder such as a cellulose derivative, an alginate, gelatin, and the like.
  • a diluent an excipient such as water, a filler such as starch, sucrose, etc.
  • a binder such as a cellulose derivative, an alginate, gelatin, and the like.
  • Polyvinylpyrrolidone wetting agent such as glycerin
  • disintegrating agents such as agar, calcium carbonate and sodium hydrogencarbonate
  • absorption enhancers such as quaternary ammonium compounds
  • surfactants such as hexadecanol
  • adsorption carriers such as kaolin and soap clay
  • Talc powder calcium and magnesium stearate, and polyethylene glycol.
  • other adjuvants such as flavoring agents, sweeteners
  • the compounds of the present invention can be administered to patients in need of such treatment by oral, nasal inhalation, rectal or parenteral administration in the form of a composition.
  • a composition When used orally, it can be prepared into conventional solid preparations such as tablets, powders, granules, capsules, etc., into liquid preparations such as water or oil suspensions or other liquid preparations such as syrups, elixirs, etc.; When administered, it may be prepared as a solution for injection, water or an oily suspension, or the like.
  • Preferred forms are tablets, coated tablets, capsules, suppositories, nasal sprays and injections, particularly preferably those which are released at specific sites in the intestinal tract.
  • compositions of this invention may be prepared according to conventional methods of manufacture in the art of pharmacy, e.
  • the 18 or 14-membered macrolide epothilone compound of the present invention can be administered according to the route of administration and the patient.
  • the age, weight, type and severity of the disease being treated are selected for the day, and the daily dose can be
  • 0. 1-10 mg/kg body weight preferably 0. 1-5 mg/kg body weight. It can be administered one or more times.
  • Figure 1 Diagram of liquid phase separation during the preparation of 14-element epothilone.
  • the Soybean sclerotium So0157-2 of the present invention is isolated from the soil sample in Yunnan by a conventional method, and is identified as the Mycobacterium i Sorangium cellulosum) So0157-2 by the State Key Laboratory of Microbiology of Shandong University, and its 16S rDNA sequence information has been published. (DQ256394. 1), and deposited with the China Center for Type Culture Collection (Wuhan University, Wuhan, China) on May 27, 2008. The deposit center number is: Sor giwn cellulosL So0157-2 CCTCC M 208078.
  • Fibronectin, Sorangium cellulos, So0157-2 CCTCC 208078 are the producing strains of epothilones.
  • the inventors Using the liquid fermentation and LC/MS detection and activity tracking methods of the bacteria, the inventors not only detected compounds such as epothilone A/B/C, but also 18 and 14-membered macrolides.
  • the compound (M, N, L, Ll) with anticancer activity was also isolated from the extract. .
  • Sorangium cellulosum was extracted from solid CNST medium by conventional culture method. So0157-2 CCTCC M 208078 cells were inoculated into solid M26 plates. After culturing for 30 days, the cells were scraped for 3 to 4 days, inoculated into 50 ml liquid M26 medium shake flask, and cultured in 3 CTC for 4 to 5 days to reach the logarithmic growth phase. The cells were sterilized by sterilizing the flask, and the M26 liquid medium was transferred. Expand the culture. The expanded cells were used as liquid fermentation seeds, inoculated into M26 liquid medium for 3-4 days, and then inoculated as secondary seeds into the fermentation medium at 32 ° C, 150 r P m and 20 mVh ventilation. The adsorption resin XAD-16 was collected after 7 days of continuous culture under the conditions to prepare an extract of the epothilone.
  • Formulation and preparation method of the above M26 medium potato starch 8g/L, yeast dip powder 2 g/L, peptone 2 g/L, glucose 2 g/L, MgS0 4 -7H 2 01 g/L, CaCl 2 1 g /L, EDTA-FeCl, 1 ml/L, trace element solution 1 ml/L, pH 7.2. Add 12 g/L of agar powder to the solid.
  • the above fermentation medium is formulated as follows: potato starch 0.8%, glucose 0.2%, soybean cake powder 0.2%, corn paddle 0.2%, MgS0 4 0.1%, CaCl, 0.1%, EDTA-Fe 3+ 1 ml/l, trace elements Liquid 1 ml/L (pH 7.2), XAD-16 resin 1% (v/v).
  • the fermentation extract of the above-mentioned Sorangium cellulosum So0157-2 CCTCC M 208078 was separated by gel column chromatography (5ep3 ⁇ 4ote LH-20, 120 g), eluted with methanol, and automatically received 15-20 s / drop, according to TLC detection, combined into five components Fr 1 (1-27) is mainly foaming enemy, Fr 2 (28-43) and Fr 3 (44-58) mainly contain Ebo compounds, Fr 4 (59-70) , Fr 5 (LH-20 wash column part).
  • Fr 3a (300 mg) was separated by gel column chromatography, eluted with methanol, and received from color. According to TLC test results, it was divided into Fr 3al (19-31, 150 mg) and Fr 3a2 (32-35, 55 mg). ).
  • the fermentation extract of Sorangium cellulosum So0157-2 CCTCC M 208078 was directly separated by gel (160 g) column chromatography, eluted with methanol, and automatically accepted 15-20 s/Drop, according to TLC detection, 1 bubble Enemy part; 2 does not contain epothilmycin; 3 does not contain epothilone, contains fatty acids; 4 contains epothilone, also has fatty acids; 5 does not contain Ebo, contains fatty acids. 4 of them were separated by MPLC and eluted with methanol water system (30:70, about 40%, M, 2L; 50:50, about 55%, 2 L; 70:30, 75%, 2 L; methanol 1 L) .
  • TLC detected all of the Ebo components in the methanol wash, and did not remove impurities; continue to use MPLC separation, methanol water system elution (40%, 300 mL; Methanol elution), combining a mixture of 6-15 relatively large polar Ebo, denoted as LF300A.
  • ESIMS gives the molecular weight of the fully acetylated product of this compound as /? ?/z 679.8 [ + H]+ , indicating that the structure contains 4 free hydroxyl groups.
  • the fully acetylated 'Wake R' shows protons 4.50 ( ⁇ -3), 3.70 ( ⁇ - 7), 3.90 ( ⁇ - 12), 4.45 ( ⁇ -15) shifted to the low field to 6.02, 5.04, 5.00 and 5.32, respectively.
  • the carbon spectrum of the compound LF300p4 (including DEPT) gives 27 signals: including 6 methyl groups, 8 methylene groups, 5 methine groups and 8 quaternary carbons. Comparing the ⁇ R data of LF300pl and LF300p4, the structure of the two is basically the same, only a single peak methyl signal is added in LF300p4 (Table 2). Therefore, the structure of LF300p4 was identified as 12-methyl epothilone L, named epothilone Ll.
  • SRB Sulfuryl Rhodamine B
  • Cell line H India G2 human liver cancer, A-549 human lung adenocarcinoma and MDA-MB-435 human breast cancer
  • Epothilone M is mixed with lactose and corn starch, moistened with water, sieved and dried, sieved, added with magnesium stearate, uniformly compressed, each tablet weighs 240 mg, Epothilone The M content is 1 mg.
  • Example 3
  • Epothilone M is mixed with lactose and magnesium stearate, sieved, uniformly mixed in a suitable container, and the obtained mixture is filled into hard gelatin capsules, each capsule weighing 200 mg, Epothilone M The content is 1 mg.
  • Example 4
  • Epothilone M and sodium chloride are dissolved in an appropriate amount of water for injection, and the resulting solution is filtered and placed in an ampoule under aseptic conditions.
  • other epothilone compounds described in this patent can also be used to prepare and treat liver cancer, lung cancer and breast cancer, for example, by epothilone M.

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Description

18元或 14元大环内酯类埃博霉素化合物及其应用 技术领域
本发明涉及一组大环内酯类埃博霉素化合物 （18或 14元大环内酯类埃博霉素化合 物）， 及其制备方法， 以该化合物为活性成分的药物组合物， 以及它在制备治疗和预防 肝癌、 肺癌和乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
埃博霉素 （Epothi lone ) 是一类 16元大环内酯类具有显著抗肿瘤活性的化合物， 最先发现的该类化合物如埃 A和 B， 其结构式如下：
Figure imgf000002_0001
其中： R = H， 埃博霉素 A
R = CH,, 埃博霉素 B 纤维堆囊菌 i Sorangium cellulosum) 属于粘球菌目， 堆囊菌亚目， 堆囊菌科， 堆 囊菌属的一类可以滑动的单细胞革兰氏阴性杆菌， 在土壤中广泛存在。 它能够合成结构 多样的次级代谢产物， 其代谢产物化学结构和生物学活性作用机制的多样性可以与链霉 菌相比拟。
由纤维堆囊菌合成的埃博霉素主要为埃博霉素 A和 B， 从其生物合成可以推测它们 是由多模块聚酮合酶与单模块的非核糖体肽合酶组成的复杂的多酶复合体催化合成的。
1993年 Rechenbach和 H0f le等人发现了这类具有细胞毒活性的天然产物，在 1995 年 Merch研究小组证实了这类化合物具有与紫杉醇 paci l itaxel (TAX0L¾) 类似的作用 机制。 直到 1996年 ΗδΠθ等人揭示了埃博霉素 Β 的立体化学结构， 由于其中典型的 epoxide/thiazole/ketone 结构特征， 所以 reichenbach 和 Hofle 将其命名为 " epothi lones " 。
埃博霉素具有类似于紫杉醇 （ TAX0O 的促微管聚合及稳定微管 (microtubule- stabi l izing ) 的作用， 诱导微管蛋白多聚体形成超稳定态， 阻碍有丝 分裂的进行， 进而阻止肿瘤细胞繁殖。 埃博霉素的分子结构远比紫杉醇的结构简单； 并 且具有更好的水溶性以及良好的化学修饰潜力； 它对紫杉醇耐药性的肿瘤细胞也具有很 高的活性； 埃博霉素由粘细菌中的纤维堆囊菌 Sorangium cellulosum)产生， 具有大规 模发酵生产的潜力。 由于以上的种种特点， 使得埃博霉素被认为是紫杉醇更新换代的产 品， 是具有很大市场潜力的新型抗肿瘤药物。
目前已经有多种埃博霉素类似物进入不同的临床评估阶段甚至上市销售， 如 ixabepi lone (aza-epothi lone B BMS 247550)， BMS- 310705 (a water-soluble analog of epothi lone B) , patupi lone (epothi lone B , EP0906 , developed by Novatis) , epothi lone D (KOS- 862 ， Kosan/Sloan- Kettering /Roche) ， ZK-EPO 以 及 C20-desmethyl-C20-methylsulfanyl-Epo B (ABJ879, No vat is)。 但关于 18或.14元大 环内酯类埃博霉素化合物经检索尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一组大环内酯类埃博霉素化合物 （18或 14元大环内酯类埃 博霉素化合物）， 及其制备方法， 以该化合物为活性成分的药物组合物， 以及它在制备 治疗和预防肝癌、 肺癌和乳腺癌的药物中的应用。
本发明所述大环内酯类埃博霉素化合物， 包括 18元大环内酯类埃博霉素化合物和 14元大环内酯类埃博霉素化合物， 其特征在于：
所述 18元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式（ I )所示：
Figure imgf000003_0001
式 (I) 式（I )中
Figure imgf000003_0003
所述 14元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式（II)所示:
Figure imgf000003_0002
式 （II ) 式（π)中
Figure imgf000004_0001
本发明所述 18或 14元大环内酯类埃博霉素化合物的制备方法， 其特征在于， 所述 18 或 14 元大环内酯类埃博霉素化合物是由纤维堆囊菌 So ngium cellulosum ) So0157-2 CCTCC M 208078经液体发酵后， 从其液体发酵产物中分离得到。
发明人发现本发明所述大环内酯类埃博霉素化合物对肝癌、肺癌、乳腺癌具有预防 和治疗作用。 本发明的化合物和药物组合物均可用于制备相关的药物。
本发明所述 18或 14元大环内酯类埃博霉素化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中 的应用。
本发明所述 18或 14元大环内酯类埃博霉素化合物在制备预防和治疗肺癌的药物中 的应用。 '
本发明所述 18或 14元大环内酯类埃博霉素化合物在制备预防和治疗乳腺癌的药物 中的应用。
其中： 上述大环内酯类埃博霉素化合物优选埃博霉素 M。
本发明所述用于预防和治疗肝癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的 18或 14元 大环内酯类埃博霉素化合物和药学上可接受的载体。
本发明所述用于预防和治疗肺癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的 18或 14元 大环内酯类埃博霉素化合物和药学上可接受的载体。
本发明所述用于预防和治疗乳腺癌的药物组合物， 其中含有治疗有效量的 18或 14 元大环内酯类埃博霉素化合物和药学上可接受的载体。
其中： 上述大环内酯类埃博霉素化合物优选埃博霉素 M。
上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体， 例如： 稀释剂、赋形剂如 水等， 填充剂如淀粉、 蔗糖等， 粘合剂如纤维素衍生物、 藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯烷 酮； 湿润剂如甘油； 崩解剂如琼脂、 碳酸钙和碳酸氢钠； 吸收促进剂如季铵化合物； 表 面活性剂如十六垸醇； 吸附载体如高岭土和皂粘土； 润滑剂如滑石粉、 硬脂酸钙和镁、 和聚乙二醇等。 另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、 甜味剂等。
本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用 于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、 胶囊等， 制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等； 用于肠胃外给 药时， 可将其制成注射用的溶液、 水或油性悬浮剂等。 优选的形式是片剂、 包衣片剂、 胶囊、 栓剂.、 鼻喷雾剂和注射剂， 特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性 成分与一种或多种载体混合， 然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有重量比为 0. 1 % -99. 5 %的 18或 14元大环内酯类埃 博霉素化合物活性成分，最优选含有重量比为 0. 5 %-10%的 18或 14元大环内酯类埃博 霉素化合物活性成分， 特别是活性成分埃博霉素 M。
本发明所述 18或 14元大环内酯类埃博霉素化合物的施用量可根据用药途径、患者 的年龄、 体重、 所治疗的疾病的类型和严重程度等变化针对选择， 其日剂量可以是
0. 01-10 mg/kg体重， 优选 0. 1-5 mg/kg体重。 可以一次或多次施用。
本发明的 18或 14元大环内酯类埃博霉素化合物在浓度为 10―9〜 10— 6M时，对人肝癌 细胞 HepG2细胞有强效抑制作用； 对人肺癌 A-549细胞和乳腺癌 MDA-MB- 435细胞也有 不同程度的抑制作用， 证明该化合物的活性部位可以用作肝癌、 肺癌和乳腺癌的化学抑 制剂。
附图说明
图 1 : 14元埃博霉素制备过程中的液相分离效果图。
具体实施方式
下面结合实施例来使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
实施例 1 :
1.菌株的获得、 保藏及 18和 14元埃博霉素的分离纯化（以埃博霉素 M, N和 L, L1 为例）：
本发明所述纤维堆囊菌 So0157-2是以常规方法分离自云南地区土样， 由山东大学 微生物国家重点实验室鉴定为粘细菌 i Sorangium cellulosum) So0157-2 , 其 16S rDNA 序列信息己经公布 （DQ256394. 1)， 并于 2008年 5月 27日保藏于中国典型培养物保藏 中心（武汉大学，中国 武汉），保藏中心编号为：纤维堆囊菌 Sor giwn cellulosL So0157- 2 CCTCC M 208078。
发明人的研究表明： 纤维堆囊菌 、Sorangium cellulos圖 、 So0157-2 CCTCC 208078为埃博霉素类化合物的产生菌。 利用该菌的液体发酵和液质联用检测及活性跟 踪的方法， 发明人不仅检测到了埃博霉素 A/B/C等化合物， 也检测到了 18和 14元大 环内酯类埃博霉素化 ^"物 M， Ml, N， Nl, 0, 01， L， LI 的分子离子峰。 还从其提物中 分离到有抗癌活性的该类化合物 （M, N, L, Ll )。
1. 1. 纤维堆囊菌 Sorangium cellulosum ) So0157- 2 CCTCC M 208078的发酵和化 合物的提取
以常规培养方法从固体 CNST培养基上挑取纤维堆囊菌 Sorangium cellulosum ) So0157-2 CCTCC M 208078菌体接种至固体 M26平板。 30Ό培养 3- 4天后刮取菌体， 接 种至 50 ml液体 M26培养基摇瓶， 3CTC培养 4- 5天达到对数生长期， 用灭菌转瓶打匀菌 体， 转接 M26液体培养基进行扩培。 扩培后的菌体作为液体发酵种子， 接种到 M26液体 培养基继续培养 3-4天后， 作为次级种子接种到发酵培养基中， 在 32°C， 150 rPm以及 20 mVh通气量的条件下继续培养 7天后收集吸附树脂 XAD- 16， 以备 ¾得埃博霉素类的 提取物。
例如： 收集 70 L发酵液中的吸附树脂 XAD— 160， 置于 40Ό烘箱烘干多余水分， 之 后用甲醇浸泡多次， 浸提取液用滤纸过滤， 旋转蒸发仪减压 45Ό蒸干， 得含埃博霉素类 的提取物 （4. 5 g)。
上述涉及的 CNST的配方及配制方法： KN0:, 0. 5 g/L, N¾HP0, 0. 25 g/L, MgS0„-7¾0 1 g/L, FeCl:1 0. 001%, 微量元素液 1 ml/L， 琼脂 1. 5%， pH7. 2。 灭菌后倒平板， 待冷却 凝固后贴放无菌滤纸片。 上述 M26培养基的配方及配制方法：马铃薯淀粉 8g/L，酵母浸粉 2 g/L，蛋白胨 2 g/L， 葡萄糖 2 g/L, MgS04-7H201 g/L, CaCl21 g/L, EDTA-FeCl, 1 ml/L, 微量元素液 1 ml/L, pH7.2。 固体需添加 12 g/L的琼脂粉。
上述发酵培养基的配方为： 马铃薯淀粉 0.8%，葡萄糖 0.2%， 黄豆饼粉 0.2%， 玉米桨 0.2%， MgS040.1%, CaCl, 0.1%, EDTA- Fe3+ 1 ml/l， 微量元素液 1 ml/L (pH7.2), XAD - 16 树脂 1% (v/v)。
上述微量元素液的配方： MnCl2 H20 0.1 g/L, CoCl, 0.02 g/L, CuS04 0.01 g/L, Ν¾Μο04·2Η200.01 g/L, ZnCl20.02 g/L, LiCl 0.005 g/L, SnCl,-2¾00.005 g/L, H3B0:i 0.01 g/L, KBr 0.02 g/L, KI 0.02 g/L。
1.2 18元大环内酯类埃博霉素化合物的分离纯化
取上述纤维堆囊菌 Sorangium cellulosum ) So0157-2 CCTCC M 208078的发酵 提取物用凝胶柱层析分离 （5ep¾ote LH-20, 120 g) , 甲醇洗脱， 自动接收 15— 20 s/ 滴， 根据 TLC检测，合并成五个组分 Fr 1(1— 27)主要为泡敌， Fr 2 (28— 43)和 Fr 3 (44 一 58)主要含有埃博类化合物， Fr 4 (59-70), Fr 5 (LH-20洗柱部分）。
Fr 3甲醇拌样后用 10 g正相硅胶柱层析分离。 50 ml石油醚部分洗出的都是脂肪 酸类化合物； 接着用石油醚： 乙酸乙酯（10: 1， 220 ml; 6： 1， 210 ml;) PE： Acetone (6:1, 350 ml), 20 ml/tube接收， Acetone 洗脱 （300 mg)， 记为 Fr 3a; 甲醇洗脱。
Fr 3a (300 mg) 用凝胶柱层析分离， 甲醇洗脱， 从有颜色下来开始接收， 根据 TLC 检测结果分为 Fr 3al (19-31， 150 mg)和 Fr 3a2 (32-35， 55mg)。
Fr3al (150 mg), 用 1.5 g正相硅胶柱分离， 石油醚一丙酮系统洗脱 （40: 3， 86 ml; 40:5， 45 ml; 40:8， 48 ml; 40:10, 50 ml. Acetone洗柱）。 合并 40:10,洗下的 25— 35得不纯的 LF(46mg), 接着用反相中压液相柱层析分离，甲醇一水系统（30%, 300 ml； 55%, 300 ml洗脱得到的 8— 9管合并 (10mg), 进行 HPLC分离。 Agilents 1200 系 列； RP- 18色谱柱（5 μ), 04.6 X 250 隱， 247 nm紫外波长检测， MeOH- H20 (65 ： 35) 洗脱， 流速 1 ml/min)， t R- 7.8 min的主要峰为化合物 1 (2 tng)， t B = 10.9的另 一个峰为化合物 2 (0.8 mg)。
进一步的， 对以上化合物 1和化合物 2再进行 HR- T0F-MS检测。
1.3. 14元大环内酯类埃博霉素化合物的分离纯化
取纤维堆囊菌 Sorangium cellulosum ) So0157-2 CCTCC M 208078的发酵提取 物直接用凝胶（160 g)柱层析分离，甲醇洗脱， 自动接受 15— 20 s/Drop,根据 TLC检测， ①泡敌部分； ②不含埃博霉素； ③不含埃博霉素， 含有脂肪酸； ④含埃博霉素， 也有脂 肪酸； ⑤不含埃博， 含脂肪酸。 其中的④用 MPLC分离， 甲醇水系统洗脱（30:70, 约 40 %, M, 2L; 50:50, 约 55%, 2 L; 70:30， 75%, 2 L; 甲醇 1 L)。 用大的反相管接收， 合并④—①； ④—②， ④—③， ④—④， 其中的④—②用 20 g正相柱层析分离， PE - A (10： 1， 275 ml; 6： 1， 280 ml); 接着用 C- M(100: 1, 505 ml； 100:2, 300 ml； 100:3, 300 ml) ； TLC检测在 C- M (100： 2) 洗脱的组分中含有埃博霉素， 用反相柱层析分离， 甲醇水系统洗脱 （40%， 300 m L;55%, 300mL;甲醇洗脱）。 TLC检测埃博组分全部在甲 醇洗下部分， 并且没有去除杂质； 继续用 MPLC分离， 甲醇水系统洗脱（40%， 300 mL; 甲醇洗脱）， 合并 6- 15极性相对较大的埃博类的混合物， 记为 LF300A。 LF300A用 HPLC 分离， Agi lent 1200 系列， RP-18色谱柱 9. 4 X 250 瞧 （5 μ)， 紫外检测波长 247 nm， 乙腈一水 （38 ： 62 ) 洗脱，流速： 2. 5 ml/min, 图谱见说明书附图中图 1。 从 9. 1 min 开始接收， 得到 LF300pl； t, = 9. 8 min (LF300p2)； t„= 10. 4 min (LF300p3)； t = 11. 1 rain (LF300p4)； t = 12. 3 - 12. 8 min (LF300p5)； R = 13. 6 min (LF300p6)； t = 14. 5 min (LF300p7) , t, = 15. 9 min (LF300p8)； =16. 8 min (LF300p9)； t, = 18. 2 min (LF300plO)； tR = 20. 5 min (LF300pl l)。 其中的 LF300pl和 LF300p4分别蒸干用 CDC13 溶解， 进行 HR- TOF-MS检测和 NMR实验。
2. 1 化合物 1的结构鉴定
HR-T0F-MS给出化合物 1的准分子离子峰为分子量为 ¾ 532. 3589 [M 十 Na] + 510. 3305 [M + ΗΓ, 推测其分子量为 509. 。
化合物 1的碳谱 （包括 DEPT)给出 26个信号： 包括 5个甲基， 9个亚甲基， 5个次甲基 和 7个季碳 （表 ] )。 根据' H NMR 和 ':iC剛 R波谱清楚的表明了该结构中含有典型埃博霉素 类化合物的结构特征一噻唑环 （thioazole ring) , 碳碳双键（carbon-carbon double bond) , 环氧单元( epoxy moiety)禾口一个接基碳 ( a carboxyl carbonyl group)。 但是 与已知化合物埃博 A的数据相比， 2 6位甲基的信号消失， 而多了一个羟甲基。 与报道 的化合物 epothi ione A9相似。 但是， 在 'H NMR中羟甲基的质子化学位移在 5. 07和 5. 45 ppm, 而在 epothi ione A9中， 其羟甲基质子信号为 4. 11 和 4. 49 ppm。 该显著差异可能是 酯化造成的。 同时我们也分离到了化合物 epothi ione A9。 HMBC中质子 δ 5. 07和 5. 45与羧 基碳 δ 171. 9有明显的远程相关关系， 进一步表明了亚甲基的氧与羧基碳的连接。 因此 化合物 1鉴定为具有埃博霉素特征的 1 8元大环内酯， 命名为 epothi ione M.
2. 2. 化合物 2的结构鉴定
HR- T0F-MS给出化合物 2的准分子离子峰为分子量为 /7?/z m/z 550. 3109 [M + Na] +, 528. 3001 [M + H] +)， 推测其分子量为 527。 化合物 2的碳谱 （包括 DEPT)给出 26个信号： 包括 5个甲基， 9个亚甲基， 5个次甲基和 7个季碳。 比较 1和 2的刚 R数据表明二者结构基 本一致， 只是在 2中没有了环氧单元， 而是环氧环打开， 变成了两个羟基取代。 碳谱数 据更清楚的确证了该结论 [55. 2 (C-12)和 57. 7 (C- 13) in 1 ; 69. 8 (C-12) 和 68. 8 (C-13) in 2] (表 1) . 因此 2的结构鉴定为 12, 13- deepoxy- 12, 13-dihydroxyl epothi ione M， 命 名为 epothi ione N.
2. 3 化合物 LF300pl的结构鉴定
HR-TOF- MS给出化合物 LF300pl的准分子离子峰为分子量为H/Z Z 534. 4 [M + Na] +, 512. 4 [M + ΗΓ, 推测其分子量为 511。
化合物 LF300pl的碳谱 （包括 DEPT)给出 26个信号： 包括 6个甲基， 5个亚甲基， 9个次 甲基和 6个季碳 （表 2 )。 根据 'H NMR 和' :iC NMR波谱清楚的表明了该结构中含有典型埃博 霉素类化合物的结构特征. 比较该化合物与 epothi ione A的刚 R数据表明二者数据基本 一致， 只是在该化合物中没有了环氧单元， 而是环氧环打开， 变成了两个羟基取代。 碳 谱数据更清楚的确证了该结论 [72. 7 (C- 12)和 76. 4 (C- 13) ] (表 2 ) . 'Η剛 R 中质子 Η - 13 (at 5.14) 以及 H- 15 (4.45)和 C- 14， C- 13, C- 17的远程相关关系表明该化合物为 14元 大环内酯。 ESIMS给出该化合物完全乙酰化的产物的分子量为/？ ?/z 679.8 [ + H]+ ， 表 明结构中含有 4个自由羟基基团。完全乙酰化的 'Η醒 R显示质子 4.50 (Η-3) , 3.70 (Η - 7), 3.90 (Η - 12), 4.45 (Η- 15)分别向低场位移至 6.02, 5.04, 5.00和 5.32， 而质子 5.13 (Η - 13)仅位移至 5.22, 进一步确证了该化合物为 14元大环内酯。因此其结构鉴定为具有 埃博霉素特征的 14元大环内酯， 鉴定为命名为 epothilone L.
2.4化合物 LF300p4的结构鉴定
HR-TOF- MS给出化合物 LF300p4的准分子离子峰为分子量为 ffl/z m/z 548.3100 [M + Na]+, 526.3001 [M + H]+) , 推测其分子量为 525。
化合物 LF300p4的碳谱 （包括 DEPT)给出 27个信号： 包括 6个甲基， 8个亚甲基， 5个 次甲基和 8个季碳。 比较 LF300pl和 LF300p4的陋 R数据表明二者结构基本一致， 只是在 LF300p4中多了一个单峰的甲基信号（表 2)。 因此 LF300p4的结构鉴定为 12-methyl epothilone L, 命名为 epothilone Ll。
表 1. 化合物 1和 2的核磁共振数据
Table 1 · The NMR data for compounds 1 and 2 (in CDCli, δ in ppm, J in Hz).
1 2
No.
,;'C Ή I:'C Ή
1 171. 9s 172. 7s
2 38. It 2. 43 (s), 38. 2t 2. 39 (s),
2. 47 (dd, 12.7, 19.6)， AA' 2. 41 (d, 3.8),
3 74. Od 4. 20 (t, 4.2) 74. 9d 4. 25 (ra)
4 51. 7s 51. 3s
5 221. 4s 221. 2s
6 44. Od 3. 21 (dq, 6.8) 43. 9d 3. 18 (dq, 7.0)
7 75. 9d 3. 72 (dd, 3.7, 6.2) 75. 5d 3. 77 (dd, 3.5, 6.8)
8 35. 6d 1. 67 (m, overlapped) 34. 8d 1. 63 (ra, overlapped)
9 29. 4t 1. 31 (m, overlapped) , 27. 5t. 1. 30 (m, overlapped)
1. 38 (m, overlapped)
10 23. It 1. 27 (m, overlapped) , 22. 2t 1. 34 (m, overlapped) ,
1. 51 (m) 1. 57 (m, overlapped)
11 28. 3t 1. 42 (m, overlapped) , 33. 9t 1. 71 On, overlapped) , 1.93
1. 71 (m, overlapped) (ffl)
12 57. 6d 2. 99 (dt, 4.7, 7.7) 69. 8d 3. 99 (ra, overlapped)
13 55. 2d 3. 22 (ddd, 4.6, 6.7) 68. 8d 4.01 (m, overlapped)
14 34. 4t 1. 80 (br dd, 6.9, 13.9)， 40. 4t 1. 85 (ddd, 2.7, ),
1. 96 (ddd, 4.9, 10.1, 14.7) 2. 12 (ddd, )
15 74. 2d 4. 53 (d, 10.0) 73. 7d 4. 63 (br d, 7.0) 16 138. Is 138. Os
17 61. It 5.07 (d, 12.5), 61.9t 5.09 (d, 12.8)
5.45 (d, 12.5) 5.64 (d, 12.8)
18 124.7d 6.69 (s) 123.6d 6.66 (s)
19 151.0s 151.6s
20 118.8d 7.07 (s) 118.7d 7.09 (s)
21 166. Os 166. Is
22 19.3q 2.70 (s) 19.3q 2.71 (s)
23 18.9q 1.34 (s) 18.9q 1.33 (s)
24 23.3q 1.07 (s) 24.2q 1.11 (s)
25 14.8q 1.16 (d， 6.8) 15. Oq 1.17 (d, 6.9)
26 16.6q 0.95 (d, 7.0) 16.3q 0.93 (d, 7.0)
HO— 3 3.61 (br s) 3.71 (br s) 表 2. 化合物 LF300pl和 LF300p4的核磁共振数据 Table 2. The NMR data for compounds LF300pl and LF300p4 (in CDC13, δ in ppm, Jin Hz).
LF300pli LF300p4
NO.
l:'C Ή |:'C 'H
1 171.6s 170.8s
2 41.7t 2.21 (d， 16.1)， 2.52 (dd, 40.2t 2. 26 (m)， 2. 52
10.3, 17. 2)
3 71.2d 4.50 (d, 10.2) 69.5d 4. 39 (m)
4 55.4s 54.2s
5 221.3s 220.0 s
6 42. Od 3.29 (dq, 4.0, 6.6) 41. Od 3. 29 (m)
7 74.6d 3.70 (t, 3.8) 72.9d 3. 69 (dd)
8 36. Od 1.74 (m) 37.8d 1. 61 (m)
9 32.9t 1.48 (m) 32. It 1. 37 (m)
1. 50 On)
10 24. It 1.40 (m), 1.48 (m) 22.4t 1. 33 (m)
1. 42 (m)
11 31.5t 1.27 (m, 2H) 40.7t 1. 77 (m), 1. 61 (m)
12 72.7d 3.90 (t, 3.5) 74.5s 1
13 76.4d 5.14 (br s) 78.4d 4. 93 (dd, 4. 6, 7.2)
14 35.6t 2.05 (m), 2.27 (br d, 10.3) 34. Ot 2. 26 (m), 2. 05 (m)
15 76. Od 4.45 (br d, 8.0) 73.8d 4. 41
16 143.5s 142.3s
17 119.9d 6.60 (s) 118.5d 6. 55 (s) 18 153. 7s 152. 3s
19 117. 2d 6. 96 (s) 115. 7d 6. 92 (s)
20 166. 6s 165. 2s
21 20. 4q 2. 70 (s) 18. 9q 2. 68 (s)
22 17. 2q 1. 01 (s) 22. 6q 1. 37 (s)
23 24. lq 1. 35 (s) 15. 5q 1. 00 (s)
24 15. 9q 1. 20 (d, 6. 7) 17. 4q 0. 99 (d,
25 18. 6q 1. 00 (d, 7. 0) 13. 8q 1. 17 (d,
26 25. 8q 1. 23 (s)
27 16. lq 2. 02 (s) 14. 6q 1. 95 (s)
3. 化合物——埃博霉素 M抗肿瘤活性测试
筛选方法： 四氮唑盐 (methyl- thiazol-tetozol ium, MTT)还原法
硫酰罗丹明 B (sulforhodamine B， SRB)蛋白染色法
细 胞 株： H印 G2人肝癌、 A- 549人肺腺癌和 MDA-MB- 435人乳腺癌
作用时间： 48-72 h
结果评定： 无效： 10— 5 mol/L < 85%
弱效： 10— 5 mol/L > 85%或 10— 6 mol/L > 50%
强效： 10"" mol/L > 85%或 10— 7 mol/L > 50%
具体实验结果见表 3: 表 3. 埃博霉素 M对人肝癌细胞 HepG2、 人肺腺癌细胞 A-549和人乳腺癌细胞
MDA-MB-435的抑制率
浓度 (M) 10— 10 10— B 10—7 10— 8 IC¾, 95 %可信限
(μΜ)
细胞株 HepG2 抑制率 100 99. 9 93. 3 41. 5 15. 7 0. 07 0. 03-0. 15 细胞株 A-549 抑制率 100 100 96. 4 68. 2 37. 8 0. 05 0. 02-0. 1 细胞株 MDA-MB-435 抑制率 100 100 100 40. 5 22. 5 0. 12 0. 05-0. 32 结论： 从表 3可以看出， 埃博霉素 Μ在浓度为 1(ΤΜ时， 对肝癌细胞 Η印 G2、 人肺 腺癌细胞 A- 549和人乳腺癌细胞 MDA-MB-435均有有强效抑制作用。 因此该化合物及其 活性部位可以作为有关癌细胞的化学抑制剂。
' 实验还证实： 本专利中所述的其它埃博霉素类化合物同样具有与埃博霉素 M类似 的抗肿瘤活性。 实施例 2: 剂型 成分 质量
片剂 埃博霉素 M 1 mg
乳糖 182 mg
玉米淀粉 54 mg
硬脂酸镁 3 mg
制备方法： 将埃博霉素 M与乳糖和玉米淀粉混合， 用水均勾湿润， 过筛并干燥， 再过筛， 加入硬脂酸镁， 均匀 压片， 每片重 240 mg, 埃博霉素 M含量为 1 mg。 实施例 3:
剂型 成分 质量
胶囊剂 埃博霉素 M 1 mg
乳糖 197 mg
硬脂酸镁 2 mg
制备方法： 将埃博霉素 M与乳糖和硬脂酸镁混合， 过筛， 在合适的容器中均匀混 合， 把得到的混合物装入硬明胶胶囊， 每个胶囊重 200mg， 埃博霉素 M含量为 lmg。 实施例 4:
剂型 成分 质量
安瓿剂 埃博霉素 M 1 mg
氯化钠 9 mg
制备方法： 将埃博霉素 M和氯化钠溶解于适量的注射用水中， 过滤所得溶液在无菌 条件下装入安瓿瓶中。 同样的，本专利所述的其它埃博霉素类化合物也可以如埃博霉素 M所釆用方法制备 预防和治疗肝癌、 肺癌和乳腺癌的药物。

Claims

1、 一组大环内酯类埃博霉素化合物， 包括 18元大环内酯类埃博霉素化合物和 14元 大环内酯类埃博霉素化合物， 其特征在于：
所述 18元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式（ I )所示：
Figure imgf000012_0001
式（I )中
Figure imgf000012_0003
所述 元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式（II)所示:
Figure imgf000012_0002
式 （II )
式（II)中
R = H 賴職 L
R = CH:, 埃博霉素 L1 。
2、 权利要求 1所述大环内酯类埃博霉素化合物的制备方法， 其特征在于， 所述 18或 14 元大环内酯类埃博霉素类化合物是由纤维堆囊菌 tSorangium . cellulosum ) So0157-2 CCTCC M 208078经液体发酵后， 从其液体发酵产物中分离得到。
3、 权利要求 1的化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。
4、 权利要求 1的化合物在制备预防和治疗肺癌的药物中的应用。
5、 权利要求 1的化合物在制备预防和治疗乳腺癌的药物中的应用。
6、 如权利要求 3、 4或 5所述的应用， 其特征在于， 所述权利要求 1的化合物是埃博 霉素 M。
7、 用于预防和治疗肝癌的药物组合物， 其中含有治疗有效量的权利要求 1 化合物和 药学上可接受的载体。
8、 用于预防和治疗肺癌的药物组合物， 其中含有治疗有效量的权利要求 1 化合物和 药学上可接受的载体。
9、 用于预防和治疗乳腺癌的药物组合物， 其中含有治疗有效量的权利要求 1化合物 和药学上可接受的载体。
10、 如权利要求 7、 8或 9所述的药物组合物， 其特征在于， 所述权利要求 1的化合 物是埃博霉素 M。
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