CN103275106B - 一种吲哚生物碱加合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体公开了一种吲哚生物碱加合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的吲哚生物碱加合物，具有式Ⅰ所示的结构：其中，R为吲哚生物碱经肼解后与肼基连接的部分。本发明所述吲哚生物碱加合物显著降低对正常细胞的毒性和体内毒性，也能显著抑制多种肿瘤细胞株的体外增殖以及荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物领域，更具体地，涉及一种吲哚生物碱加合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症是以细胞出现异常增殖和转移为特点的一大类疾病。在城镇居民中，癌症已成为死因的首位。尽管世界各国科学家多年来从多种学科领域对如何攻克癌症这一世界难题开展深入研究，提出了多种治疗方法。这些治疗方法有一定的治疗效果，但通常带来严重的系统毒性、癌症的转移和复发，距离癌症的根治仍有相当的距离。所以，对具有更好治疗效果的抗肿瘤药物的研究仍然是当今药物研发的热点和难点。
长春碱（VLB）和长春新碱（VCR）是从植物长春花中发现的两个二吲哚生物碱（Beer,M.T.Br Emp Cancer Campaign1955,33(5),487-489;Gorman,M.,et al.J Am Chem Soc，1959,81,4745-4746）。药理作用研究表明，长春碱和长春新碱具有很好的抗肿瘤作用，两者对P1534小鼠白血病的疗效十分显著（Neuss,N.,Neuss,M.N.The Therapeutic Use of Biindole Alkaloids from Catharanthus roseus.In The Alkaloids,vol37.New York:Academic Press,1990,229-239）。目前，VLB主要用于治疗何杰金氏病和绒毛上皮癌（Zhou,X.J.,Ranmani,R.Preclinicalpharmacology of vinca alkaloids.Drugs1992,44(4),1-16）,对何杰金氏病治疗的有效率为68%，完全缓解率为30%，此外，VLB对淋巴肉瘤、黑色素瘤、卵巢癌、白血病等也有一定疗效；VCR主要用于治疗急性淋巴细胞白血病，同时也可用于治疗食道癌、睾丸内胚窦瘤、血小板减少性紫癜及难治性多发性骨髓瘤等。
与许多抗肿瘤药物一样，长春碱类药物在治疗过程中也出现许多严重的副作用，比如骨髓抑制、肌痛、恶性呕吐等不良反应（Magnus,P.,Ladlow,M.,Elliot,J.Models for a hypothetical mechanism of action of the anticancer agent vinblastine.JAm Chem Soc，1987,109(25),7929-7930），限制了其在临床上的应用。解决抗肿瘤药物毒副作用的有效途径之一是对药物进行结构修饰，使之成为前体药物，利用肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异，选择性作用于靶细胞的基因、酶、信号传导因子等，从而达到靶向治疗的目的。近年来大量的研究表明，肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblast，CAF）对肿瘤的发生发展起着重要的支持和促进作用，选择CAF稳定表达的成纤细胞激活蛋白酶（FAP）作为靶标是提高肿瘤治疗综合指数的有效策略之一，本发明是基于此目的而进行的研究成果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中吲哚生物碱作为抗癌药物时具有严重毒副作用的不足，提供一种吲哚生物碱加合物、吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐或含有吲哚生物碱加合物或/和吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐的药物组合物。
本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种吲哚生物碱加合物或吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐的制备方法及其应用。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种吲哚生物碱加合物，其特征在于，具有式Ⅰ所示的结构：
其中，R为吲哚生物碱经肼解后与肼基连接的部分。
所述的吲哚生物碱为具有抗癌作用的吲哚生物碱。所述的吲哚生物碱能够与水合肼发生肼解反应。
作为一种优选方案，所述的吲哚生物碱为文多灵、长春质碱、长春碱、长春新碱、长春瑞滨或长春氟宁。
作为一种进一步优选方案，以Z-GP表示式Ⅰ结构中所示的苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基，所述的吲哚生物碱加合物为Z-GP-NHNH-文多灵（BX-WDL）、Z-GP-NHNH-长春质碱（BX-CCZJ）、Z-GP-NHNH-长春碱（BX-CCJ）、Z-GP-NHNH-长春新碱（BX-CCXJ）、Z-GP-NHNH-长春氟宁（BX-CCFN）或Z-GP-NHNH-长春瑞滨（BX-CCRB）；
上述吲哚生物碱加合物的结构式如下：
一种吲哚生物碱加合物的制备方法，其特征在于，先将吲哚生物碱与水合肼反应得吲哚生物碱酰肼化合物，然后与苄氧羰基甘氨酰脯氨酸（Z-GP-OH）在缩合剂作用下反应得吲哚生物碱加合物。所述苄氧羰基甘氨酰脯氨酸（Z-GP-OH）的结构式为：
吲哚生物碱加合物的合成路线图如下：
作为一种优选方案，上述吲哚生物碱加合物的制备方法，具体包括如下步骤：
S1.将吲哚生物碱溶于有机溶剂，加入水合肼，氮气保护下避光加热搅拌反应10～60小时；反应温度控制在40℃～120℃；反应结束后分离纯化得吲哚生物碱酰肼化合物；
S2.将吲哚生物碱酰肼化合物、苄氧羰基甘氨酰脯氨酸（Z-GP-OH）和缩合试剂，在-10℃～50℃下避光搅拌反应；反应完毕后加水淬灭，分离、纯化得吲哚生物碱加合物。
作为一种优选方案，S1中所述的水合肼为40wt%～80wt%的水合肼；所述吲哚生物碱与水合肼的摩尔投料比为1:5.0～1200。S1中所述的有机溶剂为甲醇。
作为一种优选方案，S2中所述的缩合试剂选自氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）和1-氯N,N,2-三甲基丙烯胺中的一种或几种的混合。
作为一种优选方案，S2中所述吲哚生物碱酰肼化合物、苄氧羰基甘氨酰脯氨酸（Z-GP-OH）和缩合试剂的投料摩尔比为1:1.05～3.0:1.05～3.0。
一种由上述吲哚生物碱加合物形成的吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐。
作为一种优选方案，所述的吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐选自表1中的任意一种：
表1吲哚生物碱加合物的成盐形式
本发明所述的吲哚生物碱加合物或吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐，在药用中可以游离态形式存在。
一种吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐的制备方法，其特征在于，将吲哚生物碱加合物，溶于含1.05～3.0摩尔量酸（HA）的有机溶剂中，于-10℃～40℃温度下搅拌反应3～20小时，分离固体化合物，洗涤，再将固体化合物重新溶于水中，冷冻干燥得成品。
作为一种优选方案，所述的酸为盐酸、硫酸、醋酸、酒石酸或柠檬酸，所述的有机溶剂为体积比为1:1的甲醇和二氯甲烷溶液。
一种药物组合物，包含上述的吲哚生物碱加合物或/和吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐。
所述吲哚生物碱加合物作为肿瘤间质成纤细胞激活蛋白酶α（FAPα）特异性水解底物的用途。
吲哚生物碱加合物或吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
作为一种优选方案，所述的肿瘤为胃癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、宫颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、肾母细胞瘤或多药耐药性肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）本发明所述吲哚生物碱加合物能显著降低正常细胞的毒性和体内毒性，在体内外能被FAPα酶特异性水解切除二肽部分（Z-GP）释放出肼解产物；（2）所述加合物能显著抑制多种肿瘤细胞株的体外增殖以及荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长；（3）本发明的合成方法具有反应条件温和、实验步骤简单、收率高、产品纯度高、经济实用等特点。
附图说明
图1为重组人源FAP对吲哚生物碱加合物酶解效率。
图2为肿瘤组织FAP对吲哚生物碱加合物酶解效率。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。
实施例1 吲哚生物碱加合物的制备及分离纯化
1.1.1长春碱的肼解产物的制备：称取硫酸长春碱182mg（0.2mmol）于35ml厚壁耐压管中，加入8ml甲醇和0.9ml80%水合肼（23mmol），超声5min，充氮气脱除溶液中所含空气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入60℃油浴锅中搅拌反应24h，反应完毕后加水稀释，以二氯甲烷（DCM）萃取多次，合并有机相，依次用水、饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥后减压蒸除溶剂。所得混合物经RP-HPLC（反相制备高效液相色谱）分离纯化（流动相为MeOH:H2O:Et3N=70:30:0.005，V/V/V），得116mg浅黄色粉末状固体化合物，收率76.1%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.19(s,1H),8.03(s,1H),7.51(d,J=9.0Hz,1H),7.07～7.22(m,3H),6.54(s,1H),6.09(s,1H),5.74～5.88(m,2H),4.13(m,2H),3.84～4.00(m,3H),3.78(s,3H),3.60(s,3H),3.45～3.56(m,2H),3.34(d,J=6.0Hz,1H),3.29(d,J=6.0Hz,1H),3.12～3.27(m,3H),2.81～2.93(m,3H),2.78(s,3H),2.61(s,1H),2.39～2.54(m,3H),2.26～2.38(m,2H),1.94～2.08(m,2H),1.64～1.80(m,4H),1.43～1.58(m,3H),1.32～1.45(m,4H),0.81～0.96(m,6H);13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:175.3,173.4,158.0,152.5,135.0,131.4,130.4,129.3,123.9,123.7,122.5,122.3,120.0,118.9,118.4,116.7,110.5,93.4,84.1,80.5,73.7,69.3,66.4,64.0,55.8,55.7,53.3,52.4,50.4,50.2,49.7,47.7,45.1,42.2,41.0,40.8,38.3,34.5,32.8,29.7,22.6,8.6,6.9；ESI-MS(m/z):769.9[M+H]+。以上数据证明产物为去乙酰长春碱酰肼（JJ-CCJ），结构如下所示：
1.1.2长春瑞滨的肼解产物的制备：称取酒石酸长春瑞滨185.6mg（0.2mmol）于35ml厚壁耐压管中，往其中加入8ml甲醇和9ml80%水合肼（0.23mol），先超声5min，再充氮气脱气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入52℃油浴锅中搅拌反应60h，反应完成后加水稀释，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，Na2SO4干燥后移除溶剂。经HPLC分离纯化（MeOH:H2O:Et3N=70:30:0.005，V/V/V），得到89.8mg黄色粉末状固体化合物，收率为61%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.61(s,1H),8.22(br s,1H),8.02(d,J=6.0Hz,1H),7.16～7.25(m,2H),6.27(s,1H),6.09(s,1H),5.79～5.92(m,2H),5.71(d,J=9.0Hz,1H),4.92(d,J=15.0Hz,1H),4.52(d,J=15.0Hz,1H),4.19(d,J=15.0Hz,1H),4.02(s,1H),3.84(s,3H),3.70(s,3H),3.65(s,1H),3.40～3.55(m,3H),3.30(dd,J=3.0,15.0Hz,1H),3.10～3.23(m,2H),2.93(d,J=15.0Hz,1H),2.85(s,1H),2.80(s,1H),2.75(d,J=3.0Hz,1H),2.60～2.73(m,3H),2.36～2.59(m,3H),2.00～2.14(m,4H),1.88～1.99(m,2H),1.65～1.84(m,4H),1.22～1.34(m,4H),1.10(t,J=9.0,3H),0.84(t,J=9.0Hz,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:174.2,158.1,152.9,134.7,134.4,131.3,130.0,128.2,124.7,124.0,123.4,123.0,122.4,121.4,119.2,117.3,110.6,104.8,93.0,83.7,73.9,65.0,55.7,54.4,53.4,53.3,53.0,50.1,48.9,47.2,44.7,43.5,42.1,37.7,34.5,31.8,29.7,27.6,27.3,11.9,8.5；ESI-MS(m/z):737.5[M+H]+。以上数据证明产物为去乙酰长春瑞滨酰肼（JJ-CCRB），结构如下所示：
1.1.3文多灵的肼解产物的制备：称取文朵灵91.2mg（0.2mmol）于35ml厚壁耐压管中，往其中加入8ml甲醇和9ml80%水合肼（0.23mol），先超声5min，再充氮气脱气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入60℃油浴锅中搅拌反应24小时，反应完成后加水稀释，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化（MeOH:H2O:Et3N=80:20:0.005，V/V/V），得到75.3mg浅黄色粉末状固体化合物，收率为91%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.27(s,1H),6.83(d,J=9.0Hz,1H),6.22(dd,J=3.0,9.0Hz,1H),6.04(d,J=3.0Hz,1H),5.85(dd,J=6.0,12.0Hz,1H),5.73(d,J=9.0Hz,1H),4.10(s,1H),3.75(s,3H),3.43(s,1H),3.30～3.42(m,2H),2.82(d,J=15Hz,1H),2.73(s,3H),2.51(q,J=9.0Hz,1H),2.10～2.20(m,2H),1.98(s,1H),1.48(dt,J=6.0,15.0Hz,1H),1.04(dt,J=6.0,15.0Hz,1H),1.01(t,J=9.0Hz,3H);13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:173.9,161.0,153.5,130.8,124.6,123.3,122.5,103.7,95.0,84.4,80.6,76.6,73.5,67.7,55.2,52.9,50.9,44.8,42.2,38.4,32.2,7.6；ESI-MS(m/z):415.4[M+H]+。以上数据证明产物为去乙酰文多灵酰肼（JJ-WDL），结构如下所示：
1.1.4长春氟宁的肼解产物的制备：称取长春氟宁163.2mg（0.2mmol）于35ml厚壁耐压管中，往其中加入8ml甲醇、9ml80%水合肼，先超声5min，再充氮气脱气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入52℃油浴锅中搅拌反应60小时，反应完成后加水稀释，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后移除溶剂。经HPLC分离纯化（Acetonitrile:H2O:Et3N=55:45:0.005），得到80.5mg浅黄色粉末状固体化合物，总收率为52%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.53(br s,1H),8.48(s,1H),8.28(s,1H),7.72(d,J=6.0Hz,1H),7.18(m,3H),6.32(s,1H),6.08(s,1H),5.55～5.90(m,3H),4.48～4.64(m,2H),4.06(s,1H),3.80(s,3H),3.69(s,3H),3.37～3.45(m,3H),3.23～3.37(m,2H),3.13～3.22(m,1H),2.89～3.12(m,2H),2.79(s,3H),2.66(d,J=6.0Hz,1H),2.61(s,1H),2.51(s,1H),2.29～2.47(m,2H),1.91～2.05(m,3H),1.79～1.91(d,J=12.0Hz,1H),1.53～1.78(m,6H),1.22～1.36(m,2H),1.09～1.23(m,1H),0.81(t,J=9.0Hz,3H)；13CNMR(75MHz,CDCl3):δ174.7,173.5,157.8,152.5,134.6,133.3,130.2,128.5,124.0,122.8,122.7,122.4,120.0,119.0,118.3,110.6,109.2,92.9,83.8,80.4,73.7,65.5,55.6,55.3,53.4,53.1,52.7,50.2,49.3,47.0,46.3,44.7,42.0,37.9,33.7,32.0,29.9,28.5,22.5,21.5,8.4；ESI-MS(m/z):775.4[M+H]+。以上数据证明产物为去乙酰长春氟宁酰肼（JJ-CCFN），结构如下所示：
1.2.1Z-GP-NHNH-长春碱（BX-CCJ）的制备：称取36.7mg（0.12mmol）N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于5ml乙腈中，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min;取0.031mL（0.2mmol）DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min；另称取76.8mg（0.1mmol）JJ-CCJ，溶于1ml DCM中，在冰浴下缓慢滴加到上述反应液中，逐渐升至室温，随后在室温下继续搅拌反应24h。反应完毕后加水淬灭，以DCM萃取多次，合并有机相，依次用水、饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥后减压蒸除溶剂。所得混合物经RP-HPLC分离纯化（淋洗剂为MeOH:Water:Et3N=70:30:0.005，V/V/V），得目标化合物86.6mg（浅黄色粉末状固体），收率82.2%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.04(br,1H),7.53(d,J=9.0Hz1H),7.27～7.38(m,5H),7.05～7.21(m,3H),6.54(s,1H),6.08(s,1H),5.61～5.84(m,2H),5.00～5.20(m,2H),4.63(d,J=6.0Hz,1H),3.81～4.09(m,4H),3.76(s,3H),3.60(s,3H),3.56(s,2H),3.25～3.49(m,4H),3.08～3.24(m,3H),3.04(dd,J=6.0,15.0Hz,1H),2.86(s,2H),2.81(s,3H),2.60(s,1H),2.37～2.54(m,2H),2.24～2.37(m,2H),1.90～2.10(m,4H),1.58～1.79(m,2H),1.40～1.53(m,2H),1.14～1.39(m,8H),0.81～1.00(m,8H);13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:175.1,171.2,169.6,168.8,158.0,156.5,152.8,136.5,134.9,131.4,130.3,129.3,128.4,128.0,124.0,123.5,122.4,122.3,119.8,118.9,118.3,116.4,110.5,93.5,83.4,80.8,73.7,69.4,66.8,66.2,63.6,58.8,55.8,55.7,53.4,53.2,52.4,50.3,49.6,47.3,46.3,45.3,44.8,43.4,42.3,40.8,38.6,34.5,32.7,29.6,29.4,28.2,27.4,24.8,14.1,8.7,8.6,6.8;ESI-MS(m/z):1057.9[M+H]+。其质谱图见图1。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春碱（BX-CCJ），结构如下所示：
1.2.2Z-GP-NHNH-长春瑞滨（BX-CCRB）的制备：称取33.7mg（0.11mmol）Z-GP-OH溶于5ml乙腈中，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min，取0.031ml（0.2mmol）DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min，得反应液A；另称取73.6mg（0.1mmol）JJ-CCRB，溶于1ml DCM中，在冰浴下缓慢滴加到反应液A中，逐渐升至室温，随后在室温下搅拌反应24h，反应完毕后加水淬灭，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化（MeOH:H2O:Et3N=70:30:0.005，V/V/V），得到80.2mg白色粉末状固体化合物，收率为77%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.69(s,1H),8.43(br,1H),7.84(s,1H),7.14～7.40(m,9H),6.41(s,1H),6.32(s,1H),6.08(s,1H),5.79(s,2H),5.60(d,J=9.0Hz,1H),5.00～5.18(m,2H),4.94(d,J=15.0Hz1H),4.61(s,1H),4.46(d,J=12.0Hz,1H),3.88～4.11(m,4H),3.81(s,3H),3.69(s,3H),3.48～3.65(m,4H),3.36(m,4H),2.98～3.27(m,8H),2.87(m,1H),2.83(s,3H),2.67(m,2H),2.52(t,J=12.0Hz,2H),2.14～2.30(m,1H),1.83～2.14(m,6H),1.66～1.81(m,1H),1.50～1.66(m,1H),1.30(t,J=9.0Hz,3H),1.09(t,J=9.0Hz,3H),0.79(m,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:174.4,171.1,170.0,168.5,167.9,157.9,156.5,153.0,136.4,134.6,134.2,131.7,130.2,128.2,128.1,127.7,127.6,124.3,123.3,123.1,122.6,122.4,120.6,118.5,117.3,110.5,105.6,92.8,82.8,80.5,73.8,66.4,64.5,58.7,55.6,54.3,52.9,52.7,52.1,49.9,48.9,46.1,46.0,45.1,44.2,43.2,42.8,42.2,38.0,34.4,31.5,28.6,27.4,27.1,24.4,11.7,8.3,8.1；ESI-MS(m/z):1025.6[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春瑞滨（BX-CCRB），结构如下所示：
1.2.3Z-GP-NHNH-文多灵（BX-WDL）的制备：称取39.8mg（0.13mmol）Z-GP-OH溶于5ml乙腈，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min，取0.031ml（0.2mmol）DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min，得反应液A。另称取41.4mg（0.1mmol）JJ-WDL，溶于1ml DCM中，在冰浴下缓慢滴加到反应液A中，逐渐升至室温，随后在室温下搅拌反应24小时，反应完毕后加水淬灭，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化（MeOH:H2O:Et3N=70:30:0.005，V/V/V），得到61mg浅黄色粉末状固体化合物，收率为87%。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ:7.31(m,5H),6.93(d,J=9.0Hz,1H),6.26(dd,J=3.0,6.0Hz,1H),6.07(d,J=3.0Hz,1H),5.84(dd,J=3.0,9.0Hz,1H),5.60(d,J=12.0Hz,1H),5.08(d,J=6.0Hz,2H),4.55(dd,J=6.0,24.0Hz,1H),3.89～4.09(m,3H),3.72(s,3H),3.64(m,1H),2.73(s,3H),3.49～3.61(m,2H),3.42(dd,J=6.0,18.0Hz,1H),3.34(s,1H),3.31(m,1H),2.85(d,J=18.0Hz,1H),2.76(s,3H),2.71(s,1H),2.56(m,1H),2.06～2.26(m,2H),1.93(d,J=3.0,3H),1.23～1.43(m,2H),1.01(m,1H),0.64(t,J=6.0Hz,3H);13C NMR(75MHz,CD3OD)δ:173.8,173.5,170.3,162.6,159.0,155.4,138.1,132.0,129.5,129.0,128.9,126.5,125.1,124.0,105.1,96.6,85.2,82.2,75.0,69.0,67.7,60.5,55.8,54.2,52.2,52.0,47.7,47.6,45.7,44.2,44.1,33.5,30.7,25.7,23.4,22.1,9.21,8.1；ESI-MS(m/z):703.4[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-文多灵（BX-WDL），结构如下所示：
1.2.4Z-GP-NHNH-长春氟宁（BX-CCFN）的制备：称取30.6mg（0.1mmol）化合物2.2溶于5ml乙腈，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min，取0.031ml（0.2mmol）DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min。称取77.4mg（0.1mmol）JJ-CCFN，溶于1ml DCM中，在冰浴下缓慢滴加到反应体系中，反应逐渐升至室温，随后在室温下搅拌反应24小时，加水淬灭，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化（MeOH:H2O:Et3N=75:25:0.005），得到浅黄色粉末状固体化合物，总收率为74%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.73(d,J=6.0Hz,1H),7.26～7.38(m,5H),7.18(m,3H),6.31(s,1H),6.07(s,1H),5.79(dd,J=3.0,9.0Hz,1H),5.64(d,J=12.0Hz,1H),5.01～5.16(m,2H),4.44～4.75(m,2H),3.85～4.13(m,2H),3.79(s,3H),3.68(s,3H),3.51～3.65(m,2H),3.31～3.50(m,3H),3.26(dd,J=3.0,15Hz,1H),3.07～3.19(m,1H),2.90～3.07(m,3H),2.82(s,3H),2.78(s,1H),2.64(dd,J=6.0,15.0Hz,1H),2.55(s,1H),2.33～2.49(m,2H),1.65～1.73(m,2H),1.59～1.68(m,3H),1.31～1.43(m,1H),1.20～1.31(m,5H),1.06～1.20(m,2H),0.82～0.92(m,1H),0.80(t,J=9.0Hz,1H)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ174.6,173.3,171.2,170.0,168.6,157.8,156.5,155.7,153.0,136.4,134.6,133.5,130.3,128.5,128.4,127.9,127.8,124.3,122.9,122.5,122.4,120.1,118.8,118.3,93.1,83.1,80.7,73.8,66.7,65.3,58.7,55.6,55.3,53.1,52.7,50.2,49.5,49.4,49.2,46.4,46.3,45.8,45.0,44.5,43.3,42.3,38.2,33.6,32.0,29.6,28.6,28.1,24.7,22.5,8.6,8.3；ESI-MS(m/z):1063.4[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春氟宁（BX-CCFN），结构如下所示：
1.2.5Z-GP-NHNH-长春新碱（BX-CCXJ）的制备：称取1.1mol乙酸酐，加入0.5mol甲酸，充分搅拌均匀配成11:5的溶液备用。称取208mg（0.2mmol）BX-CCJ，溶于3ml DCM中，加入适量乙酸酐甲酸溶液，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕蒸除溶剂，经HPLC分离纯化（MeOH:H2O:Et3N=65:35:0.005），得到70.3mg浅黄色粉末状固体化合物，总收率为32.9%。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ8.50(m,1H),7.43(d,J=6.0Hz,2H),7.20～7.57(m,11H),7.15(d,J=6.0Hz,1H),7.08(t,J=6.0Hz,2H),7.00(t,J=6.0Hz,2H),6.54(s,1H),6.27(s,1H),5.80(m,2H),5.56～5.72(m,2H),5.00～5.14(m,4H),4.42～4.61(m,2H),3.90～4.10(m,9H),3.77～3.89(m,3H),3.72～3.75(m,1H),3.73(s,3H),3.61～3.68(m,4H),3.60(s,3H),3.49～3.57(m,3H),3.44(d,J=6.0Hz,1H),3.35～3.41(m,1H),3.29～3.33(m,4H),3.16～3.29(m,6H),3.00～3.15(m,3H),2.70～2.87(m,5H),2.63(d,J=12.0Hz,1H),2.39～2.52(m,4H),2.21～2.38(m,4H),2.05～2.21(m,7H),1.92～2.05(m,4H),1.80～2.02(m,2H),1.62～1.74(m,1H),1.44～1.61(m,4H),1.20～1.44(m,13H),0.66～1.00(m,17H);13C NMR(75MHz,CD3OD):δ177.3,174.0,173.9,173.3,170.3,170.2,159.3,158.9,158.5,151.4,138.1,136.9,136.5,132.1,131.8,131.1,130.4,130.2,129.4,129.0,128.9,128.8,126.4,125.4,125.2,124.0,123.3,120.6,119.9,119.1,118.2,117.6,112.0,111.3,102.4,94.3,82.8,81.7,75.7,75.0,69.5,69.3,69.0,67.7,64.0,60.4,60.3,60.1,57.5,56.9,56.6,56.3,54.4,54.0,53.0,52.9,51.9,51.8,47.6,44.7,44.1,43.5,41.1,40.9,35.8,33.6,33.3,33.0,30.7,30.5,30.4,27.7,25.8,23.7,14.4,9.0,7.3；ESI-MS(m/z):1071.5[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春新碱（BX-CCXJ），结构如下所示：
1.3.1BX-CCJ·硫酸盐的制备：将106.0mg（0.1mmol）BX-CCJ溶于12mL含0.01mol/L硫酸（0.12mmol）的1:1甲醇/二氯甲烷溶液中，于0℃下搅拌反应3h，室温下减压蒸除溶剂，所得固体化合物用冷乙醚洗涤三次，离心除去乙醚，合并固体化合物，将固体化合物重新溶于水中，冷冻干燥得成品111.4mg，收率为96.2%。
1.3.2BX-CCRB·酒石酸盐的制备：将102.5mg（0.1mmol）BX-CCRB溶于15mL含0.01mol/L酒石酸（0.15mmol）的1:1甲醇/二氯甲烷溶液中，于0℃下搅拌反应3小时，室温下减压蒸除溶剂，所得固体化合物用冷乙醚洗涤三次，离心除去乙醚，合并固体化合物，将固体化合物重新溶于水中，冷冻干燥得成品115.1mg，收率为98%。
实施例2 吲哚生物碱及其衍生物的体外细胞毒性实验
实验方法：取对数生长期的细胞（A549（人非小细胞肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）、CNE-2（人鼻咽癌细胞）、HepG2（人肝癌细胞）、Hela（人宫颈癌细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、NCI-N87（人胃癌细胞）、、PC-3（人前列腺癌细胞）、DU145（人前列腺癌细胞）、K562（人白血病细胞）、A375（人黑色素瘤细胞）、SH-SY5H（人神经母细胞瘤细胞）、人早幼粒白血病细胞（HL-60）、BEL-7402/5-Fu（人肝癌氟尿嘧啶耐药株）、HepG2/ADM（人肝癌多柔比星耐药株）、MCF-7/ADR（人乳腺癌阿霉素耐药株））分别加入RPMI1640培养液适量(胎牛血清10%，青霉素100U/mL），调整细胞浓度为5×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔接种肿瘤细胞悬液100μL。置于5%CO2培养箱中，37℃培养24h后，加入配制好的供试药物（对照组不加药物），继续培养72h后，每孔中加入5mg/mL MTT溶液30μL，37℃温孵4h，弃去上清液，每孔加入DMSO100μL溶解形成的甲臜（formazan），应用酶标仪（Thermo产品）于570nm处测OD值。
细胞生长抑制率按如下公式计算：
以样品浓度为横轴，以细胞生长抑制率为纵轴绘制曲线。根据细胞生长抑制曲线，计算出半数有效抑制浓度IC50值。
实验结果：从表2-1和2-2中可知，本实验所检测的吲哚生物碱、肼解产物及其加合物具有广谱抗肿瘤活性。在FAPα酶阴性表达的肿瘤细胞株上，吲哚生物碱的细胞毒性与相应的肼解产物相近，而肼解产物的细胞毒性优于加合物；另一方面，在FAPα酶阳性表达的LOVO细胞，吲哚生物碱肼解产物的细胞毒性与相应的加合物的细胞毒性几乎一致，说明加合物可能被FAPα酶切，产生相应的肼解产物。
表2-1.MTT法测定吲哚生物碱及其衍生物对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
表2-2.MTT法测定吲哚生物碱及其衍生物对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
实施例3 吲哚生物碱及其衍生物对正常细胞的体外毒性实验
实验方法：按实施例2方法检测吲哚生物碱、肼解产物和吲哚生物碱加合物对人正常肝癌细胞LO2以及人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外细胞毒性。
实验结果：肼解产物以及加合物对LO2和HUVEC的细胞毒性远小于相应的吲哚生物碱（见表3）。说明经靶向修饰后化合物的细胞毒性明显降低。
表3.MTT法测定吲哚生物碱及其衍生物对正常细胞的毒性作用
实施例4 重组人源FAPα特异性酶解吲哚生物碱加合物的实验
实验方法：HPLC色谱条件如下：高效液相色谱仪Agilent1200；色谱柱Cosmosil C18反相色谱柱（4.6x250mm2，5μm）；流动相（0min，55%甲醇和45%水（含2mM甲酸铵）；10min，65%甲醇和35%水（含2mM甲酸铵）；15min，75%甲醇和25%水（含2mM甲酸铵）；30min，85%甲醇和15%水（含2mM甲酸铵）；40min，85%甲醇和15%水（含2mM甲酸铵））；流速1mL/min；检测波长：254nm；进样量2uL。建立吲哚生物碱加合物检测标准曲线方法如下：将吲哚生物碱加合物溶解于酶解反应缓冲液（50mM Tris-HCl，1.0M NaCl，pH7.4）中，设计5个浓度梯度，分别为6.25μМ、12.5μМ、25μМ、50μМ、100μМ。以峰面积为纵坐标（Y），化合物浓度（μМ）为横坐标（X）绘制标准曲线。本实验重复3次。将终浓度为50μМ的Z-GP-NHNH-吲哚生物碱加合物分别孵育于含5μg/mL重组人源FAP的酶解反应缓冲液中，37℃水浴进行反应。分别在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h及24h时吸取上清，HPLC法检测酶解产物，计算酶解率(A:BX-CCJ，B:BX-CCRB，C:BX-CCFN，D:BX-CCXJ)。
实验结果：重组人源FAPα呈时间依赖性水解吲哚生物碱加合物（见图1）。实施例5肿瘤组织中FAPα特异性酶解吲哚生物碱加合物的实验
实验方法：裸鼠移植瘤接种后21天，用CO2麻醉后脱臼处死，剥离皮下肿瘤。用生理盐水洗净并清除脂肪组织，滤纸吸干表面水分。秤取约2g肿瘤组织，用剪刀剪成细小组织块，转移至玻璃匀浆器中，加入10mL酶解缓冲液匀浆。收集匀浆液，过200目筛网。精确量取10ml匀浆液，分别加入10μL浓度为50mM的吲哚生物碱加合物储存液，使化合物终浓度为50μМ，37℃水浴进行反应。分别在0h、2h、8h、12h及24h时吸取2mL匀浆液转至15mL离心管中，加入5mL萃取剂（乙腈/二氯乙烷=1：4），涡旋混匀1min，2500rpm离心5min，取下层有机相，于氮气下吹干，加入200μL甲醇溶解残渣，经0.22μm滤膜出去杂质，HPLC法检测酶解产物，计算酶解率（A:BX-CCJ，B:BX-CCRB，C:BX-CCFN，D:BX-CCXJ）。
实验结果：肿瘤组织FAPα呈时间依赖性水解吲哚生物碱加合物（见图2）。
实施例6 吲哚生物碱加合物的急性毒性实验
实验方法：取体重18～22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组10只，腹腔注射不同剂量的VLB以及吲哚生物碱加合物，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD50。
半数致死量按如下公式计算：
实验结果：结果表明，BX-CCJ的LD50约为10mg/kg，BX-CCRB的LD50约为12mg/kg，BX-CCFN的LD50约为15mg/kg，BX-CCXJ的LD50约为10mg/kg而VLB在4mg/kg的给药剂量下，已观察到一半小鼠的死亡。
实施例7 吲哚生物碱加合物的体内抗肿瘤实验
实验方法：将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞消化，用PBS清洗2遍，调整细胞密度为1×107个，每只BALB/nu/nu雌性裸鼠皮下接种0.1mL。待瘤块长至70～100mm3时，裸鼠随机分为生理盐水组（对照组）、VLB组和吲哚生物碱加合物组，每组6只，每只裸鼠分别隔天腹腔注射1mg/kg的VLB或1mg/kg的吲哚生物碱加合物，隔天给药，共给药8次，隔天测量裸鼠体重及肿瘤大小。实验结束后，处死裸鼠，剥离瘤块及各脏器器官。上述试验中肿瘤体积计算公式为：V=1/2(ab2)，其中a、b分别表示瘤块的长径和短径。
HepG2、LOVO、K562以及HL-60细胞裸鼠移植瘤模型的建立以及实验方法与上述方案一致。
实验结果：在1mg/kg的给药剂量下，吲哚生物碱加合物对MDA-MB-231、HepG2、LOVO、K562以及HL-60细胞的裸鼠移植瘤生长均有较强的抑制作用且效果明显优于VLB组（见表4-表8）。在1mg/kg的给药剂量下，吲哚生物碱加合物的毒性远低于VLB。与对照组比较，吲哚生物碱加合物组的体重、各脏器器官无明显差异，而VLB组的体重明显下降，且出现肝脏以及脾脏等脏器的损伤。
表4.吲哚生物碱加合物对MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表5.吲哚生物碱加合物对HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表6.吲哚生物碱加合物对LOVO裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表7.吲哚生物碱加合物对K562裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表8.吲哚生物碱加合物对HL-60裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
以上实验揭示了本发明所述吲哚生物碱加合物能显著降低正常细胞的毒性和体内毒性，在体内外能被FAPα酶特异性水解切除二肽部分（Z-GP）释放出肼解产物。本发明所述加合物能显著抑制多种肿瘤细胞株的体外增殖以及荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长。
Claims (8)
1.一种吲哚生物碱加合物，其特征在于，所述的吲哚生物碱加合物为选自如下结构式中的任意一种：
所述Z-GP表示苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基，其结构为：
2.权利要求1所述的吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐。
3.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，先将吲哚生物碱与水合肼反应得吲哚生物碱酰肼化合物，然后与苄氧羰基甘氨酰脯氨酸在缩合剂作用下反应得吲哚生物碱加合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1.将吲哚生物碱溶于有机溶剂，加入水合肼，氮气保护下避光加热搅拌反应10～60小时；反应温度控制在40℃～120℃；反应结束后分离纯化得吲哚生物碱酰肼化合物；
S2.将吲哚生物碱酰肼化合物、苄氧羰基甘氨酰脯氨酸和缩合试剂，在-10℃～50℃下避光搅拌反应；反应完毕后加水淬灭，分离、纯化得吲哚生物碱加合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1中所述的水合肼为40wt％～80wt％的水合肼；所述吲哚生物碱与水合肼的摩尔投料比为1:5.0～1200。
6.根据权利要求4所示的制备方法，其特征在于，S2中所述的缩合试剂选自氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N,N′-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和1-氯N,N,2-三甲基丙烯胺中的一种或几种的混合；S2中所述吲哚生物碱酰肼化合物、苄氧羰基甘氨酰脯氨酸和缩合试剂的投料摩尔比为1:1.05～3.0:1.05～3.0。
7.权利要求1所述的吲哚生物碱加合物或权利要求2所述的吲哚生物碱加合物生理上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胃癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、宫颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、肾母细胞瘤或多药耐药性肿瘤。
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