EA026683B1

EA026683B1 - МЕТАБОЛИТ ХОЛЕСТЕРИНА ДИСУЛЬФАТ 5-ХОЛЕСТЕН-3β,25-ДИОЛА (25HCDS) ДЛЯ ТЕРАПИИ НАРУШЕНИЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, ГИПЕРЛИПИДЕМИИ, ДИАБЕТА, ЖИРОВЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЕЧЕНИ И АТЕРОСКЛЕРОЗА

Info

Publication number: EA026683B1
Application number: EA201491859A
Authority: EA
Inventors: Шуньлинь Жэнь
Original assignee: Вирджиния Коммонвелт Юниверсити
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2017-05-31
Also published as: BR112014025081B1; CA2867694C; PT2836502T; CN106083976A; MX357046B; JP2019089777A; CN106083976B; AU2017268646A1; DK2836502T3; CN104220450B; HK1202294A1; JP2021138713A; EP2836502B1; JP2017160213A; EP2836502A4; KR20150013520A; US20200157140A1; AU2017268646B2; PL2836502T3; AU2013246435B2

Abstract

Было выявлено, что дисульфат 5-холестен-3β,25-диола (25HCDS) представляет собой оригинальный агонист PPARγ и антагонист LXR и его используют для терапии расстройств обмена липидов и воспалительных заболеваний, включая без ограничения жировые болезни печени, воспалительные заболевания кишечника и атеросклеротические болезни.

Description

Изобретение в основном относится к новому метаболиту холестерина дисульфату 5-холестен-3в,25диола (25ΗΟΌδ) и его применениям. В частности, изобретение относится к 25ΗΟΌδ для предупреждения и лечения заболеваний, таких как нарушения липидного обмена и воспалительные нарушения, например гиперлипидемия, диабет, жировые болезни печени и атеросклероз.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Печень играет основную роль в поддержании гомеостаза липидов. Накопление липидов в тканях печени приводит к неалкогольным жировым болезням печени (ΝΑΡΈΌ). ΝΑΡΈΌ поражает практически четверть всего населения США и может прогрессировать до выраженного цирроза и печеночноклеточной карциномы. Спектр ΝΑΡΈΌ находится в диапазоне от простого непрогрессирующего стеатоза до прогрессирующего неалкогольного стеатогепатита (ΝΑδΗ), что приводит к циррозу печени и печеночноклеточной карциноме. Патогенез ΝΑΡΈΌ рассматривают в виде двухстадийного процесса. Первая стадия представляет собой накопление триглицеридов и ассоциированных липидов в гепатоцитах. Вторая стадия представляет собой возникновение воспаления печени. Отличительный признак ΝΑΡΈΌ характеризуется повышением накопления внутрипеченочных триглицеридов. Снижение уровней липидов является важным элементом успешной терапии ΝΑΡΈΌ. У млекопитающих связывающий стеролрегулирующие элементы белок 1с (δΡΕΒΡ-Π) предпочтительно контролирует экспрессию липогенных генов и регулирует гомеостаз жирных кислот и триглицеридов. Документально доказана его роль в биосинтезе жирных кислот и развитии жировой болезни печени. Однако в настоящее время не существует утвержденного лечения ΝΑΡΈΌ.

Оксистеролы могут действовать во многих точках гомеостаза холестерина и метаболизма липидов. Рецептор оксистеролов, ΈΧΡ, представляет собой регулируемый стеролом фактор транскрипции метаболизма липидов. Активация ΈΧΚ стимулирует экспрессию АВСА1 и ΑΒСΟ5/8, опосредующих отток и клиренс холестерина, а также она повышает экспрессию δΡΕΒΡ-Π, который, в свою очередь, регулирует по меньшей мере 32 гена, участвующих в биосинтезе и транспорте липидов. Таким образом, несмотря на то, что активация ΈΧΡ синтетическими лигандами может снижать уровень холестерина в сыворотке, обеспечивая защиту от атеросклероза, активация также приводит к жировому гепатозу и гипертриглицеридемии вследствие индукции синтеза жирных кислот и триглицеридов через активацию δΡΕΒΡ-Π. Гепатоциты обладают ограниченной способностью хранить жирные кислоты в форме триглицеридов. После того как способность становится перегруженной происходит повреждение клетка. Избыток количества внутриклеточных свободных жирных кислоты инициирует продукцию активных форм кислорода (ΡΟδ), приводящих к липотоксичности и активации воспалительного пути передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к апоптозу.

5-Холестен-3в,25-диол-3-сульфат (25ΗС3δ) представляет собой оксистерол, который недавно идентифицировали в ядре первичных гапатоцитов крысы. 25ΗС3δ описан в АО 2006/047022. Этот оксистерол можно синтезировать посредством стероидной сульфотрансферазы δΈΈΤ2Β1ϋ из 25-гидроксихолестерина (25НС) сульфатированием оксистерола. Экзогенное введение сходного метаболита холестерина 5-холестен-3в,25-диол-3в-сульфата (25ΗΟΡδ) приводит к снижению экспрессии δΡΕΒΡ-1 и δΡΕΒΡ-2; блокирует процессинг δΡΈΒΡ-^ и подавляет экспрессию ключевых ферментов, участвующих в метаболизме липидов, включая ацетил-СоА-карбоксилазу-1 (АСС-1), синтез жирных кислот (ΡΑδ) и 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА-редуктазу (ΗΜΟΡ), соответственно снижая уровни нейтральных липидов и холестерина.

Результаты указывают на то, что 25ΗС3δ действует как антагонист ΈΧΡ и как сигнал насыщения холестерина, подавляя пути синтеза жирных кислот и триглицеридов через ингибирование передачи сигналов Б-ΧΡ/δΡΕΒΡ. Кроме того, 25ΗС3δ повышает экспрессию ΙΚΒβ, блокирует индуцируемую ΤΝΡα деградацию ΙΚΒβ и снижает уровни ΝΡΕΒ в ядре. В отличие от этого, 25НС действует противоположным образом, индуцируя деградацию ΙΚΒβ и накопление ΝΡΕΒ в ядре. Эти результаты указывают на то, что 25ΗС3δ также участвует в воспалительных ответах и может представлять собой связь между воспалительными путями и регуляцией гомеостаза липидов.

Сущность изобретения

В настоящее время идентифицирован другой регуляторный метаболит холестерина - дисульфат 5холестен-3в,25-диола (25ΗΟΌδ). Исследования 25ΗΟΌδ свидетельствуют о том, что пониженная экспрессия этого природного метаболита играет важную роль в накоплении липидов и клеточном повреждении в гепатоцитах и макрофагах, таким образом, способствуя патогенезу нарушений обмена веществ. Добавление 25ΗΟΌδ в среды для культивирования гепатоцитов и макрофагов приводило к снижению уровней иРНК белка, связывающего стеролрегулирующие элементы (δΡΕΒΡ), ингибировало процессинг δΡΕΒΡδ, а затем подавляло ключевые ферменты, участвующие в биосинтезе липидов, приводя к пони- 1 026683 женным внутриклеточным уровням липидов в гепатоцитах и макрофагах. 25НСИ8 также повышал экспрессию рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (РРАК), 1кВ и уровни иРНК коактиватора 1-α рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (РОС-Ια), снижало уровни МРкВ в ядре и снижало экспрессию и секрецию провоспалительных цитокинов. Следует отметить, что исследования ίη νίνο продемонстрировали, что введение 25Ηί'.Όδ снижало нейтральные липиды в гепатоцитах на 2035%, не вызывая токсичности.

Таким образом, недавно открытый метаболит холестерина 25НСО8 функционирует как настоящий агонист РРАКу и антагонист ЬХК, который ингибирует биосинтез холестерина и липидов в гепатоцитах и макрофагах ίη νίίτο и ίη νίνο наряду с подавлением воспалительных ответов через путь передачи сигнала РРАКуЛкВ/МРкВ. Таким образом, 25НСЭ8. который химически синтезировали, как описано в разделе примеры в настоящем описании, можно применять в качестве лекарственного средства для лечения и предупреждения нарушений метаболизма липидов и воспалительных нарушений, включая гиперлипидемию, атеросклероз, диабет, жировые болезни печени и т.д.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения указаны в описании изобретения, которое следует ниже, и частично будут понятны из описания или могут быть понятны в результате практического осуществления изобретения. Изобретение осуществляют и получают посредством композиций и способами, в частности указанными в письменном описании и его формуле изобретения.

В одном из аспектов изобретение относится к применению соединения, которое представляет собой (ί) дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25НСО8) формулы

и/или его фармацевтически приемлемые соли в качестве лекарственного средства. В некоторых аспектах соединение представляет собой

В некоторых аспектах изобретение относится к применению соединения в способах понижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; понижения биосинтеза холестерина и липидов у нуждающегося в этом индивидуума; уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума и/или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума. В дополнительных аспектах изобретение относится к применению соединения

или

- 2 026683

для получения лекарственного средства для: понижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; понижения биосинтеза холестерина и липидов у нуждающегося в этом индивидуума; уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.

В других аспектах изобретение относится к способам лечения индивидуума, где способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества соединения

или

где способ выбран из: способа понижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; способа понижения биосинтеза холестерина и липидов у нуждающегося в этом индивидуума; способа уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума и способа лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых аспектах соединение вводят в количестве в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг массы тела указанного индивидуума или соединение вводят в количестве в диапазоне от 1 до 10 мг/кг массы тела указанного индивидуума, и/или введение включает по меньшей мере одно пероральное введение, энтеральное введение, сублингвальное введение, трансдермальное введение, внутривенное введение, перитонеальное введение, парентеральное введение, введение посредством инъекции, подкожной инъекции и внутримышечной инъекции.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, которое представляет собой (ί) дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25ΗΟΌδ) формулы

и/или его фармацевтически приемлемым солям. Один из аспектов относится к самому соединению и его фармацевтически приемлемым солям. Другой аспект относится к применению соединения и его фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственного средства.

- 3 026683

В некоторых аспектах соединение представляет собой

В некоторых аспектах соединение представляет собой выделенное соединение. В других аспектах соединение является по существу чистым. В еще одних других аспектах соединение находится в твердой форме. Твердая форма может находиться в форме порошка и/или в лиофилизированной форме.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение, которое представляет собой (ί) дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25ИСИ8) формулы

и (и) физиологически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель. В некоторых аспектах соединение представляет собой

В некоторых аспектах фармацевтическую композицию формулируют в стандартной лекарственной форме. В других аспектах фармацевтическая композиция находится в твердой форме. Твердые формы композиции включают формы, в которых фармацевтическая композиция находится в форме порошка, таблетки, капсулы или таблетки-леденца, или композиция содержит соединение в лиофилизированной форме совместно с наполнителем, где композиция необязательно содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке. В некоторых аспектах фармацевтическая композиция содержит носитель, который представляет собой жидкость. В этом аспекте соединение можно растворять в жидкости или диспергировать в жидкости; и/или жидкость является водной, и/или жидкость представляет собой стерильную воду для инъекций или фосфатно-солевой буфер, и/или композиция содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.

Изобретение также относится к способу получения соединения

или

- 4 026683

где способ включает взаимодействие 25-гидроксихолестерина с источником триоксида серы и необязательно образование фармацевтически приемлемой соли из получаемого дисульфат 5-холестен3в,25-диола (25ΗΟΌδ). В некоторых аспектах источник триоксида серы представляет собой аминный комплекс триоксида серы. В других аспектах способ включает объединение соединения с физиологически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.

Как указано выше, настоящее изобретение в числе прочего относится к конкретным соединениям для применения в способе снижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума, снижения уровней холестерина и биосинтеза липидов у нуждающегося в этом индивидуума, уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума, лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума, лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума, лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума, лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума. Во избежание неоднозначности толкования, в этом аспекте настоящее изобретение может относиться к конкретному соединению для применения в качестве лекарственного средства в конкретном способе. Кроме того, настоящее изобретение может относиться к указанному соединению в качестве активного терапевтического ингредиента в конкретном способе. Кроме того, настоящее изобретение может относиться к указанному соединению для применения в способе лечения организма человека или животного терапией, способом, включая указанный способ.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано, что характеризация ядерного оксистерола в виде дисульфата 5-холестен-3в,25диола посредством тройной квадрупольной масс-спектрометрии отрицательных ионов. Представлен спектр ВЭЖХ/МС полного сканирования в режиме отрицательных ионов, профиль элюции ВЭЖХ-МС в зависимости от массы иона 80, полученный при сканировании продукта т/ζ 583 и т/ζ 561.

На фиг. 2 показаны результаты анализа химически синтезированного 25ΗΟΌδ. МС-спектр продукта.

На фиг. 3 представлен спектр ¹Н ЯМР 25ΗΟΌδ. Стрелками указан протон в положении 3 соединения и его химический сдвиг резонанса в исходном веществе и в продукте.

На фиг. 4 представлен спектр ¹³С ЯМР 25НСЭ8. Стрелками указаны положения 3 и 25 углерода соединения и его химический сдвиг резонанса в исходном веществе и в продукте.

На фиг. 5Ά-Ό показано, как 25НСЭ8 регулирует экспрессию генов биосинтеза липидов. 5А - анализ ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени уровней иРНК §КЕВР-1с, АСС и РА§ в клетках ТНР-1, обработанных 25НС'П5> в указанных концентрациях; 5В - 8КЕВР-2, НМС-СоА-редуктаза и ЬПЬК; уровни иРНК РРАКд и ЕкВ в клетках ТНР-1, обработанных 25НС'П5> в указанные моменты времени (5С) и в указанных концентрациях (5Ό). Уровни экспрессии нормализовали на САРОН. Каждое значение представляет собой среднее трех отдельных измерений ± стандартное отклонение.

На фиг. 6 показано, что введение 25НС'П35> уменьшает накопление липидов в ткани печени на моделях ΝΑΡΡΌ на мышах. Животным перитонеально вводили 25НСЭ8 один раз в 3 суток в течение 6 недель. Триглицерид, свободную жирную кислоту, общий холестерин, свободный холестерин и сложный эфир холестерина, свободную жирную кислоту и триглицерид в печени определяли, как описано в примере. Каждый отдельный уровень нормализозали на концентрацию белка. Все значения выражают в виде среднего значения ± 8Ό; символ * означает р<0,05 в сравнении с печенью мышей, обрабатываемых ΗΡΌпищевым носителем.

Подробное описание

В настоящее время идентифицирован новый метаболит холестерина дисульфат 5-холестен-3в,25диола (25ΗΟ'Όδ). Введение 25ΗС^δ существенно повышало экспрессию РРАКу, коактиватора 1-α РРАКу (РСС-1а) и 1кВ и снижало уровни триглицеридов и холестерина в печени через путь передачи сигнала ЬХК-§КЕВР-1с ίη νίνο на моделях ΝΑΡΡΌ на мышах. Эти открытия демонстрируют, что 25ΗΟ'Όδ является эффективным регулятором, участвующим в метаболизме липидов и воспалительных ответах.

Таким образом, изобретение относится к способам применения 25ΗΟΌδ для лечения и предупреждения нарушений метаболизма липидов и воспалительных нарушений. В некоторых аспектах способы

- 5 026683 включают введение терапевтически эффективной дозы 25НСЭ8 индивидуумам, нуждающимся в таком лечении, для повышения уровня 25НСО8 у индивидуума и/или для обеспечения благоприятных изменений метаболизма липидов. Реализация способов, как правило, включает идентификацию пациентов, страдающих или подвергающихся риску развития нарушений липидного обмена и ассоциированных с этим состояний, и/или идентификацию пациентов, страдающих или подвергающихся риску развития аномального воспаления, и введение 25НСО8 в приемлемой форме подходящим путем. Идентификацию подходящих индивидуумов можно проводить, например, с использованием различных тестов крови, результатов биопсии печени, наличия манифестирующих симптомов заболевания и т.д., как известно в данной области. Индивидуумы, для которых подходит лечение, включают индивидуумов, у которых идентифицируют, что они страдают или с большой вероятностью страдают нарушением обмена липидов и/или воспалением. Также по настоящему изобретению предоставлены 25НСЭ8 и родственные фармацевтические композиции. Их можно использовать в способах лечения.

25НСО8 может находиться в форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемая соль может представлять собой соль диприсоединения или соль моноприсоединения. Соль диприсоединения образуется в результате потери атомов водорода в каждой из двух сульфатных групп молекулы 25НСО8. Соль моноприсоединения образуется в результате потери атома водорода только в одной из двух сульфатных группах молекулы 25НСО8 (в положении 3 или положении 25 молекулы).

Фармацевтически приемлемая соль может представлять собой, например, соль щелочного металла (например, соль лития, натрия или калия), соль щелочноземельного металла (например, соль кальция) или аммонийную соль. Фармацевтически приемлемая соль может представлять собой, например, соль натрия, калия, кальция, лития или аммония.

Один из примеров такой соли представляет собой натриевую соль 25НСО8, например, натриевую соль моноприсоединения 25НСЭ8. такую как соль моноприсоединения, образуемая в результате потери атома водорода в сульфатной группе в положении 25 25НСЭ8. т.е. соединение с формулой

Во избежание неоднозначности толкования, следует подчеркнуть, что на всем протяжении настоящего описания 25НСО8 включает фармацевтически приемлемые соли 25НСО8, если явно не указано иное.

Холестерин содержит восемь хиральных центров, таким образом, являясь источником большого числа различимых стереоизомеров. Эти восемь хиральных центров также содержатся в 25НСЭ8. Как правило, 25НСЭ8. используемый в настоящем изобретении, может находиться в любой одной стереоизомерной форме или может представлять собой смесь любых двух или более таких стереоизомерных форм. Однако по меньшей мере 50 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 90 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 мас.%. 25НСО8 может иметь формулу

Следует понимать, что хиральность в каждом из восьми хиральных центров в этой формулу является сходной с хиральностью, встречающейся в нативном холестерине. Таким образом, этот стереоизомер соответствует стереизомерной форме метаболита нативного 25НСЭ8 ίη νίνο.

25НСО8 или его фармацевтически приемлемую соль может представлять собой выделенный 25НСЭ8 или его фармацевтически приемлемую соль. Выделенный означает, что он не содержится в тканевом веществе, содержащемся или экстрагируемом у индивидуума, являющегося человеком или животным. Например, выделенный 25НСО8 или его фармацевтически приемлемая соль не содержится в клетке. Таким образом, выделенный 25НСО8 или его фармацевтически приемлемая соль можно явно

- 6 026683 отличать от нативного 25НСИ8, который содержится в тканевом веществе (например, клетке), которое само по себе содержится, или его экстрагируют у являющегося человеком или животным индивидуума.

25НСИ8 или его фармацевтически приемлемая соль может по существу являться чистой. Например, 25НСИ8 или его фармацевтически приемлемую соль можно предоставлять в значительной степени очищенной форме для применения в способах лечения.

В случае когда он является по существу чистым или в значительной степени очищенным, дисульфатированный оксистерол (25НСИ8 или его фармацевтически приемлемая соль) может находиться в форме, в которой по меньшей мере приблизительно 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или более не содержит других химических соединений. По существу чистый 25НСИ8 или его фармацевтически приемлемая соль может содержать, в частности, по меньшей мере приблизительно 90 мас.%, или по меньшей мере приблизительно 95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98 мас.%, по меньшей мере приблизительно 99 мас.%, или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99,5 мас.%, или по меньшей мере приблизительно 99,8 мас.%. 25НСИ8 или его фармацевтически приемлемой соли.

25НСИ8 или его фармацевтически приемлемая соль может представлять собой твердое вещество. Например, 25НСИ8 или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в форме порошка.

25НСИ8 или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в лиофилизированной форме. Как хорошо известно, лиофилизация представляет собой способ дегидратации, как правило, используемый для сохранения скоропортящегося вещества или для того, чтобы делать вещество более удобным для транспортировки. Существует три основные стадии этого способа, а именно замораживание, первичная сушка и вторичная сушка. Замораживание, как правило, проводят с использованием устройства для лиофильной сушки. Во время первичной сушки давление контролируют применением соответствующих уровней вакуума, при этом подают достаточно теплоты для обеспечения сублимации любой содержащейся воды. В процессе вторичной сушки удаляют воду гидратации дальнейшим применением тепла. Как правило, для поддержания дальнейшей сушки также понижают давление. После завершения процесса лиофилизации вакуум можно заполнять инертным газом, таким как азот, перед герметичным запечатыванием или вещество можно герметично запечатывать в вакууме.

Несмотря на то, что возможно выделять и очищать 25НСО8 из живых клеток, специалистам в данной области понятно, что для получения достаточных количеств дисульфатированного оксистерола соединение, как правило, синтезируют способами синтеза химического вещества или способами, которые включают применение технологии рекомбинантных ДНК (например, с использованием клонированных ферментов для проведения подходящих модификаций холестерина). Иллюстративная схема синтеза предоставлена в разделе примеры ниже.

В более общем смысле 25НСО8 или его фармацевтически приемлемую соль можно получать синтетически посредством взаимодействия 25-гидроксихолестерина с источником триоксида серы и необязательно с получением фармацевтически приемлемой соли из получаемого продукта.

Для преобразования двух гидроксильных групп (-ОН), содержащихся в 25-гидроксихолестерине, в сульфатные группы (-О8О₃Н) можно использовать любой подходящий источник триоксида серы. Комплексы триоксид серы-амин представляют собой одну из иллюстративных групп источников триоксида серы. Примеры таких комплексов включают комплекс триоксида серы и триметиламина (ΤΜΑδ), комплекс триоксида серы и триэтиламина (ΤΕΑδ), комплекса триоксида серы диметиланилина (ΌΜΑδ), комплекс триоксида серы и диметилформамида (ΌΜΡδ), комплекс триоксида серы и пиридина (Ρδδ) и комплекс триоксида серы и поливинилпиридина (ΡΥΡδ). Как правило, на моль 25-гидроксихолестерина используют от одного до двадцати моль, например, от двух до десяти моль выбранного источника триоксида серы (такого как комплекс триоксид серы-амин).

Реакцию, как правило, проводят в инертном растворителе. Растворитель может представлять собой, например, безводный растворитель. Один из таких иллюстративных растворителей представляет собой безводный пиридин.

Также можно добавлять основание, например, для получения желаемой фармацевтически приемлемой соли из продукта дисульфата. Одно из таких оснований представляет собой ЫаОН, который можно использовать для получения натриевой соли Σ^τΜΕΌδ. Следует понимать, что для получения других фармацевтически приемлемых солей можно использовать альтернативные реагенты (обладающие различными валентностями и/или содержащие различные катионы).

Температура реакции, как правило, может составлять от 10 до 100°С, например, от 20 до 80°С. Время реакции, как правило, может составлять от 0,1 до 24 ч, например, от 0,25 до 5 ч.

При желании продукт можно очищать от реакционной смеси после прохождения реакции. При желании продукт можно выделять из реакционной смеси после прохождения реакции.

Исходное вещество 25-гидроксихолестерина представляют собой коммерчески доступный продукт. Альтернативно, его можно получать гидроксилированием холестерина (см., например, Ода\\а с1 а1., δΙΟΓοίάδ, 74: 81-87). Таким образом, способ может дополнительно включать начальный этап гидроксилирования холестерина с получением 25-гидроксихолестерина.

- 7 026683

25ΗΟΟδ можно вводить в чистой форме или в фармацевтически приемлемом составе. Такие составы (композиции), как правило, содержат 25ΗΟΌδ или его фармацевтически приемлемую соль и физиологически приемлемый (совместимый) эксципиент, разбавитель или носитель/основу. 25ΗΟΟδ может находиться, например, в форме фармацевтически приемлемой соли (например, соли щелочного металла, такого как натрий, калий, кальций, литий, аммоний и т.д.) или другого комплекса.

Фармацевтическая композиция является стерильной. Стерильная означает, что, по существу, не содержатся жизнеспособные микроорганизмы, например, как определяют с испытанием на стерильность υδΡ (см. ТЬе ИпЪеЬ δίαίοδ РЬагтасоре1а, 301Ь Κβνίδίοη, ТЬе ИпЬеЬ δίαίοδ РЬагтасоре1а1 СопуепЬоп: 2008). Для сохранения стерильности фармацевтическую композицию можно предоставлять в герметично запечатанной упаковке, которая может предотвращать проникновение жизнеспособных микроорганизмов. Например, в случае жидкой фармацевтической композиции, композицию можно герметично запечатывать во флаконе или ампуле.

Следует понимать, что фармацевтически приемлемые составы (композиции) содержат жидкие и твердые вещества, общепринято используемые для получения инъецируемых лекарственных форм и твердых лекарственных форм, таких как таблетки, таблетки-леденцы, порошки и капсулы, а также аэрозольных лекарственных форм. Соединения можно формулировать с водными или масляными основными носителями. Воду можно использовать в качестве носителя для получения композиций (например, инъецируемых композиций), которые также могут содержать общепринятые буферы и средства для придания изотонических свойств композиции и для поддержания физиологически приемлемого ρΗ. Другие возможные добавки (предпочтительно добавки, которые, как правило, считаются безопасными [ΟΚΑδ]) включают: красители, ароматизаторы, поверхностно-активные вещества (ΤνΕΕΝ, олеиновую кислоту и т.д.), растворители, стабилизаторы, эликсиры и связывающие средства или инкапсулирующие средства (лактозу, липосомы и т.д.). Твердые разбавители и эксципиенты включают лактозу, крахмал, общепринятые дезинтегрирующие средства, покрытия и т.п. Также можно использовать консерванты, такие как метилпарабен или бензалкония хлорид.

Более подробно, когда композиция находится в твердой форме, она может находиться в форме порошка, таблетки, капсулы или таблетки-леденца. Когда композиция находится в твердой форме, композиция может содержать 25Ηί'Όδ в лиофилизированной форме совместно с наполнителем. Наполнитель представляет собой фармацевтически неактивное и, как правило, химически инертное вещество, которое можно добавлять к композиции для увеличения ее объема. Общепринятые наполнители для применения в препарате лиофилизированных фармацевтических композициях и являющиеся подходящими для настоящего изобретения включают маннит и глицин. Когда композиция находится в твердой форме, она может необязательно содержаться в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.

В случае, когда фармацевтическая композиция содержит жидкий носитель, 25Ηί'Όδ можно растворять в указанной жидкости или диспергировать в указанной жидкости, и/или жидкость может являться водной, и/или жидкость может представлять собой стерильную воду для инъекций или фосфатносолевой буфер. В случае, когда фармацевтическая композиция содержит жидкий носитель, композиция может содержаться в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.

В зависимости от состава рассчитывают, что активное средство 25ΗΟΟδ составляет приблизительно от 1% приблизительно до 99 мас.% композиции, и подвижный носитель составляет приблизительно от 1% приблизительно до 99 мас.% композиции. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать любые подходящие фармацевтически приемлемые добавки или дополнительные средства в тех случаях, когда они не препятствуют или нарушают терапевтический эффект сульфатированного оксистерола.

Введение может представлять собой по меньшей мере одно из перорального введения, энтерального введения, сублингвального введения, трансдермального введения, внутривенного введения, перитонеального введения, парентерального введения, введения посредством инъекции, подкожной инъекции и внутримышечной инъекции. Например, введение может быть пероральным или парентеральным, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную, интрадермальную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию и т.д., или можно проводить другими путями (например, трансдермальной, сублингвальной, пероральной, ректальной и буккальной доставкой, ингаляцией аэрозоля и т.д.). В предпочтительном варианте осуществления введение является пероральным. Кроме того, введение соединения можно проводить в виде одного вида терапии или в сочетании с другими видами терапии, например, с лекарственными средствами, снижающими уровень липидов или холестерина, схемами лечения на основе физической нагрузки и рациона питания и т.д., как описано выше для схем лечения, которые может применять индивидуум после детекции нарушение обмена липидов. Введение 25ΗΟΟδ пациенту может быть периодическим или с поэтапной или непрерывной, постоянной или контролируемой скоростью. Кроме того, время суток и число раз в сутки, с которыми вводят фармацевтический состав, может изменяться, и их лучше всего определяет практикующий специалист в данной области, такой как врач.

Точная доза 25Ηί'Όδ, которую необходимо вводить, может изменяться в зависимости от возраста, пола, массы, общего состояния здоровья индивидуального пациента и т.д., а также от конкретной этиологии заболевания. Однако в основном для введения млекопитающим (например, людям) терапевтически

- 8 026683 эффективные дозы находятся в диапазоне приблизительно от 0,1 приблизительно до 100 мг или более соединения на кг массы тела в течение 24 ч и, как правило, эффективными являются приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг соединения на кг массы тела в течение 24 ч и часто приблизительно от 1 приблизительно до 10 мг соединения на кг массы тела в течение 24 ч.

Фармацевтическую композицию по изобретению можно формулировать в стандартной лекарственной форме, т.е. фармацевтическая композиция может находиться в форме дискретных порций, где каждая порция содержит стандартную дозу 25ΗΟΌδ. В этом контексте стандартная доза может содержать, например, приблизительно от 0,1 мг приблизительно до 100 мг или приблизительно от 0,5 мг приблизительно до 50 мг, или приблизительно от 1 мг приблизительно до 10 мг 25ΗΟΌδ.

Фармацевтическую композицию можно получать объединением 25ΗΟΌδ с выбранными физиологически приемлемыми эксципиентами, разбавителями и/или носителями.

Несмотря на то, что индивидуумы, как правило, являются людьми, также предусматривают применения технологии в ветеринарии.

В других аспектах уровень 25ΗΟΌδ повышают у нуждающегося в этом индивидуума посредством увеличения эндогенной экспрессии/продукции 25ΗΟΌδ. Иллюстративные способы получения такого результата включают предоставление индивидууму одного или нескольких ферментов, ответственных за синтез 25ΗΟΌδ. В некоторых вариантах осуществления предоставляют сами ферменты; в других вариантах осуществления предоставляют нуклеиновые кислоты, которые кодируют ферменты. Ферменты, которые участвуют в синтезе 25ΗΟΌδ, представляют собой §ИЬТ2ВаЬ и §ИЬТ2В1а, и для повышения эндогенных уровней 25ΗΟΌδ можно вводить один или оба из этих ферментов. Например, можно предоставлять векторы, которые содержат и экспрессируют один или оба этих фермента. Иллюстративные векторы включают, но не ограничиваются ими, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, репликационно-компетентные векторы, векторы на основе вируса герпеса и т.д.

Нарушения липидного обмена, в отношении которых можно проводить предупреждение или лечение посредством повышения уровней 25ΗΟΌδ у индивидуума, как описано в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими: гепатит (воспаление печени), вызываемый в основном различными вирусами, а также некоторыми бактериальными инфекциями, лекарственными средствами или химическими веществами (например, ядами, спиртом), а также связанные осложнения, такие как фиброз печени; аутоиммунную реакцию (аутоиммунный гепатит) или наследственные патологические состояния; неалкогольную жировую болезнь печени (ΝΑΡΈΌ), спектр заболеваний, связанных с ожирением и характеризующихся избытком жира в печени, и различные синдромы, ассоциированные с ΝΛΡΈΌ (например, гепатит, неалкогольный стеатогепатит (ΝΆ8Η), цирроз, заболевание печени на терминальной стадии и т.д.); цирроз, т.е. образование ткани фиброзных рубцов в печени вследствие замены погибших клетки печени (гибель клеток печени может быть вызвана, например, вирусным гепатитом, алкоголизмом или контактированием с другими токсичными для печени химическими веществами); гемохроматоз, наследственное заболевание, вызываемое накоплением железа в организме, в конечном итоге приводящее к повреждению печени; злокачественную опухоль печени (например, первичную печеночноклеточную карциному или холангиокарциному и метастатические злокачественные опухоли, как правило, из других отделов желудочно-кишечного тракта); болезнь Вильсона, наследственное заболевание, которое приводит к накоплению меди в организме; первичный склерозирующий холангит, воспалительное заболевание желчного протока с большой вероятностью аутоиммунное по природе; первичный биллиарный цирроз, аутоиммунное заболевание малых желчных протоков; синдром Бадда-Киари (окклюзия печеночной вены); синдром Жильбера, генетическое нарушение метаболизма билирубина, встречающееся приблизительно у 5% популяции; гликогеновую болезнь накопления II типа, а также различные заболевания печени у детей, например, включая атрезию желчных протоков, дефицит ингибитора трипсина α-1, синдром Алажиля и прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз и т.д. Кроме того, также можно лечить повреждение печени в результате травмы, например, повреждение, вызванное несчастными случаями, огнестрельными ранениями и т.д. Кроме того, можно проводить предупреждение или лечение повреждений печени, вызываемых определенными лекарственными препаратами, например, известно, что лекарственные средства, такими как антиаритмическое средство амиодарон, различные противовирусные лекарственные средства (например, аналоги нуклеозидов), аспирин (редко при синдроме Рейе у детей), кортикостероиды, метотрексат, тамоксифен, тетрациклин и т.д., вызывают повреждение печени. В некоторых вариантах осуществления способы диагностики и лечения проводят в сочетании (например, до, во время или после) с хирургической операцией на печени у индивидуума. Например, хирургическая операция на печени может представлять собой операцию по трансплантации печени, и индивидуум, для которого проводят лечение, может являться донором или реципиентом, или хирургическая операция на печени может представлять собой хирургическую операцию, в ходе которой удаляют пораженную или поврежденную ткань печени или удаляют злокачественные опухоли и т.д.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, для которого проводят предупреждение или лечение, представляет собой гиперлипидемию или обусловлено ей. Под гиперлипидемией авторы подразумевают состояние аномально повышенных уровней любого или всех липидов и/или липопротеинов в крови. Г иперлипидемия включает первичные и вторичные подтипы, где первичная ги- 9 026683 перлипидемия, как правило, обусловлена генетическими причинами (такими как мутация в рецепторном белке), а вторичная гиперлипидемия возникает в результате других первопричин, таких как диабет. Липиды и композиции липидов, которые могут повышаться и понижаться у индивидуума в результате лечений, описываемых в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности, липопротеины промежуточной плотности, липопротеины низкой плотности (ЬПЬ) и липопротеины высокой плотности (НИЬ). В частности, известно, что повышенные уровни холестерина (гиперхолестеринемия) и триглицеридов (гипертриглицеридемия) являются факторами риска заболевания кровеносных сосудов и сердечно-сосудистого заболевания вследствие их влияния на атеросклероз. Повышение уровня липидов также может провоцировать у индивидуума другие состояния, такие как острый панкреатит. Таким образом, способы по изобретению также можно применять для лечения или предупреждения (например, профилактического лечения) состояний, которые сопровождаются или ассоциированы с повышенным уровнем липидов. Такие состояния включают, но не ограничиваются ими, например, гиперлипидемию, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, жировую печень (жировой гепатоз), метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, ишемическую болезнь сердца, атеросклероз (т.е. поражение сосудов с атеросклерозом или ΑδΥΟ) и родственные заболевания, острый панкреатит, различные нарушения обмена веществ, такие как синдром резистентности к инсулину, диабет, синдром поликистозных яичников, жировую болезнь печени, кахексию, ожирение, атеросклероз, инсульт, желчные камни, воспалительное заболевание кишечника, наследственные нарушения обмена веществ, такие как нарушения накопления липидов и т.п. Кроме того, различные состояния, ассоциированные с гиперлипидемией, включают состояния, описанные в опубликованных патентах США 8003795 (Ьш с1 а1.) и 8044243 (§Ьагта с1 а1.), полное содержание которых полностью включено в настоящее описании посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления заболевания и состояния, в отношении которых проводят предупреждение или лечение, включают воспаление и/или заболевания и состояния, ассоциированные, характеризующиеся или вызываемые воспалением. Они включают широкую группу нарушений, которые лежат в основе многих заболеваний человека. В некоторых вариантах осуществления воспаление является острым, возникающим в результате, например, инфекции, повреждения и т.д. В других вариантах осуществления воспаление является хроническим. В некоторых вариантах осуществления иммунная система участвует в воспалительном нарушении, как можно видеть в случае аллергических реакциях и некоторых миопатий. Однако также можно лечить различные неиммунные заболевания с воспалительными процессами в качестве этиологических причин, включая злокачественную опухоль, атеросклероз и ишемическую болезнь сердца, а также другие перечисленные ниже заболевания.

Примеры нарушений, ассоциированных с аномальным воспалением, в отношении которого можно проводить предупреждение или лечение, включая 25НСО8, включают, но не ограничиваются ими, обыкновенные угри, астму, различные аутоиммунные заболевания, глютеиновую болезнь, хронический простатит, гломерулонефрит, различные виды гиперчувствительности, воспалительные заболевания кишечника, воспалительное заболевание органов таза, реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит, саркоидоз, отторжение трансплантата, васкулит и интерстициальный цистит. Также включены воспаление нарушения, которые возникают в результате применения легально выписанных и запрещенных лекарственных средств, а также воспаление, инициируемое негативными состояниями или их последствиями, например, вызываемые стрессом, насилием или депривацией.

В одном из аспектов воспалительное нарушение, в отношении которого проводят предупреждение или лечение, представляет собой аллергическую реакцию (гиперчувствительность 1 типа), результат неадекватного иммунного ответа, который инициирует воспаление. Общеизвестным примером является сенная лихорадка, которая обусловлена гиперчувствительным ответом тучных клеток кожи на аллергены. Тяжелые воспалительные ответы могут переходить в системную реакцию, известную как анафилаксия. Другие реакции гиперчувствительности (2 типа и 3 типа) опосредуются реакциями антител и индуцируют воспаление привлечением лейкоцитов, которые повреждают окружающую ткань, и их также можно лечить, как описано в настоящем описании.

В других аспектах проводят предупреждение и лечение воспалительных миопатий. Такие миопатии обусловлены иммунной системой, несоответствующим образом атакующей компоненты мышцы, приводящей к проявлению признакам воспаления мышц. Они могут возникать в сочетании с другими иммунными нарушениями, такими как системный склероз, и включают дерматомиозит, полимиозит и миозит с тельцами включения.

В одном из аспектов способы и композиции по изобретению используют для предупреждения или лечения системного воспаления, такого как, ассоциированное с ожирением воспаление. При таком воспалении вовлеченные процессы являются идентичными воспалению тканей, но системное воспаление не ограничивается конкретной тканью, а включает эндотелий и другие системы органов. Системное воспаление может быть хроническим, и часто встречается при ожирении, при котором наблюдают повышенные многие маркеры воспаления, включая: Ш-6 (интерлейкин-6), Ш-8 (интерлейкин-8), ЕЬ-18 (интерлейкин-18), ΤΝΕ-α (фактор некроза опухоли-α), СКР (С-реактивный белок), инсулин, глюкозу в крови и лептин. В отношении состояний или заболеваний, ассоциированных с повышенными уровнями этих

- 10 026683 маркеров, можно проводить предупреждение или лечение, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления воспаление можно классифицировать как слабо выраженное хроническое воспаление, при котором наблюдают двух-трехкратное повышение общих концентраций цитокинов, таких как ΤΝΡ-α, 1Ь-б и СКР. Окружность талии также значительно коррелирует с системными воспалительными ответами, преобладающий фактор это корреляции обусловлен аутоиммунным ответом, инициируемым ожирением, при котором иммунные клетки ошибочно принимают жировые отложения за возбудителей инфекции, таких как бактерии и грибы. Системное воспаление также может быть инициировано перееданием. Была установлена связь пищи с высоким содержанием насыщенного жира, а также пищи с высоким содержанием калорий с повышениями уровней воспалительных маркеров, и ответ может становиться хроническим, если переедание является хроническим.

Различные аспекты изобретения описаны в примере ниже. Однако предоставленную в примере информацию не следует расценивать как каким-либо образом ограничивающую объем изобретения.

Пример

Новый метаболит холестерина дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25НСЭ8) понижает биосинтез липидов и подавляет воспалительные ответы ίη νίΐτο и ίη νίνο.

Введение

Показано, что широко распространено изменение метаболизма липидов при неалкогольных жировых болезнях печени (ΝΆΡΈΌ), в частности наблюдают существенные нарушение метаболизма холестерина. Потенциальные механизмы, в результате которых такие изменения могут приводить к ΝΆΡΈΌ через путь передачи сигналов ядерного рецептора остаются неясными. В настоящем исследовании в первичных гепатоцитах крыс идентифицировали новый метаболит холестерина дисульфат 5-холестен-3в,25диола (25НСЭ8). Как описано в настоящем описании, в настоящее время 25НСЭ8 химически синтезировали и исследовали его биологическую функцию. Введение 25НСО8 (25 мкМ) в клетки ТНР-1 макрофагов человека и НерО2 и на модели на животных ΝΆΡΈΌ ίη νίνο на мышах повышало экспрессию РРЛКу и коактиватора 1-α РРЛКу (РОС-1а) и понижало экспрессию ключевых белков, участвующих в биосинтезе липидов и провоспалительных ответах. Введение заметно понижало уровни печеночных липидов и подавляло воспалительные ответы. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией и анализ вестернблоттинга демонстрировали, что 25НСО8 приводило к значительному снижению уровней иРНК 8КЕВР1/2 и подавлению экспрессии их соответствующих генов, включая АСС, ΡΆδ и НМО-СоЛ-редуктазу и к повышению 1кВ и снижению уровней иРНК ΤΝΡα и ΙΈβ. Результаты позволяют предположить, что ингибирование биосинтеза липидов возникает в результате блокирования передачи сигналов δКЕВР и подавления воспалительных ответов путем повышения экспрессии РРЛКу, РОС-1а и 1кВ. Анализ профилей липидов в тканях печени демонстрировал, что введение 25НС^δ один раз каждые трое суток в течение б недель значительно снижало уровень общего холестерина, свободных жирных кислот и триглицеридов на 30, 25 и 20% соответственно. Таким образом, 25НС^δ является эффективным регулятором метаболизма липидов и воспалительных ответов.

Материалы и способы

Материалы

Реагенты для культивирования клеток и вспомогательные вещества приобретали от О1ВСО ΒΚΈ (ОгапБ ЫапБ, ΝΥ); 25-гидроксихолестерин от №\у Еп§1апБ №.1с1еаг (Βοδΐοη, МЛ). Клетки ТНР-1 и НерО2 получали от Лтепсап Туре СиНите ΈοΙΚοίίοη (ΚοοΈνίΙΚ, ΜΌ). Реагенты для ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией приобретали от АВ ЛррйеБ Вю8У81ет8 (^ΗΓΓίη§Ιοη УЛ14 δΚ, ИК). Химические соединения, используемые в этом исследовании получали от δφιιη-ι СНет1са1 Со. (δΐ. Έοιιίδ. МО) или ΒίοКаБ ΈηΕοηιΙοΗ8 (Нетси1е8, СЛ). Поликлональные антитела кролика против δΚЕΒР1, δΚЕΒР-2 и НМОСοЛ-редуктазы приобретали от δаηίа Сгн/ ВюЮсНгюкду (Ъап1а Сгн/, СЛ). Все растворители получали от р18Йет (Раш Па\уп, Νί), если не указано иное. Реагенты для усиленной хемилюминесценции (ЕСЛ) приобретали от ЛтетвЬат Вю8шепсе8 (Р18са1а\уау, Νί). Тестостерон и 27-гидроксихолестерин получали от Ке8еагсН Р1и8 1пс. (Βауοнηе, Νί). Планшеты ΈΚ6 20x20 см для тонкослойной хроматографии (ТСХ) приобретали от \УНа1тап 1пс. (СЕГЮн, Νί).

Способы

Химический синтез дисульфата 5-холестен-3в,25-диола Общий способ: 25-гидроксихолестерин получали из холестерина ранее описанным способом (Одауа еΐ а1., δΐе^ο^Б8, 74: 81-87). Спектры ИК получали в пластинах КВг на спектрометре .^δΈΟ РТ-1К 4б0 р1и8 (Τοкуο, 1аран). ЯМР-спектры ¹Н и ¹³С а получали с использованием прибора Уапап 500 Iηονа ^δ500) при 499,62 и 125,64 МГц соответственно. Масс-спектры низкого разрешения (ПК-Μδ) с впрыском в поток регистрировали посредством ТНегпю δс^енι^Г^с ΤδΟ ОиапЦнп и11га Μδ, оборудованного зондом ионизации распылением в электрическом поле (ΕδΙ) в режиме отрицательных ионов. Масс-спектры высокого разрешения (НК-Μδ) измеряли с использованием ТНегпю δΗηΟΓΚ ΈΤΟ ОгЬНгар ^^8сονе^у Μδ с зондом ΕδΙ в режиме отрицательных ионов. Обращено-фазовую ТСХ проводили на предварительно покрытых планшетах ΚР-18Ρ254δ с применением смеси метанол-вода-уксусная кислота (90:10:1 об./об./об.) в качестве проявляющего растворителя. Пятна визуализировали посредством 50% ΗδΟ₄ с нагреванием при 110°С. Для очистки образцов использовали

- 11 026683 картридж С18 Βοηά Е1п1е (10 г, Уапап). ΟΧΟΝΕ® (пероксимоносульфат калия) и ацетон приобретали от δίβΐηα-ΛΙύπαΙι Со. (δΐ. Ьошк, МО, υδΑ), и все другие используемые реагенты являлись высшей степени чистоты за исключением органических растворителей, которые являлись степени чистоты для ВЭЖХ.

Синтез дисульфата 5-холестен-3в,25-диола (25НС^δ): к раствору 25-гидроксихолестерина (30 мг, 0,07 ммоль) в безводном пиридине (300 мкл) добавляли комплекс триоксид серы-триметиламин (45 мг) и перемешивали суспензию при 50°С в течение 1 ч. К реакционной смеси добавляли 0,1н. метанольного ΝαΟΗ (100 мкл) и наносили смесь на картридж С18 δορ Рак, который обрабатывали метанолом (10 мл) и водой (10 мл). Картридж последовательно промывали ΡΒδ (25 мл) и водой (25 мл), а затем элюировали удерживаемый 25Ηί'Όδ 60% метанолом (10 мл). После 10Х разбавления ацетонитрилом выпаривали растворители досуха под потоком Ν₂ при температуре ниже 40°С и получали 25Ηί'Όδ в порошкообразной форме. Выход продукта 25 мг (60%).

Культура клеток

Моноциты ТНР-1 человека и клетки НерС2 приобретали от Ашегюап Туре СиНиге СоПесОоп (АТСС, Мапаккак, УА) и поддерживали согласно протоколам поставщика. Моноциты ТНР-1 дифференцировали в макрофаги добавлением 100 нМ форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА). Когда клетки достигали ~90% конфлуэнтности, добавляли 25Ηί'Όδ в этаноле (конечная концентрация этанола в среде составляла 0,1%). Клетки собирали в указанные периоды времени для анализа белков, иРНК и липидов.

Для исследования регуляции экспрессии НМС-СоА культивировали НерС2 или РНН в среде, как описано выше, в присутствии или отсутствие мевинолина (50 мкМ) и мавалоната (0,5 мкМ). После культивирования в течение 48 ч добавляли оксистеролы и культивировали еще в течение 6 ч, а затем собирали клетки для определения уровней иРНК и белка.

Определение биосинтеза холестерина ТСХ и ВЭЖХ

После инкубации макрофагов ТНР-1 или клеток НерС2 в среде, содержащей различные концентрации 25Ηί'Όδ. как указано, в течение 6 ч, к клеткам в 60 мм чашках добавляли 3 мл той же свежей среды, содержащей 5 МКС1 [1-¹⁴С]-ацетата. После 2 ч инкубации при 37°С удаляли среду и дважды промывали клетки фосфатно-солевым буфером (ΡΒδ), отбирали с использованием резинового скребка, как описано, и собирали в микроцентрифужные пробирки. Осаждали клетки центрифугированием и промывали осадки три раза посредством ресуспендирования и седиментации. Субклеточную фракцию (микросомальную, цитозольную и ядерную) выделяли, как описано ранее (2). Клеточные или субклеточные осадки ресуспендировали в 0,3 мл ΡΒδ. К каждому образцу добавляли 1,5 мкг тестостерона в качестве внутреннего стандарта. Общие липиды экстрагировали и отделяли добавлением 3 объемов хлороформа:метанола (1:1). [¹⁴С]-холестерин и гидроксихолестерины выделяли в хлороформной фазе и отделяли ТЬС (толуол:ацетилацетат, 2/3, об./об.). Производные [1-¹⁴С]-ацетата визуализировали посредством 1таде КеаДег Рирй1т ΒΑδ-1800 II, как описано ранее (1).

Для анализа немеченных продуктов стерола экстрагированные липиды инкубировали с 2 единицами холестериноксидазы при 37°С в течение 20 мин. Реакцию окисление останавливали добавлением 1,5 мл метанола с последующим добавлением 0,5 мл насыщенного КС1. Стеролы дважды экстрагировали с применением 3 мл гексана. Собирали гексановую фазу и выпаривали под потоком азота. Остатки растворяли в подвижной фазе растворители для анализа ВЭЖХ, как описано ранее (3).

Производные [1-¹⁴С]-ацетата в хлороформной фазе анализировали ВЭЖХ на колонке с диоксидом кремния (5 мкх4,6 ммх25 см; Βесктаη, υδΑ) с применением растворителя системы доставки растворителя НР серия 1100 (НеМеК РаскагД) при скорости потока 1,3 мл/мин. Колонку уравновешивали и проводили анализ в смеси растворителей гексан-изопропанол:ледяная уксусная кислота (965:25:10, об./об./об.) в качестве подвижной фазы. Элюаты собирали каждые 0,5 мин (0,65 мл на фракцию) за исключением указанных случаев. Число импульсов в производных [¹⁴С]-ацетата определяли подсчетом сцинтилляций. Колонку калибровали [¹⁴С]-холестерином, [³Н]-25-гидроксихолестерином и [¹⁴С]-27-гидроксихолестерином.

Определение уровней иРНК ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией

Тотальную РНК выделяли с использованием набора δν То1а1 ΡΝΑ 1ко1аПоп (Рготеда, МаФкоп, ^Ι), который включал обработку ДНКазой. Тотальную РНК 2 мкг использовали для синтеза первой цепи кДНК в соответствии с рекомендациями производителя Дпуйгодеп, СагПЪаД, СΑ). ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией проводили с применением подходящего красителя в качестве индикатора в системе ΑΒΙ 7500 Рак! Кеа1-Т1те РСК (ЛррПеД Β^ο5у5ΐет5, Рок!ег Сйу, СΑ). Все наборы праймеров/зондов для ПЦР в реальном времени появлялись для анализов экспрессии генов ТацМап (Лρρ1^еД Β^ο5у5ΐет5, Рок!ег Сйу, СΑ). Амплификации β-актина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (СЛΡ^Н) использовали в качестве внутренних контролей. Относительную экспрессию информационной РНК (иРНК) количественно определяли способом сравнения пороговых циклов (С!) и выражали в виде 2^-ΔΔα Последовательности подходящих для амплификации праймеров описаны, например, у Кеп е! а1., 2007 (1).

Анализ вестерн-блоттинга

Микросомальную фракцию выделяли, как описано ранее (4). Микросомальные или общие экстра- 12 026683 гированные белки из обработанных клеток разделяли на 7,5% ЗЭЗ-полиакриламидном денатурирующем геле. После ЗЭЗ-РАОЕ проводили электрофоретически перенос белков на поливинилиденфторидные (РУЭР) мембраны (МПНроге). Затем мембраны блокировали при 25°С в течение 60 мин в блокирующем буфере [РВЗ, рН 7,4, 0,1% Τ\νΕΕΝ® 20 (солюбилизирующее мембранные белки неионное поверхностноактивное вещество, С₅₈Н₁₁₄О₂₆), 5% обезжиренное сухое колоко). Затем белки инкубировали при 4°С в течение ночи с поликлональным 1дО кролика против ЗКЕВР1, ЗКЕВР-2 или НМО-СоА-редуктазы человека. Поле промывания РВЗ рН 7,4, содержащим 0,05% ΤνΕΕΝ® 20, в промывающий раствор добавляли конъюгат антитела коза против 1дО кролика с пероксидазой хрена 1:2500 и инкубировали в течение 60 мин. Полосы белка детектировали с использованием набора Атегкйат ЕСЬ р1и8, положительные полосы количественно определяли посредством анализатора Абхамсеб 1таде Эа1а (А1ба 1пс., 81гаиЬепНагб1, Оегтапу). Исследования на животных Исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием МсОшге Уе1егап5 Айаиь Мебюа1 СеШег, и их проводили в соответствии с Хельсинской декларацией, руководством по содержанию и использованию лабораторных животных и всех действующих регулирующих документов. Для анализа эффективности 25НСОЗ по отношению к обусловленному рационом накоплению липидов в сыворотке и печени самок мышей С57ВБ/61 (СЬат1е8 КМет, νίΐιηίηβίοη, МА) в возрасте 8 недель содержали на рационе с высоким содержанием жиров (НРЭ) (Набам Тек1аб, Маб^8οη, VI), содержащем 42% ккал от жиров, 43% ккал от углеводов, 15% ккал от белков и 0,2% холестерина, в течение 10 недель. Всех мышей содержали в одинаковых условиях в стерильном помещении и обеспечивали свободный доступ к воде и корму. В конце каждого периода мышам интраперитонеально инъецировали раствор носителя (этанол/РВЗ, носитель) или 25НСЭЗ (25 мг/кг) один раз каждые трое суток в течение 6 недель и лишали корма в течение ночи; и собирали образцы крови. Уровни триглицеридов, общего холестерина, липопротеина высокой плотности-холестерина, глюкозы, щелочной фосфатазы (АЬК), аланинаминотрансферазы (АЬТ) и аспартатаминотрансферазы (А8Т) в сыворотке измеряли стандартными ферментативными способами в клинической лаборатории в МсОшге Уеίе^аη8 Айшге Мебюа1 СеШег. Профили липопротеинов в сыворотке анализировали ВЭЖХ, как описано ниже.

Количественное определение печеночных липидов

Ткани печени гомогенизировали и экстрагировали липиды смесью хлороформа и метанола (2:1) и фильтровали. Экстракты 0,2 мл выпаривали досуха и растворяли в 100 мкл изопропанола, содержащего 10% ΤΚΙΤΘΝ™ Х-100 (С₃₄Н₂₂О (С₂Н₄О)_п), неионное поверхностно-активное вещество) для анализа холестерина ^а^ СНеписаЕ ИЗА, ΚΕΙιιηοιΠ, УА), раствор МЕРА (0,5 г Е^ΤА-Nа₂, 2 г ΤΚΓΓΟΝ™ Х-100, 0,76 мл 1н. №ЮН и 0,5 г азида натрия/л, рН 6,5) для анализа свободных жирных кислот ^а^ СНеписаЕ ИЗА, ΚΕΙιιηοηΓ УА) или только изопропанол для анализа триглицеридов (Икйет ЗаеШтйс, РШФитдН, РА). Все анализы проводили по инструкциям производителя соответственно. Каждую концентрацию липидов нормализовали на массу печени.

Статистика

Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. В тех случаях, где указано, данные подвергали анализу с использованием ί-критерия и определяли как достоверно различные при р<0,05.

Результаты

Детекция нового метаболита холестерина в ядрах первичных гепатоцитах крыс

Для определения наличия новых метаболитов холестерина в ядрах гепатоцитов из первичных гепатоцитов крыс выделяли ядерные фракции. Оксистеролы в метанольных/водных фразах в каждой фракции анализировали посредством ЬС-МЗ. Результаты демонстрируют, что два основных молекулярных иона т/ζ 561 и т/ζ 583 (561+Νη) хорошо соответствуют молекуле дисульфата 5-холестен-3в,25-диола (фиг. 1). Молекула вероятнее всего синтезируется Зυ^Τ2В1Ь и Зυ^Τ2В1а.

Химический синтез ядерного оксистерола, дисульфат 5-холестен-3в,25-диола

Для подтверждения его структуры и исследования его роли в клеточном гомеостазе липидов и воспалительных ответах химически синтезировали, как описано выше, и очищали 25НСЭЗ.

Анализ МЗ синтезируемого соединения демонстрирует такую же молекулярную массу иона т/ζ 561 и т/ζ 583 (+№), как в оригинальном ядерном оксистероле, и очищенный продукт не был загрязнен исходным веществом 25-гидроксихолестерином т/ζ 401. ЬК-МЗ (ЕЗ1-отрицательный), т/ζ 583,4 (М+№2Н, 88%), 561,3 (М-Н, 46%), 481,4 (М-ЗО₃-Н, 11%), 463,4 (М-Н₂ЗО₄-Н, 34%), 431,82 (14%), 381,27 (100%) (фиг. 2). ^!Н ЯМР (СЭ3ОЭ) δ: 0,72 (3Н, с, 18-СН3) , 0,97 (3Н, д, 15,0 Гц, 21-СН3), 1,03 (3Н, с, 19-СН3), 1,14 (6Н, с, 26- и 27-СН3), 4,14 (1Н, уш.м, 3а-Н), 5,39 (1Н, уш.с, 6-Н) (фиг. 3). ¹³С ЯМР (СЭ3ОЭ) δ: 12,45, 19,37, 19,90 21,82, 22,29, 25,45, 25,51, 27,05, 27,12, 29,39, 29,44, 30,13, 33,16, 33,37, 37,26, 37,32, 37,50, 38,60, 40,52, 41,27, 43,65, 51,78, 57,71, 58,37, 79,98, 85,93, 123,44, 141,71 (фиг. 4).

Результаты свидетельствуют о том, что синтезированная молекула представляет собой дисульфат 5холестен-3в,25-диола (25НСЭЗ) и что он соответствует указанной молекуле в ядерной фракции гепатоцитов.

25НСЭЗ ингибирует биосинтез липидов, снижая уровни иРНК АСС, РАЗ и ΗМО-СοА-редуктазы

- 13 026683 через путь передачи сигналов 8КЕВР.

Для исследования, как 25НСЭ8 ингибирует биосинтез липидов, из обработанных макрофагов ТНР1 выделяли тотальную РНК. Уровни иРНК АСС и РЛ8 для синтеза триглицеридов и НМС-СоА редуктазы для синтеза холестерина в макрофагах и клетках НсрО2 определяли ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. Как представлено на фиг. 5, понижения уровней иРНК АСС и РА8 (фиг. 5А) и НМОСоА редуктазы (фиг. 5В) после добавления 25НСЭ8 к клеткам в культуре зависели от концентрации, как продемонстрировано, и зависели от времени (данные не показаны). Такие понижения согласовывались с понижениями экспрессии 8РЕВР1/2, продемонстрированными на фиг. 5А и 5В. Эти результаты свидетельствуют о том, что 25НСЭ8 снижает передачу сигналов 8РЕВР и в дальнейшем снижает биосинтез липидов. Следует отметить, что 25НСЭ8 линейно повышал уровни иРНК РРАКу и одновременно повышал экспрессию 1кВа на раннем этапе и при низких концентрациях. Результаты позволяют предположить, что 25НСЭ8 подавляет воспалительные ответы через путь передачи сигнала РРАКуДкВа, равно как и 25НС38.

Эффекты введения 25НСЭ8 на гомеостаз липидов у мышей, содержащихся на рационе НРЭ

Для исследования эффектов длительной обработки 25НСЭ8 на гомеостаз липидов самок мышей С57ВЙ/61 в возрасте 8 недель содержали на рационе НРЭ в течение 10 недель, а затем разделяли на две группы. Одну группу обрабатывали 25НСЭ8. а другую носителем посредством перитонеальной инъекции один раз каждые трое суток в течение шести недель. Во время обработки мышей содержали на рационе НРЭ и наблюдали за массой тела и потреблением калорий. Не наблюдали значимых отличий этих двух параметров (данные не показаны). После 6 недель инъекций мышей содержали без корма в течение ночи и умерщвляли. Не наблюдали значимый различий масс печени мышей независимо от рациона (данные не показаны).

Для исследования эффекта 25НСЭ8 на метаболизм липидов в печени определяли уровни липидов в печени и уровни экспрессии соответствующих генов. Как сообщалось ранее, у мышей, содержащихся на рационе НРЭ, выявляли повышенные уровни триглицеридов, общего холестерина, свободных жирных кислот и триглицеридов в печени по сравнению с мышами, содержащимися на стандартном рационе (данные не показаны). Эти повышения значительно снижались при введении 25НСЭ8, например, на 30%, 20% и 18% (р<0,05) соответственно, как представлено на фиг. 6. Кроме того, анализ экспрессии генов демонстрировал, что введение 25НСЭ8 значительно снижало экспрессию ключевых ферментов и рецепторов, участвующих в синтезе свободных жирных кислот, триглицеридов и холестерина, как представлено в табл. 1.

Нарушение регуляции метаболизма липидов часто ассоциировано с воспалительными состояниями. Обработка 25НСЭ8 значительно подавляла экспрессию ΤΝΡα и ΣΓ1β на 50%, 36% соответственно (табл. 2). Эти результаты соответствуют анализам функции печени, которые демонстрировали, что 25НС38 подавляет воспалительные реакции печени, уменьшая повреждение печени и активность щелочной фосфатазы в сыворотке (данные не показаны). Следует отметить, что 25НСЭ8 повышал экспрессию РОС-1а в 2 раза в печени. Таким образом, 25НСЭ8, по-видимому, регулирует метаболизм липидов и воспалительные ответы через путь передачи сигналов ЬХК, РРАКу и РОС-1а.

- 14 026683

Таблица 1. Относительная экспрессия иРНК в печени участвовала в метаболизме липидов у мышей, содержащихся на рационе НРБ с 25НСБ8 или без него

Название гена	Описание гена	НГО (п=6>	НРБ+25НСБ8 (п=7)
Биосинтез жирных кислот
5ЕЕВР-1С	Связывающий стеролрегулирующие элементы белок 1с	1,0±0,Зб	0,64±0,14*
АСС1	Ацетил-СоА-карбоксилаза 1	1,0±0,31	0,8б±0,18
РАЗ	Синтез жирных кислот	1,0±0,27	0,68+0,17*
Метаболизм триглицеридов
СРАМ	Глицерин-3-фосфат- ацилтрансфераза	Ι,ΟφΟ,ΙΟ	0,74+0,18*
МТТР	Микросомальный белок-переносчик триглицеридов	1,0±0,11	0,94±0,17
РЬТР	Белок-переносчик фосфолипидов	1,0+0,3	0,68±0,21*
Метаболизм холестерина
5ЕЕВР-2	Связывающий стеролрегулирующие элементы белок 2	1,0+0,18	1,12+0,25
НМСЕ	Гидрок Симе тилглутарил-кофермент А-редуктаза	1,0±0,16	0,84±0,07*
ымьк	Рецептор липопротеинов низкой плотности	1,0±0,43	0,62±0,08*
СЦ36	Рецептор тромбоспондина	1,0±0,52	0,69±0,29

Животных обрабатывали, как описано выше. Все значения выражают в виде среднего значения ±8Б; п=6-7.

*р<0,05 по сравнению с мышами, содержащимися на НРБ.

Сокращенные обозначения: НРБ, рацион с высоким содержанием жиров.

Таблица 2. Относительная экспрессия иРНК в печени участвовала в воспалительных ответах у мышей, содержащихся на НРБ с 25НСБ8 или без него

Название гена	Описание гена	НГО (п=6)	НГО+25НСЦ5 (п=7)
рес-1а	Коактиватор-1а гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом	1,0+0,27	2,11±0,82*
ррАКа	Гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом	1,0±0,42	1,27±0,52
ΙκΒα	Ядерный транскрипционный фактор в изоформе-α ингибитора В-клеток	1,0±0,25	1,35±0,27*
ΤΝΡν	Фактор некроза опухоли а	1,0±0,28	0,50±0,21**
1Ыа	Интерлейкин 1а	1,0±0,35	1,02±0,20
ΙΙ,Ιβ	Интерлейкин 1β	1,0+0,21	0,64±О,16**

Животных обрабатывали, как описано выше. Все значения выражают в виде среднего значения ±8Б; *р<0,05, **р<0,01 по сравнению с мышами, содержащимися на НРБ.

Обсуждение

Метаболизм холестерина и метаболизм триглицеридов являются тесно связанными. Ядерные рецепторы-сироты представляют собой активируемые лигандом факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию ключевых генов-мишеней, которые являются важными регуляторами многих биологических событий. Рецепторы жирных кислот (РРАК), оксистеролов (ЬХК), ретиноевых кислот (КХК) и 8КЕВР функционируют как сенсоры клеточного уровня липидов, вызывая изменения экспрессии генов для поддержания гомеостаза липидов и защиты клеток от повреждений в результате накопления липидов. Однако взаимное влияние сигналов в видах рецепторной активности остается неясным. Как продемонстрировано в настоящем описании, метаболит холестерина 25НСБ8 ингибирует экспрессию, процессинг и активность §КЕВР-1с ίη νίίτο и ίη νίνο и повышает экспрессию РРАКу И РСС-Ια. Убедительно подтверждено документальными доказательствами, что 8КЕВР контролируют биосинтез липидов,

- 15 026683

ΡΡΑΚγ регулирует воспалительные ответы, и РСС-Ια контролирует энергетический баланс. Таким образом, результаты демонстрируют, что 25НСО8 представляет собой эффективный регулятор этих процессов и играет важную роль в поддержании гомеостаза липидов в печени и воспалительных ответов. Введение 25НС38 повышает уровни ядерного белка ΡΡΆΚγ и подавляет воспалительные ответы, но только незначительно повышает уровни иРНК ΡΡΑΚγ. В противоположность этому, 25НСЭ8 значительно повышает экспрессию иРНК ΡΡΑΚγ и ΡΟΤ'-Ια в зависимости от времени и концентрации, свидетельствуя, что 25НСЭ8 является более эффективным при регуляции метаболизма липидов и воспалительных ответов по сравнению с 25НС38.

Реакции биосинтеза 25НСО8 и сульфатирования оксистерола представляют собой новый регуляторный путь, который опосредует активность ядерного рецептора в гепатоцитах. Ключевые компоненты такого пути обобщены следующим образом: 1) когда уровни внутриклеточного холестерина повышаются, митохондриальный белок, обеспечивающий доставку холестерина, δΐΑΚ доставляет холестерин в митохондрии, где синтезируются регуляторные оксистеролы, такие как 25НС, посредством СΥΡ27Α1. В свою очередь, эти оксистеролы активируют ЬХК и затем повышают экспрессию его генов-мишеней, участвующих в биосинтезе жирных кислот и триглицеридов. Кроме того, 25НС активирует ЬХК, подавляет синтез вновь синтезируемого холестерина путем ингибирования экспрессии НМСК и увеличивает опосредуемую АВСА1 секрецию холестерина клетками (образование НИЬ). 2) 25НС38 и 25НСО8 инактивируют ЬХК и подавляют процессинг δΚΕΒΡ-1ο. свидетельствуя о том, что эти сульфатированные оксистеролы снижают уровни внутриклеточных липидов, ингибируя синтез; 3) эффекты 25НС на метаболизм липидов являются противоположными эффектам 25НС38 и 25НСЭ8. Таким образом, сульфатирование внутриклеточного оксистерола представляет собой новый механизм регуляции, участвующий в метаболизме липидов и в развитии ΝΑΡΈΌ.

Обработка 25НСО8 на модели ΝΑΡΈΌ на мышах приводила к понижению уровней липид в печени. Было исследовано большое число видов лечения ΝΑΡΈΌ. Несмотря на то, что многие, по-видимому, улучшают биохимические маркеры, такие как уровни аланинтрансаминазы, для большинства из них не было продемонстрировано, что они улучшают гистологические аномалии или уменьшают клинические конечные точки. 25НСЭ8 подавляет экспрессии ключевых генов, участвующих в биосинтезе липидов, на транскрипционном уровне путем блокирования активации ядерного рецептора ΈΧΚ и δΚΕΒΡ, подавляя провоспалительные цитокины, индуцируемые НГО, и контролируя энергетический баланс через ΡΟίΈι. Таким образом, 25НСО8 служит в качестве эффективного регулятора для эффективного снижения уровней липид в печени и, таким образом, представляет собой новое средство для терапии ΝΑΈΡΌ и других заболеваний, связанных с метаболизмом липидов.

Ссылки

1. Кеп,3., Π,Χ., Κ.ούη§4βζ-Α§ιϊί1ο,ϋ., ΟίΙ,Ο., Ну1етоп,Р., апй Рапйак.УЛМ. 2007. Зи1£а(еЙ охуз(его1, 25НС35,13 а ро£еп1 ге§и1а£ог οίΐίρίά тМаЪоЬзт ίη Ьитап Ьера1осу!ее. ВюсЬет.

ВюрЬуз. Кез. Соттип. 360:802-808.

2. Кеп,8., Ну1етоп, Ρ., ΖΗβηβ,Ζ.Ρ., Койп^иег-А^искф., МащиезД)., Ο,Χ., ΖΗοα,Η., Οϋ,Ο., апб Рапс1ак,\У.М. 2006. МепОйсаНоп оГапоуе! зи!Гопа1ей охуз1его1, 5-сЬо1ез£еп-ЗЬе£а, 25ύίοΐ 3-зи1Гопа£е, ίη Нера£осу£е пио!е1 апй тйосЬопйпа. λ Έίρίύ Вез. 47:1081-1090.

3. Рапс1ак,\У.М., К.еп,3., Магяиез.О., На11,Е,, Ке<Иогй,К,, МаНопееДЗ., ВоЬйап,Р.,

Неитап.О., ΟίΙ,Ο., ап<1 Ну1етоп,Р. 2002, ТгапзроН οίсЬо1ез£его1 ίηίο тЬосЬопспа ίβ га£еΙύηίΐίηβ Гог ЬОе асМ зуп1Ьез13 νία 1Ье аНетабуе раЙпуау ίη рптагу га£ Ьера£осу£ез. I. Βίο).

СЬет. 277:48158-48164.

4. Кеп,5., Ну1етоп,Р., Магяиезф., На11,Е., КейГогй,К., Οϋ,Ο., апй Рапйак,\У.М. 2004. ЕЙес! оГтсгеазт^ 1Не ехргеззюп оГ сЬо1ез£его1 (гапзройегз (διΑΚ, ΜΕΝ64, апй ЗСР-2) оп Ъйе асИ зупЛезгз. ί. ΠρίάΚεβ. 45:2123-2131.

Несмотря на то, что изобретение описано в отношении его предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области понятно, что изобретение можно практически осуществлять с модификацией, входящей в рамки сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не должно ограничиваться вариантами осуществления, как описано выше, а должно дополнительно включать все модификации и их эквиваленты, входящие в рамки сущности и объема описания, предоставленного в настоящем описании.

Claims

1. Применение соединения, которое представляет собой дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25НСО8) формулы

- 16 026683 или его фармацевтически приемлемую соль;

в качестве лекарственного средства для снижения уровней липидов; снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов; лечения диабета; лечения гиперлипидемии; лечения атеросклероза; лечения жировой болезни печени; лечения воспаления и/или заболевания или состояния, ассоциированного, характеризующегося или вызываемого воспалением, или лечения нарушения метаболизма липидов у нуждающегося в этом индивидуума.

2. Применение по п.1, где соединение представляет собой

3. Применение соединения, определенного в п.1 или 2, для получения лекарственного средства для снижения уровней липидов; снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов; лечения диабета; лечения гиперлипидемии; лечения атеросклероза; лечения жировой болезни печени; лечения воспаления и/или заболевания или состояния, ассоциированного, характеризующегося или вызываемого воспалением, или лечения нарушения метаболизма липидов у нуждающегося в этом индивидуума.

4. Способ лечения индивидуума, где способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества соединения, определенного в п.1 или 2, где указанный способ выбран из способа снижения уровней липидов; способа снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов; способа лечения диабета; способа лечения гиперлипидемии; способа лечения атеросклероза; способа лечения жировой болезни печени; способа лечения воспаления и/или заболевания или состояния, ассоциированного, характеризующегося или вызываемого воспалением; и способа лечения нарушения метаболизма липидов у нуждающегося в этом индивидуума.

5. Способ по п.4, где указанное соединение вводят в количестве в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг массы тела указанного индивидуума и где введение включает по меньшей мере одно пероральное введение, энтеральное введение, сублингвальное введение, трансдермальное введение, внутривенное введение, перитонеальное введение, парентеральное введение, введение посредством инъекции.

6. Способ по п.5, где введение представляет собой подкожную инъекцию или внутримышечную инъекцию.

7. Способ по п.5, где указанное соединение вводят в количестве в диапазоне от 1 до 10 мг/кг массы тела указанного индивидуума.

8. Соединение, которое представляет собой фармацевтически приемлемую соль дисульфата 5холестен-3в,25-диола (25НСБ8) формулы

- 17 026683

9. Соединение по п.8, которое представляет собой фармацевтически приемлемую соль дисульфата 5-холестен-3в,25-диола (25НСО8) формулы

10. Соединение, которое представляет собой дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25НСО8) формулы или его фармацевтически приемлемую соль в твердой форме.

11. Соединение по п.10, которое представляет собой дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25НСО8) формулы или его фармацевтически приемлемую соль.

12. Соединение по п.10 или 11, которое находится в порошкообразной форме и/или в лиофилизированной форме.

13. Фармацевтическая композиция для снижения уровней липидов; снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов; лечения диабета; лечения гиперлипидемии; лечения атеросклероза; лечения жировой болезни печени; лечения воспаления и/или заболевания или состояния, ассоциированного, характеризующегося или вызываемого воспалением, или лечения нарушения метаболизма липидов у нуждающегося в этом индивидуума, содержащая соединение, определенное в п.1 или 2, и физиологически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.

- 18 026683

14. Фармацевтическая композиция по п.13, где композиция находится в твердой форме.

15. Фармацевтическая композиция по п.14, где композиция находится в форме порошка, таблетки, капсулы или таблетки-леденца или композиция содержит соединение в лиофилизированной форме совместно с наполнителем, где композиция необязательно содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.

16. Фармацевтическая композиция по п.13, которая содержит носитель, который является жидкостью.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, где соединение солюбилизировано в указанной жидкости или диспергировано в указанной жидкости, и указанная жидкость представляет собой стерильную воду для инъекций или фосфатно-солевой буфер, и указанная композиция содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.

18. Способ получения соединения, которое представляет собой дисульфат 5-холестен-3в,25-диола (25НСО8) формулы или его фармацевтически приемлемую соль, где способ включает взаимодействие 25гидроксихолестерина с комплексом триоксида серы и амина и выделение дисульфата 5-холестен-3в,25диола в свободной форме или в форме его фармацевтически приемлемой соли.

19. Способ по п.18, где соединение представляет собой

20. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.13-17, где способ включает объединение указанного соединения с указанным физиологически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.