CN105121447B - 长春碱类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

长春碱类衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一类新的长春碱类衍生物及其新应用和制备方法。所述长春碱类衍生物包括肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物。所述的肼解长春碱类化合物为长春碱类化合物或其盐与水合肼反应所得到的化合物；所述的长春碱类二肽衍生物为肼解长春碱类化合物与N‑苄氧羰基甘氨酰脯氨酸缩合所得的化合物。本发明提供了所述长春碱类衍生物或其药物组合在抗肿瘤、预防或治疗糖尿病性视网膜病变、类风湿关节炎以及作为血管生成抑制剂或者血管阻断剂中的用途。

Description

长春碱类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明提供一类新的长春碱类衍生物及其制备方法和新应用。属于医药领域。
背景技术
血管生成是一个各方面严格调节的过程，在成熟的哺乳动物机体中，生理性的血管仅发生在卵巢、子宫和胎盘中，而在其他组织中血管生成后即保持高度的稳定性，受到许多正、负性调节因子的调控，从而保持动态平衡状态；病理性的血管生成包括伤口愈合和恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等一系列疾病过程(Peter B,et al.CurrOpin Genet Dev,2005,15:102-111)。
20世纪70年代初，Judah Folkman首先提出，恶性肿瘤的生长、迁移都与肿瘤血管的生成密切相关，大多数的肿瘤在生长到直径为2～3mm时就需要新生血管以供给养分及氧气(Folkman J.N Engl J Med,1971,285:1182-1186)；与肿瘤组织比较，正常组织的血管内皮细胞处于静息状态，血管成熟而稳定；而肿瘤组织的血管细胞具有迅速增殖、血管分级不规则、网络混乱等特点(Dietmar W,et al.Cancer Treat Rev,2011,37:63-74)。因此，肿瘤的血管系统成为一个非常重要的治疗靶点。目前大多数文献趋于将血管靶向剂分为血管生成抑制剂(anti-angiogenic drugs或angiogenesis inhibitors，AIs)和血管阻断剂(vascular disrupting agents，VDAs)(Patherson DM,et al.Clin Oncol(R CollRadio1),2007,19:443-456)。AIs主要通过抑制基质降解、抑制血管生成因子活化以及影响肿瘤血管内皮细胞增殖(Folkman J.Nat Rev Drug Discov.2007,6:273-286)等方式抑制肿瘤的血管新生。大量临床数据证实，AIs通过抑制血管的生成可有效地抑制肿瘤的恶化，减少肿瘤转移的发生(Gasparini G,et al.Nat Clin Pract Oncol.2005,2:562-577)；而VDAs则可以快速、广泛地破坏已形成的肿瘤血管，导致肿瘤内部缺血而大面积坏死，从而抑制肿瘤的生长(Philip ET.Clin Cancer Res,2004,10:415-427)。因此，抑制肿瘤血管生成以及破坏已形成的肿瘤血管已成为抗肿瘤药物研发的有效策略。
糖尿病性视网膜病变是一种严重的糖尿病并发症，严重影响糖尿病患者的生活质量(Malone JI,et al.Diabetes Care,2001,24:522-526；Ramavat PR,et al.J ClinDiagn Res,2013, 7:1387-1390)。虽然目前关于糖尿病性视网膜病变的确切发病机制还不完全清楚，有研究认为视网膜新生血管的形成参与了该病变的进程(Jae SY,etal.Diabetes Metab J,2013,37:262-269)。近年来，临床上发现，贝伐单抗作为VEGF(血管内皮生长因子)受体拮抗剂可用于治疗糖尿病性视网膜病变患者视网膜血管的生成，并取得了一定的疗效(Zhao LQ,et al.Br J Ophthalmol,2011,95:1216-1222)。然而，VEGF受体拮抗剂并不能完全抑制糖尿病性视网膜病变患者视网膜血管的生成(Watanabe D,et al.NEngl J Med,2005,353:782-792)。可见，寻找更加有效的抑制糖尿病性视网膜病变的药物具有重要意义。
另一方面，类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎合并侵蚀软骨，最终导致骨与关节破坏为特征的难治性疾病。类风湿性关节炎的发病机制至今尚未完全阐明，也无特效疗法。有文献报道，滑膜血管生成伴随炎性细胞浸润是类风湿性关节炎血管翳形成及关节破坏的重要病理特征(Lioté F.Rev Prat,1993,43:2239-2245；Roccaro AM,etal.Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005,4:27-30；Hirohats S,et al.Lancet,1999,353:1331-1334)。抑制类风湿性关节炎病人的滑膜血管生成已成为当前类风湿性关节炎的有效治疗策略之一。
长春碱类化合物包括从夹竹桃科植物长春花中分离得到的长春碱和长春新碱及其衍生物长春瑞滨和长春氟宁，它们都属于双吲哚生物碱。长春碱(VLB)和长春新碱(VCR)是天然来源的双吲哚生物碱(Beer MT.Br Emp Cancer Campaign,1955,33:487-489；Gorman M,et al.J Am Chem Soc,1959,81:4745-4746)。药理作用研究表明，长春碱及其类似物或者衍生物属于细胞毒性药物，主要抑制微管蛋白的聚合，妨碍纺锤体微管的形成，使细胞核分裂被阻滞于中期(Olmsted J B,et al.Annu Rev Biochem,1973,42:507-509)。长春碱及其衍生物具有广谱的抗肿瘤活性，临床上主要用于治疗何杰金氏病、绒毛膜上皮癌，对急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌、口咽部癌、单核细胞白血病均有一定疗效(Wilson L.Ann NY Acad Sci USA,1975,253:213-214)。近年来，Angelo Vacca等人研究发现，非毒剂量下长春碱可在细胞水平显著抑制血管的新生(Angelo V,et al.Blood,1999,94:4143-4155)；Giannoula Klement等人研究表明，持续给予低剂量的长春碱可抑制肿瘤血管的新生(Giannoula K,et al.J Clin Invest,2000,105:R15-24)；James Moore等人证实长春新碱能够抑制肿瘤新生血管的生长(James M,et al.J Pediatr Surg,2001,36:1273-1276)；另一方面，Anna Kruczynskia等人研究发现，长春氟宁可抑制肿瘤血管生成，同时破坏已生成的肿瘤血管，对实验性恶性肿瘤转移也有显著的抑制作用(Anna K,etal.Eur J Cancer,2006,42:2821-2832)。然而，长春碱类化合物在糖尿病视网膜病变以及类风湿性关节炎等方面的 应用和研究尚未见报道。
与许多临床使用的化疗药物一样，长春碱类药物在疾病治疗过程中也出现许多严重的副作用，例如骨髓抑制、肌痛、恶性呕吐等不良反应(Magnus P,et al.J Am Chem Soc，1987,109:7929-7930)，极大限制了其在临床上的应用。降低该类药物毒副作用的有效途径之一是对药物进行结构修饰，使之成为前体药物，利用病灶组织与正常组织之间分子生物学上的差异，选择性作用于病灶靶细胞的基因、酶、信号传导因子等，从而达到靶向治疗的目的。近年来大量研究表明，成纤维细胞激活蛋白酶α(Fibroblast-activation proteinα,FAPα)特异性表达于伤愈组织和90％以上的肿瘤组织激活的成纤维细胞与周细胞表面(Teresa RM,et al.Oncogene,2004,23:5435–5446)，同时亦表达于骨关节炎的软骨细胞表面(Jennifer MM,et al.Arthritis Res Ther,2006,8:R23)，在玻璃体视网膜病变组织的肌成纤维细胞表面也显著地高表达(Jennifer MM,et al.Acta Ophthalmol,2011,89:115-121)。综上所述，本发明将长春碱类化合物经化学修饰形成FAPα酶激活式前药，以期达到靶向、减毒和增效的目的。
发明内容
为了实现长春碱类药物的靶向性，克服现有技术中该类药物具有严重毒副作用的不足和提高药物的疗效，本发明提供了一类新的长春碱类衍生物(包括肼解长春碱类化合物以及长春碱类二肽衍生物)及其生理上可接受的盐，具体的发明技术方案如下：
本发明提供了一种长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐，其中所述的长春碱类二肽衍生物选自如下所示的结构，分别命名为BX-CCXJ、BX-CCJ、BX-CCRB和BX-CCFN。
其中，Z-GP-表示具有如下结构的苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基：
本发明还提供了上述长春碱类二肽衍生物的制备方法，其合成路线如下：
具体包括如下步骤：
S1.将长春碱类化合物或其盐溶于有机溶剂，加入水合肼，氮气保护下避光加热搅拌反应10～60小时；反应温度控制在40℃～120℃；反应结束后分离纯化得肼解长春碱类化合物(R-NHNH2)。
S2.将肼解长春碱类化合物(R-NHNH2)、苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)和缩合试剂，在-10℃～50℃下避光搅拌反应；反应完毕后加水淬灭，分离、纯化得长春碱类二肽衍生物(Z-GP-NHNH-R)。
作为一种优选方案，S1中所述的水合肼为40wt％～80wt％的水合肼；所述长春碱类化合物与水合肼的摩尔投料比为1:5～1200。S1中所述的有机溶剂为甲醇。
作为一种优选方案，S2中所述的缩合试剂选自氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和1-氯-N,N’,2-三甲基丙烯胺中的一种或几种的混合。
作为一种优选方案，S2中所述肼解长春碱类化合物、苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)和缩合试剂的投料摩尔比为1:1.05～3.0:1.05～3.0。
其中，所述的长春碱类化合物选自长春新碱、长春碱、长春氟宁、长春瑞滨或其盐；所述的肼解长春碱类化合物选自如下所示的JJ-CCXJ、JJ-CCJ、JJ-CCRB和JJ-CCFN。
本发明另一目的，还提供一种肼解长春碱类化合物或其生理上可接受的盐，其中所述的肼解长春碱类化合物选自如上所示JJ-CCXJ、JJ-CCJ、JJ-CCRB和JJ-CCFN。
本发明还提供了一种由上述长春碱类二肽衍生物形成的长春碱类二肽衍生物生理上可接受的盐及其制备方法。
作为一种优选方案，所述的长春碱类二肽衍生物生理上可接受的盐选自表1中的任意一种：
表1长春碱类二肽衍生物的成盐形式
本发明所述的长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐，在药用中可以游离态形式 存在。
上述所述的长春碱二肽衍生物或其生理上可接受的盐的制备方法，其特征在于，将长春碱类二肽衍生物，溶于含1.05～3.0摩尔量酸(HA)的有机溶剂中，于-10℃～40℃温度下搅拌反应3～20小时，分离固体化合物，洗涤，再将固体化合物重新溶于水中，冷冻干燥得成品。
作为一种优选方案，所述的酸为盐酸、硫酸、醋酸、酒石酸或柠檬酸，所述的有机溶剂为体积比为1:1的甲醇和二氯甲烷溶液。
本发明还提供了上述所述的肼解长春碱类化合物、长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，优选地，所述的肿瘤为胃癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、宫颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、肾母细胞瘤或多药耐药性肿瘤。
本发明还提供了上述所述的肼解长春碱类化合物、长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐在制备预防或治疗糖尿病性视网膜病变或类风湿关节炎药物中的应用。
本发明还提供了上述所述的肼解长春碱类化合物、长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐在制备血管生成抑制剂或者血管阻断剂的药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述所述的长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐或者所述的肼解长春碱类化合物或其生理上可接受的盐。
其中，上述所述的生理上可接受的盐，可以选自盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、酒石酸盐或柠檬酸盐。
上述所述应用，优选地，其中所述的长春碱类二肽衍生物作为FAPα特异性水解底物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述的长春碱类二肽衍生物能显著降低正常细胞的毒性和体内毒性，在体内外能被FAPα酶特异性水解切除二肽部分(Z-GP)释放出肼解长春碱类化合物。
(2)所述长春碱类衍生物能显著抑制多种肿瘤细胞株的体外增殖以及荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长。
(3)本发明所述的长春碱类衍生物还具有显著的抑制新的血管生成及破坏已形成的新生血管的作用。
(4)本发明所述的长春碱类衍生物对HUVECs细胞侵袭能力、迁移能力以及HUVECs管腔形成具有很好抑制作用；对眼角膜微囊袋血管生成、滑膜血管生成以及基质胶栓塞模型血管生成等，具有很好抑制作用。同时对已形成的HUVECs管腔、眼角膜微囊 袋血管、滑膜血管以及基质胶栓塞血管具有破坏作用。
(5)体内外的药效试验均显示，本发明所述的长春碱类衍生物可应用于恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病的治疗或预防。特别地，本发明还发现，所述的长春碱类衍生物在应用于恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病上，与长春碱类化合物相比，具有更好的药效，并且二者药效上差别显著。
(6)本发明的合成方法具有反应条件温和、实验步骤简单、收率高、产品纯度高、经济实用等特点。特别是，本发明所述的肼解长春碱类化合物可作为所述的长春碱类二肽衍生物的合成中间体，而且其本身也具有良好的生理活性，可以作为活性成分应用于制备相关药物。
附图说明
图1为重组人源FAPα对长春碱类二肽衍生物酶解效率。
图2为肿瘤组织FAPα对长春碱类二肽衍生物酶解效率。
图3为长春碱类衍生物对HUVECs细胞侵袭能力的抑制作用。
图4为长春碱类衍生物对HUVECs细胞迁移能力的抑制作用。
图5为长春碱类衍生物对HUVECs管腔形成的抑制作用。
图6为长春碱类衍生物对已形成HUVECs管腔的破坏作用。
图7为长春碱类衍生物对鸡胚尿囊膜血管生长的抑制作用。
图8为长春碱类衍生物对已形成鸡胚尿囊膜血管的破坏作用
图9为长春碱类衍生物对大鼠胸主动脉环微血管生成的抑制作用。
图10为长春碱类衍生物对已形成大鼠胸主动脉环微血管的破坏作用。
图11为长春碱类衍生物对基质胶栓塞模型血管生成的抑制作用。
图12为长春碱类衍生物对已形成基质胶栓塞模型血管的破坏作用。
图13为长春碱类衍生物对大鼠眼角膜微囊袋血管生成的抑制作用。
图14为长春碱类衍生物对已形成大鼠眼角膜微囊袋血管的破坏作用。
图15为长春碱类衍生物对CIA小鼠滑膜血管生成的抑制作用。
图16为长春碱类衍生物对已形成CIA小鼠滑膜血管的破坏作用。
其中，在图3－16中，*表示P<0.05,**表示P<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1长春碱类衍生物的制备及分离纯化
1.1.1长春碱的肼解：称取长春碱硫酸盐182mg(0.2mmol)于35mL厚壁耐压管中，加入8mL甲醇和0.9mL 80％水合肼(23mmol)，超声5min，充氮气脱除溶液中所含空气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入60℃油浴锅中搅拌反应24h，反应完毕后加水稀释，以二氯甲烷(DCM)萃取多次，合并有机相，依次用水、饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥后减压蒸除溶剂。所得混合物经RP-HPLC(反相制备高效液相色谱)分离纯化(流动相为MeOH:H2O:Et3N＝70:30:0.005，V/V/V)，得116mg浅黄色粉末状固体化合物，收率76.1％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.19(s,1H),8.03(s,1H),7.51(d,J＝9.0Hz,1H),7.07～7.22(m,3H),6.54(s,1H),6.09(s,1H),5.74～5.88(m,2H),4.13(m,2H),3.84～4.00(m,3H),3.78(s,3H),3.60(s,3H),3.45～3.56(m,2H),3.34(d,J＝6.0Hz,1H),3.29(d,J＝6.0Hz,1H),3.12～3.27(m,3H),2.81～2.93(m,3H),2.78(s,3H),2.61(s,1H),2.39～2.54(m,3H),2.26～2.38(m,2H),1.94～2.08(m,2H),1.64～1.80(m,4H),1.43～1.58(m,3H),1.32～1.45(m,4H),0.81～0.96(m,6H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:175.3,173.4,158.0,152.5,135.0,131.4,130.4,129.3,123.9,123.7,122.5,122.3,120.0,118.9,118.4,116.7,110.5,93.4,84.1,80.5,73.7,69.3,66.4,64.0,55.8,55.7,53.3,52.4,50.4,50.2,49.7,47.7,45.1,42.2,41.0,40.8,38.3,34.5,32.8,29.7,22.6,8.6,6.9；ESI-MS(m/z):769.9[M+H]+。以上数据证明产物为肼解长春碱(JJ-CCJ)，结构如下所示：
1.1.2长春瑞滨的肼解：称取长春瑞滨酒石酸盐185.6mg(0.2mmol)于35mL厚壁耐压管中，往其中加入8mL甲醇和9mL 80％水合肼(0.23mol)，先超声5min，再充氮气脱气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入52℃油浴锅中搅拌反应60h，反应完成后加水稀释，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，Na2SO4干燥后移除溶剂。经HPLC分离纯化(MeOH:H2O:Et3N＝70:30:0.005，V/V/V)，得到89.8mg黄色粉末状固体化合物，收率为61％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.61(s,1H),8.22(br s,1H),8.02(d,J＝6.0Hz,1H),7.16～7.25(m,2H),6.27(s,1H),6.09(s,1H),5.79～5.92(m,2H),5.71(d,J＝9.0Hz, 1H),4.92(d,J＝15.0Hz,1H),4.52(d,J＝15.0Hz,1H),4.19(d,J＝15.0Hz,1H),4.02(s,1H),3.84(s,3H),3.70(s,3H),3.65(s,1H),3.40～3.55(m,3H),3.30(dd,J＝3.0,15.0Hz,1H),3.10～3.23(m,2H),2.93(d,J＝15.0Hz,1H),2.85(s,1H),2.80(s,1H),2.75(d,J＝3.0Hz,1H),2.60～2.73(m,3H),2.36～2.59(m,3H),2.00～2.14(m,4H),1.88～1.99(m,2H),1.65～1.84(m,4H),1.22～1.34(m,4H),1.10(t,J＝9.0,3H),0.84(t,J＝9.0Hz,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:174.2,158.1,152.9,134.7,134.4,131.3,130.0,128.2,124.7,124.0,123.4,123.0,122.4,121.4,119.2,117.3,110.6,104.8,93.0,83.7,73.9,65.0,55.7,54.4,53.4,53.3,53.0,50.1,48.9,47.2,44.7,43.5,42.1,37.7,34.5,31.8,29.7,27.6,27.3,11.9,8.5；ESI-MS(m/z):737.5[M+H]+。以上数据证明产物为肼解长春瑞滨(JJ-CCRB)，结构如下所示：
1.1.3长春新碱的肼解：称取长春新碱硫酸盐461mg(0.5mmol)于100mL厚壁耐压管中，往其中加入20mL甲醇和20mL 80％水合肼(0.51mol)，先超声5min，再充氮气脱气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入60℃油浴锅中搅拌反应24小时，反应完成后加水稀释，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化(Acetonitrile:H2O:Et3N＝55:45:0.005，V/V/V)，得到324mg浅黄色粉末状固体化合物，收率为86％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:9.77(s,1H),8.06(s,1H),7.51(d,J＝9.0Hz,1H),7.05～7.19(m,3H),6.60(s,1H),6.20(s,1H),5.76～5.94(m,3H),5.65(d,J＝9.0Hz,1H),5.48(s,1H),4.00(s,1H),3.85～3.96(m,1H),3.83(s,1H),3.72(s,3H),3.58(s,3H),3.25～3.47(m,4H),3.04～3.24(m,3H),2.72～2.88(m,3H),2.35～2.52(m,3H),2.27(d,J＝15.0Hz,1H),2.02～2.15(m,2H),1.98(s,3H),1.79～1.93(m,1H),1.48～1.65(m,2H),1.36～1.48(m,2H),0.8～1.00(m,8H)；ESI-MS(m/z):755.6([M+H]+)。以上数据证明产物为肼解长春新碱(JJ-CCXJ)，结构如下所示：
1.1.4长春氟宁的肼解：称取长春氟宁163.2mg(0.2mmol)于35mL厚壁耐压管中，往其中加入8mL甲醇、9mL 80％水合肼，先超声5min，再充氮气脱气，然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入52℃油浴锅中搅拌反应60小时，反应完成后加水稀释，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后移除溶剂。经HPLC分离纯化(Acetonitrile:H2O:Et3N＝55:45:0.005)，得到80.5mg浅黄色粉末状固体化合物，总收率为52％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.53(br s,1H),8.48(s,1H),8.28(s,1H),7.72(d,J＝6.0Hz,1H),7.18(m,3H),6.32(s,1H),6.08(s,1H),5.55～5.90(m,3H),4.48～4.64(m,2H),4.06(s,1H),3.80(s,3H),3.69(s,3H),3.37～3.45(m,3H),3.23～3.37(m,2H),3.13～3.22(m,1H),2.89～3.12(m,2H),2.79(s,3H),2.66(d,J＝6.0Hz,1H),2.61(s,1H),2.51(s,1H),2.29～2.47(m,2H),1.91～2.05(m,3H),1.79～1.91(d,J＝12.0Hz,1H),1.53～1.78(m,6H),1.22～1.36(m,2H),1.09～1.23(m,1H),0.81(t,J＝9.0Hz,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ174.7,173.5,157.8,152.5,134.6,133.3,130.2,128.5,124.0,122.8,122.7,122.4,120.0,119.0,118.3,110.6,109.2,92.9,83.8,80.4,73.7,65.5,55.6,55.3,53.4,53.1,52.7,50.2,49.3,47.0,46.3,44.7,42.0,37.9,33.7,32.0,29.9,28.5,22.5,21.5,8.4；ESI-MS(m/z):775.4[M+H]+。以上数据证明产物为肼解长春氟宁(JJ-CCFN)，结构如下所示：
1.2.1 Z-GP-NHNH-长春碱(BX-CCJ)的制备：称取36.7mg(0.12mmol)N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于5mL乙腈中，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min；取0.031mL(0.2mmol)DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min；另称取76.8mg(0.1mmol)JJ-CCJ，溶于1mL DCM中，在冰浴下缓慢滴加到上述反应液中，逐渐升至室温，随后在室温下继续搅拌反应24h。反应完毕后加水淬灭，以DCM萃取多次，合并有机相，依次用水、饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥后减压蒸除溶剂。所得混合物经RP-HPLC分离纯化(淋洗剂为MeOH:Water:Et3N＝70:30:0.005，V/V/V)，得目标化合物86.6mg(浅黄色粉末状固体)，收率82.2％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.04(br,1H),7.53(d,J＝9.0Hz 1H),7.27～7.38(m,5H),7.05～7.21(m,3H),6.54(s,1H),6.08(s,1H),5.61～5.84(m,2H),5.00～5.20(m,2H),4.63(d,J＝6.0Hz,1H),3.81～4.09(m,4H),3.76(s,3H),3.60(s,3H),3.56(s,2H),3.25～3.49(m,4H),3.08～3.24(m,3H),3.04(dd,J＝6.0,15.0Hz,1H),2.86(s,2H),2.81(s,3H),2.60(s,1H),2.37～2.54(m,2H),2.24～2.37(m,2H),1.90～2.10(m,4H),1.58～1.79(m,2H),1.40～1.53(m,2H),1.14～1.39(m,8H),0.81～1.00(m,8H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:175.1,171.2,169.6,168.8,158.0,156.5,152.8,136.5,134.9,131.4,130.3,129.3,128.4,128.0,124.0,123.5,122.4,122.3,119.8,118.9,118.3,116.4,110.5,93.5,83.4,80.8,73.7,69.4,66.8,66.2,63.6,58.8,55.8,55.7,53.4,53.2,52.4,50.3,49.6,47.3,46.3,45.3,44.8,43.4,42.3,40.8,38.6,34.5,32.7,29.6,29.4,28.2,27.4,24.8,14.1,8.7,8.6,6.8；ESI-MS(m/z):1057.9[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春碱(BX-CCJ)，结构如下所示：
1.2.2 Z-GP-NHNH-长春瑞滨(BX-CCRB)的制备：称取33.7mg(0.11mmol)Z-GP-OH溶于5mL乙腈中，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min，取0.031mL(0.2mmol)DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min，得反应液A；另称取73.6mg(0.1mmol)JJ-CCRB，溶于1mL DCM中，在冰浴下缓慢滴加到反应液A中，逐渐升至室温，随后在室温下搅拌反应24h，反应完毕后加水淬灭，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清 洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化(MeOH:H2O:Et3N＝70:30:0.005，V/V/V)，得到80.2mg白色粉末状固体化合物，收率为77％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.69(s,1H),8.43(br,1H),7.84(s,1H),7.14～7.40(m,9H),6.41(s,1H),6.32(s,1H),6.08(s,1H),5.79(s,2H),5.60(d,J＝9.0Hz,1H),5.00～5.18(m,2H),4.94(d,J＝15.0Hz 1H),4.61(s,1H),4.46(d,J＝12.0Hz,1H),3.88～4.11(m,4H),3.81(s,3H),3.69(s,3H),3.48～3.65(m,4H),3.36(m,4H),2.98～3.27(m,8H),2.87(m,1H),2.83(s,3H),2.67(m,2H),2.52(t,J＝12.0Hz,2H),2.14～2.30(m,1H),1.83～2.14(m,6H),1.66～1.81(m,1H),1.50～1.66(m,1H),1.30(t,J＝9.0Hz,3H),1.09(t,J＝9.0Hz,3H),0.79(m,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:174.4,171.1,170.0,168.5,167.9,157.9,156.5,153.0,136.4,134.6,134.2,131.7,130.2,128.2,128.1,127.7,127.6,124.3,123.3,123.1,122.6,122.4,120.6,118.5,117.3,110.5,105.6,92.8,82.8,80.5,73.8,66.4,64.5,58.7,55.6,54.3,52.9,52.7,52.1,49.9,48.9,46.1,46.0,45.1,44.2,43.2,42.8,42.2,38.0,34.4,31.5,28.6,27.4,27.1,24.4,11.7,8.3,8.1；ESI-MS(m/z):1025.6[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春瑞滨(BX-CCRB)，结构如下所示：
1.2.3 Z-GP-NHNH-长春新碱(BX-CCXJ)的制备：称取137.7mg(0.45mmol)Z-GP-OH溶于7.5mL乙腈，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min，取0.09mL(0.6mmol)DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min，得反应液A。另称取339.0mg(0.45mmol)JJ-CCXJ，溶于4.5mL DCM中，在冰浴下缓慢滴加到反应液A中，逐渐升至室温，随后在室温下搅拌反应24小时，反应完毕后加水淬灭，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化(MeOH:H2O:Et3N＝80:20:0.005，V/V/V)，得到286.1mg浅黄色粉末状固体化合物，收率为61％，该化合物命名为B。
取1.1mol乙酸酐，加入0.5mol甲酸，充分搅拌均匀配成11:5的溶液备用。称取208mg(0.2mmol)化合物B，溶于3mL DCM中，加入适量乙酸酐甲酸溶液，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕蒸除溶剂，经HPLC分离纯化(MeOH:H2O:Et3N＝65:35:0.005)，得到70.3mg浅黄色粉末状固体化合物，总收率为32.9％。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ:8.50(m, 1H),7.43(d,J＝6.0Hz,2H),7.20～7.57(m,11H),7.15(d,J＝6.0Hz,1H),7.08(t,J＝6.0Hz,2H),7.00(t,J＝6.0Hz,2H),6.54(s,1H),6.27(s,1H),5.80(m,2H),5.56～5.72(m,2H),5.00～5.14(m,4H),4.42～4.61(m,2H),3.90～4.10(m,9H),3.77～3.89(m,3H),3.72～3.75(m,1H),3.73(s,3H),3.61～3.68(m,4H),3.60(s,3H),3.49～3.57(m,3H),3.44(d,J＝6.0Hz,1H),3.35～3.41(m,1H),3.29～3.33(m,4H),3.16～3.29(m,6H),3.00～3.15(m,3H),2.70～2.87(m,5H),2.63(d,J＝12.0Hz,1H),2.39～2.52(m,4H),2.21～2.38(m,4H),2.05～2.21(m,7H),1.92～2.05(m,4H),1.80～2.02(m,2H),1.62～1.74(m,1H),1.44～1.61(m,4H),1.20～1.44(m,13H),0.66～1.00(m,17H)；13C NMR(75MHz,CD3OD)δ:177.3,174.0,173.9,173.3,170.3,170.2,159.3,158.9,158.5,151.4,138.1,136.9,136.5,132.1,131.8,131.1,130.4,130.2,129.4,129.0,128.9,128.8,126.4,125.4,125.2,124.0,123.3,120.6,119.9,119.1,118.2,117.6,112.0,111.3,102.4,94.3,82.8,81.7,75.7,75.0,69.5,69.3,69.0,67.7,64.0,60.4,60.3,60.1,57.5,56.9,56.6,56.3,54.4,54.0,53.0,52.9,51.9,51.8,47.6,44.7,44.1,43.5,41.1,40.9,35.8,33.6,33.3,33.0,30.7,30.5,30.4,27.7,25.8,23.7,14.4,9.0,7.3；ESI-MS(m/z):1071.5([M+H]+)。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春新碱(BX-CCXJ)，结构如下所示：
1.2.4 Z-GP-NHNH-长春氟宁(BX-CCFN)的制备：称取30.6mg(0.1mmol)化合物苄基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)溶于5mL乙腈，用胶塞密封，置冰浴中搅拌5min，取0.031mL(0.2mmol)DIC加入反应体系中，在冰浴下搅拌反应20min。称取77.4mg(0.1mmol)JJ-CCFN，溶于1mL DCM中，在冰浴下缓慢滴加到反应体系中，反应逐渐升至室温，随后在室温下搅拌反应24小时，加水淬灭，以DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和NaCl溶液清洗，无水Na2SO4干燥后蒸除溶剂。经HPLC分离纯化(MeOH:H2O:Et3N＝75:25:0.005)，得到浅黄色粉末状固体化合物，总收率为74％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.73(d,J＝6.0Hz,1H),7.26～7.38(m,5H),7.18(m,3H),6.31(s,1H),6.07(s,1H),5.79(dd,J＝3.0,9.0Hz,1H),5.64(d,J＝12.0Hz,1H),5.01～5.16(m,2H),4.44～4.75(m,2H),3.85～4.13(m, 2H),3.79(s,3H),3.68(s,3H),3.51～3.65(m,2H),3.31～3.50(m,3H),3.26(dd,J＝3.0,15Hz,1H),3.07～3.19(m,1H),2.90～3.07(m,3H),2.82(s,3H),2.78(s,1H),2.64(dd,J＝6.0,15.0Hz,1H),2.55(s,1H),2.33～2.49(m,2H),1.65～1.73(m,2H),1.59～1.68(m,3H),1.31～1.43(m,1H),1.20～1.31(m,5H),1.06～1.20(m,2H),0.82～0.92(m,1H),0.80(t,J＝9.0Hz,1H)；13CNMR(75MHz,CDCl3):δ174.6,173.3,171.2,170.0,168.6,157.8,156.5,155.7,153.0,136.4,134.6,133.5,130.3,128.5,128.4,127.9,127.8,124.3,122.9,122.5,122.4,120.1,118.8,118.3,93.1,83.1,80.7,73.8,66.7,65.3,58.7,55.6,55.3,53.1,52.7,50.2,49.5,49.4,49.2,46.4,46.3,45.8,45.0,44.5,43.3,42.3,38.2,33.6,32.0,29.6,28.6,28.1,24.7,22.5,8.6,8.3；ESI-MS(m/z):1063.4[M+H]+。以上数据证明产物为Z-GP-NHNH-长春氟宁(BX-CCFN)，结构如下所示：
1.3.1 BX-CCJ·硫酸盐的制备：将106.0mg(0.1mmol)BX-CCJ溶于12mL含0.01mol/L硫酸(0.12mmol)的1:1甲醇/二氯甲烷溶液中，于0℃下搅拌反应3h，室温下减压蒸除溶剂，所得固体化合物用冷乙醚洗涤三次，离心除去乙醚，合并固体化合物，将固体化合物重新溶于水中，冷冻干燥得成品111.4mg，收率为96.2％。
1.3.2 BX-CCRB·酒石酸盐的制备：将102.5mg(0.1mmol)BX-CCRB溶于15mL含0.01mol/L酒石酸(0.15mmol)的1:1甲醇/二氯甲烷溶液中，于0℃下搅拌反应3小时，室温下减压蒸除溶剂，所得固体化合物用冷乙醚洗涤三次，离心除去乙醚，合并固体化合物，将固体化合物重新溶于水中，冷冻干燥得成品115.1mg，收率为98％。
实施例2长春碱类衍生物的体外细胞生长抑制活性实验
实验方法：取对数生长期的细胞(A549(人非小细胞肺癌细胞)、LOVO(人结肠癌细胞)、CNE-2(人鼻咽癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、NCI-N87(人胃癌细胞)、、PC-3(人前列腺癌细胞)、DU145(人前列腺癌细胞)、K562(人白血病细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)、SH-SY5H(人神经母细胞瘤细胞)、人早幼粒白血病细胞(HL-60)、BEL-7402/5-Fu(人肝 癌氟尿嘧啶耐药株)、HepG2/ADM(人肝癌多柔比星耐药株)、MCF-7/ADR(人乳腺癌阿霉素耐药株))分别加入RPMI 1640培养液适量(胎牛血清10％，青霉素100U/mL)，调整细胞浓度为5×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔接种肿瘤细胞悬液100μL。置于5％CO2培养箱中，37℃培养24h后，加入配制好的供试药物(对照组不加药物)，继续培养72h后，每孔中加入5mg/mL MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]溶液30μL，37℃温孵4h，弃去上清液，每孔加入DMSO 100μL溶解形成的甲臜(formazan)，应用酶标仪(Thermo产品)于570nm处测OD值。
细胞生长抑制率按如下公式计算：
以样品浓度为横轴，以细胞生长抑制率为纵轴绘制曲线。根据细胞生长抑制曲线，计算出半数有效抑制浓度IC50值。
实验结果：从表2-1和2-2中可知，本实验所检测的长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物具有广谱抗肿瘤活性。在FAPα酶阴性表达的肿瘤细胞株上，长春碱类化合物的细胞生长抑制活性与相应的肼解长春碱类化合物相近，而长春碱类化合物及相应的肼解长春碱类化合物的细胞生长抑制活性均优于相应的长春碱类二肽衍生物；另一方面，在FAPα酶阳性表达的LOVO细胞，肼解长春碱类化合物的细胞生长抑制活性与相应的长春碱类二肽衍生物几乎一致，说明长春碱类二肽衍生物可以被FAPα酶切，产生相应的肼解长春碱类化合物。
表2-1. MTT法测定长春碱类衍生物对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
表2-2. MTT法测定长春碱类衍生物对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
实施例3长春碱类衍生物对正常细胞的体外毒性实验
实验方法：按实施例2方法检测长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二 肽衍生物对人正常肝癌细胞LO2以及人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外细胞毒性。
实验结果：肼解长春碱类化合物及长春碱类二肽衍生物对LO2和HUVEC的细胞毒性远小于相应的长春碱类化合物(见表3)。说明经靶向修饰后化合物的细胞毒性明显降低。
表3. MTT法测定长春碱类衍生物对正常细胞的毒性作用
实施例4重组人源FAPα特异性酶解长春碱类二肽衍生物的实验
实验方法：HPLC色谱条件如下：高效液相色谱仪Agilent 1200；色谱柱CosmosilC18反相色谱柱(4.6×250mm2，5μm)；流动相[0min，55％甲醇和45％水(含2mM甲酸铵)；10min，65％甲醇和35％水(含2mM甲酸铵)；15min，75％甲醇和25％水(含2mM甲酸铵)；30min，85％甲醇和15％水(含2mM甲酸铵)；40min，85％甲醇和15％水(含、、2mM甲酸铵)]；流速1mL/min；检测波长：254nm；进样量2μL。建立长春碱类二肽衍生物检测标准曲线方法如下：将长春碱类二肽衍生物溶解于酶解反应缓冲液(50mM Tris-HCl，1.0M NaCl，pH7.4)中，设计5个浓度梯度，分别为6.25、12.5、25、50、100μМ。以峰面积为纵坐标(Y)，化合物浓度(μМ)为横坐标(X)绘制标准曲线。本实验重复3次。将终浓度为50μМ的长春碱类二肽衍生物分别孵育于含5μg/mL重组人源FAPα的酶 解反应缓冲液中，37℃水浴进行反应。分别在0、0.5、1、2、4、8、12及24h时吸取上清，HPLC法检测酶解产物，计算酶解率。其中A:BX-CCJ；B:BX-CCRB；C:BX-CCFN；D:BX-CCXJ。
实验结果：重组人源FAPα呈时间依赖性水解长春碱类二肽衍生物(见图1)。
实施例5肿瘤组织中FAPα特异性酶解长春碱类二肽衍生物实验
实验方法：裸鼠移植瘤接种后21天，用CO2麻醉后脱臼处死，剥离皮下肿瘤。用生理盐水洗净并清除脂肪组织，滤纸吸干表面水分。秤取约2g肿瘤组织，用剪刀剪成细小组织块，转移至玻璃匀浆器中，加入10mL酶解缓冲液匀浆。收集匀浆液，过200目筛网。精确量取10mL匀浆液，分别加入10μL浓度为50mM的长春碱类二肽衍生物储存液，使化合物终浓度为50μМ，37℃水浴进行反应。分别在0、2、8、12及24h时吸取2mL匀浆液转至15mL离心管中，加入5mL萃取剂(乙腈/二氯乙烷＝1:4)，涡旋混匀1min，2500rpm离心5min，取下层有机相，于氮气下吹干，加入200μL甲醇溶解残渣，经0.22μm滤膜出去杂质，HPLC法检测酶解产物，计算酶解率。其中A:BX-CCJ；B:BX-CCRB；C:BX-CCFN；D:BX-CCXJ。
实验结果：肿瘤组织FAPα呈时间依赖性水解长春碱类二肽衍生物(见图2)。
实施例6长春碱类二肽衍生物的急性毒性实验
实验方法：取体重18～22g的昆明种小鼠(购自广东省动物中心)，随机分组，每组10只，腹腔注射不同剂量的VLB(长春碱)以及长春碱类二肽衍生物，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD50。
半数致死量按如下公式计算：
实验结果：结果表明，BX-CCJ的LD50约为10mg/kg，BX-CCRB的LD50约为12mg/kg，BX-CCFN的LD50约为15mg/kg，BX-CCXJ的LD50约为10mg/kg；而VLB在4mg/kg的给药剂量下，已观察到一半小鼠的死亡。
实施例7长春碱类衍生物的体内抗肿瘤实验
实验方法：将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞消化，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗2遍，调整细胞密度为1×107个，每只BALB/nu/nu雌性裸鼠皮下接种0.1mL。待瘤块长至70～100mm3时，裸鼠随机分为生理盐水组(对照组)、长春碱类化合物(VLB、CCRB、CCFN、CCXJ)以及长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、 BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ组，每组6只，每只裸鼠分别隔天腹腔注射1mg/kg的上述药物，共给药8次，隔天测量裸鼠体重及肿瘤大小。实验结束后，处死裸鼠，剥离瘤块及各脏器器官。上述试验中肿瘤体积计算公式为：V＝1/2(ab2)，其中a、b分别表示瘤块的长径和短径。
HepG2、LOVO、K562以及HL-60细胞裸鼠移植瘤模型的建立以及实验方法与上述方案一致。
实验结果：在1mg/kg的给药剂量下，长春碱类化合物以及长春碱类衍生物对MDA-MB-231、HepG2、LOVO、K562以及HL-60细胞的裸鼠移植瘤生长均有较强的抑制作用且效果明显(见表4-表8)。在1mg/kg的给药剂量下，长春碱类二肽衍生物的毒性远低于相对应的长春碱类化合物及肼解长春碱类化合物。与生理盐水组比较，长春碱类二肽衍生物组的体重、各脏器器官无明显差异，而相对应的长春碱类化合物及肼解长春碱类化合物组的体重明显下降，且出现肝脏以及脾脏等脏器的损伤。
表4.长春碱类衍生物对MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表5.长春碱类衍生物对HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表6.长春碱类衍生物对LOVO裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表7.长春碱类衍生物对K562裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
表8.长春碱类衍生物对HL-60裸鼠移植瘤的抑制作用
相比于对照组，*P<0.05，**P<0.01
实施例8长春碱类衍生物对人血管内皮细胞HUVECs侵袭能力的抑制作用
实验方法：将处于对数生长期的HUVECs细胞消化，离心，计数，以5×106/mL分别接种于铺有Matrigel基质胶(BD公司)的Transwell小室，每孔0.1mL，置于5％CO2、37℃细胞培养箱孵育24小时后，设立空白对照组及给药组，给药组分别加入长春碱类化合物以及长春碱类衍生物，药物终浓度均为100pmol/L,培养24小时后，吸去培养液，用PBS清洗一次，4％(W/V)多聚甲醛固定15分钟，用吉姆萨染料着色30分钟，PBS清洗一次，显微镜观察并计算细胞数目。结果如图3。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制HUVECs细胞的侵袭作用。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制HUVECs细胞的侵袭作用。
实施例9长春碱类衍生物对人血管内皮细胞HUVECs迁移能力的抑制作用
实验方法：取对数生长期的HUVECs细胞，PBS清洗离心，重悬细胞于无血清培养基中。将2×106个/mL的细胞接种于Transwell小室，每孔100μL，设立空白对照组及给药组，给药组分别加入长春碱类化合物长春碱(CCJ)、长春瑞滨(CCRB)、长春氟宁(CCFN)和长春新碱(CCXJ)以及长春碱类衍生物肼解长春碱(JJ-CCJ)、长春碱二肽(BX-CCJ)、肼解长春瑞滨(JJ-CCRB)、长春瑞滨二肽(BX-CCRB)、肼解长春氟宁(JJ-CCFN)、长春氟宁二肽(BX-CCFN)、肼解长春新碱(JJ-CCXJ)和长春新碱二肽(BX-CCXJ)，药物终浓度均为100pmol/L，下室加入700μL含10％新生牛血清的1640培养液。置37℃、含5％CO2的细胞培养箱中，培养24h后，弃去培养液，用4％多聚甲醛于4℃固定30min，清水缓慢清洗两遍。用吉姆萨染料着色30min后，用棉棒将膜上的细胞擦去，水慢清洗，在显微镜下观察并计算细胞数目。结果如图4。
实验结果：与长春碱类化合物相比，实施例1所制得的长春碱类衍生物更显著地抑制HUVECs细胞的迁移能力。实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制HUVECs细胞的迁移能力。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制HUVECs细胞的迁移能力。
实施例10长春碱类衍生物对人血管内皮细胞HUVECs管腔形成的抑制作用
实验方法：将Matrigel基质胶铺于预冷的48孔板中，每孔加100μL，放置于37℃细胞培 养箱中20min。待基质胶凝固后，加入1×105个HUVECs细胞/孔，细胞培养液预先加入长春碱类化合物以长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ(终浓度为100pmol/L)和血管内皮生长因子(VEGF)(终浓度为100ng/mL)，不加药物及VEGF的孔作为空白对照组。继续培养8h后，在倒置显微镜下观察管腔形成的情况并拍照。结果如图5。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制VEGF诱导的HUVECs管腔形成。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制VEGF诱导的HUVECs管腔形成。
实施例11长春碱类衍生物对已形成HUVECs管腔的破坏作用
实验方法：参照文献(Zhi-Ting Deng,et al.Biochemical Pharmacology 2011,82:1832-42.)并加以优化，将Matrigel基质胶铺于预冷的48孔板中，每孔加100μL，放置于37℃细胞培养箱中20min。待基质胶凝固后，加入1×105个HUVECs细胞/孔，培养4h后，待HUVECs管腔形成后，细胞培养液换成加入长春碱类化合物以及长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ(终浓度为100pmol/L)和血管内皮生长因子(VEGF)(终浓度为100ng/mL)的培养液，不加药物及VEGF的孔作为空白对照组。继续培养8h后，在倒置显微镜下观察管腔形成的情况并拍照。结果如图6。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均可破坏VEGF诱导已形成HUVECs管腔。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏VEGF诱导已形成的HUVECs管腔。
实施例12长春碱类衍生物对鸡胚尿囊膜血管生长的抑制作用
实验方法：参照文献(Cho SG,et al.Cancer Res.2009,69(17):7062–7070)方法，将60只5日龄种蛋随机分为PBS组，长春碱类化合物组以及长春碱类衍生物JJ-CCJ组，BX-CCJ组，JJ-CCRB组，BX-CCRB组，JJ-CCFN组，BX-CCFN组，JJ-CCXJ组以及BX-CCXJ组，每组10只。种蛋经消毒后，放入37℃恒温培养箱，气室朝上。孵育8天后，用剪刀和镊子在气室部位开窗(1.5cm×1.5cm)，剥离卵壳膜，暴露出尿囊膜。将含药滤纸放在尿囊膜血管较少部位。用封口膜封好气室口，置于孵育箱中继续孵育1天后除去封口膜，注入甲醇和丙酮的混合液(1:1,V/V)室温固定15min。待血管凝固后，以滤纸为中心把膜剪下，放入盛有少量水的平皿上展开，平铺于滤纸上，而后将滤纸连同膜从水中取出，采用眼科显微镜观察实验部位边缘5mm范围内的血管，计数并拍照。结果如图7。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制鸡胚尿囊膜的血管生成。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制鸡胚尿囊膜的血管生成。
实施例13长春碱类衍生物对已形成鸡胚尿囊膜血管的破坏作用
实验方法：将60只5日龄种蛋随机分为长春碱类化合物组以及长春碱类衍生物JJ-CCJ组，BX-CCJ组，JJ-CCRB组，BX-CCRB组，JJ-CCFN组，BX-CCFN组，JJ-CCXJ组以及BX-CCXJ组，每组10只。种蛋经消毒后，放入37℃恒温培养箱，气室朝上。孵育8天后，用剪刀和镊子在气室部位开窗(1.5cm×1.5cm)，剥离卵壳膜，暴露出尿囊膜。将含VEGF(100nmol)的滤纸放在尿囊膜血管较少部位。用封口膜封好气室口，置于孵育箱中继续孵育1天后除去封口膜，在滤纸上分别滴加长春碱类化合物以及长春碱类衍生物JJ-CCJ，BX-CCJ，JJ-CCRB，BX-CCRB，JJ-CCFN，BX-CCFN，JJ-CCXJ以及BX-CCXJ各1nmol，用封口膜再次封好气室口，重新置于孵育箱中继续孵育1天后除去封口膜，注入甲醇和丙酮的混合液(1:1,V/V)室温固定15min。待血管凝固后，以滤纸为中心把膜剪下，放入盛有少量水的平皿上展开，平铺于滤纸上，而后将滤纸连同膜从水中取出，采用眼科显微镜观察实验部位边缘5mm范围内的血管，计数并拍照。结果如图8。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均可破坏VEGF诱导的新生鸡胚尿囊膜血管。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏VEGF诱导的新生鸡胚尿囊膜的血管。
实施例14长春碱类衍生物对大鼠动脉环微血管生成的抑制作用
实验方法：参照文献(Srinivas Reddy Boreddy,et al.PLoS One.2011,6(10):e25799)方法，将100μL预冷溶解好的Matrigel基质胶加到预冷的48孔板中，置于37℃细胞培养箱中孵育30min，使基质胶完全凝固。在此期间，SD大鼠经CO2安乐死后，用75％酒精浸泡3min，在无菌操作台中将大鼠胸腔剖开，分离胸主动脉。分离出来的胸主动脉用PBS清洗至无血迹，转移至DMEM/F12完全培养液后用剪刀和镊子剔除主动脉周围的结缔组织和脂肪组织，然后用眼科剪将胸主动脉剪成约1mm长的小段，并接种于Matrigel上。在血管环上再铺上100μL预冷的Martigel，再置于37℃细胞培养箱中孵育30min后，设立空白对照组和给药组，给药组在孔里加入含有2nmol/L长春碱类化合物以及长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ的DMEM/F12完全培养液(含100ng/mL VEGF)。隔天换液一次，换液四次后在倒置显微镜下拍照，对新生芽管进行统计。结果如图9。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制大鼠动脉环微血管的生成。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制大鼠动脉环微血管的生成。
实施例15长春碱类衍生物对已形成大鼠胸主动脉环微血管的破坏作用
实验方法：参照文献(Deng ZT,et al.Biochemical Pharmacology 2011,82:1832-42)并加以优化，将100μL预冷溶解好的Matrigel基质胶加到预冷的48孔板中，置于37℃细胞培养箱中孵育30min，使基质胶完全凝固。在此期间，SD大鼠经CO2安乐死后，用75％酒精浸泡3min，在无菌操作台中将大鼠胸腔剖开，分离胸主动脉。分离出来的胸主动脉用PBS清洗至无血迹，转移至DMEM/F12完全培养液后用剪刀和镊子剔除主动脉周围的结缔组织和脂肪组织，然后用眼科剪将胸主动脉剪成约1mm长的小段，并接种于Matrigel上。在血管环上再铺上100μL预冷的Martigel，再置于37℃细胞培养箱中孵育30min后，加入DMEM/F12完全培养液(含100ng/mL VEGF)。隔天换液一次，待微血管形成后，在孔里加入含有2nmol/L长春碱类化合物以及长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ的DMEM/F12完全培养液，24h后在倒置显微镜下拍照，对芽管进行统计。结果如图10。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具可破坏已形成的大鼠动脉环微血管。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已形成的大鼠动脉环微血管。
实施例16长春碱类衍生物对基质胶栓塞模型血管生成的抑制作用
实验方法：参照文献(Nasim Akhtar,et al.Angiogenesis.2002,5:75–80)方法，取500μL预冷的Matrigel，加入500ng VEGF和150单位的肝素钠，分别与长春碱类化合物以及长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ按1:1(V/V)比例混合，使药物终浓度为100pmol/L，接种于6周龄BALB/C nu/nu裸鼠背侧皮下。设立PBS组为空白对照组，每组6只。常规饲养14天后，裸鼠经CO2安乐死，小心剥离Matrigel栓塞，马上用4％多聚甲醛固定，24h后，进行石蜡切片及H&E染色，切片在倒置显微镜下观察血管形成情况并拍照，进行新生血管数目统计。结果图11。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制基质胶栓塞模型血管的生成。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制基质胶栓塞模型血管的生成。
实施例17长春碱类衍生物对已形成基质胶栓塞模型血管的破坏作用
实验方法：参照文献(Nasim Akhtar,et al.Angiogenesis.2002,5:75–80)方法并加以改进，取500μL预冷的Matrigel，加入500ng VEGF和150单位的肝素钠，接种于6周龄BALB/C nu/nu裸鼠背侧皮下，一周后，隔天尾静脉注射长春碱类化合物以及长春碱类衍生物JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ，药物浓度均为1mg/kg,设立生理盐水空白对照组，每组6只。给药7次后，裸鼠经CO2安乐死，小心剥离Matrigel栓塞，马上用4％多聚甲醛固定，24h后，进行石蜡切片及H&E染色，切片在倒置显微镜下观察血管形成情况并拍照，进行新生血管数目统计。结果图12。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均可破坏已形成的基质胶栓塞模型血管。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已形成的基质胶栓塞模型血管。
实施例18长春碱类衍生物对大鼠眼角膜微囊袋血管生成的抑制作用
实验方法：参照文献方法(Yi ZF,et al.Int J Cancer.2009,124:843–852)方法，构建大鼠眼角膜微囊袋模型。采用硫糖铝及Poly-HEMA制作含VEGF200ng/粒的缓释微粒，SD大鼠用2％(的戊巴比妥纳麻醉后，将VEGF缓释微粒注射进眼角膜微囊袋，术后用盐酸氯霉素涂眼。术后次日，将大鼠随机分组，分成PBS组，长春碱类化合物组，JJ-CCJ组，BX-CCJ组，JJ-CCRB组，BX-CCRB组，JJ-CCFN组，BX-CCFN组，JJ-CCXJ组以及BX-CCXJ组，每组10只，给药剂量均为1mg/kg。隔天尾静脉给药1次，给药7次后，在体视显微镜下观察血管的生长情况，并记录新生血管的长度(VL)和钟点数(CN)，如以下公式计算血管面积：Area(mm2)＝0.2×π×VL(mm)×CN(mm)。结果如图13。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制大鼠眼角膜微囊袋血管的生成。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制大鼠眼角膜微囊袋血管的生成。
实施例19长春碱类衍生物对已形成大鼠眼角膜微囊袋血管的破坏作用
实验方法：参照文献方法(Yi ZF,et al.Int J Cancer.2009,124(4):843–852)方法并加以改进，构建大鼠眼角膜微囊袋模型。采用硫糖铝及Poly-HEMA制作含VEGF200ng/粒的缓释微粒，SD大鼠用2％(的戊巴比妥纳麻醉后，将VEGF缓释微粒注射进眼角膜微囊袋，术后用盐酸氯霉素涂眼。术后次日，将大鼠随机分组，分成PBS组，长春碱类化合物组，JJ-CCJ组，BX-CCJ组，JJ-CCRB组，BX-CCRB组，JJ-CCFN组，BX-CCFN组，JJ-CCXJ组以及BX-CCXJ组，每组10只，先饲养一周，待血管生成后，隔天尾静脉给药1次，给药剂量均为1mg/kg。给药7次后，在体视显微镜下观察血管的生长情况，并记录新生血管的长度 (VL)和钟点数(CN)，如以下公式计算血管面积：Area(mm2)＝0.2×π×VL(mm)×CN(mm)。结果如图14。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均可破坏已形成的大鼠眼角膜微囊袋血管。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已形成的大鼠眼角膜微囊袋血管。
实施例20长春碱类衍生物对CIA小鼠滑膜血管生成的抑制作用
实验方法：参照文献方法(Campbell IK,et al.Eur J Immunol,2000,30:1568–1575)构建C57小鼠CIA(胶原诱导性关节炎)模型，以每只100μL的剂量在尾根部皮内多点激发注射含100μgⅡ型胶原的乳液。对照组以生理盐水注射,方法同模型组。小鼠造模后随机分组，每组10只。造模后次日，隔天经尾静脉分别注射PBS、长春碱类化合物以及JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ，给药剂量均为1.0mg/kg。连续给药7次后结束实验，小鼠经CO2麻醉后处死，剥取后腿右侧膝关节，分离滑膜组织。4％多聚甲醛溶液固定24h后，按常规免疫组化方法(Yajuan Song,et al.Angiogenesis.2012,15:421–432)检测滑膜组织血管生成，以CD31为标记，微血管评判标准参考文献(TatsutaM,et al.Int J Cancer,1999,80:396-399)：染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数,凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数；计数方法：先用低倍镜(×10)选取3个血管密度高的区域，再转到高倍镜(×40)下计数每个区域微血管密度(MVD)值。结果如图15。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均具有抑制CIA模型小鼠滑膜组织的血管生成。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制CIA模型小鼠滑膜组织的血管生成。
实施例21长春碱类衍生物对已形成CIA小鼠滑膜血管的破坏作用
实验方法：参照文献方法(Campbell IK,et al.Eur.J.Immunol.2000,30:1568–1575)并加以改进构建C57小鼠CIA模型，以每只100μL的剂量在尾根部皮内多点激发注射含100μg Ⅱ型胶原的乳液。对照组以生理盐水注射,方法同模型组。小鼠造模后随机分组，每组10只。造模后先饲养7天，然后隔天经尾静脉分别注射PBS,、长春碱类化合物以及JJ-CCJ、BX-CCJ、JJ-CCRB、BX-CCRB、JJ-CCFN、BX-CCFN、JJ-CCXJ和BX-CCXJ，给药剂量均为1.0mg/kg。连续给药7次后结束实验，小鼠经CO2麻醉后处死，剥取后腿右侧膝关节，分离滑膜组织。4％多聚甲醛溶液固定24h后，按常规免疫组化方法(Yajuan Song,et al.Angiogenesis.2012,15:421–432)检测滑膜组织血管生成，以CD31为标记，微血管评判标准 参考文献(TatsutaM,et al.Int.J.Cancer.1999,80:396-399)：染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数,凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数；计数方法：先用低倍镜(×10)选取3个血管密度高的区域，再转到高倍镜(×40)下计数每个区域微血管密度(MVD)值。结果如图16。
实验结果表明，长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均可破坏已形成的CIA模型小鼠滑膜组织的血管。而且，与长春碱类化合物相比，所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已形成的CIA模型小鼠滑膜组织的血管。
上述实验结果证实了本发明所述长春碱类衍生物在体内外可应用于恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病的治疗和预防，特别是所述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物具有更好地预防或治疗恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐在制备预防或治疗如下疾病的药物中的应用，
所述疾病为糖尿病性视网膜病变或类风湿关节炎，
其中所述的长春碱类二肽衍生物选自如下所示的BX-CCXJ、BX-CCJ、BX-CCRB或BX-CCFN：
其中，Z-GP-表示具有如下结构的苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基：
2.权利要求1所述的长春碱类二肽衍生物的应用，
其中，所述的长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐所制备的药物具有显著的抑制新的血管生成及破坏已形成的新生血管的作用；
并且，其中所述长春碱类二肽衍生物的制备包括如下步骤：
(1)将长春碱类化合物或其盐与水合肼反应得肼解长春碱类化合物；
(2)将肼解长春碱类化合物与苄氧羰基甘氨酰脯氨酸在缩合剂作用下反应得所述的长春碱类二肽衍生物；
其中，所述的长春碱类化合物选自长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春氟宁或其盐；所述的肼解长春碱类化合物选自如下所示的JJ-CCXJ、JJ-CCJ、JJ-CCRB或JJ-CCFN：
3.根据权利要求2所述的应用，
其中，所述的长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐所制备的药物能显著降低正常细胞的毒性和体内毒性，在体内外能被FAPα酶特异性水解切除二肽部分Z-GP基团释放出肼解长春碱类化合物；
并且，其中所述长春碱类二肽衍生物的制备中，所述的缩合剂选自氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N,N’-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和1-氯-N,N′,2-三甲基丙烯胺中的一种或几种的混合。
4.一种长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐在制备作为肿瘤间质成纤细胞激活蛋白酶α特异性水解底物的药物中的应用，
其中所述的长春碱类二肽衍生物选自如下所示的BX-CCXJ、BX-CCJ、BX-CCRB或BX-CCFN：
其中，Z-GP-表示具有如下结构的苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基：
5.根据权利要求1－4中任一项的应用，其中所述的生理上可接受的盐选自盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、酒石酸盐或柠檬酸盐。
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