BR112012001762A2

BR112012001762A2 - composto cl168 representado por uma fórmula estrutural geral i, composto cl168 representado por uma fórmula estrutural geral ii, método de preparação do composto e uso do composto

Info

Publication number: BR112012001762A2
Application number: BR112012001762A
Authority: BR
Inventors: Chen Dagang; Lei Haimin
Original assignee: Chen Dagang
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2020-01-21
Also published as: CN101619089B; EP2460812A1; US20120130067A1; RU2507211C2; JP5542930B2; RU2012106722A; CN101619089A; JP2013500277A; US8853194B2; EP2460812A4; EP2460812B1; WO2011011984A1

Abstract

composto cl168 representado por uma fórmula estrutural geral i, composto cl168 representado por uma fórmula estrutural geral ii, método de preparação do composto e uso do composto são revelados derivados de esterol com fórmula estrutural geral i ou ii, em que r é definido conforme a descrição da invenção. seus métodos de sintetização e uso antitumoral também são revelados. especialmente, o composto da fórmula i, na qual ré o (isto é, o composto cl 168-6), tem o índice terapêutico antitumoral de 49,3. o composto pode ser usado para preparar um medicamento para prevenção ou tratamento de doenças imunológicas e cânceres, tal como câncer de fígado e câncer de pulmão.

Description

COMPOSTO CL168 REPRESENTADO POR UMA FÓRMULA ESTRUTURAL GERAL I, COMPOSTO CL168 REPRESENTADO POR UMA FÓRMULA ESTRUTURAL GERAL II, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO COMPOSTO E USO DO COMPOSTO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a compostos farmacêuticos no campo das ciências química e biológica, particularmente às drogas antitumorais CL168 com fórmula estrutural geral I e II, e suas sínteses e métodos de uso.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

O tumor é uma das principais doenças prejudiciais à saúde humana, e vem em segundo na mortalidade de várias doenças. Um grande número de práticas clínicas provou que, ao matar células tumorais, tratamento quimioterápico e tratamento por radiação simultaneamente tem um efeito danoso significativo nas células normais. Estes tratamentos causam sérios danos ao sistema hematopoiético e função imune dos seres humanos, e levam facilmente a mote do paciente. Todas as células tumorais são dependentes da vascularização, e a angiogênese é uma etapa importante no crescimento e metástase de um tumor. Para ambos os tumores primário e secundário, a angiogênese ocorre uma vez que seu diâmetro de crescimento é maior que 2 mm, e então os tumores crescem rápido e a metástase ocorre. (Folkman J. what is the evidence that tumors are angiogenesis department J Natl Cancer Inst. 1990D82:4-6.).

Na presente, drogas para tratar tumores podem principalmente serem divididas em três tipos: drogas citotóxicas, drogas adjuntas radioterápicas e quimioterápicas, e inibidores de angiogênese. Atualmente, os inibidores de angiogênese são um tipo de drogas antitumorais muito promissoras.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

2/39

Os compostos da presente invenção, chamados CL168, são um tipo de composto com esqueletos estruturais novos, atividades claras e alvos antitumorais específicos, selecionados a partir de modificações estruturais de centenas de produtos naturais com base na seleção de base do modelo CAM (Ribatti D, Vacca A, et al. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Curr Pharm Biotechnol. 2000 Jul;l(l):7382.) e VEGF (Gretten TF,Korangy F, et al. Molecular therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma. Br J Cancer. 2009 Jan 13,-100(1):19-23.). Experimentos f armacológicos mostram que estes compostos têm efeitos significantes antitumorais, em que o CL168-6 tem um índice terapêutico anti tumoral de 4 9,3 e pode ser usado para preparar drogas para a prevenção e tratamentos de cânceres, tais como câncer de fígado, câncer de pulmão, etc., e doenças imunológicas.

Um dos objetivos da presente invenção é fornecer uma rota de sintetização para preparar CL168 conforme mostrado pela fórmula geral I e intermediários desta.

O segundo objetivo da presente invenção é fornecer uma rota de sintetização para preparar CL168 conforme mostrado na fórmula geral II e intermediários desta.

O terceiro objetivo da presente invenção é fornecer aplicações do CL168 de fórmulas gerais I & II e intermediários destas em pesquisas de melhora da imunidade e antitumorais.

3/39

Isto é CL16B-6 quando R representa O. R representa S, NH ou SO₂.

R representa um grupo alquila Ci-js, grupo arila substituído por um grupo doador de elétron ou grupo de retirada de elétron, grupo alquinila Cj-®, grupo alquenila, grupo cicloalquila C₃_₅, c>-_ssubstituído por grupo heterocicloalquila, grupo de ácido graxo €_χ-_21ι, grupo adia aromática, sulfonil,

Os objetivos da presente invenção podem ser alcançados pelos seguintes procedimentos.

O composto CL168 representado pela fórmula estrutural geral I pode ser preparado através de um método incluindo as seguintes etapas:

(1) dissolver colesterol (Composto 2) em um solvente orgânico para produzir acetato de colesterol (Composto 3) reagindo o colesterol com anidrido acético sob a catalise de um catalisador, em certa temperatura;

(2) dissolver o Composto 3 em um solvente orgânico para produzir acetato de 7-bromocolesten-3-ol (Composto 4) reagindo o Composto 3 com reagente de brometo sob a catalise de um catalisador, em certa temperatura;

(3) dissolver o Composto 4 em um solvente orgânico para produzir acetato de 7-dehidrocolesterol-3-ol (Composto 5) através da eliminação da reação com uma base em certa temperatura;

(4) dissolver o Composto 5 em um solvente orgânico para produzir 7-dehidrocolesterol (Composto 6) hidrolisando o Composto 5 com uma base em certa temperatura;

(5) dissolver o Composto 6 em um solvente orgânico para produzir 5α, 8a-cioclobioxigênio-6-colesten-3-ol (Composto 7) através da oxidação do Composto 6 com um oxidante em certa temperatura;

(6) dissolver o Composto 7 em um solvente orgânico para produzir 5a,8a-ciclobioxigênio-6-colesten-3-um (Composto 1, isto é, CL168-6) através da oxidação do Composto 7 com um oxidante em certa temperatura;

As equações de reação nas etapas acima mencionadas (1)-(6) são conforme segue:

Em que a etapa (1) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo...consistindo dos seguintes compostos cada um contendo 2-20 carbonos: um éter, um álcool, um alcano, um hidrocarboneto aromático, uma cetona, um haleto de 15 alquila, um amido, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é a partir de -20°C a 250°C; o catalisador é um ácido protônico, tal como um ácido sulfúrico, ou uma base orgânica, tal como piridina; a razão molar do Composto 2 para o anidrido acético

5/39 é 1: 1-20.

Em que na etapa (2) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo consistindo dos seguintes compostos cada um contendo 1-20 carbonos: um hidrocarboneto aromático, um alcano, um éter, uma cetona, um haleto de alquila, um amido, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é a partir de 10°C a 150°C; o reagente de brometo é bromosuccinimida (NBS), brometo de hidrogênio, ou brometo de acetila; o catalisador é trifenilfosfina ou uma fonte leve com comprimento de onda de 290-800nm; a razão molar do Composto 3 ao reagente de brometo é 1 : 1-10.

Em que na etapa (3) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo consistindo dos seguintes compostos cada um contendo 1-20 carbonos: um hidrocarboneto aromático; um alcano, um éter, uma cetona, um haleto de alquila, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é de 0°C a 150 °C; o catalisador é uma base orgânica, tal como piridina ou trietilamina; a razão molar do Composto 4 para a base orgânica é 1 : 1-10.

Em que na etapa (4) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo consistindo dos seguintes compostos cada um contendo 2-2 0 carbonos: um éter, um álcool, um alcano, um hidrocarboneto aromático, uma cetona, um haleto de alquila, um amido, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é partir de 0°C a 150°C; o catalisador é um ácido protônico com o representante de ácido sulfúrico, ou uma base protônica com o representante de hidróxido de sódio.

Em que na etapa (5) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo consistindo dos seguintes compostos cada um contendo 1-20 carbonos: um hidrocarboneto aromático,

6/39 um alcano, um éter, uma cetona, um haleto de alquila, um amido, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é de 0°C a 150 °C; o catalisador é Eosin Y, trifenilfosfina, ou uma fonte leve com um comprimento de onda de 290-800nm.

Em que na etapa (6) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo consistindo dos seguintes componentes cada um contendo 1-20 carbonos: um hidrocarboneto aromático, um alcano, um éter, uma cetona, um haleto de alquila, um amido, uma nitrila, um éster ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é partir de -20 °C a 100 °C; o ácido sulfúrico ou a solução ácida crômica é o representativo do oxidante.

composto CL168 representado pela fórmula estrutural geral II pode ser preparado através de um método incluindo as seguintes etapas:

(1) dissolver colesterol (Composto 2) em um solvente orgânico para produzir o Composto 3 reagindo o colesterol com um agente doador R (R representa um grupo alquila C₂-₂₅, grupo arila substituído por um grupo doador de elétron ou grupo de retirada de elétron, grupo alquinila C₃.₆, grupo alquenila, grupo cicloalquila C₃__9/ C₃.₉ substituído por grupo heterocicloalquila, grupo de ácido graxo Ci_₂₀, grupo acila aromática, sulfonil, cinamoil, cafeoil, galoil, feruloil, benzoila, ácido amino alifático L, ou ácido amino aromático L) sob a catálise de um catalisador em certa temperatura;

(2) dissolver o Composto 3 em um solvente orgânico para produzir o Composto 4 reagindo o Composto 3 com um regente de brometo sob a catálise de um catalisador, em certa temperatura;

(3) dissolver o Composto 4 em um solvente orgânico para produzir o Composto 5 através da eliminação da reação

7/39 com uma base em certa temperatura;

(4) dissolver o Composto 5 em um solvente orgânico para produzir o Composto com um oxidante em certa

As equações de através da oxidação do composto 5 temperatura;

reação nas etapas acima mencionadas (1)-(4) são conforme segue:

Composto 3

HO

Composto 2

RO

Em

COmPOStO 6 que na etapa selecionado de um cada um contendo (4) (2)^

RO

Br

Composto 4

o solvente orgânico é grupo consistindo dos seguintes compostos

2-20 carbonos: um éter, um alcano, um hidrocarboneto aromático, uma cetona, alquila, um amido, uma nitrila, um éster, destes em partir de tal como piridina;

ou álcool, um um haleto de uma mistura várias proporções de mistura;

-20°C a 250°C; O ácido sulfúrico, a razão molar do é 1 : 1-20;

temperatura é a catalisador é ou uma

Composto

Em que na ' etapa selecionado componentes aromático, um ácido protônico base orgânica, tal como para o anidrido acético o solvente orgânico é a partir de um cada um contendo grupo

1-20 um alcano, um éter alquila, um amido, uma nitrila destes com várias proporções de partir de -10°C a ,150°C; o consistindo os seguintes carbonos: um hidrocarboneto uma cetona, um haleto de um éster, mistura; a reagente ou uma mistura temperatura é de brometo bromosuccinimida (NBS), brometo de hidrogênio, ou brometo de

8/39 acetila; o catalisador é trifenilfosfina ou uma fonte leve com um comprimento de onda de 2 90-800nm; a razão molar do Composto 3 para o reagente de brometo é 1 : 1-10;

Em que na etapa (3) , o solvente orgânico é selecionado de um grupo consistindo dos seguintes compostos cada um contendo 1-20 carbonos: um hidrocarboneto aromático, um alcano, um éter, uma cetona, um haleto de alquila, um amido, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é a partir de 0°C a 150°C; o catalisador é uma base orgânica com os representantes de piridina e trietilamina; a razão molar do Composto 4 para a base orgânica é 1 : 1-10;

Em que na etapa (4) , o solvente orgânico é selecionado do grupo consistindo dos seguintes componentes cada um contendo 1-20 carbonos: um hidrocarboneto aromático, um alcano, um éter, uma cetona, um haleto de alquila, um amido, uma nitrila, um éster, ou uma mistura destes com várias proporções de mistura; a temperatura é a partir de 0°C a 150°C; o catalisador é Eosin Y, trifenilfosfina, ou uma fonte leve com um comprimento de onda de 290-800nm;

CL168-6 acima obtido (5a, 8a-ciclobioxigênio-6colesten-3-um) tem um efeito inibidor significante na proliferação da célula de hepatoma humana HepG2 e a célula de câncer de pulmão humano A549 in vitro;

CL168-6 obtido acima (5a, 8a-ciclobioxigênio-6colesten-3-um) tem uma atividade inibidora significante na angiogênese tumoral;

CL168-6 obtido acima (5a, 8a-ciclobioxigênio-6colesten-3-um) pode inibir efetivamente o crescimento do tumor S180, prolongar o tempo de sobrevivência dos ratos portadores do tumor, e aumentar o índice do baço dos ratos;

O CL168-6 obtido acima (5a, 8a-ciclobioxigênio-6colesten-3-um) mostra baixa toxicidade in vivo, e o LD50 dos

9/39 ratos é 1479 mg/kg;

O CL168-6 obtido acima (5a, 8a-ciclobioxigênio-6colesten-3-um) pode ser feito nas formas de dosagem oral, injeção e administração externa, e usado para prevenção e tratamento do tumor.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

	A	Figura	1 ilustra	o efeito	do	CL168-6 nos vasos
CAM.
	A	figura	2 mostra	curvas	de	sobrevivência dos
ratos.
	A	Figura	3 mostra	tumores	dos	ratos de vários
grupos	de dosagem.
	A	Figura	4 mostra os	resultados	detectados no VEGF

sanguíneo ocular do rato.

A Figura 5 mostra os resultados detectados em 24 horas da Caspase-3, 8, 9.

A Figura 6 mostra os resultados detectados em 48 horas da Caspase-3, 8, 9.

	A	Figura	7 ilustra uma	curva	padrão de proteína.
	A	Figura	8 mostra o	nível	de expressão do p53
(n=3).	A	Figura	9 mostra o	nível	de expressão do bcl-2
(n=3) .	A	Figura	10 mostra o	nível	de expressão do VEGF
(n=3).	A	Figura	11 mostra o	nível	de expressão do P21
(n=3) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Sem limitação, alguns exemplos da presente invenção serão descritos a título de ilustração aqui.

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 1: SÍNTESE DO ACETATO DE COLESTEROL (COMPOSTO 3)

Colesterol (11,58 g, 30,00 mmol), tolueno (60ml),

10/39 anidrido acético (5,67ml, 60,00mmol) e piridina (ml, 12,41 mmol) foram colocados em um frasco de reação de 100 ml, agitados magneticamente, aquecidos a 114 °C, refluídos e reagidos até que não sobre nenhum material bruto. O líquido de reação foi resfriado, lavado duas vezes com 2 vezes a quantidade da solução de ácido clorídrico (0,10%), lavado duas vezes com 2 vezes a quantidade de solução de cloreto de sódio saturado, lavado duas vezes com 2 vezes a quantidade de água destilada, seco por sulfato de sódio anidro, então submetido à destilação a vácuo para recuperar o tolueno, finalmente um sólido branco (12,84 g) foi obtido. O rendimento é 100,0%, e os espectros de hidrogênio e carbono NMR do Composto 3 são conforme segue:

¹HNMR(500MHZ,CDC1₃) : 0,68 (s, 3H, H18),0,86(d,3H,J=2HZ,H-26),0,87(d,3H,J=2HZ,H27),0,91(d,3H,J=4.4HZ,H-21),1,02(S,3H,H-19),2,03(S,3H,H2'),2,32(dd,2H,H-4),4,60(m,1H,H-3),5,39(t,1H,H-6) ) ¹³CNMR (5 00MHZ, CDC1₃) :36,6(C-1) ,31,9(C-2) ,74,0(C3),39,7(C-4),140,0(C-5),122,7(C-6),28,2(C-7),31,8(C8),50,0(C-9),38,1(C-10),21,0(C-ll),37,0(C-12),42,3(C13),56,1(C-14),24,3(C-15),27,8(C-16),56,7(C-17),11,9(C18) ,19,3(C-19) ,35,8(C-20) ,18,7(C-21) ,36,2(C-22) ,23,8 (C23),39,5(C-24),28,0(C-25),22,6(C-26),22,8(C-27),170,6(C-l'), 21,5(C-2').

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 2: SÍNTESE DO ACETATO DE 7DEHIDROCOLESTEN-3-OL (COMPOSTO 5)

Acetato de colesterol (4,28g, 10,00mmol), tetracloreto de carbono (30ml) e NBS (l,78g, 10,00 mmol) foram colocados em um frasco de reação de 50ml, exposto a luz fluorescente, refluídos em 74 °C e reagidos até que não restasse nenhum material bruto. O líquido de reação foi resfriado, submetido a uma filtração por bomba de ar, lavado

11/39 com uma pequena quantidade de tetracloreto de carbono, submetido à destilação a vácuo para recuperar o tetracloreto de carbono, finalmente um líquido similar a óleo amarelo alaranjado foi obtido.

líquido similar a óleo, amarelo alaranjado foi adicionado a tolueno (50ml), e 2,6-dimetilpiridina (5ml), colocado em um frasco de reação de 100ml, agitado magneticamente, aquecido a 114°C, refluído e reagido até que não restasse nenhum material bruto. 0 líquido de reação foi resfriado, lavado duas vezes com 2 vezes a quantidade da solução de acido clorídrico (0,10%), lavado duas vezes com 2 vezes a quantidade de solução de cloreto de sódio saturado, lavado duas vezes com 2 vezes a quantidade de água destilada, seco por sulfato de sódio anidro, então submetido à destilação a vácuo para recuperar o tolueno, dissolvido em álcool etílico absoluto, submetido à cristalização repetida para obter 3,54g de um sólido branco, com um rendimento de 85,5%. Os espectros de hidrogênio e carbono do Composto 5 são conforme segue:

¹HNMR(500MHZ, CDC1₃) : 0,62 (s, 3H, H-18) , 0,87(d,3H, J=2HZ,H-26) , 0,87(d,3H,J=2HZ,H-27), 0,94(d,3H,J=4,4HZ,H-21) , 0,99(s,3H,H-19) , 2,04(s,3H, H-2' ) , 2,38(m,1H,H-4a), 2,50(m, lH,H-4b) 4,70(m,lH,H-3) , 5,39(d,1H,J=2HZ,H-7), 5,59(d,lH, J=2HZ,H-6) ¹³CNMR (500MHZ, CDC1₃) :36,6 (C-l) , 28,1(0-2), 72,8(03), 37,9(0-4), 141,6(0-5), 120,2(0-6), 116,2(C-7),138,5(C-8), 46,0(0-9), 39,5(0-10), 21,5(0-11), 37,1(0-12), 42,9(0-13), 55,4(0-14), 23,9(0-15), 28,1(0-16), 55,8(0-17), 11,8(0-18), 18,4(0-19), 36,2(0-20), 16,2(0-21), 36,1(0-22), 23,0(0-23), 39,1(0-24), 28,1(0-25), 22,6(0-26), 22,8(0-27), 170,6(0-1'), 21,0(0-2').

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 3: SÍNTESE DE 7-DEHIDROCOLESTEROL (COMPOSTO 6)

12/39

Acetato de 7-dehidrocolesten-3-ol (Composto 5) (2,07g, 5mmol), etanol (50ml) e solução de hidróxido de sódio (10%, 50ml) foram colocados em um frasco de reação de 250ml, reagidos em 80°C até que não restasse nenhum material bruto. O líquido de reação foi submetido à destilação a vácuo para recuperar o etanol remanescente, extraído uma vez com uma vez a quantidade do acetato etílico, lavado com água destilada a neutra, e seco com sulfato de sódio anidro. Após recuperar o acetato de etila, o sólido resultante foi submetido à cristalização repetida com etanol para obter l,85g de 5,7dieno colesterol, com um rendimento de 96,4%. O espectro de hidrogênio NMR do Composto 6 é conforme segue:

¹HNMR (5 00MHZ, CDCI3) : 0,62(s,3H,H-18) , 0,86(d,3H, J=2HZ,H-26), 0,88 (d,3H,J=2HZ,H-27) , 0,94(s,3H,H-19) , 1,22(d,3H,J=12HZ,H-21) , 2,33(dd,1H,H-4a) , 2,49(dd,1H,H-4b) , 3,66(m,lH,H-3), 4,03(m,1H,3-OH), 5,39(m,1H,H-7), 5,68(dd,lH, H-6) .

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 4: SÍNTESE DO 5A, 8A-CICLOBIOXIGÊNIO-6COLESTEN-3-OL (COMPOSTO 7)

5,7-dieno colesterol (l,15g, cerca de 3 mmol), Eosin Y (200mg, cerca de 0,31mmol, dissolvidos em álcool) e etanol absoluto (100 ml, 10,00mmol) foram colocados em um frasco de reação de 250ml. Após difundir ar no líquido de reação, o último foi exposto à luz fluorescente, reagido ate que não restasse nenhum material bruto, destilado para recuperar o etanol absoluto até um certo volume ser alcançado, mantido para cristalização para obter 0,94g de 5a, 8a-ciclobioxigênio-6-colesten-3-ol, com um rendimento de 75,3%.

¹HNMR(500MHZ,CDCI3) : 0,80(s,3H,H-18) , 0,85(d,3H,J=2HZ,H-26), 0,88(d,3H,J=2HZ,H-27), 0,88(s,3H,H19), 0,91(d,3H,J=12HZ,H-21), 3,97(m,1H,H-3),

13/39

6,23(d,1H,J=7HZ,Η-7), 6,51(d,1H,J=7HZ,Η-6) ;

¹³CNMR (500MHZ , CDCI3) : 36,0(0-1), 28,3(0-2), 66,5(03), 39,4(0-4), 82,2(0-5), 135,4(0-6), 130,8(0-7), 79,5(0-8), 51,1(0-9), 35,2(0-10), 20,6(011), 34,7 (C-12) , 44,8 (C-13 ) ,

52,0(0-14), 23,4(0-15), 30,1(0-16), 56,4(0-17), 12,7(0-18), 18,2(0-19), 36,9(0-20), 19,0(0-21), 36,9(0-22), 23,8(0-23), 37,0(0-24), 28,0(0-25), 22,6(0-26), 22,8(0-27).

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 5: SÍNTESE DE 5A,8A-CICL0BI0XIGÊNI0-6C0LESTEN-3-UM (COMPOSTO 1, CL168-6)

5α, 8a-ciclobioxigênio-6-colesten-3-ol (Composto 7) (0,62g, cerca de 1,5 mmol) foi dissolvido em acetona (50ml) em um frasco de reação de 100ml, adicionado lentamente por gotas de solução de ácido crômico (l,6mmol) em banho de água e gelo, reagido até que não restasse nenhum material bruto. 0 líquido de reação foi despejado em uma mistura de água e gelo (600ml), agitado, mantido por uma noite inteira, e então submetido à filtração por bomba de ar. 0 bolo de filtro foi submetido à cristalização repetida com etanol para obter 0,62g de 5a, 8a-ciclobioxigênio-6-colesten-3-um, com um rendimento de 96,1%.

¹HNMR (5 00MHZ, CDC1₃) : 0,85 (s , 3H, H-19) ,

0,88(d,3H,J=2HZ,H-26), 0,89(d,3H,J=2HZ,H-27),

0,92(d,3H,J=6.5HZ,H-21), 1,07(s,3H,H-18), 3,97(m,1H,H-3),

6,29(d,1H,J=8,5HZ,H-7), 6,59(d,1H,J=8,5HZ,H-6) ;

-25 ¹³CNMR(500MHZ,CDCl₃) : 36,7(0-1), 35,3(0-2), 207,0 (03), 43,6(0-4), 83,4(0-5), 134,2(0-6), 131,6(0-7), 80,0(0-8), 51,1(0-9), 39,4(0-10), 20,5(0-11), 37,3(0-12), 44,9(0-13),

51,4(0-14), 23,8(0-15), 28,2(0-16), 56,4(0-17), 12,8(0-18),

18,5(0-19), 35,2(0-20), 17,5(0-21), 35,9(0-22), 23,5(0-23),

39,3(0-24), 28,0(0-25), 22,5(0-26), 22,8(0-27).

Exemplo de Resultado 1: Avaliação do efeito do CL168-6 na proliferação de uma célula de hepatoma humano

14/39

HepG2, uma célula de câncer de pulmão humano A549 e um célula de fibroblastos humanos imortalizadas NIH3T3 através do teste MTT

1. Materiais

1.1 Cepas de Tumor

As células de hepatoma humano HepG2 e as células de câncer de pulmão humano A549 foram cultivadas pelo Instituto de Doenças Infecciosas PLA para presumir a viabilidade, enquanto as células de fibroblastos humanas imortalizadas NIH3T3 foram trazidas da Academia de Ciências Médicas Militares.

1.2 Drogas Experimentais

CL168-6, preparado por nós, que tinham uma pureza igual ou maior que 98% avaliada pela Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) e, portanto cumpre os requisitos experimentais. 0 pó do dito CL168-6, que foi previamente selado e armazenado a 4°C, foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) para obter uma solução de estoque de 1 ml/mg para uso posterior.

2. Método

2.1 Cultivo de Célula

As células de hepatoma humano HepG2, células de câncer de pulmão humano A549 e NIH3T3 foram recuperadas, e sub cultivadas em frascos de cultura. Uma vez que as células crescem para a fase logarítmica, o experimento pode ser iniciado. As células foram digeridas através de tripsina filtrada em alta pressão para preparar uma suspensão contendo célula, tingidas por 3 minutos com 0,4% de azul de tripano, e então contadas com contador de células sanguíneas (células vivas não foram coloridas, enquanto as células mortas foram tingidas de azul). As porcentagens de células vivas avaliadas através de exclusão de azul de tripano foram todas acima de 98%.

15/39

2.2 Experimentos na Inibição da Multiplicação de Células

Os três tipos de células na fase logarítmica foram semeados em placas de fonte 96 com uma densidade de lxl0⁴/ml (200pL/fonte) , e então cultivadas por 24 horas a 37°C em 5% de caixa cultivável de CO₂. O meio de cultura foi aspirado e descartado. 200 ul de soluções CL168-6 de diferente concentração (com uma concentração final respectivamente de 10 pg, 5 pg, 2,5 pg e 0 pg/ml preparadas com um meio de cultura de 4% de soro bovino em DMEM) foram adicionadas, em que para cada concentração havia 6 fontes paralelas. Após o cultivo por 24 horas e 4 8 horas, 10 0 pl de flutuante foram cuidadosamente aspirados e descartados respectivamente. MTS (20 pl/poço) foram adicionados e misturados igualmente. A mistura foi cultivada por 1 hora a 37 °C em 5% de caixa cultivável de CO₂. A absorção em 492 nm foi determinada através de teste de imunoabsorvência de Enzima ligada quantitativa (ELISA). O experimento foi repetido por três vezes. A taxa de inibição de crescimento foi calculada conforme segue.

Taxa de inibição do crescimento (%) =[(valor médio OD do grupo de controle - valor médio OD do grupo de tratamento) / valor médio OD do grupo de controle} x 100%.

3. Resultados

CL168-6 tem um efeito de inibição significante na proliferação da célula de hepatoma humano HepG2 e a célula de câncer de pulmão humano A549 cultivada in vitro, e mostra dependência da dose; os resultados relevantes dão listados na Tabela 1-1. Quando tratado pela droga com uma concentração de 2,5 pg/ml por 24 horas, a taxa de inibição é 52,85% e 48,69% respectivamente para células HepG2 e células A549. A taxa de inibição irá aumentar com o aumento da concentração da droga; quando a concentração da droga é 10 pg/ml, a taxa de inibição

16/39 para os dois tipos de célula acima é respectivamente acima de 64,39% e 62,40%; quando após 4 8 horas e a dosagem é 2,5 pg/ml, a taxa de inibição para as células HepG2 e A549 é respectivamente acima de 59,83% e 51,91%; quando a concentração é 10 pg/ml, a taxa de HepG2 e A54 9 é respectivamente 73,67% e 69,67%. Comparada à situação das células NIH3T3, a inibição do CL168-6 a HepG2 e A54 9 mostra diferença significante nos grupos com diferente concentração e tempo de tratamento (p<0,05). Os resultados experimentais mostram que o efeito de inibição do CL168-6 nas células tem uma boa seletividade, e o efeito é positivo correlacionado a concentração de droga e tempo de medicação.

Tabela 1-1 Efeito de Inibição do CL168-6 na

multiplicação dos 3 tipos de cepas celulares
Concentração (pg/ml)	Taxa de inibição (%) 24h	Taxa de Inibição (%) 48h
HepG2	A54 9	NIH3T3	HepG2	A54 9	NIH3T3
0 2,5	52,85*	48,69*	3,87	59,83*	51,91*	0,75
5,0	58,51*	55,78*	5,69	69,08*	59,75*	1,97
10,0	64,39*	62,40*	8,45	73,67*	6 9,3 7*	5,37

Notas: * P< 0,05 vs 0,0qg/ml

4. Conclusão

CL168-6 pode inibir significativamente a multiplicação de células de hepatoma humano HepG2 e células de câncer de pulmão·humano A549. Exemplo de Resultado 2: Avaliação do efeito de

CL168-6 na angiogênese tumoral através do teste CAM

1. Materiais

1.1 Animais

Ovos embrionários russo-romanos (cada um pesando 50-60g, obtidos do Centro Experimental Embrionário da Universidade de Agricultura da China).

17/39

1.2 Drogas Experimentais

O CL168-6, preparado por nós, que tem uma pureza igual ou maior que 98% avaliada através de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) e, portanto atendem aos requisitos experimentais. O pó do dito CL168-6 foi selado e armazenada a 4°C.

Suramin, trazido da companhia SIGMA.

2. Método

2.1 Método de Preparação das Amostras a serem Avaliadas

Uma esponja gelatinosa estéril, previamente feita em disco com diâmetro de 5 mm feito por um furador, foi usada como portador da amostra. O CL168-6 foi dissolvido em 70% de etanol para preparar um solução com uma concentração de 2mg/5ml. Havia 3 grupos de dosagem, em que o (grupo de baixa dosagem de 5μ1, com um volume de dose de 20pl/embrião) , 10μ1 (grupo de dose média, com um volume de dose de 4pg/embrião) , e 20μ1 (grupo de alta dosagem, com um volume de dose de δμΐ/embrião) da solução foram adicionados respectivamente nos pedaços da esponja gelatinosa através de uma transferência líquida quantitativa. Os pedaços de esponja foram secos no ambiente estéril.

2.2 Incubação Embrionária e Processo para Remover a Câmara de Ar do ovo Embrião

Um ovo esterilizado foi colocado em uma incubadora a 37 °C com a sua câmara de ar para cima. No 7° dia, o embrião foi posicionado em uma bancada super limpa e esterilizada com etanol, e então foi perfurado por uma broca dentária para formar um pequeno buraco no topo do embrião. A casca do ovo e a membrana da casca em torno do buraco foram cuidadosamente removidas para formar uma abertura de cerca de 1,2 cm X 1,2 cm; após determinar um local de adição de amostra, a membrana da câmara de ar foi cuidadosamente furada no lugar de

18/39 separação entre a câmara e a gema por uma agulha de seringa; através do buraco perfurado 1-2 gotas de água esterilizadas foram injetadas, o que tornou a membrana da câmara e a membrana CAM separadas; após remover delicadamente a camada superior da membrana da câmara com um fórceps, a membrana CAM na camada mais baixa foi exposta.

2.3 Processo de Adição da Amostra

Um suporte contendo droga foi colocado na área de junção da membrana CAM e a membrana do saco vitelino, em um lugar em que os vasos fossem menores, e então selado com uma fita adesiva transparente esterilizada para continuar a incubação por 72 horas.

2.4 Medições dos Vasos

Após a incubação, a fita adesiva transparente parada no topo da câmara de ar foi delicadamente removida por fórceps; uma mistura de metanol/acetona (1:1, l-2ml) foi delicadamente adicionada; a temperatura ambiente foi mantida constante por 10 minutos. Então, a membrana CAM foi cuidadosamente retirada e colocada em uma lâmina de vidro para observação e tirar fotos. 0 efeito do composto na angiogênese foi avaliado através da contagem dos números de vasos sanguíneos grandes, médios e pequenos irradiados pelo suporte.

2.5 Tratamento Estatístico

Todos os dados foram estatisticamente analisados pelo pacote de software SPSS 11.0; a comparação dos dados de contagem verificados pelo teste x2. Considerando p<0,05, todos têm significância estatística.

3. Resultados

A Figura 1 ilustra o efeito do CL168-6 nos vasos CAM e o controle em branco.

Os números de vasos minutos dos três grupos de dose de CL168-6 são comparados com aquele do grupo em branco

19/39 respectivamente; para todos os três grupos diferenças significantes são encontradas, e a dependência de dose é mostrada. Os resultados são listados na Tabela 2-1, que indicam que o composto tem um certo efeito de inibição no crescimento da angiogênese.

Tabela 2-1 Tabela Estatística sobre o Efeito do CL168-6 nos vasos CAM com análise dos Vasos [(número de vasos)+S]%

Grupos	Número de Embriões	Vasos Grandes	Vasos Médios	Vasos Pequenos
CL168-6 (2ug/embrião)	20	3,5+1,8	13,2±3,7	8,8±2,3**
CL168-6 (4ug/embrião)	20	3,6+1,9	11,2±3,2	6,5±2,5**
CL168-6 (8ug/embrião)	20	2,5±2,0	12,6+5,6	4,0±2,8**
Suramin (4ug/embrião)	20	3,6±2,0	12,4+3,8	6,1±3,0**
Grupo de controle em branco	20	4,7±3,1	18,1±5,5	11,6±2,2

Notas: comparado com o grupo de controle em branco, *P<0,05, **P<0,01

4. Conclusão

O CL168-6 tem um efeito de inibição significante na angiogênese tumoral, e o dito efeito é dependente da quantidade de droga.

Exemplo de Resultado 3: Efeito Antitumoral do CL168-6 nos ratos portadores de tumor ascítico S180, H22

1. Materiais

1.1 Animais Experimentais e Cepas de Tumor

Ratos Balb/C fêmeas saudáveis, cada um pesando 1822g, foram trazidos do Centro de Animal Experimental da Academia de Ciências Médica Militar (Certificação n° SCXK (Militar) 2007-004). As células de hepatoma humano H22 foram cultivadas pelo nosso laboratório para presumir a

20/39 viabilidade; células de sarcoma do rato S180 foram apresentadas pelo Instituto de Medicina Chinês do Hospital 302; ratos portadores de tumores ascíticos S180, H22 foram sub cultivados uma vez a cada 7 dias.

1.2 Drogas Experimentais

O CL168-6, preparado por nós, que tinham uma pureza igual ou maior que 98% avaliada pela Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) e, portanto cumpriram os requisitos experimentais. 0 pó do dito CL168-6 foi selado e armazenado a 4°C.

Ciclofosfamida para Injeção: fabricada por Shanxi Pude Pharmaceutical Co., Ltd.

2. Processo

2.1 Estabelecimento de Modelos Animais

Ratos ascíticos S180 e H22 que foram vacinados 7 dias foram sacrificados pela cervical, cujos ascíticos foram obtidos sob condições estéreis respectivamente; os ascíticos obtidos foram lavados duas vezes com o meio de cultura RPMI1640, e preparados para uma suspensão de 2xl0₇/ml em soro fisiológico estéril. A suspensão da célula S180 foi inoculada subcultaneamente na axila direita de 40 ratos (0,1 ml/rato) para produzir modelos de tumores sólidos; enquanto a suspensão da célula H22 foi inoculada nas cavidades animais de 40 ratos (0,2 ml/rato) por meios condicionais sob condições estéreis para produzir modelo de tumores ascíticos.

2.2 Grupos Experimentais ratos foram aleatoriamente divididos em 9 grupos de 3 tipos, em que o primeiro tipo de grupo era um grupo de controle normal, o segundo tipo de grupo era grupo de tumor sólido S180 incluindo um grupo de controle de (ciclofosfamida) positiva, um grupo de controle negativo, um grupo de baixa dosagem e um grupo de alta dosagem, e o terceiro tipo de grupo eram grupos ascíticos H22 incluindo um

21/39 grupo de controle (ciclofosfamida) positivo, um grupo de controle negativo, um grupo de baixa dosagem e um grupo de alta dosagem. Havia 10 ratos em cada grupo. 0 experimento foi repetido por três vezes.

2.3 Administração da Droga

O CL168-6 foi preparado em emulsões em óleo de milho. O grupo de baixa dosagem foi injetado com a dose de 16mg/kg, o grupo de alta dosagem foi injetado com a dose de 32mg/kg, o grupo de controle negativo foi injetado com o mesmo volume de óleo de milho, e o grupo de controle positivo foi injetado com injeção de solução de ciclofosfamida com a dose de 0,02g/(Kg. d) . O volume de injeção usada foi 0,1 ml/rato e a injeção foi dada como uma injeção intraperitoneal em dias alternados por 15 dias. Durante os 15 dias, atividade gerais, pêlos, fezes, etc. dos ratos foram observados diariamente. 24 horas após a última administração, os ratos

que foram	inoculados subcultaneamente	com	S180	foram
sacrificados	por	cervical, cujos tumores,	timo	e baço	foram
retirados.	Após	a última administração,	os	ratos	foram
inoculados	nas	cavidades abdominais	com	H22	foram

convencionalmente criados continuamente, pesados e observados o tempo de sobrevivência diariamente até que todos os ratos no grupo negativo estivessem mortos.

2.4 Cálculo da taxa de Sobrevivência Estendida dos Ratos horas após a inoculação dos ascíticos, o peso e a quantidade da circunferência abdominal dos ratos nos grupos de modelos ascíticos foram medidos. A administração de droga e a criação foram continuadas de acordo com os diferentes grupos, o peso e a circunferência abdominal foram medidos diariamente até um dia antes da morte. O aumento de peso (g) e o aumento da circunferência abdominal (cm) foram calculados. O experimento começou no dia da inoculação do

22/39 tumor e terminou no dia em que todos os ratos no grupo negativo estavam mortos; o tempo das mortes foi gravado, e a taxa de sobrevivência estendida foi calculada.

Taxa de Sobrevivência Estendida (5) = [(média dos dias de sobrevivência do grupo de tratamento - média dos dias de sobrevivência do grupo de controle negativo) / média dos dias de sobrevivência do grupo de controle] x 100%.

2.5 Cálculo do índice do Baço e índice do Fígado

Após finalizar a administração em todos os ratos no grupo de tumor sólido, os ratos foram sacrificados e seus baços e fígados foram pesados em uma balança eletrônica. 0 índice de baço foi equivalente ao peso do baço (mg) dos ratos em cada grupo divido pelo peso dos ratos, enquanto o índice de fígado foi equivalente ao peso do fígado (lOOg) dividido pelo peso (g) dos ratos.

2.6 Cálculo da Taxa de Inibição do Tumor

No dia seguinte após a retirada da droga, os ratos no grupo de controle negativo do tumor sólido foram pesados e sacrificados por cervical, em que o soro foi coletado por hemorragia ocular para uso posterior em experimentos subsequentes. Os tecidos do tumor foram dissecados e pesados por uma balança eletrônica. A taxa de inibição do tumor foi calculada conforme segue.

taxa de Inibição do Tumor (%) = [(médio do peso do tumor do grupo de controle negativo - média do peso do tumor do grupo de tratamento) / média do peso do tumor do grupo de controle] x 100%.

2.7 Tratamento Estatístico

Todos os dados foram estatisticamente analisados por um pacote de software SPSS 11.0; a comparação dos dados de contagem foi verificada pelo teste x₂. Considerando P< 0,05, todos têm significante estatística.

3. Resultados Experimentais

23/39

3.1 Mudança de Peso, circunferência abdominal e tempo de sobrevivência dos ratos nos grupos

Conforme mostrado na Tabela 3-1, os ratos nos grupos de dosagem baixa e alta de CL168-6 tiveram um maior tempo de sobrevivência que o grupo de controle negativo, e as taxas de sobrevivência estendidas relevantes foram 37,11% e 51,55%, respectivamente. Os ratos no grupo de tratamento tiveram um menor aumento da circunferência abdominal que o grupo negativo, e o crescimento normal daqueles ratos tratados não foi afetado pelo dito aumento. O peso dos ratos no grupo injetado com ciclofosfamida aumentou lentamente, somente teve um aumento de 3,42g, enquanto os ratos no grupo normal tiveram um aumento de peso de 6,72g. A Figura 2 ilustra um quadro estatístico no tempo de sobrevivência dos ratos ascíticos H22.

Tabela 3-1 Efeito do CL168-6 no peso, circunferência abdominal e tempo de sobrevivência dos ratos em vários grupos

Grupos	Aumento de peso (g)	Aumento da circunferência abdominal (cm)	Tempo de sobrevivência (dia)	Taxa de sobrevivência estendida (%)
Grupo de controle normal	6,76+1,56	0,58±0,09	-	-
Grupo de controle negativo	4,85±1,21 ®	3,17±0,33®	9,7+2,7	-
grupo de ciclofos -famida	3,42 + 1,67 @®	2,30±0,66@@	15,3±1,06®	57,73
Grupo de baixa dosagem de CL168-6	7,16+1,39 ®	2,84 + 0,34® (3)	13,3±1,77©	37,11
Grupo de alta dosagem de CL168-6	5,05±l,88 ®	2,32 + 0,71@@	14,7 + 1,41®	51,55

Notas: 1. Comparado com o grupo de controle normal:

®P< 0,05, ®P< 0,01;

2. Comparado com o grupo de controle negativo:

24/39 @P< 0,05, ®P< 0,01.

3.2 Mudança do índice do fígado e índice do baço dos ratos em vários grupos

Conforme mostrado na Tabela 3-2, ambos os índices de fígado e o índice do baço dos ratos ascíticos no grupo ciclofosfamida foram respectivamente mais baixos que aquele dos ratos no grupo de controle negativo, portanto tiveram estatística significante. Enquanto todos os índices de CL1686 dos grupos de dosagem alta e baixa foram maiores que aqueles do grupo de controle negativo.

Tabela 3-2 Efeito do CL168-6 no índice de fígado e no índice de baço dos ratos ascíticos (x±s)

	índice do	índice do Baço
Grupos	Fígado (100g/g)	(mg/g)
Grupo de controle em	4,04±0,47	3,45 + 0,58
branco
Grupo de Controle	4,32±0,14	3,84+0,56
Negativo
	3,26 + 0,27®®	2,45±0,34®®
Grupo de ciclofosfamida
Grupo de baixa dosagem	4,9±0,24®®	6,53±1,29@@
de CL168-6
Grupo de alta dosagem de	5,19±0,64®®	5,76 + 0,96@®
CL168-6

Notas: 1. Comparado com o grupo de controle normal:

®P< 0,05 , _®P< 0,01;

2. Comparado com o grupo de controle negativo:

@P< 0,05, @P< 0,01.

3.3 Atividade anticancerígena do CL168-6 in vivo

CL168-6 não teve efeito no aumento de peso em rato de sarcoma S180, enquanto o aumento de peso dos ratos no grupo de controle positivo foi um pouco menor, as taxas de inibição dos ratos de sarcoma S180 portadores de tumor no

25/39 grupo de dosagem baixa e alta foram de 44,33% e 54,58% respectivamente; e comparadas com o grupo de controle negativo, o grupo de alta dosagem teve significância estatística. Os resultados são mostrados na Tabela 3-3. Os corpos de tumor dos ratos em todos os grupos foram ilustrados na Figure 3.

Tabela 3-3 Efeito de Inibição do CL168-6 no sarcoma S180 dos ratos (x±s)

Grupos	Aumento de peso (g)	Peso do tumor (g)	Taxa de Inibição do Tumor (%)
Grupo de controle em branco	6,76±1,56	—	—
Grupo de controle negativo	6,92±1,23	1,385±0,440	—
Grupo de ciclofosfamida	4,76±1,01®(3)	0,518±0,231®	62,63%
Grupo de baixa dosagem CL168-6	6,71+1,22	0,771±0,407	44,33%
Grupo de alta dosagem CL168-6	6,00±l,11	0,629±0,133@	54,58%

Notas: 1. Comparado com o grupo de controle normal:

®P< 0,05, ©P< 0,01;

2. Comparado com o grupo de controle negativo: @P< 0,05, ©P< 0,01.

3.4 Mudanças nos índices de fígado e baço dos ratos S180 nos grupos

Conforme -mostrado na Tabela 3-4, os índices de fígado e baço dos ratos S180 no grupo de ciclofosfamida são mais baixos que aqueles no grupo negativo, e, portanto tem significância estatística. Enquanto os índices de baço dos ratos nos grupos de baixa e alta dosagem de CL168-6 são mais altos que aquele dos ratos no grupo negativo, e há diferença significante entre eles; no entanto, não há diferença significativa entre os índices de fígado relevantes.

26/39

Tabela 3-4 Efeito do CL168-6 no índice de baço e no índice de fígado dos ratos S180 (x±s)
Grupos	índice do fígado (100g/g)	índice do Baço (mg/g)
	Grupo de controle	4,04±0,47	3,45±0,58
	em branco
	Grupo de controle negativo	4,21±0,45	3,83±0,63
	Grupo ciclofosfamida 3,09 + 0,31®©	2,76±0,64 ®@
	Grupo de baixa dosagem de CL168-6	4,45±0,19	5,32±0,68 @@
	Grupo de alta dosagem de CL168-6	4,38±0,13	5,34±0,73 (2)@
Notas: 1. Comparado com	o grupo	de controle normal:
©P<	0,05, @P< 0,01;
2 .	Comparado com o	grupo de	controle negativo

@P< 0,05 , @P< 0,01.

4. Conclusão

4.1 0 CL168-6 pode inibir significativamente o crescimento do sarcoma do rato S180.

4.2 0 CL168-6 pode melhorar o índice do baço de um rato portador de tumor.

4.3 0 CL168-6 pode estender o tempo de sobrevivência de um rato portador de tumor.

4.4 O CL168-6 pode dissipar os ascíticos ou atrasar a geração de ascíticos em um rato H22.

Exemplo de Resultado 4: Pesquisa no mecanismo antitumoral do CL168-6

Tem sido um tópico importante na pesquisa de tratamento do tumor para estudar os mecanismos da apoptose da célula tumoral e transdução de sinal, seletivamente bloqueia as vias de sinalização das células tumorais, e destrói seus mecanismos de auto controle regulatório do crescimento. P53, Bcl-2, P21, VEGF são moléculas cruciais no crescimento ou

27/39 apoptose das células tumorais. O presente experimento estudado de mecanismo antitumoral CL168-6 no nível molecular.

I. Materiais Experimentais (Para os detalhes, verifique os Exemplos de Resultado 1 e 3)

II. Processo Experimental

1. Detectar VEGF no soro ocular do rato (Para os detalhes, verifique os Exemplos de Resultado 1 e 3)

Antes de retirar os tumores, foi coletado sangue através de hemorragia ocular dos ratos nos quatro grupos, isto é, o grupo de controle negativo, o grupo de controle CTX positivo, o grupo de alta dosagem (32 mg/kg) e o grupo de baixa dosagem (16 mg/kg).

1.1 Preparação de reagentes, amostras e padrões;

1.2 Adicionar as amostras preparadas e padrões, e reagir por 90 minutos a 37 °C;

1.3 Lavar a placa duas vezes, adicionando solução de funcionamento do anticorpo biotinilado, e reagir por 60 minutos a 37 °C;

1.4 Lavar a placa por três vezes, adicionar solução de funcionamento ABC, e reagir por 3 0 minutos a 37 °C;

1.5 Lavar a placa por cinco minutos, adicionando líquido de cor TMB, e reagir no escuro por 15 minutos a 37 °C;

1.6 Adicionar solução de parada TMB, e medir o valor OD em 450nm.

2. Determinação de atividade da Caspase 3, 8, 9 2,0pg/ml de CL168-6 trabalhado em células HepG2 por horas e 48 horas.

2.1 Coletar amostras

2.1.1 Células HepG2 foram digeridas por tripsina no meio de cultura celular. A mistura resultante (600g) foi centrifugada por 5 minutos a 4°C para coletar as células. O superflutuante foi cuidadosamente aspirado e descartado. As sobras foram lavadas uma vez com PBS, adicionadas a lisado

28/39 (100 μΐ / 2χ10⁶ células) ; e então, após resuspender a precipitação, gelo picado por 15 minutos.

2.1.2 A mistura resultante (16000g) foi centrifugada a 4 °C por 15 minutos.

2.1.3 O super flutuante foi transferido em um tubo de centrifugação que foi pré-resfriado por banho em gelo.

2.2 Detecção de atividade de Caspase3

2.2.1 Retirar pNA e uma quantidade adequada de AcDEVD-PNA(2mM), colocados no banho de gelo para uso posterior;

2.2.2 O sistema de reação foi conforme segue:

	Controle em branco	Amostras
Solução tampão detectada	90μ1	80μ1
Amostras a serem		10μ1
detectadas	0μ1
Ac-DEVD-PNA(2mM)	10μ1	10μ1
Volume Total	100μ1	ΙΟΟμΙ

2.2.3 Incubar a 37 °C por 120 minutos, detectar a

Caspase 3 com A4 05;

2.2.4 Adicionar Ac-IETD-PNA (2mM) e Ac-LEHD-PNA (2mM), respectivamente, para detectar Caspase 8, 9

3. Detectar a atividade das células tumorais VEGF, P53, P21, Bcl-2 (tomando o β-Actina como referência interna)

Usar a eletroforese da proteína (método da western blot)

3.1 Extração da proteína celular total

Um tecido tumoral do tamanho de um feijão previamente dissecado foi retirado^- e colocado em um moedor de tecido pré-resf riado. 400 μΐ de solução de lise do tecido foram adicionadas. Após 10 minutos cuidadosamente moída, a mistura foi transferida para um tubo de centrífuga de 1,5 ml, e então, após um vórtex intenso do tubo por 15 segundos, a mistura foi colocada em gelo por 10 minutos e repetidamente oscilada. Após centrifugar por 15 minutos (12000 rpm), o flutuante foi coletado, transferido para um tubo Eppendorf

29/39 pré-resfriado e então carregado separadamente e armazenado congelado a -80° para detectar o nível de atividade de vários anticorpos.

3.2 Determinação da proteína: usando um teste de proteína BCA

3.2.1 Preparação da série padrão (Tabela 4-1): O padrão no kit foi diluído em série de acordo com a especificação deste para preparar soluções padrão com concentrações de 2000pg/ml, 1500pg/ml, 1000pg/ml, 750pg/ml, 500pg/ml, 250pg/ml, 125pg/ml e 25pg/ml.

Tabela 4-1 Preparação dos padrões

Tubo n°	Quantidade de água deionizada	Quantidade de padrão BSA	Concentração final de BSA
A	0	300μ1 de solução estocada de BSA	2000pg/ml
B	125μ1	375μ1 de solução estocada de BSA	1500pg/ml
C	325μ1	325μ1 de solução estocada de BSA	1000pg/ml
D	175μ1	175μ1 de diluente B	75Cfog/ml
E	325μ1	325μ1 de diluente C	50Cfog/ml
F	325μ1	325μ1 de diluente E	250pg/ml
G	325μ1	325μ1 de diluente F	125pg/ml
H	400μ1	100μ1 de diluente G	25pg/ml
I	400μ1	0	Opg/rnl

3.2.2 Preparação da solução de trabalho Solução A e solução B (50 : 1) foram misturadas para uso posterior

3.2.3 A amostra a ser detectada foi diluída em 2 0 vezes a diluição 10 μΐ da amostra e 10 μΐ do padrão foram cada uma adicionada’ ém' três fontes de uma placa ELISA' de 96 poços. 200μ1 de solução de trabalho foi adicionada e misturada. A mistura foi reagida a 37°C por 3 0 minutos.

3.2.4 A placa ELISA foi retirada, resfriada em temperatura ambiente, e medido o valor de absorção em 562nm. A curva padrão foi retirada, de acordo com os padrões, e o teor de proteína das amostras a ser medido foi calculado usando a curva padrão.

30/39

3.3 Eletroforese da proteína

3.3.1 Preparação das amostras de proteína: Uma quantidade adequada de cada amostra foi adicionada a quatro amostras tampão de proteína e 1 amostra tampão de proteína, misturada para fazer com que cada uma tivesse um volume de 300 μΐ e uma concentração de 3,7 μς/μΐ aquecida por 3-5 minutos em água quente para desnaturação, centrifugada por um período curto em alta velocidade, e então armazenada a -20°C para uso posterior.

3.3.2 Preparar 12% de gel de separação e 4% de gel de empilhamento e derramar gel: verifique a Tabela 4-2.

Tabela 4-2 Preparação do gel de separação e do gel de empilhamento

	Gel de separação (ml)	Gel de empilhamento (ml)
30% de solução de	4	Π R
acrilamida		V f
l,5mmol/L Tris (pH 8,8)	2,5	-
1,0 mmol/L Tris (pH 6,8)	-	0,38
10% SDS	0,1	0,03
Água Deionizada	3,3	2,1
10% de Persulfato de
amônia (AP)	0,1	0,03
5% TEMED	0,004	0,003
Ao preparar o gel	de separação e o gel de
empilhamento, a fim de prevenir o gel de	curar muito cedo, o
TEMED deve ser adicionado	antes de	despejar o gel.

Primeiramente, o gel de separação foi despejado em entre camadas dos vidros; então a superfície mais alta do gel foi selada com água destilada para manter uma superfície plana do gel. Segundo, quando o gel de separação foi curado e a água destilada foi absorvida, a mistura foi lavada com água destilada por diversas vezes para remover a acrilamida que não estivesse polimerizada. Finalmente, quando a água destilada foi absorvida novamente, um pente de aplicação de amostra foi inserido, com sua borda frontal estando 0,5 cm

31/39 distante do gel de separação.

3.3.3 Adição de Amostra: Quando o gel curado em temperatura ambiente, um tampão eletroforético foi despejado em um tanque de eletroforese; após desconectar um pente de carregamento da amostra, volumes adequados de amostras a serem testadas foram respectivamente adicionados nas fontes do pente por uma micropipeta de acordo com as concentrações de proteína citoplasmática.

3.3.4 Eletroforese: Após adicionar a amostra, conectar o fornecimento de energia, primeiramente estabelecer a tensão em 120V e durante este período a amostra foi empilhada como um linha no gel de empilhamento e a borda frontal da amostra inserida no gel de separação; então estabelecer a tensão em 100V e durante este período conduzir eletroforese de tensão constante por 120 minutos; finalmente, desligar o fornecimento de energia quando o indicador azul bromo fenol alcançar a borda do fundo do gel.

3.4 Análise por western blot

3.4.1 Eletro transferência O filme PVDF foi primeiramente embebido em metanol absoluto por 30 segundos para torná-lo transparente, e então embebido em água destilada por 10 minutos, finalmente embebido em papel Whatman no tampão de transferência. O gel foi removido. O papel de filtro, gel, filme PVDF e o papel de filtro foram colocados a fim de evitar um atalho para assegurar os tamanhos de ambos os lados do papel, fixados e inseridos no tanque de eletro transferência assegurando o gel na direção do catodo e o filme PVDF na direção do anodo. A eletro transferência desempenhada por 3 horas em 80V, 4 °C.

3.4.2 Selamento Após a eletro transferência, o filme PVDF foi retirado, selado por um tampão de bloqueio de 5% de BSA (resolvido em uma solução de 1 TBST) em temperatura ambiente por 3 horas, e então lavada oscilando com TBST por 3

32/39 vezes, cada uma por 10 minutos.

3.4.3 Reação com o primeiro anticorpo O primeiro anticorpo foi diluído em solução TBST em uma proporção de 1 : 200, e então reagido com o filme PVDF a 4°C por uma noite. No dia seguinte, depois de equilibrado em temperatura ambiente por uma hora, a mistura da reação foi lavada com TBST por 3 vezes.

3.4.4 Reação com o segundo anticorpo O segundo anticorpo conjugado com HRP correspondente foi diluído por solução TBST em uma proporção de 1 : 2000, reagido com filme PVDF em temperatura ambiente por 2 horas, e então lavado com TBST por 3 vezes.

3.4.5 Desenvolvimento e fixação Soluções de Substrato A e B foram misturadas em uma proporção de 1 : 1. A misturada foi derramada no filme PVDF, incubada por 5 minutos em temperatura ambiente, e, após o líquido em excesso no filme ser removido, as substâncias restantes foram envolvidas em plástico para prevenir o surgimento de bolhas entre o filme PVDF e o filme plástico. Os seguintes procedimentos incluindo laminação, exposição, desenvolvimento, lavagem com água duplamente destilada por 1 minuto, e dose rápida de 1 minuto.

3.4.6 As fotos do desenvolvimento escaneadas foram submetidas à análise de densidade ótica através do software do Alpha Ease FC4.0, que toma a intensidade média de luz das bandas de B-actina como valor de referência interna, e mostra os resultados como uma proporção dos níveis de proteína correspondentes a β-actina.

4. Tratamento Estatístico

Todos os dados foram estatisticamente analisados por um pacote de software SPSS 11.0; os dados de distribuição normal e homogeneidade variante foram estudados através do teste t. Se os dados não alcançaram distribuição normal ou

33/39 homogeneidade variante, o teste não paramétrico foi usado.

III. Resultados Experimentais

1. Detecção de VEGF no soro ocular do rato

Conforme mostrado na Tabela 4-3 e Figura 4, o valor de densidade ótica (valor OD do soro VEGF dos ratos no grupo de alta dosagem é 0,1937, quando comparado com o valor OD 0,2200 do grupo de controle negativo, P=0,0037; para o grupo de dosagem baixa, quando comparado com o grupo de controle negativo, P=0,0259, ambos tem significância estatística.

Tabela 4-3 Detecção de resultados da atividade VEGF (x±s)

Grupos	Controle Negativo	Controle Positivo	16mg/kg	32mg/kg
Valor	0,2200 +	0,2205+	0,2064+	0,1937±
OD	0,0174	0,0238	0,0114 φ	0,0170 @

0,01.

2. Determinação da atividade da Caspase 3, 8, 9

Após o CL168-6 agir nas células HepG2 por 24 horas e 48 horas, a atividade da Caspase 3, 8, 9 foi determinada e os resultados relevantes foram mostrados na Tabela 4 e Figura 6 .

Tabela 4-4 Valores OD da Caspase 3, 8, 9

	24h	48h
Opg	2,0gg	Opg	2, Opg
Caspase3	0,163	0,190	0,165	0,185
Caspase8	0,362	0,413	0,368	0,408
Caspase9	0,130	0,156	0,132	0,146

Atividades das três Caspases não foram significativamente aumentadas, e, portanto não tem significância estatística.

3. Eletroforese da proteína

3.1 Determinação das concentrações de proteínas extraídas da célula (Figura 7)

34/39

A curva padrão de proteína foi retirada de acordo com as concentrações (x) e absorvência (y) dos padrões de BSA. A equação linear Y=2,22x-0,02 foi obtida usando a curva padrão, em que Y representa concentrações das amostras diluídas, e x representa absorvências. Conforme mostrado na Figura 3.3, o coeficiente relacionado r=l,00 significa boa correlação da equação linear. A concentração (x) de proteína correspondente foi calculada com base no valor de absorvência (y) determinado.

3.2 Expressão do nível de proteína P53

Durante a eletroforese da proteína, as quantidades totais de proteína das amostras em cada fonte foram consistentes uma a outra. Os três grupos foram um grupo de controle negativo, um grupo de controle positivo (CTX) e um grupo experimental de CL168-6. A β-Actina foi padrão de referência interna. Para o grupo experimental, o nível de expressão relativa do P53 foi 0,74+0,03; enquanto para o grupo de controle negativo, foi 0,32+0,05; houve diferença significante entre os dois grupos, P=0,002. (Figura 8)

3.3 Expressão do nível de bcl-2

Para o grupo experimental, o nível de expressão relativa do bcl-2 foi 0,75±0,04; enquanto para o grupo de controle negativo, foi 0,31+0,01; P=0,000; os dois grupos tiveram significância estatística. (Figura 9)

3.4 Expressão do nível de VEGF

Para o grupo experimental, o nível de expressão relativa do VEGF foi 0,46±0,08; enquanto para o grupo de controle negativo, foi 0,71+0,05; houve significante diferença entre os dois grupos, P=0,04. (Figura 10)

3.5 Expressão do nível de P21

Para o grupo experimental, o nível de expressão relativa do P21 foi 0,79+0,07; enquanto para o grupo de controle negativo, foi 0,76+0,06; houve uma significante

35/39 diferença entre os dois grupos, P=0,73. (Figura 11)

IV. Conclusão

O presente estudo experimental mostra que o CL168-6 pode diminuir o nível de VEGF no sangue ocular de um rato portador de tumor; ao mesmo tempo, o nível da expressão de proteína VEGF no tumor teve uma tendência de declinação. O CL168-6 pode inibir a proliferação do tumor através da redução da atividade do VEFG.

Nosso experimento mostra que o CL168-6 não tem efeito significante nas atividades da Caspase 3, 8, 9. É suposto que a apoptose induzida por CL168-6 nas células HepG2 pode não depender da ativação destas três enzimas.

No presente experimento, considerando que os níveis de expressão da proteína P21 do grupo de controle e o grupo de tratamento não tiveram significância estatística, pode ser concluído preliminarmente que o efeito de inibição do tumor do CL168-6 não é alcançado pela via de transdução do sinal do P53 - P21.

Foi descoberto neste experimento que, o nível de expressão da proteína Bcl-2 do grupo de tratamento foi significantemente mais baixo que o do grupo de controle negativo. Pode ser concluído que o CL168-6 pode alcançar o efeito inibitório do tumor através da redução do nível de expressão da proteína Bcl-2. O mecanismo específico é para ser mais explorado.

O gene P53 tem dois tipos. Um é do tipo p53 Primitivo, isto é, wtp53, o outro é do tipo p53 Mutante, isto é, mtp53. O Wtp53 é um gene supressor do tumor, pode ser envolvido na regulação do ciclo celular, e tem um papel importante nos procedimentos de manter o crescimento normal das células e inibir a proliferação do tumor. Nossos resultados experimentais mostram que o nível de expressão da proteína P53 do grupo de tratamento é significantemente mais

36/39 alto que o do grupo de controle negativo. Então, pode ser concluído preliminarmente que, o CL168-6 pode aumentar o nível de expressão do wtp53 no rato portador de tumor e inibir as expressões de proteína do Bcl-2 e VEGF de forma a alcançar o efeito antitumoral.

EXEMPLO DE TOXICIDADE 1

I. Item Experimental: Injeção LD50 intraperitoneal para rato (método de KORBER)

II. Materiais Experimentais ratos ICR [macho/fêmea = 1/1, 18-22g, Licença

Animal N° . : SCXK(Pequim)2007-0001];

CL168, pó branco (preparado por nós), diluído com óleo de salada, preparado antes do uso.

III. Método Experimental

Ratos ICR (grau SPF) , com uma faixa de peso de 1822g, fornecidos pelos Laboratórios Vital River (VRL) em Pequim, China, foram usados. Havia 5 grupos de tratamento no total, em que 2000 mg/kg, era a dose mais alta, e as outras

diminuíam para	0,8 vezes	, isto	é, 1600mg/kg,	1280mg/kg,
1024mg/kg e	819.2mg/kg	Os	ratos foram	divididos
aleatoriamente	em grupos.	Cada	grupo tinha	10	ratos com
metade machos	e metade	fêmeas.	Cada rato	foi	inj etado
intraperitonealmente (0,2	ml/10g)	. Observados	por	3-7 dias,

uma variedade de respostas animais e a quantidade de ratos mortos em cada grupo foram gravadas. O LD50 e os limites de confiança foram calculados pelo método Karber modificado (Korbor) de acordo com a taxa de mortalidade dos animais em cada grupo.

IV. Resultado Experimental

Nas 12 horas após a administração, nenhuma morte aconteceu. A situação de morte em cada grupo em 7 dias foi listada na tabela a seguir.

Tabela no Exemplo: Injeção LD50 intraperitoneal

37/39 para rato CL168

Grupo N°	Número de Animais (n)	Dose administrada: (mg/kg)	Dose logarítmica (X)	Mortes dos animais	Taxa de mortalidade (P)	P2
1	10	819,2	2,91	0	0	0
2	10	1024	3,01	1	0,1	0,01
3	10	1280	3,11	3	0,3	0,09
4	10	1600	3,20	6	0,6	0,36
5	10	2000	3,30	8	0,8	0,64
	V.	Sumário

LD₅o calculado através do método Karber modificado (Korbor) pra o CL168-6 foi 1479,11 mg/kg; 95% do intervalo de confiança foi 1304,19 - 1677,49 mg/kg.

EXEMPLO DE TOXICIDADE 2

I. Item experimental: índice terapêutico antitumoral do CL168

II. Materiais Experimentais: por favor ver Exemplo de Resultado 2 e Exemplo de Toxicidade 1.

III. Método Experimental: por favor ver Exemplo de Resultado 2 e Exemplo de Toxicidade 1.

IV. Resultado Experimental: por favor ver Exemplo de Resultado 2 e Exemplo de Toxicidade 1.

V. Pode ser encontrado no Exemplo de Resultado 2 que quando usando a dosagem alta (30 mg/kg) de CL168, a taxa de inibição para o tumor sólido S180 foi 54,58%, a taxa de sobrevivência dos ratos ascíticos H22 foi 51.55%; quando usando uma baixa dosagem (15 mg/kg) de CL168, a taxa de inibição para o tumor sólido S180 foi 44.33%, a taxa de sobrevivência dos ratos com câncer ascítico H22 foi 37,11%; em combinação com o Exemplo de Toxicidade 1, pode ser visto que o LD₅₀ do CL168 foi 1479,11 mg/kg, e o índice terapêutico (TI) deste foi cerca de 49,3.

VI. Sumário

O fato o índice terapêutico (TI) do CL168 foi

38/39 cerca de 49,3 indica que o CL168 tem uma alta segurança e significante efeito antitumoral.

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 1 lOg de CL168-6 e excipientes adequados para injeção (incluindo pó seco congelado e pó seco embalado estéril) foram misturados e preparados em injeções antitumoral através do processo de injeção (incluindo pó seco congelado e pó seco embalado estéril).

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 2 lOg de CL168-6 e excipientes adequados para comprimido (incluindo comprimido de liberação lenta, comprimido matriz, comprimido revestido, comprimido dispersável, etc.) foram misturados e preparados em comprimidos antitumorais através de processo de comprimido (incluindo comprimido de liberação lenta, comprimido matriz, comprimido revestido, comprimido dispersível, etc.)

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 3 lOg de CL168-6 e excipientes adequados para cápsula foram misturados e preparados em cápsulas antitumorais através do processo de cápsula.

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 4 lOg de CL168-6 e excipiente adequados para emulsão (incluindo micro emulsão, nano emulsão, etc.) foram misturados e preparados em emulsões antitumorais (incluindo micro emulsão, nano emulsão, etc.) através do processo de emulsão.

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 5 lOg de CL168-6 e excipientes adequados para grânulo foram misturados e preparados em grânulos antitumorais através do processo de grânulo.

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 6

10g de CL168-6 e excipientes adequados para preparação de liberação controlada foram misturados e

39/39 preparados em preparações de liberação controlada antitumorais através do processo de preparação de liberação controlada.

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 7

10g de CL168-6 e excipientes adequados para líquido oral foram misturados e preparados em líquidos orais antitumorais através de processo de líquido oral.

EXEMPLO DE FORMULAÇÃO 8 lOg de CL168-6 e excipientes adequados para lipidossomas foram misturados e preparados em lipidossomas antitumorais para processo de lipidossoma.

Claims

(1) dissolver o colesterol (Composto 2) em um solvente orgânico para produzir o Composto 3 reagindo o colesterol com um reagente doador de R (R representa um grupo alquila C2-25, grupo arila, grupo arila substituído com grupo doador de elétron ou grupo de retirada de elétron, grupo alquinila C₃-₆, grupo alquenila, grupo cicloalquila C₃_₉, grupo heterocicloalquila substituído com C₃_₉, grupo acila graxo C_x20, grupo acila aromática, sulfonil, cinamoil, cafeoil, galoil, feruloil, benzoila, acila amino alifática L·, ou acila amino aromática L) sob a catálise de um catalisador,em certa temperatura;

1. COMPOSTO

REIVINDICAÇÕES

CL168 REPRESENTADO

POR UMA

FÓRMULA

ESTRUTURAL GERAL I

caracterizado em que R representa oxigênio (isto é, o composto CL168-6), enxofre, NH ou S0₂
(2) dissolver o dito Composto 3 em um solvente orgânico para produzir o Composto 4 reagindo o Composto 3 com um reagente de brometo sob a catálise de um catalisador, em certa temperatura;

2/4 orgânico para produzir acetato de 7-bromocolesten-3-ol (Composto 4) reagindo o Composto 3 com um reagente de brometo sob a catalise de um catalisador, em certa temperatura;

2 . COMPOSTO

CL168 REPRESENTADO

POR UMA

FÓRMULA

ESTRUTURAL GERAL II,

II caracterizado em que R representa um grupo alquila

C₂-₂₅, grupo arila, grupo arila substituído com um grupo doado de elétron ou grupo de retirada de elétron, grupo alquinila

C₃-₆, grupo alquenila, grupo cicloalquila C₃.₉, grupo heterocicloalquila substituído C₃.₉, grupo acila graxos Ci-₂₀, grupo acila aromática, sulfonil, cinamoil, cafeoil, galoil, feruloil, benzoila, acila amino alifática L, ou acila amino aromática L.
(3) dissolver o dito Composto 4 em um solvente orgânico para produzir o Composto 5 através da eliminação da reação com uma base em certa temperatura;

3/4

Composto 1

(3) dissolver o dito Composto 4 em um solvente orgânico para produzir acetato de 7-dehidrocolesten-3-ol (Composto 5) através da eliminação da reação com uma base em certa temperatura;

3. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO COMPOSTO, tal como definido na reivindicação 1, caracterizado em que o método compreende as seguintes etapas:

dissolver o colesterol (Composto 2) em um solvente orgânico para produzir acetato de colesterol (Composto 3) reagindo o colesterol com anidrido acético sob a catalise de um catalisador, em certa temperatura;

dissolver o dito Composto 3 em um solvente
(4) dissolver o dito Composto 5 em um solvente orgânico para produzir o Composto 6 através da oxidação do Composto 5 com um oxidante em certa temperatura;

4. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO COMPOSTO, tal como definido na reivindicação 2, caracterizado em que o método compreende as seguintes etapas:

(4) dissolver o dito Composto 5 em um solvente orgânico para produzir 7-dehidrocolesterol (Composto 6) hidrolisando o dito Composto 5 com uma base em certa temperatura;
5. USO DO COMPOSTO, tal como definido na reivindicação 1, caracterizado pela preparação de uma droga

10 para prevenir e tratar doenças tumorais.

5 em que as equações de reação nas etapas acima (1) , (2), (3) e (4) do método são conforme segue:

Composto 2 Composto 3 Composto 4

(5) dissolver o dito Composto 6 em um solvente orgânico 5a, 8a-ciclobioxigênio-6-colesten-3-ol (Composto 7) através da oxidação do dito Composto 6 com um oxidante em certa temperatura;
6. USO DO COMPOSTO, tal como definido na reivindicação 1, caracterizado pela preparação de uma droga para prevenir e tratar doença imunológica.

(6) dissolver o dito Composto 7 em um solvente orgânico para produzir 5a, 8a-ciclobioxigênio-6-colesten-3-um (Composto 1, isto é, CL168-6) através da oxidação do Composto 7 com um oxidante em certa temperatura;

em que as equações de reação nas etapas acima (1) , (2), (3), (4), (5) e (6) do método são conforme segue:
7. USO DO COMPOSTO, tal como definido na

15 reivindicação 2, caracterizado pela preparação de uma droga para prevenir e trata doenças tumorais.
8. USO DO COMPOSTO, tal como definido na reivindicação'2,' caracterizado- pela preparação de uma droga para prevenir e tratar doenças imunológicas.