CN101619089B

CN101619089B - 抗肿瘤药物cl168、其合成方法及应用

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Publication number: CN101619089B
Application number: CN200910094773XA
Authority: CN
Inventors: 雷海民; 陈大刚
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2029-07-28
Also published as: EP2460812B1; EP2460812A1; JP2013500277A; CN101619089A; US20120130067A1; WO2011011984A1; RU2507211C2; BR112012001762A2; US8853194B2; RU2012106722A; JP5542930B2; EP2460812A4

Abstract

本发明公开了抗肿瘤药物CL168、其合成方法及应用，药理实验证明该类化合物有明显的抗肿瘤作用，其中CL168-6抗肿瘤治疗指数为49.3，可用于制备预防和治疗肝癌、肺癌等癌症及免疫疾病的药物。

其中，式I，R代表O时为CL168-6，R代表S，NH，SO ₂。式II，R代表C ₂-C ₂₅烷基、芳基、供电子基团或吸电子基团的取代芳基、C ₃-C ₆炔基、烯基、C ₃-C ₉环烷基、杂原子取代C ₃-C ₉的环烷基、C ₁-C ₂₀脂肪酰基、芳香酰基、磺酰基、桂皮酰基、咖啡酰基、没食子酰基、阿魏酰基、苯甲酰基、L-脂肪族氨基酰基、L-芳香族氨基酰基。

Description

抗肿瘤药物CL168、其合成方法及应用

技术领域

本发明涉及化学和生物科学领域的药用化合物，具体涉及到具有结构通式I和II的抗肿瘤药物CL168、其合成方法和应用。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，居各类疾病死亡率的第二位。大量临床治疗证明，化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有极大的破坏效应。这些疗法使得人体的造血系统和免疫功能遭受严重的损害，极易导致病人死亡。对血管的依赖性是一切肿瘤细胞所共有的，血管生成是肿瘤生长和转移中的一个重要步骤，无论原发性肿瘤和继发性肿瘤，一旦生长直径超过2mm，都会有血管生成，随之将是肿瘤迅速生长，转移发生。(Folkman J.what isthe evidence that tumors are angiogenesis department？J Natl Cancer Inst.1990，82：4-6.)。

目前对肿瘤的治疗主要有三大类药物，分别为细胞毒药物，放、化疗辅助类药物，血管生长抑制剂。目前血管生长抑制剂是一类非常有前途的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明是基于CAM模型(Ribatti D，Vacca A，et al.The chick embryochorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis.CurrPharm Biotechnol.2000 Jul；1(1)：73-82.)及VEGF(Gretten TF，Korangy F，et al.Molecular therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma.Br J Cancer.2009Jan 13；100(1)：19-23.)筛选基础上，从上百种天然产物的结构修饰物中筛选出来一类结构骨架新颖，活性明确，抗肿瘤靶点较为明确的一类化合物，命名为CL168。药理实验证明该类化合物有明显的抗肿瘤作用，其中CL168-6抗肿瘤治疗指数为49.3，可用于制备预防和治疗肝癌、肺癌等癌症及免疫疾病的药物。

本发明的目的之一是提供CL168结构通式I及其中间体的合成工艺路线。

本发明的目的之二是提供CL168结构通式II及其中间体的合成工艺路线。

本发明的目的之三是提供CL168 I和II及其中间体在抗肿瘤、提高免疫等方面的应用。

本发明的目的可以通过下列措施来实现：

所述化合物CL168结构通式I的制备方法，包括如下步骤：

(1)将胆甾醇(化合物2)溶于有机溶剂，一定温度下与醋酐在催化剂的催化下生成胆甾醇醋酸酯(化合物3)；

(2)将上述生成的化合物3溶于有机溶剂，一定温度下与溴代试剂在催化剂的催化下生成7-溴代-胆甾醇-3-醋酸酯(化合物4)；

(3)将上述生成的化合物4溶于有机溶剂，一定温度下与碱发生消除反应生成7-脱氢胆甾醇-3-醋酸酯(化合物5)；

(4)将上述生成的化合物5溶于有机溶剂，一定温度下，与碱发生水解反应生成7-脱氢胆甾醇(化合物6)；

(5)将上述生成的化合物6溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-醇(化合物7)；

(6)将上述生成的化合物7溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮(化合物1，CL168-6)；

上述方法中步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)的反应式为：

其中STEP 1中使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-20℃至250℃；催化剂是质子酸或有机碱，其中质子酸以硫酸为代表，有机碱以吡啶为代表；化合物2与醋酐的摩尔比为1∶1-20。

其中STEP 2中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-10℃至150℃；溴代试剂为溴代丁二酰亚胺(NBS)、溴化氢、乙酰溴；催化剂是三苯基磷或波长为290-800nm光源；化合物3与溴代试剂的摩尔比为1∶1-10。

其中STEP 3中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为0℃至150℃；催化剂是有机碱，有机碱以吡啶和三乙胺为代表；化合物4与有机碱的摩尔比为1∶1-10。

其中STEP 4中使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为0℃至150℃；催化剂是质子酸或碱，其中质子酸以硫酸为代表，碱以氢氧化钠为代表。

其中STEP 5中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为0℃至150℃；催化剂是伊红Y、三苯基磷或波长为290-800nm光源。

其中STEP 6中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-20℃至100℃；氧化剂以硫酸和铬酸溶液为代表。

所述化合物CL168结构通式II的制备方法，包括如下步骤：

(1)将胆甾醇(化合物2)溶于有机溶剂，一定温度下与提供R的反应试剂(R代表C₂-C₂₅烷基、芳基、供电子基团或吸电子基团的取代芳基、C₃-C₆炔基、烯基、C₃-C₉环烷基、杂原子取代C₃-C₉的环烷基、C₁-C₂₀脂肪酰基、芳香酰基、磺酰基、桂皮酰基、咖啡酰基、没食子酰基、阿魏酰基、苯甲酰基、L-脂肪族氨基酰基、L-芳香族氨基酰基)在催化剂的催化下生成化合物3；

(2)将上述生成的化合物3溶于有机溶剂，一定温度下与溴代试剂在催化剂的催化下生成化合物4；

(3)将上述生成的化合物4溶于有机溶剂，一定温度下与碱发生消除反应生成化合物5；

(4)将上述生成的化合物5溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物6；

上述方法中步骤(1)、(2)、(3)和(4)的反应式为：

其中STEP 1中使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-20℃至250℃；催化剂是质子酸或有机碱，其中质子酸以硫酸为代表，有机碱以吡啶为代表；化合物2与醋酐的摩尔比为1∶1-20；

其中STEP 2中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-10℃至150℃；溴代试剂为溴代丁二酰亚胺(NBS)、溴化氢、乙酰溴；催化剂是三苯基磷或波长为290-800nm光源；化合物3与溴代试剂的摩尔比为1∶1-10；

其中STEP 3中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为0℃至150℃；催化剂是有机碱，有机碱以吡啶和三乙胺为代表；化合物4与有机碱的摩尔比为1∶1-10；

其中STEP 4中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为0℃至150℃；催化剂是伊红Y、三苯基磷或波长为290-800nm光源；

上述合成得到的CL168-6(5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮)，体外对人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞A549的增殖有明显抑制作用；

所述合成得到的CL168-6(5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮)，具有明显抑制肿瘤新生血管的活性。

所述合成得到的CL168-6(5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮)，能有效抑制S180肿瘤生长；延长荷瘤小鼠的存活期，增加小鼠的脾脏指数；

所述合成得到的CL168-6(5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮)，体内表现较低的毒性，小鼠LD₅₀为1479mg/kg；

所述合成得到的CL168-6(5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮)，可制成口服剂型、注射剂型和外用剂型，应用于肿瘤预防和治疗方面。

附图说明

图1CL168-6对CAM血管的影响。

图2小鼠生存期曲线图。

图3各剂量组小鼠瘤体。

图4小鼠眼血VEGF的检测。

图524h Caspase3，8，9的检测结果。

图648h Caspase3，8，9的检测结果。

图7蛋白定量标准曲线绘制。

图8p53的表达水平(n＝3)。

图9bcl-2的表达水平(n＝3)。

图10VEGF的表达水平(n＝3)。

图11P21的表达水平(n＝3)。

具体实施方式

以下为本发明化合物的实施例，但这些实施例并不意味着对本发明的限制。

制备实施例1胆甾醇醋酸酯(化合物3)的合成

将11.58g胆甾醇(30.00mmol)，60ml甲苯，5.67ml乙酸酐(60.00mmol)，1ml吡啶(约12.41mmol)置于100ml反应瓶中，磁力搅拌加热至114℃回流，反应至无原料。反应液冷却后用2倍量0.10％的盐酸溶液洗两遍，然后用2倍量的饱和氯化钠溶液洗两遍，最后2倍量的蒸馏水洗两遍，无水硫酸钠干燥，减压回收甲苯，即得12.84g白色固体。产率100.0％，化合物3氢谱和碳谱如下：

¹HNMR(500MHZ，CDCl₃)：0.68(s，3H，H-18)，0.86(d，3H，J＝2HZ，H-26)，0.87(d，3H，J＝2HZ，H-27)，0.91(d，3H，J＝4.4HZ，H-21)，1.02(s，3H，H-19)，2.03(s，3H，H-2’)，2.32(dd，2H，H-4)，4.60(m，1H，H-3)，5.39(t，1H，H-6)；

¹³CNMR(500MHZ，CDCl₃)：36.6(C-1)，31.9(C-2)，74.0(C-3)，39.7(C-4)，140.0(C-5)，122.7(C-6)，28.2(C-7)，31.8(C-8)，50.0(C-9)，38.1(C-10)，21.0(C-11)，37.0(C-12)，42.3(C-13)，56.1(C-14)，24.3(C-15)，27.8(C-16)，56.7(C-17)，11.9(C-18)，19.3(C-19)，35.8(C-20)，18.7(C-21)，36.2(C-22)，23.8(C-23)，39.5(C-24)，28.0(C-25)，22.6(C-26)，22.8(C-27)，170.6(C-1’)，21.5(C-2’)。

制备实施例27-脱氢胆甾醇-3-醋酸酯(化合物5)的合成

将4.28g胆甾醇醋酸酯(10.00mmol)，四氯化碳30ml，1.78gNBS(10.00mmol)置于50ml反应瓶中，日光灯光照，74℃回流，反应至无原料。待反应液冷却后抽滤，少量四氯化碳溶液洗涤，减压回收干四氯化碳，即得橙黄色油状液体。

将橙黄色油状液体加入50ml甲苯，5ml 2，6-二甲基吡啶溶解，置于100ml反应瓶中，磁力搅拌加热至114℃回流，待反应至无原料，结束反应。反应液冷却后用2倍量0.10％的盐酸溶液洗两遍，2倍量的饱和氯化钠溶液洗两遍，2倍量的蒸馏水洗两遍，无水硫酸钠干燥，减压回收甲苯，无水乙醇溶解，反复结晶，得3.54g白色固体，产率85.5％，化合物5氢谱和碳谱如下：

¹HNMR(500MHZ，CDCl₃)：0.62(s，3H，H-18)，0.87(d，3H，J＝2HZ，H-26)，0.87(d，3H，J＝2HZ，H-27)，0.94(d，3H，J＝4.4HZ，H-21)，0.99(s，3H，H-19)，2.04(s，3H，H-2’)，2.38(m，1H，H-4a)，2.50(m，1H，H-4b)4.70(m，1H，H-3)，5.39(d，1H，J＝2HZ，H-7)，5.59(d，1H，J＝2HZ，H-6)

¹³CNMR(500MHZ，CDCl₃)：36.6(C-1)，28.1(C-2)，72.8(C-3)，37.9(C-4)，141.6(C-5)，120.2(C-6)，116.2(C-7)，138.5(C-8)，46.0(C-9)，39.5(C-10)，21.5(C-11)，37.1(C-12)，42.9(C-13)，55.4(C-14)，23.9(C-15)，28.1(C-16)，55.8(C-17)，11.8(C-18)，18.4(C-19)，36.2(C-20)，16.2(C-21)，36.1(C-22)，23.0(C-23)，39.1(C-24)，28.1(C-25)，22.6(C-26)，22.8(C-27)，170.6(C-1’)，21.0(C-2’)。

制备实施例37-脱氢胆甾醇(化合物6)的合成

将2.07g 7-脱氢胆甾醇-3-醋酸酯(化合物6)(5mmol)，50ml乙醇，50ml 10％氢氧化钠溶液置于250ml的反应瓶中，80℃反应至无原料，结束反应。反应液减压回收剩余乙醇，一倍量乙酸乙酯萃取一次，乙酸乙酯液用蒸馏水洗至中性，无水硫酸钠干燥，回收乙酸乙酯，固体用乙醇反复结晶，得5，7-二烯胆甾醇1.85g，反应产率96.4％，化合物6氢谱如下：

¹HNMR(500MHZ，CDCl₃)：0.62(s，3H，H-18)，0.86(d，3H，J＝2HZ，H-26)，0.88(d，3H，J＝2HZ，H-27)，0.94(s，3H，H-19)，1.22(d，3H，J＝12HZ，H-21)，2.33(dd，1H，H-4a)，2.49(dd，1H，H-4b)，3.66(m，1H，H-3)，4.03(m，1H，3-OH)，5.39(m，1H，H-7)，5.68(dd，1H，H-6)；

制备实施例45α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-醇(化合物7)的合成

将1.15g 5，7-二烯胆甾醇(约3mmol)，200mg伊红Y(醇溶)(约0.31mmol)，100ml无水乙醇置于250ml反应瓶中，向反应液里吹空气，并日光灯照射，反至无原料，回收无水乙醇至一定体积，放置结晶，得5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-醇0.94g，反应产率75.3％。

¹HNMR(500MHZ，CDCl₃)：0.80(s，3H，H-18)，0.85(d，3H，J＝2HZ，H-26)，0.88(d，3H，J＝2HZ，H-27)，0.88(s，3H，H-19)，0.91(d，3H，J＝12HZ，H-21)，3.97(m，1H，H-3)，6.23(d，1H，J＝7HZ，H-7)，6.51(d，1H，J＝7HZ，H-6)；

¹³CNMR(500MHZ，CDCl₃)：36.0(C-1)，28.3(C-2)，66.5(C-3)，39.4(C-4)，82.2(C-5)，135.4(C-6)，130.8(C-7)，79.5(C-8)，51.1(C-9)，35.2(C-10)，20.6(C-11)，34.7(C-12)，44.8(C-13)，52.0(C-14)，23.4(C-15)，30.1(C-16)，56.4(C-17)，12.7(C-18)，18.2(C-19)，36.9(C-20)，19.0(C-21)，36.9(C-22)，23.8(C-23)，37.0(C-24)，28.0(C-25)，22.6(C-26)，22.8(C-27)。

制备实施例55α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮(化合物1，CL168-6)的合成

称取5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-醇(化合物7)0.62g(约1.5mmol)，50ml丙酮溶解于100ml反应瓶中，在冰水浴下缓慢滴加4ml配制的铬酸溶液(1.6mmol)，反应至无原料。将反应液倒入600ml的冰水混合物里，搅拌，放置过夜，抽滤。虑饼用乙醇反复结晶，即得5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮0.62g，反应产率96.1％。

¹HNMR(500MHZ，CDCl₃)：0.85(s，3H，H-19)，0.88(d，3H，J＝2HZ，H-26)，0.89(d，3H，J＝2HZ，H-27)，0.92(d，3H，J＝6.5HZ，H-21)，1.07(s，3H，H-18)，3.97(m，1H，H-3)，6.29(d，1H，J＝8.5HZ，H-7)，6.59(d，1H，J＝8.5HZ，H-6)；

¹³CNMR(500MHZ，CDCl₃)：36.7(C-1)，35.3(C-2)，207.0(C-3)，43.6(C-4)，83.4(C-5)，134.2(C-6)，131.6(C-7)，80.0(C-8)，51.1(C-9)，39.4(C-10)，20.5(C-11)，37.3(C-12)，44.9(C-13)，51.4(C-14)，23.8(C-15)，28.2(C-16)，56.4(C-17)，12.8(C-18)，18.5(C-19)，35.2(C-20)，17.5(C-21)，35.9(C-22)，23.5(C-23)，39.3(C-24)，28.0(C-25)，22.5(C-26)，22.8(C-27)。

效果实施例1MTT法观察CL168-6对人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞A549、人永生化成纤维细胞NIH3T3增殖的影响

1.材料

1.1瘤株

人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549由解放军传染病研究所免疫研究室传代保种，人永生化成纤维细胞NIH3T3购自军事医学科学院

1.2实验药物

CL168-6(自制)，液相色谱(HPLC)分析进行纯度鉴定，纯度≥98％，符合实验要求。粉末密封好保存于4℃。用二甲基亚砜溶解为1ml/mg的储存液备用。

2.方法

2.1细胞培养：

人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、NIH3T3细胞复苏，培养瓶传代培养，待细胞生长到对数生长期，准备实验。用高压过滤的胰酶消化细胞，制备细胞悬液，用0.4％的台盼蓝染色3分钟，用血细胞计数板计数，活细胞不着色，死细胞染成蓝色。通过台盼蓝鉴定的活细胞数均达到98％以上。

2.2细胞增殖抑制实验

取对数生长期的三种细胞以1×10⁴/ml密度接种于96孔板，每孔200uL。于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。吸弃培养液，加入200ul不同浓度的CL168-6溶液(以含4％小牛血清DMEM培养液配制终浓度分别为10μg，5μg，2.5μg，0μg/mL)，每一浓度设6个平行孔。培养24h和48h后，分别小心吸弃孔内培养上清100ul，每孔加MTS 20μl，混匀，于37℃5％CO₂培养箱孵育1h，用酶标定量测试仪，492nm处测吸光度。实验重复3次。计算抑制率。

细胞生长抑制率(％)＝[(对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％

3.结果

CL168-6对体外培养的HepG2细胞和A549细胞均具有显著的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性，结果如表1-1。当药物浓度为2.5μg/ml、作用24h后，对HepG2细胞及A549细胞的抑制率分别52.85％和48.69％，随着药物浓度的增加，抑制率逐渐上升，当药物浓度为10μg/ml时，对上述两种细胞的抑制率分别达到64.39％和62.40％；作用48h后，剂量为2.5μg/ml时，对HepG2和A549的抑制率分别59.83％和51.91％，浓度在10μg/ml时，抑制率则分别为73.67％与69.67％。与NIH3T3细胞相比，CL168-6对HepG2和A549的抑制在不同浓度和时间组均有显著差异(p＜0.05)。实验结果表明CL168-6对细胞的抑制作用有较好的选择性，其效果与药物浓度和作用时间呈正相关。

表1-1CL168-6对3种细胞株的增殖抑制作用

注：^*P＜0.05 vs 0.0μg/ml

4.结论

CL168-6可显著抑制人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞A549的增殖。

效果实施例2CAM法观察CL168-6对肿瘤血管生成的作用

1.材料

1.1动物

德国罗曼鸡胚蛋，蛋重50～60g(中国农业大学胚胎实验中心)

1.2实验药物

CL168-6(自制)，液相色谱(HPLC)分析进行纯度鉴定，纯度≥98％，符合实验要求。粉末密封好保存于4℃。

苏拉明(suramin)，购于SIGMA公司。

2.方法

2.1待测样品制备方法

以无菌明胶海绵为样品载体，事先用打孔器制成直径5mm的圆片，CL168-6用70％乙醇配成浓度为2mg/5ml的溶液，设置三个剂量组，取溶液，用定量加样器加5μl(小剂量组，给药量为2μg/胚)，10μl(中剂量组，给药量为4μg/胚)，20μl(大剂量组，给药量为8μg/胚)溶液至明胶海绵薄片中，无菌环境中风干。

2.2蛋胚孵育及蛋胚气室的去除方法

种蛋消毒后放入37℃孵化箱，气室向上，至孵蛋第7天，在超净台上将蛋胚用酒精消毒后用牙科钻在蛋胚顶端钻一小孔，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，使开口约为1.2cm×1.2cm大小；确定加样部位后小心地用注射针头从气室与卵黄分隔处挑破气室膜，注入1～2滴无菌水，使气室膜与CAM膜分开，然后用镊子轻轻去除上层的气室膜，暴露下层的CAM膜。

2.3样品加入方法

用镊子轻轻将含药载体置于CAM和卵黄囊膜处血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续孵育72小时。

2.4血管测定

孵育结束后，用镊子轻轻去除鸡胚气室端堵塞的透明胶，轻轻加入甲醇/丙酮等体积混合液1～2ml，室温固定10min，小心地剥下CAM膜，置于载玻片上，观察拍照。采用由载体辐射大、中、小血管的数目计数分析化合物对血管生成的影响。

2.5统计学处理

所有数据采用SPSS11.0软件包进行统计分析，计数资料的比较采用x²检验。P＜0.05具有统计学意义。

3.结果

CL168-6对CAM血管的影响及空白对照见图1

CL168-6三个剂量组分别与空白组小血管数量比较，均有显著性差异，且呈剂量依赖性，结果见表2-1。表明该化合物对新生血管生长有一定的抑制作用。

表2-1CL168-6对CAM血管产生影响的血管分级统计表(X个±S)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

4.结论

CL168-6具有显著抑制肿瘤血管生成作用，且呈一定量效关系。

效果实施例3CL168-6对荷瘤S180、H22腹水小鼠抑瘤作用

1.材料

1.1实验动物和瘤株：

健康雌性Balb/C小鼠，体重18～22g，购自军事医学科学院实验动物中心(合格证号：SCXK-(军)2007-004)。小鼠肝癌细胞H22由本室传代保种，小鼠肉瘤细胞S180由302医院中药研究所惠赠，荷瘤S180、H22腹水小鼠，每7天传代一次。

1.2实验药物

注射用环磷酰胺：山西普德药业有限公司。

2.方法

2.1模型动物的建立

将已接种7天的S180和H22腹水小鼠断颈处死，分别无菌条件下取腹水，用RPMI1640培养基洗2次后用无菌生理盐水制成2×10⁷/ml细胞悬液，S180细胞悬液接种于小鼠右腋皮下，每只0.1ml，接种40只，制成实体瘤模型；无菌条件下，按常规每鼠腹腔接种0.2ml H22细胞悬液，接种40只，制成腹水瘤模型。

2.2实验分组

90只小鼠按随机数字表法将小鼠分为9组三大类，第一类正常对照组，第二类为S180实体瘤组：阳性(环磷酰胺)对照组、阴性对照组、低剂量组、高剂量组；第三类为H22腹水组：阳性(环磷酰胺)对照组、阴性对照组、低剂量组、高剂量组。每组10只。实验重复3次。

2.3给药方法

CL168-6用玉米油配制成乳剂，低剂量组剂量为16mg/kg，高剂量组剂量为32mg/kg，阴性对照组注射等容量的玉米油，阳性对照组注射环磷酰胺注射液0.02g/(Kg.d)，0.1ml/只，隔天腹腔注射，连续给药15天。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。末次给药24h后，皮下接种S180的小鼠断颈处死，取瘤、胸腺、脾脏；腹腔接种H22的小鼠末次给药后，继续常规饲养，每天称重、观察存活时间，直至阴性对照组全部死亡。

2.4小鼠生存期延长率的计算

腹水模型各组小鼠，接种腹水24h后分别称量体重、量取腹围。分组继续给药及饲喂，每日称体重、量腹围，直至死亡前1日，计算体重增重数(g)和腹围增长数(cm)。以接种肿瘤之日算起至阴性对照组小鼠全部死亡结束实验，记录死亡时间，计算生存期延长率。

2.5脾指数和肝脏指数的计算

实体瘤组全部给药结束后称取小鼠体重，随后处死，分别用电子天平称取脾脏和肝脏的重量。脾脏指数为各组小鼠脾脏重量(mg)/小鼠的体重(g)，肝脏指数为肝脏的重量(100g)/小鼠的体重(g)。

2.6抑瘤率的计算

实体瘤阴性对照组停药次日称重，(摘眼球放血，收集血清待后续实验使用)脱颈处死小鼠，剖取瘤组织，电子天平称重，计算抑瘤率。

2.7统计学处理

3.实验结果

3.1各组腹水小鼠体重、腹围及存活期的变化

如表3-1所示，CL168-6在低、高浓度小鼠存活天数均较阴性对照组长，生命延长率分别为37.11％和51.55％。给药组腹围增长量较阴性对照组的小，且不影响小鼠的正常生长，而环磷酰胺组小鼠体重增加缓慢，仅为3.42克，而正常组小鼠体重增长数为6.76克。H22腹水小鼠生存期统计图见图2。

表3-1CL168-6对各组腹水小鼠的体重、腹围及存活期的影响(x±s)

注：1.与正常对照组比较：①P＜0.05，②P＜0.01

2.与阴性对照组比较：③P＜0.05，④P＜0.01

3.2各组腹水小鼠肝、脾指数的变化

如表3-2所示，环磷酰胺组腹水瘤小鼠的肝、脾指数均比阴性对照组的指数小，有统计学意义。而CL168-6低、高浓度组的各项指数均大于阴性对照组。

表3-2CL168-6对腹水小鼠肝、脾指数的影响(x±s)

注：1.与正常对照组比较：①P＜0.05，②P＜0.01

2与阴性对照组比较：③P＜0.05，④P＜0.01

3.3CL168-6体内抗癌活性

CL168-6对S180肉瘤小鼠体重增长没影响，而阳性对照组体重增长数偏小。低、高剂量组对荷瘤S180肉瘤小鼠的肿瘤生长抑制率分别为44.33％和54.58％，且高剂量组与阴性对照组比较，具有统计学意义，见表3-3。小鼠各组的瘤体见图3。

表3-3CL168-6对小鼠S180肉瘤的抑制作用(x±s)

注：1.与正常对照组比较：①P＜0.05，②P＜0.01

2.与阴性对照组比较：③P＜0.05，④P＜0.01

3.4各组S180小鼠肝、脾指数的变化

如表2-4所示，环磷酰胺组S180小鼠的肝、脾等指数均比阴性对照组的指数小，有统计学意义。而CL168-6低、高浓度小鼠脾指数比阴性对照组的高，有显著性差异，肝指数没什么区别。

表2-4CL168-6对S180小鼠脾脏指数和肝脏指数的影响(x±s)

注：1.与正常对照组比较：①P＜0.05，②P＜0.01

2.与阴性对照组比较：③P＜0.05，④P＜0.01

4.结论

4.1CL168-6可显著抑制S180小鼠肉瘤的生长。

4.2CL168-6可提高荷瘤小鼠的脾指数。

4.3CL168-6可延长荷瘤小鼠的存活率。

4.4CL168-6可消退腹水或延缓H22小鼠的腹水生成。

效果实施例4CL168-6抗肿瘤机理研究

研究肿瘤细胞凋亡与信号传导机制，选择性地阻断肿瘤细胞的信号传导通路，破坏其自控性生长调节机制，已成为肿瘤治疗研究的热点。P53、Bcl-2、P21、VEGF等是肿瘤细胞生长或凋亡的关键性的几种分子，本部分实验以期在分子水平上探讨CL168-6抗肿瘤机制。

一.实验材料(详见效果实施例1和3)

二.实验方法

1小鼠眼睛血清中VEGF的检测(详见效果实施例1和3)

将4组小鼠(阴性对照组、阳性CTX对照组、高剂量32mg/kg组、低剂量16mg/kg组)取瘤前先摘眼球放血。

1.1准备试剂、样品和标准品

1.2加入准备好的样品和标准品，37℃反应90分钟

1.3洗板2次，加入生物素抗体工作液，37℃反应60分钟

1.4洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟

1.5洗板5次，加入TMB显色液，37℃避光反应15分钟

1.6加入TMB终止液，450nm测定OD值

2Caspase3，8，9活性的测定

CL168-62.0μg/ml作用于HepG2细胞24h和48h

2.1收集样品

2.1.1用胰酶消化HepG2细胞至细胞培养液中，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤1次，按照每2×10⁶细胞加入100μl裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。

2.1.24℃16000g离心15分钟

2.1..3把上清转移到冰浴预冷的离心管中。

2.2Caspase3活性的检测

2.2.1取出pNA和适量的Ac-DEVD-PNA(2mM)，置于冰浴上备用

2.2.2反应体系如下：

2.2.337℃孵育120分钟，A405测定Caspase3。

2.2.4测定Caspase8，9分别加入Ac-IETD-PNA(2mM)和Ac-LEHD-PNA(2mM)，

3肿瘤细胞VEGF、P53、P21、Bcl-2活性检测(以β-Actin为内参照)

采用蛋白电泳(Western blot)方法

3.1细胞总蛋白的提取：

取黄豆粒大小剥离好的瘤组织剪碎后，放入预冷的组织研磨器中，加入组织裂解液400μl，仔细研磨10分钟后，转入1.5ml的离心管中，剧烈涡旋15秒，置冰上10分钟，反复振荡。4℃，12000rpm，离心20分钟，收集上清至预冷的Eppendorf管中。-80℃分装冻存。用于检测各种抗体的活性水平。

3.2蛋白定量：采用BCA法。

3.2.1配制标准品系列(表4-1)：将试剂盒中标准品按说明书进行系列稀释，配制浓度分别为2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml以及25μg/ml。

表4-1标准品的配制

3.2.2.工作液的配制：将A液与B液按50∶1配制，混匀，待用。

3.2.3将待测样品以20倍稀释后，于96孔酶联板中加入标准品及样品各10μl，均设三孔。再加入200μl工作液，混匀，37℃反应30分钟。

3.2.4取出酶联板，冷却至室温，波长为562nm检测吸光度值。根据标准品绘制标准曲线，使用标准曲线计算待测样品的蛋白含量。

3.3蛋白电泳：

3.3.1蛋白样品的配制：每个样本取适量，加入4×蛋白上样缓冲液和1×蛋白上样缓冲液混匀，至体积均为300μl，浓度为3.7μg/μl。在沸水中加热变性3～5分钟，高速短暂离心后-20℃保存备用。每次上样前均要沸水变性，取10μl含量为3.7μg/ml的样品用微量加样器上样。

3.3.2配制12％分离胶和4％浓缩胶并灌胶：分离胶和浓缩胶的制备见表4-2：表4-2分离胶和浓缩胶的制备

在配制分离胶与浓缩胶时，为避免凝胶过早凝固，需在倒胶前加入TEMED。首先将分离胶注入玻璃夹层后，上部用蒸馏水封住液面，保持胶面水平。待分离胶凝固后，吸干蒸馏水，用蒸馏水冲洗数次以除去未聚合的丙烯酰胺，吸干后灌入浓缩胶，并插入点样梳，点样梳前沿与分离胶距离约0.5cm。

3.3.3加样：室温下凝胶凝固后，在电泳槽加入电泳缓冲液，拔去上样梳，用微量加样器根据胞浆蛋白浓度分别吸取适量体积的待分析样品加入梳孔内。

3.3.4电泳：加样毕，按通电源，先用高电压120V，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后且前沿进入分离胶后，再降低电压至100V，恒压电泳120min，待溴酚蓝指示剂到达胶底边缘时，关闭电源。

3.4蛋白印迹分析：

3.4.1电转移：预先将PVDF膜在无水甲醇中浸泡30秒，使PVDF膜成透明状，再于蒸馏水中浸泡10分钟后，与Whatman滤纸一同浸泡入转移缓冲液。取下凝胶，按滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序放好，确保两侧的滤纸大小，以免发生短路，固定后插入电转移槽中，保证凝胶在阴极、PVDF膜在阳极的方向。4℃，80V电转移3小时。

3.4.2封闭：电转移完成后，取出PVDF膜，用5％的BSA封闭液(用1×TBST溶液溶解)室温封闭3小时，再用TBST振荡洗涤3次，每次10分钟。

3.4.3与一抗反应：将一抗用TBST溶液按1∶200的比例稀释，与PVDF膜反应，4℃过夜。次日室温平衡1小时后，使用TBST洗涤3次。

3.4.4与二抗反应：将HRP标记的相应的二抗用TBST溶液按1∶2000的比例稀释，与PVDF膜室温反应2小时后，用TBST洗涤3次。

3.4.5显影及定影：取底物液A液与B液等量混合后，滴在PVDF膜上，室温孵育5分钟后去除膜上多余液体，用保鲜膜包裹，避免PVDF膜和塑料薄膜之间气泡的存在。压膜，曝光，显影，双蒸水洗1分钟，定影1分钟。

3.4.6显影照片经扫描后用Alpha Ease FC4.0软件进行光密度分析，以β-actin条带的平均光强度值为内参照，结果以蛋白相应水平与β-actin比值来表示。

4统计处理：

采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，正态分布和方差齐性数据采用t检验，如数据不符合正态分布或方差齐性，则采用非参数检验。

三、实验结果

1小鼠眼睛血清中VEGF的检测

如表4-3及图4所示，高剂量组小鼠血清VEGF的光密度值为0.1937，与阴性对照组0.2200比较，P＝0.0037；低剂量组与阴性对照比较，P＝0.0259，两者均有统计学意义。

表4-3VEGF活性检测结果(x±s)

组别	阴性对照	阳性对照	16mg/kg	32mg/kg
					OD值	0.2200±0.0174	0.2205±0.0238	0.2064±0.0114^①	0.1937±0.0170^②

注：与阴性对照比较，①P＜0.05，②P＜0.01

2Caspase3，8，9活性的测定

CL168-6作用HepG2细胞24h和48h后，对Caspase3，8，9活性检测结果见表4-4及图5、图6。

表4-4Caspase3，8，9OD值

三种酶活性增高均不明显，没有统计学意义。

3蛋白电泳

3.1细胞提取蛋白含量测定(图7)

根据BSA标准品的浓度(x)和吸光度(y)的值，绘制蛋白定量标准曲线。利用标准曲线得到直线方程Y＝2.22x-0.02(Y值代表样品稀释后的浓度，x代表吸光度值)如图3.3所示，相关系数r＝1.00，提示直线方程的相关性好，根据所测量的吸光度值(y)计算出相应的蛋白浓度(x)。

3.2P53蛋白含量的表达

蛋白电泳时每个孔上样的蛋白总量保持一致。三组分别为对阴性对照组、阳性对照组(CTX)和实验组CL168-6。以β-Actin为内参照。P53的相对表达含量实验组为0.74±0.03，阴性对照组为0.32±0.05，两组差异显著，P＝0.002。(图8)

3.3bcl-2含量的表达

bcl-2的相对表达含量实验组为0.75±0.04，阴性对照组为0.31±0.01，P＝0.000，两组有统计学意义。(图9)

3.4VEGF含量的表达

VEGF的相对表达含量实验组为0.46±0.08，阴性对照组为0.71±0.05，两组差异显著，P＝0.04。(图10)

3.5P21含量的表达

P21的相对表达含量实验组0.79±0.07，阴性对照组为0.76±0.06，两组的表达量无显著性差异，P＝0.73。(图11)

四.结论

本实验研究表明，CL168-6可降低荷瘤小鼠眼睛血中的VEGF含量，同时瘤体中VEGF蛋白表达水平呈下降趋势。CL168-6可通过降低VEFG的活性抑制肿瘤增生。

我们的实验显示，CL168-6对Caspase-3，8，9的活性无明显影响，推测CL168-6诱导HepG2细胞凋亡可能不依赖于这三种酶的活化。

本实验中，对照组和给药组P21蛋白的表达量没有统计学意义，初步推断CL168-6抑瘤作用不是通过P53→P21这条信号传导途径来实现的。

我们在实验中发现，给药组Bcl-2蛋白表达量明显低于阴性对照组，可以认为，CL168-6可通过下调Bcl-2蛋白表达水平而达到抑瘤效果，具体机制有待进一步的探讨。

P53基因有野生型(Wild type p53，wtp53)和突变型(Mutant type p53，mtp53)两种，wtp53是抑癌基因，可参与细胞周期的调控，在维持细胞正常生长、抑制肿瘤增殖过程中起重要作用，我们的实验结果显示，给药组的P53蛋白表达量明显高于阴性对照组的表达量，可以初步判断，CL168-6可上调荷瘤小鼠wtp53的表达水平，抑制Bcl-2和VEGF蛋白表达，从而发挥抗肿瘤作用。

毒性实施例1

一、实验项目：小鼠经腹腔注射LD50(KORBER氏法)

二、实验材料：

ICR小白鼠【雌雄各半，18-22g，动物许可证编号：SCXK(京)2007-0001】

CL168，白色粉末(自制)，用色拉油稀释，现用现配。

三、实验方法：

采用ICR种小鼠，体重范围18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(SPF级)。实验剂量以2000mg/kg为最高剂量组，以0.8倍递减，设1600mg/kg、1280mg/kg、1024mg/kg和819.2mg/kg共五组，将小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半，腹腔注射0.2ml/10g。，观察3-7天，记录动物各种反应及各组死亡的只数。根据各组动物的死亡率，用改良寇氏法(Korbor)算出LD50和可信限。

四、实验结果：

在给药后12小时内，未见死亡，7天内各组小鼠死亡情况见下表：

实施例表CL168小鼠经腹腔注射LD₅₀

五、小结：

采用改良寇氏(Korber)法计算CL168的LD₅₀为1479.11mg/kg，95％的可信区间为1304.19～1677.49mg/kg。

毒性实施例2

一、实验项目：CL168抗肿瘤治疗指数

二、实验材料：(见效果实施例2，毒性实施例1)

三、实验方法：(见效果实施例2，毒性实施例1)

四、实验结果：(见效果实施例2，毒性实施例1)

五、由效果实施例2可知，CL168高剂量30mg/kg时，对实体瘤S180的抑制率为5458％，对H22腹水癌小鼠存活率为51.55％；CL168低剂量15mg/kg时，对实体瘤S180的抑制率为44.33％，对H22腹水癌小鼠存活率为37.11％；结合毒性实施例1可知，CL168的LD₅₀为1479.11mg/kg，其治疗指数TI约为49.3。

六、小结：

CL168治疗指数TI约为49.3，说明CL168安全性较高，抗肿瘤作用明显。

制剂实施例1

取CL168-6 10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成抗肿瘤药注射剂。

制剂实施例2

取CL168-6 10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成抗肿瘤药片剂。

制剂实施例3

取CL168-6 10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成抗肿瘤药胶囊剂。

制剂实施例4

取CL168-6 10g，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成抗肿瘤药乳剂。

制剂实施例5

取CL168-6 10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成抗肿瘤药颗粒剂。

制剂实施例6

取CL168-6 10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制备成抗肿瘤药缓释控释剂。

制剂实施例7

取CL168-6 10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成抗肿瘤药口服液。

制剂实施例8

取CL168-6 10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成抗肿瘤药脂质体剂型。

Claims

1.CL168结构通式I化合物

I

其中，R代表氧(化合物CL168-6)。

2. 据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将胆甾醇（化合物2）溶于有机溶剂，一定温度下与醋酐在催化剂的催化下生成胆甾醇醋酸酯（化合物3），使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们的混合物，温度为-20至250℃，催化剂为吡啶或硫酸；

（2）将上述生成的化合物3溶于有机溶剂，一定温度下与溴代试剂生成7-溴代胆甾醇-3-醋酸酯（化合物4），使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们的混合物；温度为-10至150℃；溴代试剂为溴代丁二酰亚胺（NBS）、溴化氢或乙酰溴；催化剂是三苯基磷或波长为290-800nm光源；

（3）将上述生成的化合物4溶于有机溶剂，一定温度下与碱消除反应生成7-脱氢胆甾醇-3-醋酸酯（化合物5），使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们的混合物；温度为0至150℃；碱是吡啶或三乙胺；

（4）将上述生成的化合物5溶于有机溶剂，一定温度下，与碱发生水解反应生成7-脱氢胆甾醇（化合物6），使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们的混合物；温度为0至150℃；碱是氢氧化钠；

（5）将上述生成的化合物6溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-醇（化合物7），使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们的混合物；温度为0至150℃；催化剂是伊红Y、三苯基磷或波长为290-800nm光源；

（6）将上述生成的化合物7溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成5α，8α-环二氧-胆甾-6-烯-3-酮（化合物1，CL168-6），使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们的混合物；温度为-20至100℃；氧化剂是硫酸或铬酸溶液；

上述步骤（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）的反应式为：

3．如权利要求1所述的化合物在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。