KR20150013520A

KR20150013520A - 대사 장애, 고지질혈증, 당뇨병, 지방간 질환 및 죽상동맥경화증의 치료를 위한 신규한 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐, 3β-25-디올, 디설페이트 (２５ＨＣＤＳ)

Info

Publication number: KR20150013520A
Application number: KR1020147031567A
Authority: KR
Inventors: 선린 렌
Original assignee: 버지니아 커먼웰스 유니버시티
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-02-05
Also published as: US20210238219A1; US20150072962A1; CN106083976B; AU2013246435B2; PT2836502T; HUE035073T2; EP2836502A1; JP6125610B2; EP2836502B1; KR102180485B1; US20180127457A1; CN104220450A; BR112014025081B1; US20200157140A1; JP2021138713A; MX357046B; CN104220450B; AU2017268646A1; SI2836502T1; AU2013246435A1

Abstract

5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 는 PPARγ 아고니스트 및 LXR 안타고니스트임이 밝혀졌고, 지방간, 염증성 장, 및 죽상동맥경화 질환을 제한 없이 포함하는, 지질 장애 및 염증성 질환의 치료에 사용된다.

Description

대사 장애, 고지질혈증, 당뇨병, 지방간 질환 및 죽상동맥경화증의 치료를 위한 신규한 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐, 3β-25-디올, 디설페이트 (２５ＨＣＤＳ) {A NOVEL CHOLESTEROL METABOLITE, 5-CHOLESTEN, 3β-25-DIOL, DISULFATE (25HCDS) FOR THERAPY OF METABOLIC DISORDERS, HYPERLIPIDEMIA, DIABETES, FATTY LIVER DISEASES AND ATHEROSCLEROSIS}

관련 출원에 대한 교차 참조

이 출원은 미국 가 특허 출원 61/623,203 및 61/623,414 (두 출원은 2012 년 4 월 12 일자에 출원됨) 의 우선권을 주장한다. 상기 두 개의 가 출원의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 신규한 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 지질 대사 장애 및 염증 장애 예를 들어 고지질혈증, 당뇨병, 지방간 질환 및 죽상동맥경화증과 같은 질환의 예방 및 치료를 위한 25HCDS 를 제공한다.

간은 지질 항상성의 유지에서 중추적인 역할을 수행한다. 간 조직 내의 지질 축적은 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 을 초래한다. NAFLD 는 미국 일반 인구의 거의 4 분의 1 에게 발생하고, 심각한 간경변 및 간세포암으로 진행할 수 있다. NAFLD 의 범위는 단순한 비진행성 지방증에서부터 간경변 및 간세포암을 초래하는 진행성 비알코올성 지방간염 (NASH) 까지 다양하다. NAFLD 의 발병기전은 2-단계 과정으로서 여겨진다. 첫번째 단계는 간세포 내의 트리글리세리드 및 연관 지질 축적이다. 두번째 단계는 간 염증의 발생이다. NAFLD 의 전형적인 특색은 증가된 간내 트리글리세리드 축적을 특징으로 한다. 지질 수준의 저하는 성공적인 NAFLD 요법의 중요한 요소이다. 포유류에서, 스테롤 조절성 요소-결합 단백질-1c (SREBP-1c) 는 우선적으로 지방생성 유전자 발현을 통제하고; 지방산 및 트리글리세리드 항상성을 조절한다. 지방산 생합성 및 지방간 질환의 발달에 있어서의 그것의 역할은 잘 입증되어 있다. 그러나, 현재 NAFLD 에 대해 승인된 치료법은 없다.

옥시스테롤은 콜레스테롤 항상성 및 지질 대사에서 복수의 지점에서 작용할 수 있다. 옥시스테롤 수용체, LXR 은 스테롤에 의해 조절되는 지질 대사 전사 인자이다. LXR 의 활성화는 ABCA1 및 ABCG5/8 을 통해 콜레스테롤 배출 및 제거의 발현을 자극하지만, 또한 SREBP-1c 의 발현을 상향조절하며, SREBP-1c 는 결국 지질 생합성 및 수송에 관여하는 32 개 이상의 유전자를 조절한다. 그러므로, 합성 리간드에 의한 LXR 의 활성화는 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시켜 죽상동맥경화증에 대해 보호할 수 있지만, 활성화는 또한 SREBP-1c 의 활성화를 통해 지방산 및 트리글리세리드 합성을 유도하여 간 지방증 및 고트리글리세리드혈증을 초래한다. 간세포가 지방산을 트리글리세리드 형태로 저장하는 용량에는 한계가 있다. 용량이 초과되면, 세포 손상이 발생한다. 과잉량의 세포내 자유 지방산은 반응성 산소 종 (ROS) 의 생산을 유발하여, 지방독성 및 염증 신호전달 경로 활성화를 야기하며, 이는 궁극적으로 세포자멸사를 초래한다.

5-콜레스텐-3β, 25-디올 3-설페이트 (25HC3S) 는 최근에 일차 랫트 간 핵에서 확인된 옥시스테롤이다. 25HCDS 는 WO 2006/047022 에 개시되어 있다. 이러한 옥시스테롤은 스테롤 술포트랜스퍼라제 SULT2B1b 에 의해 25-히드록시콜레스테롤 (25HC) 로부터 유사 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐-3β,25-디올 3β-설페이트 (25HCβS) 의 옥시스테롤 황산화 외인성 투여에 의해 합성될 수 있고, SREBP-1 및 SREBP-2 둘다의 발현을 감소시키고; SREBP-1c 가공을 차단하고; 아세틸-CoA 카르복실라제-1 (ACC-1), 지방산 신타제 (FAS) 및 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리턱타제 (HMGR) 를 포함하는 지질 대사에 관여하는 핵심 효소의 발현을 억제하여, 후속적으로 중성 지질 및 콜레스테롤 수준을 감소시킨다.

결과는 25HC3S 가 LXR 안타고니스트 및 콜레스테롤 포만 신호로서 작용하여; LXR/SREBP 신호전달 저해를 통해 지방산 및 트리글리세리드 합성 경로를 억제함을 시사한다. 더욱이, 25HC3S 는 IκBβ 발현을 증가시키고; TNFα-유도 IκBβ 분해를 차단하고; 핵 NFκB 수준을 감소시킨다. 그와 대조적으로, 25HC 는 반대 방식으로 작용하여, IκBβ 분해 및 핵 NFκB 축적을 유도한다. 이들 결과는 25HC3S 가 염증 반응에도 관여하고 염증 경로와 지질 항상성 조절 사이의 연결에 해당할 수 있음을 시사한다.

또다른 조절성 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 가 현재 확인되었다. 25HCDS 의 연구는 이러한 자연 발생적 대사물질의 감소된 발현이 대사 장애의 발병에 기여하는, 간세포 및 마크로파지에서의 지질 축적 및 세포 손상 둘다에서 중요한 역할을 수행함을 시사한다. 간세포 및 마크로파지의 배양 배지에 대한 25HCDS 의 첨가는 스테롤 조절성 요소 결합 단백질 (SREBP) 의 mRNA 수준을 감소시켰고, SREBP 가공을 저해했고, 후속적으로 지질 생합성에 관여하는 핵심 효소를 하향조절하여, 간세포 및 마크로파지에서 감소된 세포내 지질 수준을 초래했다. 25HCDS 는 또한 퍼옥시좀 증식 활성화인자 수용체 (PPAR), IκB 의 발현, 및 퍼옥시좀 증식 활성화인자 수용체 공활성화인자 1 알파 (PGC-1α) mRNA 수준을 증가시켰고, 핵 NFκB 수준을 감소시켰고, 전-염증성 사이토카인 발현 및 분비를 감소시켰다. 의미 있게도, 생체내 연구는 25HCDS 투여가 독성을 나타내지 않으면서 간 중성 지질을 ~20-35% 만큼 감소시켰음을 보여줬다.

이와 같이, 새롭게 발견된 콜레스테롤 대사물질 25HCDS 는 PPARγ/IκB/NFκB 신호전달 경로를 통해 염증 반응을 억제하는 것 외에도, 시험관내 및 생체내에서 간세포 및 마크로파지에서의 콜레스테롤 및 지질 생합성을 저해하는 진짜 PPARγ 아고니스트 및 LXR 안타고니스트로서 기능한다. 따라서, 본원의 실시예 부분에서 기재된 바와 같이 화학적으로 합성된, 25HCDS 는 고지질혈증, 죽상동맥경화증, 당뇨병, 지방간 질환 등을 포함하는 지질 대사 및 염증 장애의 치료 및 예방용 약제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 특색 및 장점은 뒤따르는 발명의 상세한 설명에 제시될 것이고, 일부는 발명의 상세한 설명으로부터 명백할 것이고 또는 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 본 발명은 기재된 설명 및 그의 청구항에서 특별히 지적된 조성물 및 방법에 의해 실현 및 획득될 것이다.

하나의 양상에서, 본 발명은 하기 화합물: (i) 하기 화학식의 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS)

,

및/또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 약제로서의 용도를 제공한다.

일부 양상에서, 상기 화합물은

이다.

일부 양상에서, 본 발명은 하기 방법에 있어서의 상기 화합물의 용도를 제공한다: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하는 방법; 및/또는 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하는 방법. 추가 양상에서, 본 발명은 화합물

또는

의 하기를 제조하기 위한 용도를 제공한다: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하기 위한 약제; 또는 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하기 위한 약제.

또다른 양상에서, 본 발명은 대상에게 화합물

또는

의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 대상을 치료하는 방법으로서, 하기로부터 선택되는 방법을 제공한다: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하는 방법; 및 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하는 방법. 일부 양상에서, 화합물은 상기 대상의 체질량을 기준으로 0.1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 의 양으로 투여되거나, 화합물은 상기 대상의 체질량을 기준으로 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 의 양으로 투여되고/거나; 투여는 경구 투여, 장 투여, 설하 투여, 경피 투여, 정맥내 투여, 복막 투여, 비경구 투여, 주입, 피하 주입 및 근육내 주입에 의한 투여 중 하나 이상을 포함한다.

,

및/또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 하나의 양상에서, 화합물 자체 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다. 또다른 양상에서, 약제로서의, 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도가 제공된다.

일부 양상에서, 화합물은

이다.

일부 양상에서, 화합물은 단리된 화합물이다. 하나의 양상에서, 화합물은 실질적으로 순수하다. 또다른 양상에서, 화합물은 고체 형태이다. 고체 형태는 분말 형태; 및/또는 동결건조 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 하기 화합물: (i) 하기 화학식의 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS)

및 (ii) 생리적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

일부 양상에서, 화합물은

이다.

일부 양상에서, 약학적 조성물은 단위 투여 형태로 제형화된다. 하나의 양상에서, 약학적 조성물은 고체 형태이다. 고체 형태의 조성물은 하기와 같은 약학적 조성물을 포함한다: 분말, 정제, 캡슐 또는 로젠지 형태인 약학적 조성물; 또는, 임의로 밀봉 바이알, 앰플, 주사기 또는 백 내에 제공되는, 동결건조 형태의 화합물을 증량제와 함께 포함하는 조성물. 일부 양상에서, 약학적 조성물은 액체 담체를 포함한다. 이 양상에서, 화합물은 액체에 용해되거나 액체에 분산될 수 있고/거나; 액체는 수성이고/거나; 액체는 주사용 멸균수 또는 포스페이트-완충 식염수이고/거나; 조성물은 밀봉 바이알, 앰플, 주사기 또는 백 내에 제공된다.

본 발명은 또한 화합물

또는

을 생산하는 방법으로서, 25-히드록시콜레스테롤을 삼산화황의 공급원과 반응시키고, 임의로, 결과적인 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 로부터 약학적으로 허용가능한 염을 형성하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 삼산화황의 공급원은 삼산화황 아민 복합체이다. 하나의 양상에서, 상기 방법은 화합물을 생리적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합시키는 것을 포함한다.

위에 명시된 바와 같이, 본 발명은 특히 하기 방법에서 사용하기 위한 명시된 화합물을 제공한다: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하는 방법; 또는 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하는 방법. 의심할 여지를 없애기 위해, 이 양상에서 본 발명은 명시된 방법에서 약제로서 사용하기 위한 명시된 화합물을 제공할 수 있다. 나아가, 본 발명은 명시된 방법에서 활성 치료 성분으로서의 명시된 화합물을 제공할 수 있다. 나아가, 본 발명은 명시된 방법을 포함하는, 요법에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 명시된 화합물을 제공할 수 있다.

도 1. 음성 이온-3중 4중 질량 분석법에 의한 5-콜레스텐-3β, 25-디올 디설페이트로서의 핵 옥시스테롤의 특성분석. HPLC/MS 음성 풀 스캔 스펙트럼, m/z 583 및 m/z 561 의 생성물 스캔 스펙트럼으로부터 질량 이온 80 으로 소팅된 HPLC-MS 용리 프로파일이 제시되어 있다.
도 2. 화학적으로 합성된 25HCDS 의 분석. 생성물의 MS 스펙트럼.
도 3. 25HCDS 의 ¹H NMR 스펙트럼. 화살표는 화합물의 3 위치에서의 양성자 및 출발 물질 및 생성물에서 그것의 공명 화학적 이동을 나타낸다.
도 4. 25HCDS 의 ¹³C NMR 스펙트럼. 화살표는 화합물의 3 및 25 탄소 위치 및 출발 물질 및 생성물에서 그것의 공명 화학적 이동을 나타낸다.
도 5A-D. 25HCDS 는 지질 생합성 유전자 발현을 조절한다. 표시된 농도에서 25HCDS 로 처리된 THP-1 세포 내의 SREBP-1c, ACC, 및 FAS mRNA 수준 (도 5A); SREBP-2, HMG-CoA 리턱타제, 및 LDLR 수준 (도 5B); 표시된 시간 (도 5C) 및 표시된 농도 (도 5D) 에서 25HCDS 로 처리된 THP-1 세포 내의 PPARg 및 IkB mRNA 수준의 실시간 RT-PCR 분석이 나타나 있다. 발현 수준이 γGAPDH 로 정규화되었다. 각각의 값은 3 개의 별개의 측정값의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 6. 25HCD3S 의 투여는 마우스 NAFLD 모델에서 간 조직 내의 지질 축적을 감소시킨다. 동물에게 6 주 동안 3 일마다 1 회 25HCDS 를 복막-주입했다. 간 트리글리세리드, 자유 지방산, 총 콜레스테롤, 자유 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 에스테르, 자유 지방산, 및 트리글리세리드는 실시예에 기재된 바와 같이 측정되었다. 각각의 개별 수준은 단백질 농도에 의해 정규화되었다. 모든 값은 평균 ± SD 로 표현되어 있다; 기호 * 는 HFD 를 공급한 비히클-처리된 마우스 간에 대한 p < 0.05 를 나타낸다.

신규한 콜레스테롤 대사물질 5-콜레스텐-3β,25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 가 현재 확인되었다. 25HCDS 의 투여는 마우스 NAFLD 모델에서 생체내에서 LXR-SREBP-1c 신호전달 경로를 통해 실질적으로 PPARγ, PPARγ 공활성화인자 1 알파 (PGC-1α), 및 IκB 의 발현을 증가시키고, 간 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준을 감소시켰다. 이들 발견은 25HCDS 가 지질 대사 및 염증 반응에 관여하는 강력한 조절인자라는 것을 입증한다.

본 발명은 따라서 지질 대사 및 염증 장애의 치료 및 예방을 위한 25HCDS 의 사용 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 본 발명의 방법은 대상에서 25HCDS 의 수준을 상승시키고/거나 지질 대사에서 유익한 변화를 가져오기 위해 치료 유효량의 25HCDS 를 그러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법의 실행은 일반적으로 지질 대사 장애 및 그와 연관된 상태를 앓고 있거나 그것을 발달시킬 위험에 처한 환자를 식별하고/거나, 비정상적 염증을 앓고 있거나 그것을 발달시킬 위험에 처한 환자를 식별하고, 25HCDS 를 수용가능한 형태로 적당한 경로에 의해 투여하는 것을 포함한다. 적합한 대상의 식별은, 예를 들어, 다양한 혈액 시험, 간 생검 결과, 현성 질환 증상의 존재 등을 사용하여 달성될 수 있으며, 이는 당업계에 알려져 있다. 적합한 치료 대상은 지질 대사 장애 및/또는 염증을 앓고 있거나 앓을 가능성이 있는 것으로 확인된 대상을 포함한다. 25HCDS 및 관련 약학적 조성물이 또한 본 발명에 따라 제공된다. 이들은 치료 방법에서 사용될 수 있다.

25HCDS 는 약학적으로 허용가능한 염 형태일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 2-부가 염 또는 1-부가 염일 수 있다. 2-부가 염은 25HCDS 분자의 각각의 2 개의 설페이트 기 상의 수소 원자의 상실에 의해 형성된다. 1-부가 염은 25HCDS 분자의 2 개 중 오직 1 개의 설페이트 기 (분자의 3β 또는 25-위치에서) 상의 수소 원자의 상실에 의해 형성된다.

약학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어, 알칼리 금속 염 (예를 들어, 리튬, 나트륨 또는 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예를 들어, 칼슘 염) 또는 암모늄 염일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 리튬 또는 암모늄 염일 수 있다.

그러한 염의 하나의 예는 25HCDS 의 나트륨 염, 예를 들어 25HCDS 의 1-부가 나트륨 염, 예컨대 25HCDS, 즉, 하기 화학식을 갖는 화합물의 25-위치에서 설페이트 기 상의 수소 원자의 상실에 의해 형성되는 1-부가 염이다:

.

의심할 여지를 없애기 위해, 이 명세서 전체에서 "25HCDS" 에 대한 언급은 명백히 다르게 표시되지 않으면 25HCDS 의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다는 점이 강조된다.

콜레스테롤은 8 개의 키랄 중심을 함유하므로, 다수의 구별가능한 입체이성질체가 생긴다. 이들 8 개의 키랄 중심은 25HCDS 에도 존재한다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 25HCDS 는 임의의 단일 입체이성질체 형태 또는 임의의 둘 이상의 이들 입체이성질체 형태의 혼합물일 수 있다. 그러나, 25HCDS 의 50 wt% 이상, 바람직하게는 90 wt% 이상, 가장 바람직하게는 95 wt% 이상이 하기 화학식을 가질 수 있다:

.

이 화학식에서 8 개의 키랄 중심 각각에서의 키랄성은 자연 콜레스테롤에서 발견되는 것과 유사하다고 이해될 것이다. 따라서, 이러한 입체이성질체는 생체내 자연 25HCDS 대사물질의 입체이성질체 형태에 상응한다.

25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 단리된 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. "단리된" 은 인간 또는 동물 대상 내에 함유된, 또는 그로부터 추출된 조직 물질 내에 포함되어 있지 않음을 의미한다. 예를 들어, 단리된 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 세포 내에 포함되어 있지 않다. 따라서, 단리된 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 인간 또는 동물 대상 내에 직접 함유되어 있는, 또는 그로부터 추출된 조직 물질 (예를 들어, 세포) 내에 포함되어 있는 자연 25HCDS 와 명백히 구별가능하다.

25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 실질적으로 순수할 수 있다. 예를 들어, 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 치료 방법에서 사용하기 위해 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있다.

"실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된" 형태일 때 디설페이트화 옥시스테롤 (25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염) 은 다른 화학 종이 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 없는 형태일 수 있다. 실질적으로 순수한 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 특히 약 90 wt% 이상 또는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 wt% 이상, 약 99 wt% 이상 또는, 더욱더 바람직하게는, 약 99.5 wt% 이상 또는 약 99.8 wt% 이상의 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.

25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 고체일 수 있다. 예를 들어, 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 분말 형태일 수 있다.

25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 동결건조 형태일 수 있다. 잘 알려져 있는 바와 같이, 동결-건조는 상하기 쉬운 물질을 보존하거나 그 물질을 수송에 더 편리하게 만드는데 전형적으로 사용되는 탈수 과정이다. 이 기술에는 3 개의 주요 단계, 즉 동결, 1 차 건조 및 2 차 건조가 있다. 동결은 전형적으로 동결-건조 기계를 사용하여 수행된다. 1 차 건조 동안 적당한 수준의 진공의 적용에 의해 압력이 조절되는 한편, 충분한 열이 공급되어 존재하는 임의의 물을 승화시킨다. 2 차 건조 과정에서, 열의 추가의 적용에 의해 수화수가 제거된다. 전형적으로, 압력이 또한 저하되어 추가의 건조를 촉진한다. 동결-건조 과정의 완료 후에, 밀봉 전에 질소와 같은 불활성 기체로 진공이 해소되거나, 물질이 진공 하에 밀봉될 수 있다.

생세포로부터 25HCDS 를 단리 및 정제하는 것이 가능하지만, 당업자는 충분한 품질의 디설페이트화 옥시스테롤을 생성하기 위해, 화합물이 일반적으로 합성 화학 수단에 의해, 또는 재조합 DNA 기술의 사용을 수반하는 방법에 의해 (예를 들어 클로닝된 효소를 사용하여 콜레스테롤의 적합한 수식을 수행함으로써) 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 예시적 합성 방법이 하기 실시예 부분에 제공되어 있다.

더욱 일반적으로, 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 25-히드록시콜레스테롤을 삼산화황의 공급원과 반응시키고, 임의로, 결과적인 생성물로부터 약학적으로 허용가능한 염을 형성함으로써 합성적으로 생산될 수 있다.

임의의 적합한 삼산화황의 공급원이 사용되어 25-히드록시콜레스테롤에 존재하는 2 개의 히드록실 기 (-OH) 가 설페이트 기 (-OSO₃H) 로 전환될 수 있다. 삼산화황-아민 복합체는 삼산화황 공급원의 하나의 예시적 그룹이다. 그러한 복합체의 예는 삼산화황 트리메틸아민 복합체 (TMAS), 삼산화황 트리에틸아민 복합체 (TEAS), 삼산화황 디메틸아닐린 복합체 (DMAS), 삼산화황 디메틸포름아미드 복합체 (DMFS), 삼산화황 피리딘 복합체 (PSS) 및 삼산화황 폴리비닐피리딘 복합체 (PVPS) 를 포함한다. 전형적으로 1 내지 20 moles, 예를 들어 2 내지 10 moles 의 선택된 삼산화황 공급원 (예컨대 삼산화황-아민 복합체) 이 1 mole 의 25-히드록시콜레스테롤마다 사용된다.

반응은 전형적으로 불활성 용매에서 수행된다. 용매는, 예를 들어, 무수 용매일 수 있다. 하나의 예시적 용매는 무수 피리딘이다.

예를 들어 디설페이트 생성물로부터 원하는 약학적으로 허용가능한 염을 생성하기 위해, 염기가 또한 첨가될 수 있다. 그러한 염기는 NaOH 이며, 이는 25HCDS 의 나트륨 염을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적 시약 (상이한 염기도 및/또는 상이한 양이온을 가짐) 이 사용되어 다른 약학적으로 허용가능한 염을 생성할 수 있다는 것이 쉽게 이해될 것이다.

반응 온도는 전형적으로 10 내지 100 ℃, 예를 들어 20 내지 80 ℃ 일 수 있다. 반응 시간은 전형적으로 0.1 내지 24 시간, 예를 들어 0.25 내지 5 시간일 수 있다.

원하는 경우, 반응이 일어난 후에 반응 혼합물로부터 생성물이 정제될 수 있다. 원하는 경우, 반응이 일어난 후에 반응 혼합물로부터 생성물이 단리될 수 있다.

25-히드록시콜레스테롤 출발 물질은 상업적으로 입수가능한 제품이다. 대안적으로, 그것은 콜레스테롤을 수산화시켜 제조될 수 있다 (예를 들어 Ogawa et al. Steroids 74:81-87 참고). 그 과정은 그러므로 콜레스테롤을 수산화시켜 25-히드록시콜레스테롤을 생성하는 초기 단계를 추가로 포함할 수 있다.

25HCDS 는 순수한 형태로 또는 약학적으로 허용가능한 제형으로 투여될 수 있다. 그러한 제형 (조성물) 은 전형적으로 25HCDS 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 생리적으로 허용가능한 (화합성) 부형제, 희석제 또는 담체/비히클을 포함한다. 25HCDS 는, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염 (예를 들어 알칼리 금속 염 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 리튬, 암모늄 등), 또는 기타 복합체 형태일 수 있다.

약학적 조성물은 무균성이다. 무균성은, 예를 들어 USP 무균 시험 ("The United States Pharmacopeia", 30th Revision, The United States Pharmacopeial Convention: 2008. 참고) 을 사용하여 측정할 때, 생존가능한 미생물이 실질적으로 없음을 의미한다. 무균성을 유지하기 위해, 약학적 조성물은 생존가능한 미생물의 침입을 방지할 수 있는 밀봉 패키지 내에 제공될 수 있다. 예를 들어, 액체 약학적 조성물의 경우, 조성물은 바이알 또는 앰플 내에 밀봉될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 제형 (조성물) 은 주사가능한 투여 형태 및 고체 투여 형태 예컨대 정제, 로젠지, 분말 및 캡슐, 뿐만 아니라 에어로졸화된 투여 형태를 제조하는데 통상적으로 이용되는 액체 및 고체 물질을 포함한다고 이해될 것이다. 화합물은 수성 또는 유성 비히클과 함께 제형화될 수 있다. 물이 조성물 (예를 들어 주사가능한 조성물) 을 제조하기 위한 담체로서 사용될 수 있으며, 조성물은 조성물을 등장성으로 만들고 생리적으로 허용가능한 pH 를 유지하게 하는 종래의 완충제 및 작용제를 또한 포함할 수 있다. 기타 가능한 첨가제 (바람직하게는 일반적으로 안전하게 여겨지는 것 [GRAS]) 는 하기를 포함한다: 착색제; 향미료; 계면활성제 (TWEEN, 올레산 등); 용매, 안정화제, 엘릭시르, 및 결합제 및 캡슐화제 (락토스, 리포좀 등). 고체 희석제 및 부형제는 락토스, 전분, 종래의 붕해제, 코팅 등을 포함한다. 보존제 예컨대 메틸 파라벤 또는 벤잘코늄 클로라이드가 또한 사용될 수 있다.

더 상세히, 조성물이 고체 형태일 때 조성물은 분말, 정제, 캡슐 또는 로젠지 형태일 수 있다. 조성물이 고체 형태일 때 조성물은 동결건조 형태의 25HCDS 를 증량제와 함께 포함할 수 있다. 증량제는 조성물에 첨가되어 조성물의 규모를 증가시킬 수 있는 약학적으로 비활성이고, 전형적으로 화학적으로 불활성인 물질이다. 동결-건조된 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 본원에서 적합한 통상적 증량제는 만니톨 및 글리신을 포함한다. 조성물이 고체 형태일 때 조성물은 임의로 밀봉 바이알, 앰플, 주사기 또는 백 내에 제공될 수 있다.

약학적 조성물이 액체 담체를 포함할 때, 25HCDS 는 상기 액체에 용해되거나 상기 액체에 분산되어 있을 수 있고/거나; 액체는 수성일 수 있고/거나; 액체는 주사용 멸균수 또는 포스페이트-완충 식염수일 수 있다. 약학적 조성물이 액체 담체를 포함할 때, 조성물은 밀봉 바이알, 앰플, 주사기 또는 백 내에 제공될 수 있다.

제형에 따라, 활성제 25HCDS 는 조성물의 약 1 중량% 내지 약 99 중량% 를 이루고, 비히클 "담체" 는 조성물의 약 1 중량% 내지 약 99 중량% 를 구성할 것으로 예상된다. 본 발명의 약학적 조성물은 임의의 적합한 약학적으로 허용가능한 첨가제 또는 아주반트를 설페이트화 옥시스테롤의 치료 효과를 방해 또는 간섭하지 않을 정도로 포함할 수 있다.

투여는 경구 투여, 장 투여, 설하 투여, 경피 투여, 정맥내 투여, 복막 투여, 비경구 투여, 주입, 피하 주입, 및 근육내 주입에 의한 투여 중 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 투여는 경구 또는 비경구 (정맥내, 근육내, 피하, 피내 주입, 복막내 주입 등을 포함), 또는 다른 경로 (예를 들어 경피, 설하, 경구, 직장 및 볼 전달, 에어로졸의 흡입 등) 에 의할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 투여는 경구이다. 또한, 화합물의 투여는 단일 모드의 요법으로서, 또는 다른 요법과 함께, 예를 들어 지질 또는 콜레스테롤 저하 약물, 운동 및 식이 요법 등과 함께, 지질 대사 장애의 탐지시 대상에 의해 착수될 수 있는 치료 섭생법에 대해 위에 기재된 바와 같이, 수행될 수 있다. 환자에 대한 25HCDS 의 투여는 간헐적이거나, 점진적 또는 연속적, 지속적 또는 제어되는 속도로 수행될 수 있다. 또한, 약학적 제형이 투여되는 하루 중 시간 및 하루 당 횟수는 다를 수 있고, 숙련의 예컨대 내과의사에 의해 최선으로 결정된다.

25HCDS 의 정확한 투여량은 개별 환자의 연령, 성별, 체중, 전반적인 건강 상태 등, 뿐만 아니라 질환의 정확한 병인에 따라 다를 수 있다. 그러나, 일반적으로 포유류 (예를 들어 인간) 에서 투여하는 경우, 치료적 유효 투여량은 약 24 시간마다 체중 1 ㎏ 당 화합물 약 0.1 내지 약 100 ㎎ 이상, 통상적으로 24 시간마다 체중 1 ㎏ 당 화합물 약 0.5 내지 약 50 ㎎, 빈번히 24 시간마다 체중 1 ㎏ 당 화합물 약 1 내지 약 10 ㎎ 이다.

본 발명의 약학적 조성물은 단위 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 즉, 약학적 조성물은 25HCDS 의 단위 투여물을 각각 함유하는 별개의 분할 형태일 수 있다. 이러한 맥락에서, 단위 투여물은, 예를 들어, 약 0.1 ㎎ 내지 약 100 ㎎, 또는 약 0.5 ㎎ 내지 약 50 ㎎, 또는 약 1 ㎎ 내지 약 10 ㎎ 의 25HCDS 를 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 25HCDS 를 선택된 생리적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 조합함으로써 제조될 수 있다.

대상은 통상적으로 인간이지만, 기술의 수의학적 응용도 고려된다.

다른 양상에서, 필요로 하는 대상에서 25HCDS 의 내인성 발현/생성을 증가시킴으로써 25HCDS 의 수준이 상승된다. 이를 수행하는 예시적 방법은 25HCDS 의 합성을 책임지는 하나 이상의 효소를 대상에게 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소 자체가 제공된다; 다른 구현예에서, 그 효소를 인코딩하는 핵산이 제공된다. 25HCDS 의 합성에 관여하는 효소는 SULT2Bab 및 SULT2B1a 이고, 25HCDS 의 내인성 수준을 상승시키기 위해 이들 중 하나 또는 둘 모두가 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들 효소 중 하나 또는 둘 모두를 함유하고 발현하는 벡터가 제공될 수 있다. 예시적 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 복제-적격 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등을 포함하나 그에 제한되지 않는다.

본원에서 기재된 바와 같이 대상에서 25HCDS 수준을 상승시킴으로써 예방 또는 치료될 수 있는 지질 대사 장애는 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 주로 다양한 바이러스에 의해 뿐만 아니라 일부 박테리아 감염, 약물 또는 화학물질 (예를 들어 독약, 알코올) 에 의해 야기되는 간염 (간 염증), 뿐만 아니라 연관된 합병증 예컨대 간 섬유증; 자가면역 (자가면역 간염) 또는 유전 상태; 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 간 내의 풍부한 지방을 특징으로 하는 비만과 연관되는 스펙트럼 질환, 및 NAFLD 와 연관되는 다양한 증후군 (예를 들어 간염, 비알코올성 지방간염 (NASH), 간경변, 말기 간 질환 등); 간경변, 즉, 죽은 간 세포 (간 세포의 죽음은, 예를 들어 바이러스 간염, 알코올중독 또는 다른 간-독성 화학물질과의 접촉에 의해 야기될 수 있음) 의 대체로 인한 간 내의 섬유질 반흔 조직의 형성; 혈색소침착증, 신체 내의 철 축적을 야기하여 궁극적으로 간 손상을 초래하는 유전 질환; 간암 (예를 들어 일차 간세포암 또는 담관암종 및 통상적으로 위장관의 다른 부분으로부터의 전이성 암); 윌슨 질환, 신체가 구리를 보유하게 하는 유전 질환; 일차 경화성 담관염, 담관의 염증성 질환, 아마도 자연에서 자가면역성임; 일차 담즙 간경변, 작은 담관의 자가면역 질환; 버드-키아리증후군 (간 정맥의 폐쇄); 질베르 증후군, 빌리루빈 대사의 유전 장애, 인구의 약 5% 에서 발견됨; 글리코겐 저장 질환 유형 II; 뿐만 아니라 다양한 소아 간 질환, 예를 들어 담도폐쇄증, 알파-1 항트립신 결핍증, 알라질 증후군, 및 진행성 가족성 간내 담즙정체 등. 또한, 외상으로부터의 간 손상, 예를 들어 사고로 야기되는 손상, 총상 등이 또한 치료될 수 있다. 또한, 특정 약제, 예를 들어, 부정맥치료제 아미오다론, 다양한 항바이러스 약물 (예를 들어 뉴클레오시드 유사체), 아스피린 (드물게 어린이에서 라이 증후군의 일부로서), 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 타목시펜, 테트라사이클린 등의 간 손상을 야기하는 것으로 알려진 약물로 야기되는 간 손상이 예방 또는 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 진단 및 치료 방법은 대상에서 간 수술과 연합하여 (예를 들어 이전, 동안 또는 이후) 수행된다. 예를 들어, 간 수술은 간 이식 수술일 수 있고, 치료되는 대상은 공여자 또는 수령자일 수 있다; 또는 간 수술은 병든 또는 손상된 간 조직을 제거하거나, 암성 종양을 제거하는 수술일 수 있다.

일부 구현예에서, 예방 또는 치료되는 질환 또는 상태는 고지질혈증이거나, 고지질혈증에 의해 야기된다. "고지질혈증" 은 혈액 내의 임의의 또는 모든 지질 및/또는 지단백질의 수준이 비정상적으로 상승된 상태를 의미한다. 고지질혈증은 일차 및 이차 하위유형을 둘다 포함하며, 일차 고지질혈증은 통상적으로 유전 원인 (예컨대 수용체 단백질 내의 돌연변이) 으로 인한 것이고, 이차 고지질혈증은 기타 근원적인 원인 예컨대 당뇨병에서 발생한다. 대상에서 상승되고 본원에 기재된 치료법에 의해 저하될 수 있는 지질 및 지질 복합물은 카일로미크론, 초저밀도 지단백질, 중밀도 지단백질, 저밀도 지단백질 (LDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL) 을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 특히, 상승된 콜레스테롤 (고콜레스테롤혈증) 및 트리글리세리드 (고트리글리세리드혈증) 는 죽상동맥경화증에 대한 영향으로 인해 혈관 및 심혈관 질환에 대한 위험 인자인 것으로 알려져 있다. 지질 상승은 또한 대상을 기타 상태 예컨대 급성 췌장염에 취약하게 만들 수 있다. 본 발명의 방법은 따라서 또한 상승된 지질 또는 그와 연관된 상태의 치료 또는 예방 (예를 들어 예방적 치료) 에서 사용될 수 있다. 그러한 상태는, 예를 들어, 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세리드혈증, 지방간 (간 지방증), 대사 증후군 심혈관 질환, 관상동맥 심장 질환, 죽상동맥경화증 (즉, 동맥경화 혈관 질환 또는 ASVD) 및 연관된 병, 급성 췌장염, 다양한 대사 장애, 예컨대 인슐린 저항성 증후군, 당뇨병, 다낭성 난소 증후군, 지방간 질환, 악액질, 비만, 동맥경화증, 뇌졸중, 담석, 염증성 장 질환, 유전적 대사 장애 예컨대 지질 저장 장애 등. 또한, 고지질혈증과 연관된 다양한 상태는 공표된 미국 특허 8,003,795 (Liu, et al) 및 8,044,243 (Sharma, et al) (이들의 전문은 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 것들을 포함한다.

일부 구현예에서, 예방 또는 치료되는 질환 및 상태는 염증, 및/또는 염증과 연관되는, 염증을 특징으로 하는, 또는 염증에 의해 야기되는 질환 및 상태를 포함한다. 이들은 많은 인간 질환의 기저를 이루는 큰 그룹의 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 염증은 급성이며, 예를 들어 감염, 부상 등으로 초래된다. 다른 구현예에서, 염증은 만성이다. 일부 구현예에서, 면역계는 알레르기 반응 및 일부 근질환 둘다에서 보이는 염증 장애에 관여한다. 그러나, 암, 죽상동맥경화증, 및 허혈성 심장 질환, 뿐만 아니라 기타 아래 열거된 것들을 포함하는 염증 과정에 병의 원인이 있는 다양한 비면역 질환이 또한 치료될 수 있다.

25HCDS 를 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 비정상적 염증과 연관되는 장애의 예는 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 여드름, 천식, 다양한 자가면역 질환, 셀리악 질환, 만성 전립선염, 사구체신염, 다양한 과민증, 염증성 장 질환, 골반 염증 질환, 재관류 손상, 류머티스성 관절염, 유육종증, 이식 거부, 맥관염, 및, 간질성 방광염. 또한 포함되는 것은 합법적으로 처방된 약물 및 불법 약물 둘다의 사용의 결과로서 발생하는 염증 장애, 뿐만 아니라 부정적 인식 또는 그의 결과에 의해 유발되는, 예를 들어 스트레스, 폭행, 또는 궁핍에 의해 야기되는 염증이다.

하나의 양상에서, 예방 또는 치료되는 염증 장애는 알레르기 반응 (유형 1 과민증) 이며, 이는 염증을 유발하는 부적절한 면역 반응의 결과이다. 흔한 예는 건초열이며, 이는 알레르겐에 대한 피부 비만 세포에 의한 과민성 반응에 의해 야기된다. 중증 염증 반응은 아나필락시스로 알려진 전신 반응으로 성숙할 수 있다. 기타 과민증 반응 (유형 2 및 유형 3) 은 항체 반응에 의해 매개되고, 주변 조직을 손상시키는 백혈구를 유인함으로써 염증을 유도하고, 또한 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다.

다른 양상에서, 염증성 근질환이 예방 또는 치료된다. 그러한 근질환은 근육의 성분들을 부적절하게 공격하여 근육 염증의 징후를 초래하는 면역계에 의해 야기된다. 그러한 근질환은 기타 면역 장애, 예컨대 전신성 경화증과 함께 발생할 수 있고, 피부근염, 다발성근염, 및 봉입체 근염을 포함한다.

하나의 양상에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 전신 염증 예컨대 비만과 연관되는 것을 예방 또는 치료하는데 사용된다. 그러한 염증에서, 수반되는 과정은 조직 염증과 동일하나, 전신 염증은 특정 조직에 한정되지 않고 내피 및 기타 기관계를 수반한다. 전신 염증은 만성일 수 있고, 비만에서 널리 관찰되며, 비만에서 하기를 포함하는 다수의 상승된 염증 마커가 관찰된다: IL-6 (인터류킨-6), IL-8 (인터류킨-8), IL-18 (인터류킨-18), TNF-α (종양 괴사 인자-알파), CRP (C-반응성 단백질), 인슐린, 혈액 글루코스, 및 렙틴. 이들 마커의 상승된 수준과 연관되는 상태 또는 질환은 본원에 기재된 바와 같이 예방 또는 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 염증은 사이토카인 예컨대 TNF-α, IL-6, 및 CRP 의 전신 농도의 2- 내지 3 배 증가가 관찰되는 "낮은 등급 만성 염증" 으로 분류될 수 있다. 허리 둘레가 또한 전신 염증 반응과 상당한 상관관계가 있다; 이러한 상관관계에서 우세한 인자는 면역 세포가 지방 침착물을 박테리아 및 곰팡이와 같은 감염 물질로 "오인" 하는, 지방과다증에 의해 유발되는 자가면역 반응으로 인한 것이다. 전신 염증은 또한 과식에 의해 유발될 수 있다. 포화 지방이 풍부한 식사, 뿐만 아니라 칼로리가 높은 식사는 염증 마커의 증가와 연관된 적이 있고, 과식이 만성인 경우에 반응이 만성으로 될 수 있다.

본 발명의 다양한 양상이 하기 실시예에 기재되어 있다. 그러나, 실시예에서 제공되는 정보는 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다.

실시예

신규한 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 는 시험관내 및 생체내에서 지질 생합성을 감소시키고 염증 반응을 억제함

서론

비알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 에서 지질 대사의 광범위한 조절장애가 존재하고, 구체적으로 콜레스테롤 대사에서 큰 변화가 존재한다고 밝혀졌다. 그러한 변화가 핵 수용체 신호전달을 통해 NAFLD 를 초래할 수 있는 잠재적 메카니즘은 아직 불명확하다. 본 연구에서, 신규한 콜레스테롤 대사물질, 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 는 일차 랫트 간세포에서 식별되었다. 본원에서 기재된 바와 같이, 25HCDS 는 현재 화학적으로 합성되고, 그것의 생물학적 기능이 연구되어 왔다. 인간 THP-1 마크로파지 및 HepG2 세포에 대한, 그리고 생체내에서 마우스 NAFLD 동물 모델에 대한 25HCDS (25 μM) 의 투여는 PPARγ 및 PPARγ 공활성화인자 1 알파 (PGC-1α) 발현을 증가시켰고, 지질 생합성 및 전-염증 반응에 관여하는 핵심 단백질의 발현을 감소시켰다. 투여는 간 지질 수준을 현저히 감소시켰고, 염증 반응을 억제했다. 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 25HCDS 가 SREBP-1/2 mRNA 수준을 크게 감소시켰고, ACC, FAS, 및 HMG-CoA 리턱타제를 포함하는 그들의 대응 유전자의 발현을 억제했고, IκB 를 증가시켰고, TNFα 및 ILβ mRNA 수준을 감소시켰음을 보여줬다. 결과는 지질 생합성의 저해가 SREBP 신호전달의 차단을 통해 일어났고, 염증 반응의 억제가 PPARγ, PGC-1α, 및 IκB 발현 증가를 통해 일어났음을 시사한다. 간 조직 내의 지질 프로파일의 분석은 6 주 동안 3 일 마다 1 회 25HCDS 의 투여가 총 콜레스테롤, 자유 지방산, 및 트리글리세리드를 각각 30, 25, 및 20% 만큼 상당히 감소시켰음을 보여줬다. 따라서 25HCDS 는 지질 대사 및 염증 반응의 강력한 조절인자이다.

재료 및 방법

재료:

세포 배양 시약 및 공급물을 GIBCO BRL (Grand Island, NY) 로부터 구입했고; 25-히드록시콜레스테롤을 New England Nuclear (Boston, MA) 로부터 구입했다. THP-1 및 HepG2 세포를 American Type Culture Collection (Rockville, MD) 로부터 수득했다. 실시간 RT-PCR 용 시약을 AB Applied Biosystems (Warrington WA1 4 SR, UK) 로부터 구입했다. 이 연구에서 사용한 화학물질을 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) 또는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) 로부터 수득했다. SREBP1, SREBP-2 및 HMG-CoA 리턱타제에 대한 폴리클로날 토끼 항체를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) 로부터 구입했다. 모든 용매를 다르게 표시되지 않으면 Fisher (Fair Lawn, NJ) 로부터 수득했다. 강화된 화학발광 (ECL) 시약을 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) 로부터 구입했다. 테스토스테론 및 27-히드록시콜레스테롤을 Research Plus Inc. (Bayonne, NJ) 로부터 수득했다. LK6 20 x 20 cm 박막 크로마토그래피 (TLC) 플레이트를 Whatman Inc. (Clifton, NJ) 로부터 구입했다.

방법:

5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트의 화학적 합성

일반 절차: 이전에 기재된 방법 (Ogawa et al. Steroids 74:81-87) 에 의해 콜레스테롤로부터 25-히드록시콜레스테롤을 제조했다. IR 스펙트럼을 JASCO FT-IR 460 플러스 분광계 (Tokyo, Japan) 에서 KBr 디스크에서 수득했다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 Varian 500 Inova (AS500) 장비에서 각각 499.62 MHz 및 125.64 MHz 에서 수득했다. 흐름 주입 저해상도 질량 (LR-MS) 스펙트럼을 음성 이온 모드 하에 전기분무 이온화 (ESI) 탐침을 갖춘 Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra MS 에 의해 기록했다. 고해상도 질량 (HR-MS) 스펙트럼을 음성 이온 모드 하에 ESI 탐침을 갖춘 Thermo Scientific LTQ Qrbitrap Discovery MS 를 사용하여 측정했다. 역상 TLC 를 예비-코팅된 RP-18F254S 플레이트에서 메탄올-물-아세트산 혼합물 (90:10:1, v/v/v) 을 현상 용매로서 사용하여 수행했다. 점들을 50% H₂SO₄ 에 의해 110℃ 에서 가열하여 시각화했다. Bond Elute C18 카트리지 (10 g; Varian,) 를 샘플 정제에 사용했다. OXONE® (칼륨 퍼옥시모노설페이트) 및 아세톤을 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 로부터 구입했고, 사용된 모든 다른 시약은 HPLC 등급이었던 유기 용매를 제외하고는 최고 등급이었다.

5-콜레스텐-3β,25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 의 합성: 무수 피리딘 (300㎕) 중 25-히드록시콜레스테롤 (30 ㎎, 0.07 mmol) 의 용액에, 삼산화황-트리메틸아민 복합체 (45 ㎎) 를 첨가했고, 현탁액을 50℃ 에서 1 시간 동안 교반했다. 반응 혼합물에, 0.1N 메탄올 NaOH (100 ㎕) 를 첨가했고, 혼합물을 메탄올 (10 ㎖) 및 물 (10 ㎖) 로 프라이밍한 Sep Pak C18 카트리지에 적용했다. 카트리지를 PBS (25 ㎖) 및 물 (25 ㎖) 로 연속적으로 세정한 후, 보유된 25HCDS 를 60% 메탄올 (10 ㎖) 로 용리시켰다. 아세토니트릴로 10X 희석한 후에, 용매를 40℃ 미만에서 N₂ 스트림 하에 증발 건조시켰고, 25HCDS 를 분말 형태로 수득했다. 수율, 25 ㎎ (60%).

세포 배양

인간 THP-1 단핵구 및 HepG2 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) 로부터 구입했고, 공급사의 프로토콜에 따라 유지했다. 100 nM 의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 를 첨가함으로써 THP-1 단핵구가 마크로파지로 분화되었다. 세포가 ~90% 밀집도 (confluence) 에 도달했을 때, 에탄올 (배지 중 에탄올의 최종 농도는 0.1% 였음) 중 25HCDS 를 첨가했다. 세포를 표시된 시간에 단백질, mRNA, 및 지질 분석을 위해 수집했다.

HMG CoA 발현 조절을 연구하기 위해, HepG2 또는 PHH 를 위에 기재된 바와 같이 배지에서 메비놀린 (50 μM) 및 메발로네이트 (0.5 μM) 의 존재 또는 부재 하에 배양했다. 48 시간 동안 배양한 후에, 옥시스테롤을 첨가하고 또다른 6 시간 동안 배양한 후, 세포를 mRNA 및 단백질 수준 측정을 위해 수집했다.

TLC 및 HPLC 에 의한 콜레스테롤 생합성의 측정

6 시간 동안 표시된 바와 같은 상이한 농도의 25HCDS 를 함유하는 배지에서 THP-1 마크로파지 또는 HepG2 세포의 인큐베이션 후에, 60 ㎜ 디쉬 내의 세포에 5 μCi 의 [1-¹⁴C] 아세테이트를 함유하는 동일한 신선한 배지 3 ㎖ 를 제공했다. 37℃ 에서 2 시간 인큐베이션 후에, 배지를 제거하고, 세포를 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 로 2 회 세정하고, 기재된 바와 같은 고무 찰자로 수집하고, 마이크로원심분리 튜브 내에 수집했다. 세포를 원심분리에 의해 침강시키고, 펠렛을 재현탁 및 참강에 의해 3 시간 세정했다. 세포 분획 (마이크로솜, 시토졸, 및 핵) 을 이전에 기재된 바와 같이 (2) 단리했다. 세포 또는 세포하 펠렛을 0.3 ㎖ 의 PBS 에 재현탁시켰다. 각각의 샘플에, 1.5 ㎍ 의 테스토스테론을 내부 표준으로서 첨가했다. 3 부피의 클로로포름:메탄올 (1:1) 을 첨가함으로써 총 지질을 추출하고 분리했다. [¹⁴C] 콜레스테롤 및 히드록시콜레스테롤을 클로로포름 상 내로 단리하고, TLC (톨루엔:아세틸 아세테이트, 2/3, v/v/) 에서 분리했다. [1-¹⁴C] 아세테이트 유도체를 Image Reader, Fujifilm BAS-1800 II 에 의해 이전에 기재된 바와 같이 (1) 시각화했다.

라벨링되지 않은 스테롤 생성물의 분석을 위해, 추출된 지질을 20 분 동안 37℃ 에서 2 유닛의 콜레스테롤 옥시다제와 함께 인큐베이션했다. 산화 반응을 1.5 ㎖ 의 메탄올에 뒤이어 0.5 ㎖ 의 포화 KCl 을 첨가함으로써 종료시켰다. 스테롤을 3 ㎖ 의 헥산을 사용하여 2 회 추출했다. 헥산 상을 수집하고, 질소 스트림 하에 증발시켰다. 잔류물을 이전에 기재된 바와 같이 (3) HPLC 분석용 이동상 용매에 용해시켰다.

클로로포름 상 중 [1-¹⁴C]아세테이트 유도체를 HPLC 에 의해 실리카 칼럼 (5μ x 4.6 ㎜ x 25 ㎝; Beckman, USA) 에서 HP Series 1100 용매 전달 시스템 (Hewlett Packard) 을 사용하여 1.3 ㎖/분 유속에서 분석했다. 칼럼을 평형시키고, 이동상으로서의 헥산:이소프로판올:빙초산 (965:25:10, v/v/v) 의 용매계에서 영동시켰다. 배출물을 표시된 것을 제외하고는 0.5 분 (분획 당 0.65 ㎖) 마다 수집했다. [¹⁴C] 아세테이트 유도체 중 총수를 섬광 계수법에 의해 확인했다. 칼럼을 [¹⁴C] 콜레스테롤, [³H] 25-히드록시콜레스테롤, 및 [¹⁴C] 27-히드록시콜레스테롤로 보정했다.

실시간 RT-PCR 에 의한 mRNA 수준의 측정

DNase 처리를 포함하는 SV 총 RNA 단리 키트 (Promega, Madison, WI) 로 총 RNA 단리했다. 제조사 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 의해 권고되는 바와 같이 총 RNA, 2 ㎍ 을 첫번째 가닥 cDNA 합성에 사용했다. 실시간 RT-PCR 을 적합한 염료를 지시약으로서 사용하여 ABI 7500 고속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 에서 수행했다. 모든 실시간 PCR 용 프라이머/프로브 세트는 TaqMan 유전자 발현 검정 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 이었다. β-액틴 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH) 를 내부 대조군으로서 사용했다. 상대 메신저 RNA (mRNA) 발현을 비교 주기 역치 (Ct) 방법으로 정량화하고, 2^-△△Ct 로서 표현했다. 증폭에 적합한 프라이머의 서열은, 예를 들어, Ren et al., 2007 (1) 에 기재되어 있다.

웨스턴 블롯 분석

마이크로솜 분획을 이전에 기재된 바와 같이 (4) 단리했다. 처리된 세포로부터의 마이크로솜 또는 총 추출된 단백질을 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 변성화 겔에서 분리했다. SDS-PAGE 후에, 단백질을 폴리비닐리덴 플루오리드 (PVDF) 막 (Millipore) 에 전기영동적으로 전달했다. 그 후 막을 25℃ 에서 60 분 동안 차단 완충액 [PBS, pH 7.4, 0.1% TWEEN® 20 (막 단백질 가용화 비이온성 계면활성제, C₅₈H₁₁₄O₂₆), 5% 탈지분유] 에서 차단했다. 그 후 단백질을 인간 SREBP1, SREBP-2, 또는 HMG-CoA 리턱타제에 대한 토끼 폴리클로날 IgG 와 함께 4℃ 에서 밤새 인큐베이션했다. 0.05% 의 TWEEN® 20 을 함유하는 PBS, pH 7.4 로 세정 후에, 세정 용액 중 염소 항-토끼 IgG-홀스래디시 퍼옥시다제 접합체, 1:2500 를 첨가하고, 60 분 동안 인큐베이션했다. 단백질 밴드를 Amersham ECL 플러스 키트를 사용하여 탐지했다. 양성 밴드를 어드밴스드 이미지 데이타 분석기 (Aida Inc., Straubenhardt, Germany) 에 의해 정량화했다.

동물 연구

동물 연구를 Institutional Animal Care and Use Committee of McGuire Veterans Affairs Medical Center 에 의해 승인받았고, the Declaration of Helsinki, the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 및 모든 적용가능한 규제에 따라 수행했다. 혈청 및 간 내의 식사-유도된 지질 축적에 대한 25HCDS 의 효과를 조사하기 위해, 8-주령 암컷 C57BL/6J 마우스 (Charles River, Wilmington, MA) 에게 지방으로부터 42% kcal, 탄수화물로부터 43% kcal, 단백질로부터 15% kcal 및 0.2% 콜레스테롤을 함유하는 고지방식 (HFD) (Harlan Teklad, Madison, WI) 을 10 주 동안 공급했다. 모든 마우스를 무균 시설에서 동일한 조건 하에 수용했고, 물 및 먹이에 대한 자유로운 접근을 허용했다. 각각의 기간의 마지막에, 마우스에게 비히클 용액 (에탄올/PBS; 비히클), 또는 25HCDS (25 ㎎/㎏) 를 6 주 동안 3 일 마다 1 회 복막내 주사했고; 혈액 샘플을 수집했다. 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지단백질-콜레스테롤, 글루코스, 알칼리성 포스파타제 (ALK), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 를 McGuire Veterans Affairs Medical Center 에서 임상 실험실에서 표준 효소 기술을 사용하여 측정했다. 혈청 중 지단백질 프로파일을 아래 기재된 바와 같이 HPLC 에 의해 분석했다.

간 지질의 정량화

간 조직을 균질화하고, 지질을 클로로포름 및 메탄올 (2:1) 의 혼합물로 추출하고, 여과했다. 추출물 0.2 ㎖ 를 증발 건조시키고, 콜레스테롤 검정 (Wako Chemicals USA, Richmond, VA) 을 위한 10% 의 TRITON™ X-100 (C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)n), 비이온성 계면활성제) 을 함유하는 100 ㎕ 의 이소프로판올, 자유 지방산 검정 (Wako Chemicals USA, Richmond, VA) 을 위한 NEFA 용액 (0.5 g 의 EDTA-Na₂, 2 g 의 TRITON™ X-100, 0.76 ㎖ 의 1N NaOH, 및 0.5 g 의 나트륨 아지드/ℓ, pH 6.5), 또는 트리글리세리드 검정 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 을 위한 오직 이소프로판올에 용해시켰다. 모든 검정을 각각 제조사의 지시에 따라 수행했다. 각각의 지질 농도를 간 중량으로 정규화시켰다.

통계

데이타는 평균 ± 표준 편차로서 보고되어 있다. 표시된 경우에, 데이타를 t-시험 분석에 적용했고, p<0.05 인 경우에 유의하게 상이한 것으로 결정했다.

결과

일차 랫트 간세포 핵 내의 신규한 콜레스테롤 대사물질의 탐지

간 핵 내의 신규한 콜레스테롤 대사물질의 존재를 확인하기 위해, 핵 분획을 일차 랫트 간세포로부터 단리했다. 각각의 분획의 메탄올/물 상 내의 옥시스테롤을 LC-MS 에 의해 분석했다. 결과는 2 개의 주된 분자 이온, m/z 561 및 m/z 583 (561+Na) 이 분자, 5-콜레스텐-3β, 25-디올 디설페이트 (도 1) 에 잘 맞음을 보여준다. 상기 분자는 아마도 SULT2B1b 및 SULT2B1a 에 의해 합성될 것이다.

핵 옥시스테롤, 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트의 화학적 합성

구조를 확인하고 세포 지질 항상성 및 염증 반응에서의 역할을 연구하기 위해, 25HCDS 를 위에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성하고 정제했다.

합성된 화합물의 MS 분석은 진짜 핵 옥시스테롤로서의 동일한 분자 질량 이온, m/z 561 및 m/z 583 (+Na), 및 정제된 생성물이 출발 물질, 25-히드록시콜레스테롤, m/z 401 에 의해 오염되지 않았음을 보여준다.

결과는 합성된 분자가 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 이고, 그것이 간세포 핵 분획 중 표시된 분자와 "맞음" 을 나타낸다.

25HCDS 는 SREBP 신호전달을 통해 ACC, FAS, 및 HMG-CoA 리턱타제 mRNA 수준을 감소시킴으로써 지질 생합성을 저해함

25HCDS 가 지질 생합성을 저해하는 방식에 대해 연구하기 위해, 총 RNA 를 처리된 THP-1 마크로파지로부터 단리했다. 마크로파지 및 hepG2 세포 내의 트리글리세리드 합성을 위한 ACC 및 FAS 의 mRNA 수준, 및 콜레스테롤 합성을 위한 HMG-CoA 리턱타제의 수준을 실시간 RT-PCR 에 의해 측정했다. 도 5 에 나타난 바와 같이, 배양물 내의 세포에 25HCDS 를 부가한 후에 ACC 및 FAS (도 5A), 및 HMG-CoA 리턱타제 mRNA 수준 (도 5B) 의 감소는 나타난 바와 같이 농도 의존적 및 시간 의존적이다 (데이타는 제시되지 않음). 이들 감소는 도 5A 및 5B 에 나타난 SREBP1/2 의 발현의 감소와 일치한다. 이들 결과는 25HCDS 가 SREBP 신호전달을 감소시키고, 후속적으로 지질 생합성을 감소시킴을 시사한다. 흥미롭게도, 25HCDS 는 PPARγ mRNA 수준을 선형으로 증가시켰고, 동시에 초기 단계에서 낮은 농도에서 IκBα 발현을 증가시켰다. 결과는 25HCDS 가 25HC3S 가 그러하듯이 PPARγ/IκBα 신호전달 경로를 통해 염증 반응을 억제함을 시사한다.

HFD 를 공급한 마우스에서 지질 항상성에 대한 25HCDS 투여의 효과

지질 항상성에 대한 25HCDS 의 장기 처리의 효과를 연구하기 위해, 8-주령 C57BL/6J 암컷 마우스에게 HFD 를 10 주 동안 공급한 후, 2 개의 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 25HCDS 로, 다른 그룹은 비히클로 6 주 동안 3 일 마다 1 회 복막 주입에 의해 처리했다. 처리 동안, 마우스에게 HFD 를 공급하고, 체질량 및 칼로리 섭취를 모니터링했다. 이들 2 개의 파리미터에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 6 주의 주입 후에, 마우스를 밤새 단식시키고, 희생시켰다. 마우스의 간 중량은 식사에 상관없이 유의한 차이를 보이지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).

간 지질 대사에 대한 25HCDS 의 효과를 연구하기 위해, 간 지질 수준 및 관련 유전자 발현 수준을 측정했다. 이전에 보고된 바와 같이, HFD 를 공급한 마우스는 차우 (chow) 를 공급한 마우스와 비교할 때 간에서 증가된 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 자유 지방산, 및 트리글리세리드 수준을 나타냈다 (데이타는 제시되지 않음). 이들 증가는 25HCDS 투여에 의해, 예를 들어 각각 30%, 20% 및 18% (p < 0.05) 만큼 유의하게 감소되었으며, 이는 도 6 에 나타나 있다. 또한, 유전자 발현 분석은 25HCDS 투여가 자유 지방산, 트리글리세리드, 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 핵심 효소 및 수용체의 발현을 유의하게 감소시켰음을 보여줬으며, 이는 표 1 에 나타나 있다.

지질 대사의 조절장애는 염증 상태와 빈번히 연관된다. 25HCDS 처리는 TNFα, 및 IL1β 의 발현을 각각 50%, 36% 만큼 유의하게 억제했다 (표 2). 이들 결과는 25HC3S 가 간 염증 반응을 억제하여, 간 손상 및 혈청 중 알칼리성 포스파타제 활성을 감소시킴을 보여준 간 기능 검정과 일치한다 (데이타는 제시되지 않음). 흥미롭게도, 25HCDS 는 간에서의 PGC-1α 의 발현을 2 배 증가시켰다. 이와 같이, 25HCDS 는 LXR, PPARγ 및 PGC-1α 신호전달을 통해 지질 대사 및 염증 반응을 조절하는 것으로 보인다.

표 1. 25HCDS 함유 또는 미함유 HFD 를 공급받은 마우스에서 지질 대사에 수반되는 상대적 간 mRNA 발현.

표 2. 25HCDS 함유 또는 미함유 HFD 를 공급받은 마우스에서 염증 반응에 수반되는 상대적 간 mRNA 발현

검토

콜레스테롤 및 트리글리세리드 대사는 밀접하게 연관된다. 고아 핵 수용체는 많은 생물학적 사건의 중요한 조절인자인 핵심 표적 유전자의 발현을 조절하는 리간드-활성화되는 전사 인자이다. 지방산 (PPAR), 옥시스테롤 (LXR), 레티노산 (RXR), 및 SREBP 에 대한 수용체는 세포 지질 수준의 센서로서 기능하여, 지질 항상성을 유지하고 지질 축적에 의한 손상으로부터 세포를 보호하기 위해 유전자 발현 변화를 유발한다. 그러나, 수용체 활성 사이의 혼선은 여전히 알려져 있지 않다. 본원에서 나타난 바와 같이, 콜레스테롤 대사물질, 25HCDS 는 시험관내 및 생체내에서 SREBP-1c 발현, 가공, 및 활성을 저해하고, PPARγ 및 PGC-1α 발현을 증가시킨다. SREBP 가 지질 생합성을 제어하고, PPARγ 가 염증 반응을 조절하고, PGC-1α 가 에너지 항상성을 조절한다는 것이 잘 입증되어 있다. 따라서, 결과는 25HCDS 가 이들 과정의 강력한 조절인자이고, 간 지질 항상성의 유지 및 염증 반응에서 중요한 역할을 수행함을 보여준다. 25HC3S 의 투여는 핵 PPARγ 단백질 수준을 증가시키고, 염증 반응을 억제하지만, PPARγ mRNA 는 아주 조금 증가시킨다. 이와 대조적으로, 25HCDS 는 PPARγ 및 PGC-1α mRNA 발현을 시간 및 농도 의존적 방식으로 유의하게 증가시키며, 이는 25HCDS 가 지질 대사 및 염증 반응의 조절에서 25HC3S 보다 더욱 강력함을 시사한다.

25HCDS 생합성 및 옥시스테롤 황산화의 반응은 간세포에서 핵 수용체 활성을 매개하는 신규한 조절 경로를 나타낸다. 이러한 경로의 핵심 성분은 하기와 같이 요약된다: 1) 세포내 콜레스테롤 수준이 증가되었을 때, 미토콘드리아 콜레스테롤 전달 단백질, StAR 은 콜레스테롤을 미토콘드리아 내로 전달하며, 미토콘드리아에서 조절 옥시스테롤, 예컨대 25HC 가 CYP27A1 에 의해 합성된다. 이들 옥시스테롤은 결국 LXR 을 활성화시키고, 후속적으로 지방산 및 트리글리세리드 생합성에 관여하는 그것의 표적 유전자의 발현을 상향조절한다. 또한, 25HC 는 LXR 을 활성화시키고, HMGR 발현을 저해함으로써 새로 합성되는 콜레스테롤 합성을 하향조절하고, 세포로부터의 ABCA1 매개 콜레스테롤 분비를 증가시킨다 (HDL 형성). 2) 25HC3S 및 25HCDS 는 LXR 을 비활성화시키고, SREBP-1c 가공을 억제하며, 이는 이들 설페이트화 옥시스테롤이 합성을 저해함으로써 세포내 지질 수준을 감소시킴을 시사한다; 3) 지질 대사에 대한 25HC 의 효과는 25HC3S 및 25HCDS 의 효과와 반대이다. 따라서, 세포내 옥시스테롤 황산화는 지질 대사, 및 NAFLD 의 발달에 관여하는 신규한 조절 메카니즘을 나타낸다.

25HCDS 에 의한 마우스 NAFLD 모델의 처리는 간 지질 수준을 감소시켰다. NAFLD 에 관한 다수의 처리가 연구되어 왔다. 다수가 생화학적 마커 예컨대 알라닌 트랜스아미나제 수준을 개선하는 것으로 보이지만, 대부분은 조직학적 이상을 역전시키거나 임상적 종점을 감소시키는 것으로 밝혀지지 않았다. 25HCDS 는 핵 수용체 LXR 및 SREBP 의 활성 차단을 통해 전사 수준에서 지질 생합성에 관여하는 핵심 유전자 발현을 억제하여, HFD 에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인을 억제하고 PGC1a 를 통해 에너지 항상성을 조절한다. 따라서, 25HCDS 는 강력한 조절인자로서의 역할을 하여 간 지질 수준을 효과적으로 감소시키고, 그에 따라 NALFD 및 기타 지질 대사 연관 질환의 치료를 위한 신규한 작용제를 나타낸다.

참고문헌

본 발명은 그것의 바람직한 구현예의 면에서 기재되었지만, 당업자는 본 발명이 첨부된 청구항의 주제 및 범위 내에서 변화를 가해 실행될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 위에 기재된 바와 같은 구현예에 한정되지 않을 것이고, 본원에 제공된 설명의 주제 및 범위 내에서 모든 변화 및 등가물을 추가로 포함할 것이다.

Claims

약제로서 사용하기 위한, 하기 화합물: (i) 하기 화학식의 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS)

,
또는 (ii) 그의 약학적으로 허용가능한 염.
제 1 항에 있어서, 하기인 화합물:

.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 방법에서 사용하기 위한 화합물: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하는 방법; 또는 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하는 방법.
하기를 제조하기 위한, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 용도: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 약제; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하기 위한 약제; 또는 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하기 위한 약제.
대상에게 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 대상을 치료하는 방법으로서, 하기로부터 선택되는 방법: 필요로 하는 대상에서 지질을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 콜레스테롤 및 지질 생합성을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 염증을 감소시키는 방법; 필요로 하는 대상에서 당뇨병을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 고지질혈증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 죽상동맥경화증을 치료하는 방법; 필요로 하는 대상에서 지방간 질환을 치료하는 방법; 및 필요로 하는 대상에서 염증성 질환을 치료하는 방법.
제 5 항에 있어서, 하기와 같은 방법:
- 화합물이 대상의 체질량을 기준으로 0.1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 의 양으로 투여되고/거나;
- 투여가 경구 투여, 장 투여, 설하 투여, 경피 투여, 정맥내 투여, 복막 투여, 비경구 투여, 주입, 피하 주입 및 근육내 주입에 의한 투여 중 하나 이상을 포함함.
제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 바와 같은 화합물.
제 7 항에 있어서, 단리된 화합물인 화합물.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 실질적으로 순수한 화합물.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 형태인 화합물.
제 10 항에 있어서, 하기 형태인 화합물
- 분말 형태; 및/또는
- 동결건조 형태.
하기를 포함하는 약학적 조성물:
(i) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물; 및
(ii) 생리적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체.
제 12 항에 있어서, 단위 투여 형태로 제형화되어 있는 약학적 조성물.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 고체 형태인 조성물.
제 14 항에 있어서, 하기와 같은 약학적 조성물:
- 분말, 정제, 캡슐 또는 로젠지 형태의 조성물; 또는
- 임의로 밀봉 바이알, 앰플, 주사기 또는 백 내에 제공되는, 동결건조 형태의 화합물을 증량제와 함께 포함하는 조성물.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 액체 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 16 항에 있어서, 하기와 같은 약학적 조성물:
- 화합물이 액체에 용해되어 있거나 액체에 분산되어 있고/거나;
- 액체가 수성이고/거나;
- 액체가 주사용 멸균수 또는 포스페이트-완충 식염수이고/거나;
- 조성물이 밀봉 바이알, 앰플, 주사기 또는 백 내에 제공됨.
25-히드록시콜레스테롤을 삼산화황의 공급원과 반응시키고, 임의로, 결과적인 5-콜레스텐-3β, 25-디올, 디설페이트 (25HCDS) 로부터 약학적으로 허용가능한 염을 형성하는 것을 포함하는, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물을 생산하는 방법.
제 18 항에 있어서, 삼산화황의 공급원이 삼산화황 아민 복합체인 방법.
화합물을 생리적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하는 것을 포함하는, 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 생산하는 방법.