CN112294827B

CN112294827B - 5-胆甾烯 -3β-醇硫酸酯盐的用途

Info

Publication number: CN112294827B
Application number: CN202011262813.XA
Authority: CN
Inventors: 苏智广; 刘银; 张雪萍; 张彩霞
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2040-11-12
Also published as: CN112294827A

Abstract

本发明提供了5‑胆甾烯‑3β‑醇硫酸酯盐在制备减少胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖、保护胰岛形态结构的药物中的用途以及含有5‑胆甾烯‑3β‑醇硫酸酯盐的药物。5‑胆甾烯‑3β‑醇硫酸酯盐能减少胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖，保护胰岛形态结构，防止胰岛β细胞丢失，增强胰岛素分泌功能，显著改善因胰岛素减少而引起的高血糖，逆转I型糖尿病，为临床提供了一种新的选择。

Description

5-胆甾烯 -3β-醇硫酸酯盐的用途

技术领域

发明属于生物医药领域，具体涉及5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐的用途。

背景技术

I型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病，约占糖尿病患者总数的10%左右，大多发病较快，症状显著且严重。目前认为I型糖尿病发生的最重要的原因是由自身反应性T淋巴细胞介导的自身免疫，诱发了胰β细胞自身免疫反应，引起胰岛β细胞损伤和凋亡，损伤了胰岛β细胞使其丧失合成和分泌胰岛素的功能，引起糖代谢紊乱。

早期对I型糖尿病治疗采用免疫抑制剂（如环孢素）来阻断自身免疫过程从而保存胰岛β细胞功能，但长期使用会产生不良反应，且无法长期保护胰岛β细胞。对于I型糖尿病的病人来说，保护胰岛β细胞，减少胰岛β细胞损伤和凋亡，增强胰岛素分泌胰岛素的功能，是治疗I型糖尿病导致的高血糖的关键，寻找一种能够治疗I型糖尿病的安全有效的药物显得十分重要。

5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐又称为胆固醇硫酸盐（Cholesterol Sulfate，CS），是血液循环中主要的类固醇硫酸酯盐，在体内由硫酸基转移酶（SULT2B1b）催化胆固醇硫化作用形成。人血浆中胆固醇硫酸盐的浓度范围在134~254 μg/ml，也存在于包括尿液、胆汁、精液、皮肤、肾上腺、肾脏和肝脏等各种体液和组织中。同时胆固醇硫酸盐也是一种主要的细胞膜物质，对细胞膜功能至关重要。体外研究表明，胆固醇硫酸盐是维甲酸孤核受体RORα的天然激动剂。研究表明胆固醇硫酸盐通过靶向肝细胞核因子HNF4α，防止其入核，从而可以抑制肝脏糖异生，和脂质合成，改善胰岛素敏感性，减轻胰岛素抵抗，缓解代谢综合征，即能够改善肥胖和胰岛素抵抗型II型糖尿病。

然而，5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐对胰岛β细胞的作用以及对I型糖尿病的治疗作用还未见公开。

发明内容

本发明的目的在于提供5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐的用途。本发明提供了5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐或其药学上可接受的盐、酯、立体异构、溶剂化合物在制备减少胰岛β细胞凋亡和/或促进胰岛β细胞增殖的药物中的用途，所述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐的结构式如下：

。

进一步地，上述药物是增强胰腺分泌胰岛素功能和/或保护胰岛形态结构的药物。

进一步地，上述药物是预防和/或治疗I型糖尿病的药物。

进一步地，上述药物是以5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐或其药学上可接受的盐、酯、立体异构、溶剂化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。

本发明还提供了一种减少胰岛β细胞凋亡和/或促进胰岛β细胞增殖的药物，其特征在于，它是以5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐或其药学上可接受的盐、酯、立体异构、溶剂化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。

进一步地，上述药物是5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液。

更进一步地，上述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液的浓度为1~10mg/L，优选为5mg/L。

更进一步地，上述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液是以5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐与生理盐水混匀制得，优选地，上述溶液还含有助溶剂与有机溶剂；所述助溶剂为表面活性剂，质量分数为1~5%，更优选为吐温20，质量分数为2%；所述有机溶剂为二甲亚砜，质量分数为1~20%，更优选为10%。

实验结果表明，5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐能减少胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖，保护胰岛形态结构，防止胰岛β细胞丢失，增强胰岛分泌胰岛素的功能，显著改善因胰岛β细胞损伤或丢失导致胰岛素减少而引起的高血糖，逆转I型糖尿病。

本发明所述的5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐又称为胆固醇硫酸盐、硫酸胆固醇、胆甾醇硫酸盐、硫酸胆甾醇，Cholesterol Sulfate（缩写为CS），具体是指CAS号为1256-86-6的化合物。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为CS抑制链脲佐霉素（STZ）引起的高血糖实验结果。（A）STZ诱导下的随机高血糖测试；（B）葡萄糖耐量测试；（C）糖耐量测试实验曲线下的面积，反映血浆内葡萄糖总量；（D）高糖刺激下的胰岛素分泌；（E）高糖刺激下的胰岛素分泌曲线下的面积。

图2为（A）胰岛β细胞系经过不同CS浓度处理后的存活率；（B）不同浓度STZ和CS处理后NIT-1细胞凋亡情况；（C）不同浓度CS处理后NIT-1细胞增殖情况，（D）各实验组胰岛的胰岛素和胰高血糖素免疫荧光染色结果。

具体实施方式

实验材料：C57/6J小鼠购买自北京华阜康生物科技有限公司，链脲佐霉素（STZ）购自大连美仑生物技术有限公司，5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐（CS）购自上海毕得医药科技有限公司，血糖试纸购自艾科生物技术（杭州）有限公司。Insulin ELISA Kit 购自crystalchem No.90060，凋亡检测试剂盒（Cat:FXP023）购于北京四正柏生物科技公司，edu检测试剂盒（Cat:C10320-1）购于瑞博公司。其余材料均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐注射液的制备

将CS溶于DMSO中配置成50mg/mL的溶液，随后加入助溶剂吐温20，最后将上述混合液溶于生理盐水中配置成CS注射液。其中CS的浓度为5mg/L，DMSO为10%，吐温20为2%，现配现用。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯对STZ诱导的I型糖尿病高血糖的抑制作用

1、实验方法

将C57/6J小鼠分成4组，分别为溶剂组、CS组、STZ组、CS+STZ组。

（1）溶液的配制：

DMSO注射液的配制：将DMSO和吐温20溶于生理盐水中，配置成DMSO为10%，吐温20为2%的注射液，现配现用。

STZ柠檬酸缓冲液的配制：柠檬酸2.1g加入双蒸水100mL中配成A液（0.1mol/L），柠檬酸钠2.94g加入双蒸水100mL中配成B液（0.1mol/L）。将A、B液按1：1.32的比例混合，pH计测定pH值，调节pH=4.2-4.5，最后将STZ溶于上述混合液体中，配置成浓度为8mg/L的STZ柠檬酸注射液，现配现用

（2）小鼠预处理：

按照25mg/kg体重给予小鼠腹腔注射实施例1配制的CS溶液1周，每天两次。

（3）实验组处理：

溶剂组：按照25mg/kg体重给予预处理后的小鼠腹腔注射步骤（1）配制的DMSO注射液（2次/天），持续5周；

CS组：按照25mg/kg体重给予预处理后的小鼠腹腔注射实施例1配制的CS注射液（2次/天），持续5周；

STZ组：按40mg/kg体重给予预处理后的小鼠连续4天腹腔注射步骤（1）配制的STZ柠檬酸缓冲液（1次/天），STZ总剂量160mg/kg。同时按照25mg/kg体重给予小鼠腹腔注射步骤（1）配制的DMSO注射液（2次/天），持续5周；

CS+STZ组：按40mg/kg体重给予预处理后的小鼠连续4天腹腔注射步骤（1）配制的STZ柠檬酸缓冲液（1次/天），STZ总剂量160mg/kg。同时按照25mg/kg体重给予小鼠腹腔注射实施例1配制的CS注射液（2次/天）。持续5周；

（4）检测方法：开始实验到实验结束，每周监测小鼠随机血糖。

实验结束前一周开展下述实验：对小鼠过夜禁食后进行葡萄糖耐受测试（GTT）同时收集糖耐量过程中血样用于胰岛素含量测定（ITT），空腹禁食6小时后，葡萄糖剂量为2g/kg。

实验步骤：用生理盐水配制0.2g/mL葡萄糖溶液，用配好的葡萄糖溶液以每kg体重2g葡萄糖给予小鼠腹腔注射，按照注射葡萄糖的时间分别在0min，15 min，30 min，60 min，120 min取小鼠尾血检测其血糖含量，在0min，5min，15min，30min取小鼠尾血检测其胰岛素含量。

2、结果与结论：如图1所示，小鼠经STZ处理后，从第三周开始，STZ组小鼠的随机血糖逐渐升高，而CS+STZ组维持在正常水平位置（图1A），说明CS可以降低STZ诱导下的随机高血糖。在CS给药5周后对小鼠进行糖耐量测试，发现CS能显著改善STZ导致的糖耐量受损（图1B,1C）, 同时CS能促进高糖刺激下的胰岛素分泌（图1D，1E）。

实验结果说明，5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐能防止胰岛β细胞丢失，增强胰岛素分泌功能，显著改善因胰岛素减少而引起的高血糖，逆转I型糖尿病。

实验例2、5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯对胰岛β细胞的影响

1、STZ处理NIT-1流式凋亡实验：

将NIT-1细胞铺板过夜后加入相应浓度的CS溶液（0μM，5μM，10μM，DMSO为溶剂）预处理6小时，后加入相应浓度的STZ溶液（10mM，20mM）和CS（0μM，5μM，10μM，DMSO为溶剂）处理24小时。用北京四正柏生物科技公司凋亡检测试剂盒（Cat:FXP023）检测细胞凋亡情况。

2、Edu增殖实验：

将NIT-1细胞铺板过夜后加入相应浓度的CS（0μM，10μM，20μM，DMSO为溶剂）处理24小时，用瑞博公司Edu检测试剂盒（Cat:C10320-1）检测细胞增殖情况。

3、胰岛素及胰高血糖素染色实验：

取实验例1中各实验组处理结束后的小鼠新鲜胰腺组织进行石蜡包埋固定。将包埋好的胰腺组织切成3mm厚度的片子。将切片放置60°C烘箱2小时后，依次放入二甲苯30min，无水乙醇5min，95%乙醇5min，85%酒精5min，75%酒精5min，50%酒精5min，PBS洗5min。将组织切片置于柠檬酸抗原修复液中，于微波炉内进行抗原修复（中火8min，中低火8min）。自然冷却后将片子置于PBS中洗涤3次，每次5min。0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透30min。5%浓度的BSA孵育封闭30min，弃掉封闭液，在切片上滴加一抗，将切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。PBS洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在阻水圈内滴加荧光二抗，避光孵育60min。PBS洗涤3次，每次5min。DAPI避光孵育5min。PBS中洗涤3次，每次5min。防荧光淬灭剂封片。

4、结果与结论：如图2所示，胰岛β细胞系经过不同CS浓度处理后，存活能力明显改善（图2A），流式凋亡实验也证实CS能改善STZ诱导的细胞死亡（图2B）。Edu细胞增殖实验证实随着CS浓度的增加，NIT1细胞增殖能力增加（图2C），胰岛素和胰高血糖素免疫荧光染色各实验组胰岛，发现CS能保护胰岛形态结构，防止STZ导致的胰岛β细胞丢失（图2D）。

实验结果说明，5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐能减少胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖，保护胰岛形态结构。

综上所述，5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐能减少胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖，保护胰岛形态结构，防止胰岛β细胞丢失，增强胰岛分泌胰岛素的功能，显著改善因胰岛β细胞损伤、凋亡导致的胰岛素减少而引起的高血糖，逆转I型糖尿病，为临床提供了一种新的选择。

Claims

1.5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐在制备预防和/或治疗I型糖尿病的药物中的用途；所述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐的结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是增强胰腺分泌胰岛素功能和/或保护胰岛形态结构的药物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是减少胰岛β细胞凋亡和/或促进胰岛β细胞增殖的药物。

4.如权利要求1~3任一项所述的用途，其特征在于，所述药物是以5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液的浓度为1~10mg/L。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液的浓度为5mg/L。

8.如权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐溶液是以5-胆甾烯-3β-醇硫酸酯盐与生理盐水混匀制得。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述溶液还含有助溶剂与有机溶剂；所述助溶剂为表面活性剂，质量分数为1~5%；所述有机溶剂为二甲亚砜，质量分数为1~20%。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20，质量分数为2%；所述二甲亚砜的质量分数为10%。