WO2011011984A1

WO2011011984A1 - 甾醇衍生物及其合成和应用

Info

Publication number: WO2011011984A1
Application number: PCT/CN2010/070213
Authority: WO
Inventors: 陈大刚; 雷海民
Original assignee: Chen Dagang; Lei Haimin
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2011-02-03
Also published as: EP2460812A4; CN101619089B; US20120130067A1; RU2012106722A; US8853194B2; BR112012001762A2; EP2460812A1; EP2460812B1; JP5542930B2; RU2507211C2; CN101619089A; JP2013500277A

Description

甾醇衍生物及其合成和应用技术领域

本发明涉及化学和生物科学领域的药用化合物，具体涉及到具有结构通式 I和 II的抗肿瘤药物 CL168、其合成方法和应用。背景技术

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，居各类疾病死亡率的第二位。大量临床治疗证明，化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有极大的破坏效应。这些疗法使得人体的造血系统和免疫功能遭受严重的损害，极易导致病人死亡。对血管的依赖性是一切肿瘤细胞所共有的，血管生成是肿瘤生长和转移中的一个重要步骤，无论原发性肿瘤和继发性肿瘤，一旦生长直径超过 2mm，都会有血管生成，随之将是肿瘤迅速生长，转移发生。 (Folkman J. what is the evidence that tumors are angiogenesis department? J Natl Cancer Inst. 1990， 82:4-6.)。

目前对肿瘤的治疗主要有三大类药物，分别为细胞毒药物，放、化疗辅助类药物，血管生长抑制剂。目前血管生长抑制剂是一类非常有前途的抗肿瘤药物。发明内容

本发明是基于 CAM模型 (Ribatti D, Vacca A,et al. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Curr Pharm Biotechnol. 2000 Jul;l(l):73-82.)及 VEGF(Gretten TF,Korangy F, et al. Molecular therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma.Br J Cancer. 2009 Jan 13;100(1): 19-23.)筛选基础上，从上百种天然产物的结构修饰物中筛选出来一类结构骨架新颖，活性明确，抗肿瘤靶点较为明确的一类化合物，命名为 CL168。药理实验证明该类化合物有明显的抗肿瘤作用，其中 CL168-6抗肿瘤治疗指数为 49.3，可用于制备预防和治疗肝癌、肺癌等癌症及免疫疾病的药物。

本发明的目的之一是提供 CL168结构通式 I及其中间体的合成工艺路线。

本发明的目的之二是提供 CL168结构通式 II及其中间体的合成工艺路线。

本发明的目的之三是提供 CL168 I和 II及其中间体在抗肿瘤、提高免疫等方面的应用。

烯基、 C₃- ( ₉环烷基、杂原子取代 C₃-C₉

R代表 O时为 CL168-6

的环烷基、 d-C₂。脂肪酰基、芳香酰基、 R代表 S， NH, S0₂

磺酰基、桂皮酰基、咖啡酰基、没食子酰基、阿魏酰基、苯甲酰基、 L-脂肪族氨基酰基、 L-芳香族氨基酰基

本发明的目的可以通过下列措施来实现：

所述化合物 CL168结构通式 I的制备方法，包括如下步骤：

( 1 ) 将胆醇（化合物 2) 溶于有机溶剂一定温度下与醋酐在催化剂的催化下生成胆甾醇醋酸酯（化合物 3 );

(2) 将上述生成的化合物 3溶于有机溶剂，一定温度下与溴代试剂在催化剂的催化下生成 7-溴代-胆醇 -3-醋酸酯（化合物 4);

(3 )将上述生成的化合物 4溶于有机溶剂 -定温度下与碱发生消除反应生成 7-脱氢胆甾醇 -3-醋酸酯（化合物 5 );

(4)将上述生成的化合物 5溶于有机溶剂 -定温度下，与碱发生水解反应生成 7-脱氢胆醇（化合物 6);

( 5 ) 将上述生成的化合物 6溶于有机溶剂 -定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成 5α, 8α-环二氧 -胆甾 -6-烯 -3-醇（化合物 7);

(6) 将上述生成的化合物 7溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成 5α, 8α-环二氧 -胆甾 -6-烯 -3-酮（化合物 1， CL168-6);

上述方法中步骤（1 )、（2)、（3 )、（4)、（5 )、 (6) 的反应式为：

compound

其中 STEP 1中使用的有机溶剂是含有 2-20个碳原子的醚、醇、垸烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 -20°C至 250°C; 催化剂是质子酸或有机碱，其中质子酸以硫酸为代表，有机碱以吡啶为代表；化合物 2与醋酐的摩尔比为 1 : 1-20。

其中 STEP 2中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、垸烃、醚、酮、卤代垸、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 -10°C至 150°C; 溴代试剂为溴代丁二酰亚胺（ BS)、溴化氢、乙酰溴；催化剂是三苯基磷或波长为 290-800mn光源；化合物 3与溴代试剂的摩尔比为 1 : 1-10。

其中 STEP 3中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代垸、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 0°C至 150°C; 催化剂是有机碱，有机碱以吡啶和三乙胺为代表；化合物 4与有机碱的摩尔比为 1 : 1-10。

其中 STEP 4中使用的有机溶剂是含有 2-20个碳原子的醚、醇、垸烃、芳香烃、酮、卤代垸、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 0°C至 150°C; 催化剂是质子酸或碱，其中质子酸以硫酸为代表，碱以氢氧化钠为代表。

其中 STEP 5中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、垸烃、醚、酮、卤代垸、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 0°C至 150°C; 催化剂是伊红 Y、三苯基磷或波长为 290-800nm光源。

其中 STEP 6中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、垸烃、醚、酮、卤代垸、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 -20°C至 100°C; 氧化剂以硫酸和铬酸溶液为代表。

所述化合物 CL168结构通式 II的制备方法，包括如下步骤：

( 1 )将胆醇（化合物 2) 溶于有机溶剂，一定温度下与提供 R的反应试剂（R代表 c₂-c₂₅垸基、芳基、供电子基团或吸电子基团的取代芳基、 c₃-c₆炔基、烯基、 c₃-c₉环垸基、杂原子取代 C₃-C₉的环烷基、 d-C^脂肪酰基、芳香酰基、磺酰基、桂皮酰基、咖啡酰基、没食子酰基、阿魏酰基、苯甲酰基、 L-脂肪族氨基酰基、 L-芳香族氨基酰基）在催化剂的催化下生成化合物 3 ;

(2)将上述生成的化合物 3溶于有机溶剂，一定温度下与溴代试剂在催化剂的催化下生成化合物 4;

( 3 )将上述生成的化合物 4溶于有机溶剂，一定温度下与碱发生消除反应生成化合物

(4)将上述生成的化合物 5溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物 6;

其中 STEP 1中使用的有机溶剂是含有 2-20个碳原子的醚、醇、垸烃、芳香烃、酮、卤代垸、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 -20°C至 250°C; 催化剂是质子酸或有机碱，其中质子酸以硫酸为代表，有机碱以吡啶为代表；化合物 2与醋酐的摩尔比为 1 : 1-20；

其中 STEP 2中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 -10°C至 150°C; 溴代试剂为溴代丁二酰亚胺（ BS)、溴化氢、乙酰溴；催化剂是三苯基磷或波长为 290-800mn光源；化合物 3与溴代试剂的摩尔比为 1 : 1-10; 其中 STEP 3中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、垸烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 0°C至 150°C; 催化剂是有机碱，有机碱以吡啶和三乙胺为代表；化合物 4与有机碱的摩尔比为 1 : 1-10；

其中 STEP 4中使用的有机溶剂是含有 1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为 0°C至 150。C; 催化剂是伊红 Y、三苯基磷或波长为 290-800nm光源；

上述合成得到的 CL168-6C5a， 8a-环二氧 -胆甾 -6-烯 -3-酮；)，体外对人肝癌细胞 HepG2 和人肺癌细胞 A549的增殖有明显抑制作用；

所述合成得到的 CL168-6C5a， 8a-环二氧 -胆甾 -6-烯 -3-酮；)，具有明显抑制肿瘤新生血管的活性。

所述合成得到的 CL168-6(5a， 8a-环二氧 -胆甾 -6-烯 -3-酮)，能有效抑制 S180肿瘤生长；延长荷瘤小鼠的存活期，增加小鼠的脾脏指数；

所述合成得到的 CL168-6(5a， 8a-环二氧 -胆 -6-瑶 -3-酮)，体内表现较低的毒性，小鼠 LD₅₀为 1479mg/kg_;

所述合成得到的 CL168-6 5a， 8a-环二氧 -胆甾 -6-烯 -3-酮；)，可制成口服剂型、注射剂型和外用剂型，应用于肿瘤预防和治疗方面。

附图说明

图 1 CL168-6对 CAM血管的影响。

图 2 小鼠生存期曲线图。

图 3 各剂量组小鼠瘤体。

图 4 小鼠眼血 VEGF的检测。

图 5 24h Caspase3 , 8 , 9的检测结果。

图 6 48h Caspase3 , 8， 9的检测结果。

图 7 蛋白定量标准曲线绘制。

图 8 p53的表达水平（n=3 )。

图 9 bcl-2的表达水平（n=3 )。

图 10 VEGF的表达水平 0=3；)。

图 11 P21的表达水平 (η=3)。具体实施方式

以下为本发明化合物的实施例，但这些实施例并不意味着对本发明的限制。

制备实施例 1 胆留醇醋酸酯（化合物 3 ) 的合成

将 11.58g胆甾醇（30.00mmol)， 60ml甲苯， 5.67ml乙酸酐（60.00mmol)， 1ml吡啶（约 12.41mmol ) 置于 100ml反应瓶中，磁力搅拌加热至 114Ό回流，反应至无原料。反应液冷却后用 2倍量 0.10%的盐酸溶液洗两遍，然后用 2倍量的饱和氯化钠溶液洗两遍，最后 2 (((((,,,,,,,,,,sdJ.dda.ddb.3HHH233lHH4249lHH4366mlHH3--- ((((,,,,,,,3KCC.s.dJdJHMR500MHZD10623HH086H260H27--

((((((ccccc.c24282522262227r5------ ((((((((cccccccc2756l3520362323--- (((((((((ccccccccc 285038ll425624l-- (((((((CN.ccccccMR500MHZ366l231226---- " (((((,,,,,,,dJ..s.s.dd.4HZH02H03H232H60mlHH- ((((,,,,,,NsdJ.dJHMR500MHZH3HH2687H27-- H g φΙϋ ¾回^p¾画*3J s.5.84。 s ^§ 30

-

S g ¾J¾ (.o1200m Y 031mml 100ml

(((,,,,,,.O..dd403mlH3H 539mlHH7568lH H6--- 2.方法

2.1 细胞培养：

人肝癌细胞 HepG2、人肺癌细胞 A549、 NIH3T3细胞复苏，培养瓶传代培养，待细胞生长到对数生长期，准备实验。用高压过滤的胰酶消化细胞，制备细胞悬液，用 0.4%的台盼蓝染色 3 分钟，用血细胞计数板计数，活细胞不着色，死细胞染成蓝色。通过台盼蓝鉴定的活细胞数均达到 98%以上。

2.2 细胞增殖抑制实验

取对数生长期的三种细胞以 lxl0⁴/ml密度接种于 96孔板，每孔 200uL。于 37°C， 5%C0₂ 培养箱中培养 24h。吸弃培养液，加入 200ul不同浓度的 CL168-6溶液（以含 4%小牛血清 DMEM培养液配制终浓度分别为 10μ_§， 5μ_§, 2.5μ_§, (^g/mL)，每一浓度设 6个平行孔。培养 24h和 48h后，分别小心吸弃孔内培养上清 100ul，每孔加 MTS 20μ1,混匀，于 37°C 5%C0₂ 培养箱孵育 lh，用酶标定量测试仪， 492nm处测吸光度。实验重复 3次。计算抑制率。

细胞生长抑制率（％) =[ (对照组平均 OD值 -用药组平均 OD值） /对照组平均 OD 值] χ100%

3. 结果

CL 168-6对体外培养的 HepG2细胞和 A549细胞均具有显著的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性，结果如表 1-1。当药物浓度为 2.5 g/ml、作用 24h后，对 He Ip 'QG2细胞及 A549细胞的抑制率分别 52.85%和 48.69%，随着药物浓度的增加，抑制率逐渐上升，当药物浓度为 lO g/ml时，对上述两种细胞的抑制率分别达到 64.39%和 62.40%; 作用 48h后，剂量为 2.5 g/ml时，对 HepG2和 A549的抑制率分别 59.83%和 51.91%，浓度在 lC^g/ml时，抑制率则分别为 73.67%与 69.67%。与 NIH3T3细胞相比， CL168-6对 HepG2和 A549的抑制在不同浓度和时间组均有显著差异（ρ< 0.05)。实验结果表明 CL168-6对细胞的抑制作用有较好的选择性，其效果与药物浓度和作用时间呈正相关。

表 1-1 CL 168-6对 3种细胞株的增殖抑制作用

浓度 24h抑制率（％) 48h抑制率（％)

C g/ml) HepG2 A549 NIH3T3 HepG2 A549 NIH3T3

48.69* 3.87 59.83* 0+75

55.78* 5.69 69.08* 1.97

62.40* 8.45 73.67* 5.37 注： * P < 0.05 vs Ο.Ομ^ηύ

4. 结论

CL 168-6可显著抑制人肝癌细胞 HepG2和人肺癌细胞 A549的增殖。效果实施例 2 CAM法观察 CL168-6对肿瘤血管生成的作用

1. 材料

1. 1动物

德国罗曼鸡胚蛋，蛋重 50〜60g (中国农业大学胚胎实验中心）

1. 2 实验药物

CL168-6 (自制），液相色谱（HPLC) 分析进行纯度鉴定，纯度 98%，符合实验要求。粉末密封好保存于 4°C。

苏拉明 (suramin), 购于 SIGMA公司。

2. 方法

2.1 待测样品制备方法

以无菌明胶海绵为样品载体，事先用打孔器制成直径 5mm的圆片， CL168-6用 70%乙醇配成浓度为 2mg/5ml的溶液，设置三个剂量组，取溶液，用定量加样器加 5μ1 (小剂量组，给药量为 2μ_§/胚）， ΙΟμΙ (中剂量组，给药量为 4μ_§/胚）， 20μ1 (大剂量组，给药量为 8μ_§/胚）溶液至明胶海绵薄片中，无菌环境中风干。

2.2 蛋胚孵育及蛋胚气室的去除方法

种蛋消毒后放入 37Ό孵化箱，气室向上，至孵蛋第 7天，在超净台上将蛋胚用酒精消毒后用牙科钻在蛋胚顶端钻一小孔，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，使开口约为 1.2 cmx l .2 cm大小；确定加样部位后小心地用注射针头从气室与卵黄分隔处挑破气室膜，注入 1〜2 滴无菌水，使气室膜与 CAM膜分开，然后用镊子轻轻去除上层的气室膜，暴露下层的 CAM 膜。

2.3 样品加入方法

用镊子轻轻将含药载体置于 CAM和卵黄囊膜处血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续孵育 72小时。

2.4 血管测定

孵育结束后，用镊子轻轻去除鸡胚气室端堵塞的透明胶，轻轻加入甲醇 /丙酮等体积混合液 l〜2ml，室温固定 10min，小心地剥下 CAM膜，置于载玻片上，观察拍照。采用由载体辐射大、中、小血管的数目计数分析化合物对血管生成的影响。

2.5 统计学处理

所有数据采用 SPSS 11.0软件包进行统计分析，计数资料的比较采用 X²检验。 P<0.05 具有统计学意义。

3. 结果

CL168-6对 CAM血管的影响及空白对照见图 1

CL168-6三个剂量组分别与空白组小血管数量比较，均有显著性差异，且呈剂量依赖性，结果见表 2-1。表明该化合物对新生血管生长有一定的抑制作用。

表 2-1 CL168-6对 CAM血管产生影响的血管分级统计表个 ± S)

组别鸡胚数（枚）大血管中血管细小血管

CL168-6 (2ug/胚） 20 3.5±1.8 13.2士 3.7 8.8±2.3 **

CL168-6 (4ug/胚） 20 3 +6±1 +9 11 +2±3+2 6+5±2+5**

CL168-6 (8ug/胚） 20 2.5±2.0 12.6±5.6 4.0±2.8**

苏拉明（4ug/胚） 20 3.6±2.0 12.4±3.8 6.1 ± 3.0**

空白对照组 20 4.7±3.1 18.1±5.5 11.6±2.2

注：与空白对照组比较， *P<0.05, **P<0.01

4. 结论

CL168-6具有显著抑制肿瘤血管生成作用，且呈一定量效关系。效果实施例 3 CL168-6对荷瘤 S180 、 H22腹水小鼠抑瘤作用

1.材料

1.1实验动物和瘤株：

健康雌性 Balb/C小鼠，体重 18〜22g，购自军事医学科学院实验动物中心（合格证号： SCXK- (军） 2007-004)。小鼠肝癌细胞 H22由本室传代保种，小鼠肉瘤细胞 S180由 302 医院中药研究所惠赠，荷瘤 S180 、 H22腹水小鼠，每 7天传代一次。

1.2 实验药物

CL168-6C自制)，液相色谱（HPLC) 分析进行纯度鉴定，纯度 98%，符合实验要求。粉末密封好保存于 4°C。

注射用环磷酰胺：山西普德药业有限公司。

2. 方法

2.1 模型动物的建立

将已接种 7天的 S 180和 H22腹水小鼠断颈处死，分别无菌条件下取腹水，用 RPMI1640 培养基洗 2次后用无菌生理盐水制成 2x l0⁷/ml细胞悬液， S180细胞悬液接种于小鼠右腋皮下，每只 0.1ml，接种 40只，制成实体瘤模型；无菌条件下，按常规每鼠腹腔接种 0.2ml H22 细胞悬液，接种 40只，制成腹水瘤模型。

2.2 实验分组

90只小鼠按随机数字表法将小鼠分为 9组三大类，第一类正常对照组，第二类为 S180 实体瘤组：阳性（环磷酰胺）对照组、阴性对照组、低剂量组、高剂量组；第三类为 H22 腹水组：阳性（环磷酰胺）对照组、阴性对照组、低剂量组、高剂量组。每组 10只。实验重复 3次。 2.3 给药方法

CL168-6用玉米油配制成乳剂，低剂量组剂量为 16mg/kg，高剂量组剂量为 32mg/kg，阴性对照组注射等容量的玉米油，阳性对照组注射环磷酰胺注射液 0.02g/(Kg.d)， 0.1ml/只，隔天腹腔注射，连续给药 15天。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。末次给药 24h后，皮下接种 S180的小鼠断颈处死，取瘤、胸腺、脾脏；腹腔接种 H22的小鼠末次给药后，继续常规词养，每天称重、观察存活时间，直至阴性对照组全部死亡。

2.4 小鼠生存期延长率的计算

腹水模型各组小鼠，接种腹水 24h后分别称量体重、量取腹围。分组继续给药及饲喂，每日称体重、量腹围，直至死亡前 1日，计算体重增重数（g)和腹围增长数（cm)。以接种肿瘤之日算起至阴性对照组小鼠全部死亡结束实验，记录死亡时间，计算生存期延长率。

给药组平均生存天数一阴性对照组平均生存天数

生存期延长率 (％) = x l 00%

对照组平均生存天数

2.5 脾指数和肝脏指数的计算

实体瘤组全部给药结束后称取小鼠体重，随后处死，分别用电子天平称取脾脏和肝脏的重量。脾脏指数为各组小鼠脾脏重量 (mg)/小鼠的体重 (g) ，肝脏指数为肝脏的重量（100g) /小鼠的体重（g)。

2.6 抑瘤率的计算

实体瘤阴性对照组停药次日称重，（摘眼球放血，收集血清待后续实验使用）脱颈处死小鼠，剖取瘤组织，电子天平称重，计算抑瘤率。

阴性对照组平均瘤重一给药组平均瘤重

抑瘤率 (％) = 100%

对照组平均瘤重

2.7 统计学处理

所有数据采用 SPSS11.0软件包进行统计分析，计数资料的比较采用 X²检验。 P<0.05 具有统计学意义。

3. 实验结果

3.1 各组腹水小鼠体重、腹围及存活期的变化

如表 3-1所示, CL168-6在低、高浓度小鼠存活天数均较阴性对照组长，生命延长率分别为 37.11 %和 51.55 %。给药组腹围增长量较阴性对照组的小，且不影响小鼠的正常生长，而环磷酰胺组小鼠体重增加缓慢，仅为 3.42克，而正常组小鼠体重增长数为 6.76克。 H22 腹水小鼠生存期统计图见图 2。 CL168-6对各组腹水小鼠的体重、腹围及存活期的影响 (x±s)

组别体重增长 (g) 腹围增长（cm) 存活天数（天）生命延长率（％) 正常对照组 6.76±1.56 0.58±0.09 ― ― 阴性对照组 4.85±1.21® 3.17±0.33® 9.7±2.7 ― 环磷酰胺组 3.42±1 +67②④ 2.30±0.66②④ 15.3±1.06® 57.73

CL168-6低剂量：组 ϋΐ ^® Z iOJ^③ 13.3±l +77^ffl 37.11

CL168-6高剂量：组 5.05±1.88® 2.32士0.71, 14.7士1.41④ 51.55 注： 1.与正常对照组比较： ① P < 0.05， ©P < 0.01

2.与阴性对照组比较: (DP < 0.05， (DP < o.oi

3.2 各组腹水小鼠肝、脾指数的变化

如表 3-2所示，环磷酰胺组腹水瘤小鼠的肝、脾指数均比阴性对照组的指数小，有统计学意义。而 CL168-6低、高浓度组的各项指数均大于阴性对照组。

CL168-6对腹水小鼠肝、脾指数的影响 (x±s)

组别肝脏指数（100g/g) 脾脏指数（mg/g)

空白对照组 4.04±0.47 3.45±0.58 阴性对照组 4.32士0.14 3.84士0+56 环磷酰胺组 3.26±0.27^Θ® 2+45士0.34①④

CL168-6低剂量：组 _{4 9}士 0.24®® 6.53士1.29②④

CL168-6高剂量：组 5.19±0.64^@@ 5+76士0.96②④ 注： 1.与正常对照组比较：（DP < 0.05，（DP < o.oi

2.与阴性对照组比较: (DP < 0.05， (DP < o.oi

3.3 CL168-6体内抗癌活性

CL168-6对 S180肉瘤小鼠体重增长没影响，而阳性对照组体重增长数偏小。低、高剂量组对荷瘤 S180肉瘤小鼠的肿瘤生长抑制率分别为 44.33 %和 54.58 % , 且高剂量组与阴性对照组比较，具有统计学意义，见表 3-3。小鼠各组的瘤体见图 3。

表 3-3 CL168-6对小鼠 S180肉瘤的抑制作用（Χ±Λ)

组别体重增长 ( g) 瘤重 ( g) 抑瘤率（％) 空白对照组 6.76士1.56

阴性对照组 6.92±1.23 1.385±0.440

环磷酰胺组 4.76±1.01^Θ® 0.518±0.231® 62.63 %

CL168-6低剂量：组 6.71士1.22 0.771±0.407 44.33 %

CL168-6高剂量：组 6.00±1.11 0.629±0.133® 54.58 % 注： l.与正常对照组比较： ① P < O.O5， (DP < o.oi

2.与阴性对照组比较： (DP < 0+05， ©p < o.oi

3.4 各组 S180小鼠肝、脾指数的变化

如表 2-4所示，环磷酰胺组 S180小鼠的肝、脾等指数均比阴性对照组的指数小，有统计学意义。而 CL168-6低、高浓度小鼠脾指数比阴性对照组的高，有显著性差异，肝指数没什么区别。

表 2-4 CL168-6对 S180小鼠脾脏指数和肝脏指数的影响 (x±s)

组别肝脏指数（100g/g) 脾脏指数（mg/g)

空白对照组 4.04±0.47 3.45±0.58 阴性对照组 4.21±0.45 3.83±0.63 环磷酰胺组 3.09±0.31®^@ 2+76±0.64①④

CL168-6低剂量：组 4.45±0.19 5+32±0.68②④

CL168-6高剂量：组 4.38±0.13 5.34±0.73^@®

注： 1.与正常对照组比较： ① P < 0.05， ©P < 0.01

2.与阴性对照组比较: (DP < 0.05， (¾p < o.oi

4. 结论

4.1 CL168-6可显著抑制 S180小鼠肉瘤的生长。

4.2 CL168-6可提高荷瘤小鼠的脾指数。

4.3 CL168-6可延长荷瘤小鼠的存活率。

4.4 CL168-6可消退腹水或延缓 H22小鼠的腹水生成。

效果实施例 4 CL168-6抗肿瘤机理研究

研究肿瘤细胞凋亡与信号传导机制，选择性地阻断肿瘤细胞的信号传导通路，破坏其自控性生长调节机制，已成为肿瘤治疗研究的热点。 P53、 Bcl-2、 P21、 VEGF等是肿瘤细胞生长或凋亡的关键性的几种分子，本部分实验以期在分子水平上探讨 CL168-6抗肿瘤机制。

一. 实验材料（详见效果实施例 1和 3)

二. 实验方法

1 小鼠眼睛血清中 VEGF的检测（详见效果实施例 1和 3 )

将 4组小鼠（阴性对照组、阳性 CTX对照组、高剂量 32mg/kg组、低剂量 16mg/kg组）取瘤前先摘眼球放血。

1.1 准备试剂、样品和标准品

1.2 加入准备好的样品和标准品， 37°C反应 90分钟

1 3 洗板 2次，加入生物素抗体工作液， 37°C反应 60分钟 1.4 洗板 3次，加入 ABC工作液， 37°C反应 30分钟

1.5 洗板 5次，加入 TMB显色液， 37°C避光反应 15分钟

1.6 加入 TMB终止液， 450nm测定 OD值

2 Caspase3 , 8， 9活性的测定

CL168-6 2.0 g/ml作用于 HepG2细胞 24h和 48h

2.1 收集样品

2.1.1 用胰酶消化 HepG2细胞至细胞培养液中， 600g 4°C离心 5分钟收集细胞，小心吸除上清， PBS洗涤 1次，按照每 2χ 10⁶细胞加入 ΙΟΟμΙ裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解 15 分钟。

2.1.2 4°C l6000g离心 15分钟

2.1..3 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。

2.2 Caspase3活性的检测

2.2.1 取出 pNA和适量的 Ac-DEVD-PNA(2mM),置于冰浴上备用

2.2.2 反应体系如下：

空白对照样品

检测缓冲液 90μ1 80μ1

待测样品 Ομΐ ΙΟμΙ

Ac-DEVD- NA(2mM) ΙΟμΙ ΙΟμΙ

总体积 ΙΟΟμΙ ΙΟΟμΙ

2.2.3 37°C孵育 120分钟， Α405测定 Caspase3。

2.2.4 测定 Caspase8， 9分别加入 Ac-IETD-PNApmM)和 Ac-LEHD-PNApmM), 3 肿瘤细胞 VEGF、 P53、 P21、 Bcl-2活性检测（以 β-Actin为内参照）

采用蛋白电泳（Western blot) 方法

3.1 细胞总蛋白的提取：

取黄豆粒大小剥离好的瘤组织剪碎后，放入预冷的组织研磨器中，加入组织裂解液 400μ1，仔细研磨 10分钟后，转入 1.5ml的离心管中，剧烈涡旋 15秒，置冰上 10分钟，反复振荡。 4°C， 12000rpm, 离心 20分钟，收集上清至预冷的 Eppendorf 管中。 -80°C分装冻存。用于检测各种抗体的活性水平。

3.2 蛋白定量：采用 BCA法。

3.2.1 配制标准品系列（表 4-1 ): 将试剂盒中标准品按说明书进行系列稀释，配制浓度分别为 2000 g/ml、 1500 g/ml、 1000 g/ml、 750 g/ml、 500 g/ml、 250 g/ml、 125 g/ml 以及 25 g/ml。表 4-1 标准品的配制

管号去离子水量 BSA标准品量 BSA终浓度

A 0 300μ1 的 BSA原液 200(Vg/ml

B 125μ1 375μ1 的 BSA原液 150( g/ml

C 325μ1 325μ1 的 BSA原液 lOOO g/ml

D 175μ1 175μ1 的 Β 稀释液 750 g/ml

E 325μ1 325μ1 的 C稀释液 500 g/ml

F 325μ1 325μ1 的 Ε稀释液 250μ /ηι1

G 325μ1 325μ1 的 F稀释液 125 g/ml

H 400μ1 ΙΟΟμΙ 的 G稀释液 25 g/ml

I 400μ1 0 0 g/ml

3.2.2. 工作液的配制：将 A液与 B 液按 50: 1 配制，混匀，待用。

3.2.3 将待测样品以 20倍稀释后，于 96孔酶联板中加入标准品及样品各 10μ1，均设三孔。再加入 200μ1工作液，混匀， 37°C反应 30 分钟。

3.2.4 取出酶联板，冷却至室温，波长为 562mn检测吸光度值。根据标准品绘制标准曲线，使用标准曲线计算待测样品的蛋白含量。

3.3 蛋白电泳：

3.3.1 蛋白样品的配制：每个样本取适量，加入 4x蛋白上样缓冲液和 l x蛋白上样缓冲液混匀，至体积均为 300μ1，浓度为 3.7μ_§/μ1。在沸水中加热变性 3〜5 分钟，高速短暂离心后一 20°C保存备用。每次上样前均要沸水变性，取 ΙΟμΙ含量为 3.7 g/ml的样品用微量加样器上样。

3.3.2 配制 12%分离胶和 4%浓缩胶并灌胶：分离胶和浓缩胶的制备见表 4-2:

分离胶和浓缩胶的制备

分离胶（ml) 浓縮胶（ml)

30%丙烯酰胺溶液 4 0.5

1.5mmol/L Tris (pH 8.8 ) 2.5 - l .Ommol/L Tris (pH 6.8 ) - 0.38

10%SDS 0.1 0.03 去离子水 3.3 2.1

10%过硫酸铵（AP) 0.1 0.03

5%TEMED 0+004 0.003 在配制分离胶与浓缩胶时，为避免凝胶过早凝固，需在倒胶前加入 TEMED。首先将分离胶注入玻璃夹层后，上部用蒸熘水封住液面，保持胶面水平。待分离胶凝固后，吸干蒸熘水，用蒸熘水冲洗数次以除去未聚合的丙烯酰胺，吸干后灌入浓缩胶，并插入点样梳，点样梳前沿与分离胶距离约 0.5cm。

3.3.3 加样：室温下凝胶凝固后，在电泳槽加入电泳缓冲液，拔去上样梳，用微量加样器根据胞浆蛋白浓度分别吸取适量体积的待分析样品加入梳孔内。

3.3.4 电泳：加样毕，按通电源，先用高电压 120V, 待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后且前沿进入分离胶后，再降低电压至 100V ，恒压电泳 120min，待溴酚蓝指示剂到达胶底边缘时，关闭电源。

3.4 蛋白印迹分析：

3.4.1 电转移：预先将 PVDF 膜在无水甲醇中浸泡 30 秒，使 PVDF 膜成透明状，再于蒸熘水中浸泡 10 分钟后，与 Whatman滤纸一同浸泡入转移缓冲液。取下凝胶，按滤纸、凝胶、 PVDF 膜、滤纸的顺序放好，确保两侧的滤纸大小，以免发生短路，固定后插入电转移槽中，保证凝胶在阴极、 PVDF 膜在阳极的方向。 4°C， 80V 电转移 3小时。

3.4.2 封闭：电转移完成后，取出 PVDF 膜，用 5%的 BSA封闭液（用 l xTBST溶液溶解）室温封闭 3 小时，再用 TBST振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。

3.4.3 与一抗反应：将一抗用 TBST溶液按 1 : 200的比例稀释，与 PVDF 膜反应， 4°C 过夜。次日室温平衡 1小时后，使用 TBST洗涤 3 次。

3.4.4 与二抗反应：将 HRP标记的相应的二抗用 TBST溶液按 1 : 2000的比例稀释，与 PVDF 膜室温反应 2 小时后，用 TBST洗涤 3 次。

3.4.5 显影及定影：取底物液 A液与 B 液等量混合后，滴在 PVDF 膜上，室温孵育

5 分钟后去除膜上多余液体，用保鲜膜包裹，避免 PVDF 膜和塑料薄膜之间气泡的存在。压膜，曝光，显影，双蒸水洗 1 分钟，定影 1 分钟。

3.4.6 显影照片经扫描后用 Alpha Ease FC4.0软件进行光密度分析，以 β-actin条带的平均光强度值为内参照，结果以蛋白相应水平与 β-actin 比值来表示。

4 统计处理：

采用 SPSS11.0 统计软件进行统计分析，正态分布和方差齐性数据采用 t检验，如数据不符合正态分布或方差齐性，则采用非参数检验。

三、实验结果

1 小鼠眼睛血清中 VEGF的检测

如表 4-3及图 4所示，高剂量组小鼠血清 VEGF的光密度值为 0.1937，与阴性对照组

0.2200比较， P=0.0037; 低剂量组与阴性对照比较， P = 0.0259，两者均有统计学意义。 VEGF活性检测结果（x±s)

注：与阴性对照比较， ① P<0.05， (¾ <0.01

2 Caspase3 , 8， 9活性的测定

CL168-6作用 HepG2细胞 2.4h和 48h后，对 Caspase3， 8， 9活性检测结果见表 4-4及图 5、图 6。

表 4-4 Caspase3 , 8, 9 OD值

24h 48h

2 0μ₈ 2·0μ₈

Caspase3 0.163 0.190 0.165 0.185 Caspase8 0.362 0.413 0.368 0.408 Caspase9 0.130 0.156 0.132 0.146 三种酶活性增高均不明显，没有统计学意义。

3 蛋白电泳

3.1细胞提取蛋白含量测定（图 7)

根据 BSA标准品的浓度 (X)和吸光度 (y)的值，绘制蛋白定量标准曲线。利用标准曲线得到直线方程 Y=2.22x-0.02 (Υ值代表样品稀释后的浓度， X代表吸光度值）如图 3.3所示，相关系数 r=1.00，提示直线方程的相关性好，根据所测量的吸光度值 (y)计算出相应的蛋白浓度 (χ)。

3.2 Ρ53蛋白含量的表达

蛋白电泳时每个孔上样的蛋白总量保持一致。三组分别为对阴性对照组、阳性对照组 ( CTX) 和实验组 CL168-6。以 β-Actin为内参照。 P53的相对表达含量实验组为 0.74±0.03，阴性对照组为 0.32±0.05，两组差异显著， P=0.002。（图 8)

3.3 bcl-2含量的表达

bcl-2的相对表达含量实验组为 0.75±0.04，阴性对照组为 0.31±0.01， P=0.000,两组有统计学意义。（图 9)

3.4 VEGF含量的表达

VEGF的相对表达含量实验组为 0.46±0.08，阴性对照组为 0.71±0.05，两组差异显著， P=0+04。（图 10)

3.5 P21含量的表达 P21的相对表达含量实验组 0.79±0.07，阴性对照组为 0.76±0.06，两组的表达量无显著性差异， P=0.73。（图 11 )

四. 结论

本实验研究表明， CL168-6可降低荷瘤小鼠眼睛血中的 VEGF含量，同时瘤体中 VEGF 蛋白表达水平呈下降趋势。 CL168-6可通过降低 VEFG的活性抑制肿瘤增生。

我们的实验显示， CL168-6对 Caspase-3， 8， 9的活性无明显影响，推测 CL168-6诱导 HepG2细胞凋亡可能不依赖于这三种酶的活化。

本实验中，对照组和给药组 P21蛋白的表达量没有统计学意义，初步推断 CL168-6抑瘤作用不是通过 P53—P21这条信号传导途径来实现的。

我们在实验中发现，给药组 Bcl-2蛋白表达量明显低于阴性对照组，可以认为， CL168-6 可通过下调 Bcl-2蛋白表达水平而达到抑瘤效果，具体机制有待进一步的探讨。

P53基因有野生型 (Wild type p53， wtp53 )和突变型 (Mutant type p53， mtp53)两种， wtp53 是抑癌基因，可参与细胞周期的调控，在维持细胞正常生长、抑制肿瘤增殖过程中起重要作用，我们的实验结果显示，给药组的 P53蛋白表达量明显高于阴性对照组的表达量，可以初步判断， CL168-6可上调荷瘤小鼠 wtp53的表达水平，抑制 Bcl-2和 VEGF蛋白表达，从而发挥抗肿瘤作用。毒性实施例 1

一、实验项目：小鼠经腹腔注射 LD50(KORBER氏法）

二、实验材料：

ICR小白鼠【雌雄各半， 18-22 g，动物许可证编号： SCXK (京) 2007-0001】

CL168, 白色粉末（自制），用色拉油稀释，现用现配。

三、实验方法：

采用 ICR种小鼠，体重范围 18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供 (SPF 级" )。实验剂量以 2000mg I kg为最高剂量组，以 0.8倍递减，设 1600mg I kg、 1280mg I kg、 1024mg I kg和 819.2mg I kg共五组，将小鼠随机分组，每组 10只，雌雄各半，腹腔注射 0.2ml/10g。，观察 3-7天，记录动物各种反应及各组死亡的只数。根据各组动物的死亡率，用改良寇氏法（Korbor) 算出 LD50和可信限。

四、实验结果：

在给药后 12小时内，未见死亡， 7天内各组小鼠死亡情况见下表：实施例表 CL168小鼠经腹腔注射 LD₅o

动物数给药剂量对数剂量动物死亡数死亡率

组别 P²

(n) (mg kg) (X) (P)

1 10 819.2 2.91 0 0 0

2 10 1024 3.01 1 0.1 0.01

3 10 1280 3.11 3 0.3 0.09

4 10 1600 3.20 6 0.6 0.36

5 10 2000 3.30 8 0.8 0.64 五、小结：

釆用改良寇氏（Korber)法计算 CL168 的 LD₅。为 1479.11mg/kg， 95%的可信区间为 1304.19~1677.49mg/kg。毒性实施例 2

一、实验项目： CL168抗肿瘤治疗指数

二、实验材料：（见效果实施例 2，毒性实施例 1 )

三、实验方法：（见效果实施例 2，毒性实施例 1 )

四、实验结果：（见效果实施例 2，毒性实施例 1 )

五、由效果实施例 2可知， CL168高剂量 30mg/kg时，对实体瘤 S 180的抑制率为 54.58%，对 H22腹水癌小鼠存活率为 51.55%; CL168低剂量 15mg/kg时，对实体瘤 S180的抑制率为 44.33%，对 H22腹水癌小鼠存活率为 37.11%; 结合毒性实施例 1可知， CL168的 LD₅₀ 为 1479.11mg/kg，其治疗指数 TI约为 49.3。

六、小结：

CL168治疗指数 TI约为 49.3，说明 CL168安全性较高，抗肿瘤作用明显。制剂实施例 1

取 CL168-6 10g，加入注射剂（包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂）适当辅料，按注射剂（包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂）工艺制备成抗肿瘤药注射剂。制剂实施例 2

取 CL168-6 10g，加入片剂（包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等）适当辅料，按片剂（包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等）工艺制备成抗肿瘤药片剂。制剂实施例 3

取 CL168-6 10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成抗肿瘤药胶囊剂。制剂实施例 4

取 CL168-6 10g，加入乳剂（包括微乳、纳米乳等）适当辅料，按乳剂（包括微乳、纳米乳等）工艺制备成抗肿瘤药乳剂。制剂实施例 5

取 CL168-6 10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成抗肿瘤药颗粒剂。制剂实施例 6

取 CL168-6 10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制备成抗肿瘤药缓释控释剂。制剂实施例 7

取 CL168-6 10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成抗肿瘤药口服液。制剂实施例 8

取 CL168-6 10g,加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成抗肿瘤药脂质体剂型。

Claims

权利要求

1. CL168结构通式 I

其中， R代表氧 (化合物 CL 168-6)、硫、 NH、 SO:

2. CL168结构通式 II

II

其中， R代表 C₂-C₂₅烷基、芳基、供电子基团或吸电子基团的取代芳基、 C₃-C₆炔基、烯基、 C₃-C₉环烷基、杂原子取代 C₃-C₉的环烷基、 d-C^脂肪酰基、芳香酰基、磺酰基、桂皮酰基、咖啡酰基、没食子酰基、阿魏酰基、苯甲酰基、 L-脂肪族氨基酰基、 L-芳香族氨基酰基。

3. 根据权利要求 1所述化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

( 1 ) 将胆醇（化合物 2) 溶于有机溶剂， -定温度下与醋酐在催化剂的催化下生成胆甾醇醋酸酯（化合物 3);

( 2)将上述生成的化合物 3溶于有机溶剂， -定温度下与溴代试剂在催化剂的催化下生成 7-溴代-胆醇 -3-醋酸酯（化合物 4 )；

( 3)将上述生成的化合物 4溶于有机溶剂，定温度下与碱发生消除反应生成 7-脱氢胆甾醇 -3-醋酸酯（化合物 5);

(4)将上述生成的化合物 5溶于有机溶剂， -定温度下，与碱发生水解反应生成 7-脱氢胆甾醇 (化合物 6);

( 5)将上述生成的化合物 6溶于有机溶剂， -定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成 5 α， 8 α -环二氧 -胆 -6-烯 -3-醇（化合物 7); (6)将上述生成的化合物 7溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成 5 α， 8α -环二氧 -胆 -6-烯 -3-酮（化合物 1， CL168-6);

上（1)、（2)、（3)、（4)、（5)、 (6) 的反应式为：

compound 4. 根据权利要求 2所述化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将胆醇（化合物 2)溶于有机溶剂，一定温度下与提供 R的反应试剂（R代表 C₂-C₂₅ 烷基、芳基、供电子基团或吸电子基团的取代芳基、 C₃-C₆炔基、烯基、 C₃-C₉环烷基、杂原子取代 C₃-C₉的环烷基、 d-C^脂肪酰基、芳香酰基、磺酰基、桂皮酰基、咖啡酰基、没食子酰基、阿魏酰基、苯甲酰基、 L-脂肪族氨基酰基、 L-芳香族氨基酰基）在催化剂的催化下生成化合物 3;

(3) 将上述生成的化合物 4溶于有机溶剂，一定温度下与碱发生消除反应生成化合物 5;

上述方法中步骤（1)、（2)、（3)、 (4) 的反应式为：

5. 如权利要求 1所述的化合物的用途，在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。

6. 如权利要求 1所述的化合物的用途，在制备预防和治疗免疫疾病药物中的应用。

7. 如权利要求 2所述的化合物的用途，在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。

8. 如权利要求 2所述的化合物的用途，在制备预防和治疗免疫疾病药物中的应用。