CN114732813A - 桔霉素二聚体p4在制备抗肿瘤和抗肿瘤血管生成药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤药物和/或抗肿瘤血管生成药物中的应用。该化合物桔霉素二聚体P4具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的活性，可显著降低肿瘤体积和质量，有效抑制肿瘤血管的生成。同时该化合物具有良好的安全性，无细胞毒性，对动物体的质量、脏器都没有影响。该化合物对肿瘤和肿瘤血管生成有明显的抑制作用，将其开发成抗肿瘤药物和抗肿瘤血管生成药物，具有高效、低毒的优势。

Description

桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤和抗肿瘤血管生成药物中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤药物和抗肿瘤血管生成药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，探索安全有效的抗肿瘤治疗策略是当今生命科学研究领域极富挑战性的课题。研究表明，肿瘤血管生成与肿瘤的生长、侵袭、转移、复发及预后密切相关，肿瘤组织中微血管密度已被认为是预测肿瘤转移，复发和预后的重要指标。二十世纪七十年代，Folkman等提出了通过抑制血管生成治疗肿瘤的设想。在这一理论的指导下，2004年2月，世界上第一个抗血管生成药物Avastin(基因工程重组抗VEGF单克隆抗体)获美国FDA批准上市，用于同化疗药物联合治疗转移性结、直肠癌。随后，治疗肾癌的多靶点酪氨酸激酶抑制剂——索拉非尼和舒尼替尼分别于2005年12月和2006年1月获FDA批准上市。2006年5月，用于治疗肺癌的重组人血管内皮抑素恩度由我国SFDA批准在国内上市。对于许多实体瘤，抑制血管生成已成为一种既定的治疗策略。

目前报道的抗血管生成物质种类繁多，然而，很多现有的抗血管生成药物用于治疗肿瘤时，效果并不理想，甚至有些会诱导肿瘤转变为更具侵袭性的表型，并容易触发并转移到远处的器官。例如，使用抗vegfr2抗体DC101治疗胰腺神经内分泌癌，在使用仅1周后，便诱导肿瘤转变为更具侵袭性的肿瘤表型，而且即使在治疗结束后，肿瘤的侵袭性仍持续增强，这种侵袭性肿瘤表型向远处转移。

现有的抗血管生成药物的肿瘤治疗效果远不能令人满意，副作用明显。因此，探索更加有效、毒性更低的药物来对抗肿瘤血管生成、抗肿瘤具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的是提供桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤药物和抗肿瘤血管生成药物中的应用。

本发明的再一目的是提供一种抗肿瘤药物和抗肿瘤血管生成药物。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：

一种桔霉素二聚体P4，其从Penicillium sp.菌株中提取分离得到，经鉴定其结构式为：

动物体内、体外实验表明，桔霉素二聚体P4具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的活性，可显著降低肿瘤体积和质量，有效抑制肿瘤血管的生成。同时桔霉素二聚体P4具有良好的安全性，没有显示出明显的细胞毒性，对动物体的质量、脏器都没有明显影响。

本发明提供了桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤药物和抗肿瘤血管生成药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为胰腺癌。

本发明还提供了桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为胰腺癌。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物。

优选地，所述抗肿瘤药物包含桔霉素二聚体P4。

优选地，所述抗肿瘤药物包括桔霉素二聚体P4以及药学上可接受的辅助剂组成。

优选地，所述抗肿瘤药物剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或注射剂中的任一种。

本发明还提供了一种抗肿瘤血管生成药物。

优选地，所述抗肿瘤血管生成药物包含桔霉素二聚体P4。

优选地，所述抗肿瘤血管生成药物包括桔霉素二聚体P4以及药学上可接受的辅助剂组成。

优选地，所述抗肿瘤血管生成药物剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或注射剂中的任一种。

本发明具有以下有益效果：

本发明将桔霉素二聚体P4应用于制备抗肿瘤药物和抗肿瘤血管生成药物，动物体内、体外实验表明，桔霉素二聚体P4具有明显的抑制肿瘤细胞的活性，可显著降低肿瘤体积和质量，对肿瘤和肿瘤血管生成有明显的抑制作用。同时桔霉素二聚体P4具有良好的安全性，没有显示出明显的细胞毒性，对动物体的质量、脏器没有明显影响。

附图说明

图1为桔霉素二聚体P4的¹H NMR图谱(CDCl3)。

图2为桔霉素二聚体P4的¹³C NMR图谱(CDCl3)。

图3为桔霉素二聚体P4的¹H-1H COSY和HMBC相关图。

图4为桔霉素二聚体P4的CD曲线图。

图5为不同浓度的桔霉素二聚体P4对BXPC-3细胞的抑制作用。

图6是检测桔霉素二聚体P4细胞毒性的实验结果，A图为桔霉素二聚体P4对HUVEC细胞的细胞毒性检测结果；B图为桔霉素二聚体P4对THP-1细胞的细胞毒性检测结果。

图7为构建的荷瘤小鼠模型。

图8是测定桔霉素二聚体P4对裸鼠体重影响的实验结果。

图9是测定桔霉素二聚体P4对裸鼠脏器指数影响的实验结果；A图为桔霉素二聚体P4对裸鼠心脏的影响结果；B图为桔霉素二聚体P4对裸鼠肝脏的影响结果；C图为桔霉素二聚体P4对裸鼠脾脏的影响结果；D图为桔霉素二聚体P4对裸鼠肺脏的影响结果；E图为桔霉素二聚体P4对裸鼠肾脏的影响结果。

图10为桔霉素二聚体P4对裸鼠肝、肾生化指标BUN(血尿素氮)、CRE(血肌酐)、ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)的影响实验数据；A图为桔霉素二聚体P4对裸鼠BUN(血尿素氮)的影响结果；B图为桔霉素二聚体P4对裸鼠CRE(血肌酐)的影响结果；C图为桔霉素二聚体P4对裸鼠ALT(谷丙转氨酶)的影响结果；D图为桔霉素二聚体P4对裸鼠AST(谷草转氨酶)的影响结果。

图11为桔霉素二聚体P4、5-FU给药荷瘤小鼠的肿瘤体积变化数据。

图12为检测桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤体积和质量的抑制效果的实验结果；A图为桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤体积的抑制率实验数据；B图为桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤质量的抑制率实验数据；C图为处死荷瘤小鼠后取出肿瘤，对肿瘤进行拍照的结果。

图13为桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤组织中CD31蛋白表达水平影响的实验结果；A图为蛋白质免疫印迹实验检测CD31蛋白表达水平的实验结果；B图为桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤组织中CD31蛋白表达抑制率的实验数据。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明采用的试剂和设备为市购。

实施例1桔霉素二聚体P4的分离纯化、结构鉴定

菌株(Penicillium sp.)GGF16-1-2，菌种保藏号GDMCC No：61080；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏日期：2020年7月7日。

1、微生物菌株(Penicillium sp.)GGF16-1-2发酵

S1.菌种活化：

用接种环从菌种管中挑取菌种到装有PDA培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、海盐35g、纯水1L，pH自然)的培养瓶中(100mL/250mL)，将其放置于28℃的恒温摇床(165r/min)中培养2天，获得种子液。

S2.接种：

吸取步骤S1中已活化的种子培养液1.5mL至装有400mL真1培养基(麦芽糖40g、色氨酸5g、山梨醇50g、味精10g、KH₂PO₄ 5g、MgSO₄·7H₂O 3g、酵母膏13g、陈海水，pH为6.5)的1000mL培养瓶中，共培养150L；同时准备空白真1培养基2L。将上述培养基置于28℃的室内静置培养60天，记录菌株在不同培养基的生长状况。

2、桔霉素二聚体类化合物的分离：

S1.提取：

往上述每个装有真1培养基的培养瓶中加10-20ml甲醇进行菌株灭活，纱布过滤，得发酵液和菌丝体；

将得到的发酵液浓缩至10L，依次用等体积EtOAc、n-BuOH萃取三次，得到的萃取液进行浓缩，得到发酵液EtOAc相和n-BuOH相浸膏；

S2.桔霉素二聚体P4的分离：

将提取得到的发酵液EtOAc相进行浓缩得EtOAc部位粗提物(111.9g)，然后进行硅胶柱层析分离(φ＝10cm、l＝110cm、硅胶H、165g拌样硅胶(高度7cm)、装柱硅胶1.65kg(高度57cm)、柱体积3.85L)，用石油醚-乙酸乙酯体系(V_PE:V_EtOAc＝100:0→0:100、1L/瓶)洗脱。根据薄层TLC情况合并洗脱液得到6个粗分离组分Fr1～Fr6：

Fr1(接出液序号1～78，V_PE:V_EtOAc＝100:0-90:10)；

Fr2(接出液序号79～122，V_PE:V_EtOAc＝85:15-75:25)；

Fr3(接出液序号123～199，V_PE:V_EtOAc＝70:30-40:60)；

Fr4(接出液序号200～281，V_PE:V_EtOAc＝50:50-0:100)；

Fr5(接出液序号282～290，V_甲醇:V_EtOAc＝50:50)；

Fr6纯甲醇冲柱。

在GNPS指导下，结合TLC和LC-MS分析，对上一步得到的Fr2(4.0g、PE:EtOAc＝95:5部分)继续进行Sephdex LH-20柱层析(φ＝3.0cm、l＝200cm、LH-20(40-60μm)、100g、高度160cm、柱体积300Ml)，纯甲醇洗脱，每次载样1.5g样品，25mL试管接液，TLC点板追踪。

共得到Fr2-1～Fr2-5五个亚流份：

Fr2-1(淡黄色溶液)：TLC无明显斑点；

Fr2-2(深红色溶液)：R_f＝0.1-0.45，254nm暗斑，365nm黄色斑点；

Fr2-3(亮黄色溶液)：R_f＝0.3-0.8，254nm暗斑，365nm淡黄色斑点；

Fr2-4(黄色溶液)：R_f＝0.3-0.9，254nm暗斑，365nm米黄→橙红色斑点(硫酸乙醇可显色)；

Fr2-5(淡黄色溶液)：R_f＝0.3-0.9，254nm暗斑，365nm黄色斑点。

将Fr2-1(339mg)继续进行HPLC纯化(Kromasil半制备色谱柱、10mm×250mm，5μm，瑞典Akzo Nobel公司)，流动相V_MeOH:V_H2O＝80:20、2.0ml/min，得到两个组分，分别为：peak10(τ_R＝56.960min,68mg)和化合物1(τ_R＝49.143min,15.0mg)。

peak10(τ_R＝56.960min,68mg)再次HPLC纯化(Kromasil半制备色谱柱、10mm×250mm，5μm，瑞典Akzo Nobel公司)，流动相V_MeOH:V_H2O＝85:15、1.5ml/min，得到化合物P4(τ_R＝48.960min,45.8mg)。重复此过程富集化合物P4(200mg)。化合物P4即为本申请所使用的桔霉素二聚体P4。

3、桔霉素二聚体P4结构鉴定

将分离得到的化合物P4干燥，得橙黄色无定形粉末。

正离子HRESIMS给出m/z：441.1906[M+H]⁺准分子离子峰(计算值为m/z：441.1908[M+H]⁺)，同时NMR给出其具有25个碳(13个C、5个CH、1个CH₂、和6个CH₃)的信息，确定其分子式为C₂₅H₂₈O₇，不饱和度为12。

紫外光谱中显示最大吸收波长为202、280和320nm。

红外光谱中显示其存在羟基(3280cm^-1)、羰基(1639cm^-1)以及苯环(1511和1477cm^-1)官能团。

¹H NMR(CDCl₃)图谱(图1)、¹³C NMR(CDCl3)图谱(图2)谱显示结果为：

1个双键质子信号δ_H 8.10(1H,s,H-1)，δ_C 156.8/157.0,(d，C-1)；

6个甲基信号δ_H 1.14(3H,m,H-9)、1.19(3H,m,H-10)、1.97(3H,s,H-11)和1.31(3H,m,H-9′)、1.26(3H,m,H-10′)和2.11(3H,s,H-11′)，δ_C 18.8(q,C-9)、20.1(q,C-10)、10.3(q,C-11)、19.8(q,C-9′)、18.2(q,C-10′)和10.6(q,C-11′)；

4个次甲基信号：δ_H 4.60(1H,q,6.4，H-3)、2.87(1H,q,7.2,H-4)、4.66(1H,q,6.8,H-3′)和2.95(1H,q,7.2,H-4′)，δ_C 80.4(d，C-3)、34.3(d,C-4)、80.6(d,C-3′)和30.6(d,C-4′)；

1个亚甲基信号δ_H 3.71(2H,m,H-1”)和δ_C 17.6/17.7(t，C-1″)；

3个活泼质子信号δ_H 12.20(1H,s,6'-OH)、12.88(1H,s,8'-OH)、8.94/9.10(1H,s,8-OH)。

¹³C NMR中还显示存在1个共轭酮羰基(δ_C 187.8,s,C-6)、一个酯羰基[δ_C169.5/169.6,s,C-1′)、3个连氧双键碳(δ_C 160.9(s,C-8)、162.8/162.9(s,C-6′)、157.6/157.7,(s,C-8′)]和8个四取代双键碳信息[δ_C 136.1/136.3(s,C-4a)、126.1/126.2(s,C-5)、113.7/113.8,(s,C-7)、107.0/107.1(s,C-8a)、140.3(s,C-4a′)、116.7(s,C-5′)、111.9(s,C-7′)、98.6(s,C-8a′)]。

上述图谱数据暗示桔霉素二聚体P4是一个不对称的桔霉素二聚体化合物，且存在一个完整的7-脱羧桔霉素单体和一个1位氧化的7-脱羧桔霉素单体。

HSQC对其NMR数据给予归属(表1)。

表1桔霉素二聚体P4的NMR数据

注释：¹H NMR(400MHz),¹³C NMR(100MHz)，^a表示重叠峰。

¹H-¹H COSY给出两个片段(图3)

和

HMBC给出δ_H 1.97(11-CH₃)与δ_C 126.1/126.2(C-5)、187.8(C-6)、136.1/136.3(C-4a)；δ_H 2.87(H-4)与δ_C 136.1/136.3(C-4a)、126.1/126.2(C-5)、107.0/107.1(C-8a)；δ_H7.86(H-1)与δ_C 107.0/107.1(C-8a)、136.1/136.3(C-4a)、34.3(C-4)、160.9(C-8)；δ_H 1.97(8-OH)与δ_C 160.9(C-8)、107.0/107.1(C-8a)；δ_H 4.60(H-3)与δ_C136.1/136.3(C-4a)、156.8/157.0(C-1)；δ_H 3.71(H-1″)与δ_C 113.7/113.8(C-7)、187.8(C-6)、160.9(C-8)、111.9(C-7′)、162.8/162.9(C-6′)和157.6/157.7(C-8′)；δ_H 2.11(11′-CH₃)与δ_C 116.7(C-5′)、162.8/162.9(C-6′)、140.3(C-4a′)；δ_H 2.95(H-4′)与δ_C 140.3(C-4a′)、116.7(C-5′)、98.6(C-8a′)的相关信息；

说明桔霉素二聚体P4中含有7-取代的脱羧桔霉素片段(图3：片段A)和7-取代的脱羧且1位氧化的脱羧桔霉素片段(图3：片段B)，且二者有-CH₂-(C-1″)桥连(图3)。

通过NOESY实验确定桔霉素二聚体P4的相对构型。在NOESY实验中明显观察到δ_H1.19(H₃-10)与δ_H 4.60(H-3)及δ_H 1.26(H₃-10′)与δ_H 4.66(H-3′)的相关，说明10-CH₃与3-CH₃、10′-CH₃与3′-CH₃均在异面。

查阅文献确定桔霉素片段中C-3、C-4、C-3'、C-4'的绝对立体构型为3R、4S、3'R、4'S。对桔霉素二聚体P4进行旋光测试，其比旋光值为[α]25D-35.2(c 0.10，MeOH)。CD测试结果(图4)显示其在212、232以及275nm处为(+)cotton效应，在331nm处为(-)cotton效应。与计算的3R、4S、3'R、4'S的ECD相同，确定桔霉素二聚体P4绝对构型为3R、4S、3'R、4'S。

经过上述步骤的鉴定，确定桔霉素二聚体P4的结构式为：

经SciFinder检索以及文献调研发现该化合物未被报道，确定桔霉素二聚体P4为新化合物，命名为dicitrinone E。其为首个碳桥接型1位氧化的7-脱羧型桔霉素二聚体。

实施例2桔霉素二聚体P4的抗癌活性研究和细胞毒性评价

1、实验材料：

人胰腺癌细胞(BXPC-3细胞)。

正常细胞系人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。

急性单核细胞白血病细胞(THP-1)。

桔霉素二聚体P4：由实施例1分离得到。

2、桔霉素二聚体P4的抗癌活性研究：

(1)实验方法：

1)细胞种板：收集对数期BXPC-3细胞，调整细胞悬液浓度为7×10⁴个/mL，将细胞悬液加入96孔板，每孔加入100μL，使待测细胞密度为7000个/孔，在37℃、5％的二氧化碳的条件下持续孵育。

2)细胞给药：孵育13h后，按1nm、10nm、100nm、1μM、10μM、100μM的浓度梯度给药桔霉素二聚体P4，每个梯度浓度的药物给药6个复孔。

3)MTT反应：桔霉素二聚体P4给药24h后，每孔加入MTT溶液10μL(5mg/mL，即0.5％MTT)，放入培养箱，在37℃、5％的二氧化碳的条件下继续孵育4h。

4)终止培养：用1mL注射器吸干孔内液体，细胞贴附在孔壁上，停止生长。

5)显色和OD值测定：每孔加入DMSO 150μL，置于IKA MS3数显震荡仪上震荡10min，在全波长酶标仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。

(2)实验结果见附图5，数据显示，桔霉素二聚体P4在浓度达到10μM后显示出明显的抑制肿瘤细胞增殖的活性。

3、桔霉素二聚体P4细胞毒性评价

(1)实验方法

1)细胞种板：收集对数期HUVEC和THP-1细胞，调整细胞悬液浓度为7×10⁴个/mL，分开加入96孔板，每孔100μL，使待测细胞密度为7000个/孔，在37℃、5％的二氧化碳条件下持续孵育。

2)细胞给药：细胞孵育13h后，进行HUVEC细胞培养的96孔板按0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5.0μM、10.0μM的浓度梯度桔霉素二聚体P4给药刺激；进行THP-1细胞培养的96孔板按0μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、5μM、10μM的浓度梯度桔霉素二聚体P4给药刺激，每个浓度的药物给药6个复孔。

3)MTT反应：给药刺激24h后，每孔加入MTT溶液10μL(5mg/mL，即0.5％MTT)，放入培养箱，孵育4h。

4)终止培养：用1mL注射器吸干孔内液体，细胞贴附在孔壁上，停止生长。

5)显色和OD值测定：每孔加入DMSO 150μL，置于IKA MS3数显震荡仪上震荡10min，在全波长酶标仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。

(2)实验结果见附图6，结果显示：桔霉素二聚体P4对HUVECs和THP-1细胞没有显示出明显的毒性作用，与给药浓度为0μM的实验组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，桔霉素二聚体P4具有良好的安全性。

实施例3构建荷瘤小鼠模型

1、荷瘤小鼠模型建立：

生长至对数期的BXPC-3细胞，使用胰酶消化细胞后将细胞重悬于不含血清的1640培养基中，调整细胞浓度至2×10⁷个/mL。用紫外线灯消毒超净工作台2h，用75％酒精消毒裸鼠右下肢外侧皮肤，0.1mL细胞悬液注射至35只雄性裸鼠右下肢外侧皮下组织中，继续饲养于SPF级饲养箱中。具体方法参考文献《Yin Yang-1suppresses pancreatic ductaladenocarcinoma cell proliferation and tumor growth by regulating SOX2OT-SOX2axis，JJ Zhang，2017，Source:CANCER LETTERS,Volume 408,Number 1,2017,pp.144-154(11)》。

2、如图7所示，注射部位发生癌变，裸鼠皮下肿瘤生长明显，即表示荷瘤小鼠模型构建成功。

实施例4在动物上验证桔霉素二聚体P4的对动物的毒性作用

本发明通过测定桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠体重、脏器指数以及肝、肾生化指标BUN(血尿素氮)、CRE(血肌酐)、ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)含量的影响，评价桔霉素二聚体P4对动物的毒性作用。

1、实验材料：

裸鼠：BALB/c Nude Mice，购于维通利华；

氟尿嘧啶(5-FU)：购买于麦克林，CAS No.为51-21-8。

2、实验分组：

本发明设置以下模型组：

0.25mg/kg桔霉素二聚体P4组；

0.5mg/kg桔霉素二聚体P4组；

1mg/kg桔霉素二聚体P4组；

以及5-FU阳性对照组、空白对照组。

空白对照组，每天腹腔注射(体重/100)mL的PBS，共28d；

0.25mg/kg的桔霉素二聚体P4给药组每天腹腔注射(体重/100)mL的0.025mg/mL的桔霉素二聚体P4药液，共28d；

0.5mg/kg桔霉素二聚体P4给药组每天腹腔注射(体重/100)mL的0.05mg/mL的桔霉素二聚体P4药液，共28d；

1mg/kg桔霉素二聚体P4给药组每天腹腔注射(体重/100)mL的0.1mg/mL的桔霉素二聚体P4药液，共28d；

5-FU阳性对照组(4mg/kg)，前3d给药，每天腹腔注射(体重/100)mL 0.4mg/mL的5-FU，观察28d。

3、进行下述实验：

(1)测定桔霉素二聚体P4对裸鼠体重的影响：

实验开始后，每周测量裸鼠的体重，并绘制体重曲线，实验结果见附图8。数据显示，在给药周期内，0.25、0.5、1mg/kg桔霉素二聚体P4组对裸鼠的体重无明显影响，与空白对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。5-FU阳性对照组裸鼠体重在7和14d明显下降，与空白对照组和各个桔霉素二聚体P4给药组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

(2)桔霉素二聚体P4对裸鼠脏器指数的影响：

给药28d后取材，测定裸鼠体重、心、肝、脾、肺和肾脏的质量，计算脏器指数：脏器指数＝脏器重量/体重*100％。实验结果见附图9。0.25、0.5、1mg/kg桔霉素二聚体P4组的脏器指数相对于空白对照组无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。5-FU阳性对照组脾脏的脏器指数明显高于空白对照组和各个给药组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

(3)桔霉素二聚体P4对肝、肾生化指标BUN(血尿素氮)、CRE(血肌酐)、ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)含量的影响：

给药28d后取动物的血清，测定荷瘤小鼠肝和肾功能的相关生化指标。实验结果见附图10。实验结果表明，0.25、0.5、1mg/kg桔霉素二聚体P4组及5-FU阳性对照组血清中ALT、AST、CRE、BUN水平相对于空白对照组均无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。桔霉素二聚体P4对动物的肝和肾功能没有明显的毒性

综上所述，桔霉素二聚体P4对动物体没有明显的毒性，安全性显著高于5-FU。

实施例5桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤体积、肿瘤质量、CD31蛋白表达水平的影响

1、实验材料：

荷瘤小鼠为实施例3构建的荷瘤小鼠。

实验分组同实施例4。

2、进行下述实验：

(1)桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤体积、肿瘤质量的影响：

实验开始后，每周测量荷瘤小鼠肿瘤体积；28d后，处死动物，取出肿瘤，称量肿瘤质量，计算肿瘤体积和肿瘤质量抑制率。实验结果见附图11、附图12及下表。

表2桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤体积、肿瘤质量的抑制率

数据表明，第21d以后，0.25、0.5、1mg/kg桔霉素二聚体P4组及5-FU阳性对照组肿瘤体积均明显低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。桔霉素二聚体P4能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤大小和重量，各模型组肿瘤体积与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。各模型组肿瘤质量与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。桔霉素二聚体P4给药各组荷瘤小鼠肿瘤体积和肿瘤质量抑制率高于5-FU阳性对照组。

(2)桔霉素二聚体P4对荷瘤小鼠肿瘤组织中CD31蛋白表达水平的影响CD31被广泛用于测定肿瘤微血管密度的内皮标记物，其表达水平可反映肿瘤微血管密度。

28d后，杀死动物取出肿瘤，通过蛋白质免疫印迹实验检测肿瘤组织中CD31蛋白表达水平。实验结果见附图13。实验结果表明：给药桔霉素二聚体P4后，肿瘤组织中CD31蛋白表达水平明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，桔霉素二聚体P4对肿瘤血管的生长有明显的抑制作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤药物中的应用，所述桔霉素二聚体P4结构式为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胰腺癌。

3.权利要求1中所述桔霉素二聚体P4在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胰腺癌。

5.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含桔霉素二聚体P4。

6.根据权利要求5所述药物，其特征在于，由桔霉素二聚体P4以及药学上可接受的辅助剂组成。

7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，药物剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或注射剂中的任一种。

8.一种抗肿瘤血管生成药物，其特征在于，包含桔霉素二聚体P4。

9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，由桔霉素二聚体P4以及药学上可接受的辅助剂组成。

10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，药物剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或注射剂中的任一种。

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