CN113354577B - 一种单羰基类姜黄素类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单羰基类姜黄素类似物及其制备与应用，所述姜黄素类似物由式Ⅰ表示，或其药学上可接受的盐包括有盐酸盐、硫酸盐，以醛、酮为原料，设计合成单羰基类姜黄素类似物CuA‑1～CuA‑3，以3，4‑二氢‑2H‑吡喃、香草醛、4‑甲基苯磺酸吡啶鎓、1‑甲基‑4‑哌啶酮为原料设计合成了单羰基类姜黄素类似物CuA‑4，通过单羰基取代不稳定的β‑二羰基结构得到更稳定的单羰基姜黄素类似物CuA‑1～CuA‑4，使其具备更好的药代动力学行为和更高的抗肿瘤活性，单羰基类姜黄素类在制备抗炎以及治疗与炎症相关疾病、阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的药物中的应用。

Description

一种单羰基类姜黄素类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种单羰基类姜黄素类化合物 及其制备方法与应用。
背景技术
天然药物是新药的重要来源，也为新型结构药物的开发提供了思路。姜黄素(Curcumin，CU)作为姜黄的主要活性成分之一，因其显著的抗肿瘤活性而受到广泛关注。然而，与之相关的临床研究尚未取得显著进展，其主要原因是姜黄素稳定性差和生物利用度较低。CU的不稳定性和不规律性代谢主要是由其结构中β-二羰基结构单元的存在引起的。兼顾“邻位效应”也是药物分子设计中一种提高药物抗肿瘤活性的有效策略。诸如代表性单羰基姜黄素类化合物 EF24和F35等表现出高选择性高活性，然而进一步研究发现，其在体内仍具有一定毒性。以EF24和F35为先导化合物设计合成的化合物5B具有较低的IC50和较高的选择性，但缺乏体内抗肿瘤活性的证据。此外，有研究发现以吡啶作为远端环的姜黄素类化合物 表现出较低的IC50，但低水溶性是一个需要克服的障碍。随着大量优秀的姜黄素类化合物 被开发出来，其理化性质和抗肿瘤潜力也得到深入探索。然而MCACs仍然存在研究空白。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种单羰基类姜黄素类化合物 。
本发明的第二目的是提供单羰基类姜黄素类化合物 的制备方法。
本发明的第三目的是探讨单羰基类姜黄素类化合物 在制备抗炎以及治疗与炎症相关疾病、阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种单羰基类姜黄素类化合物 ，所述姜黄素类化合物 由如下结构表示，或其药学上可接受的盐：
Figure GDA0003734005720000021
进一步，所述结构CuA-1～CuA-3的具体制备步骤如下：
取醛3.47～6.94份和酮1.735～3.47份溶解在5～10mL饱和氯化氢冰醋酸溶液中，并在室温下搅拌反应12～24h，得到溶液Ⅰ，静置24～48h后，将溶液Ⅰ过滤并用纯水和无水乙醇处理，得到化合物CuA-1、CuA-2和CuA-3。
进一步，所述醛为3.47份、酮为1.735份、饱和氯化氢冰醋酸溶液为5mL、反应时间为12h、静置时间为24h。
进一步，所述结构CuA-4的具体制备步骤如下：
取3，4-二氢-2H-吡喃28.4～56.8份和香草醛14.14～28.18份在0.16～0.32份4-甲基苯磺酸吡啶鎓的二氯甲烷悬浮液中于室温下反应12～24h，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ浓缩后，用饱和NaHCO3溶液洗涤2～4次，并用无水Na2SO2干燥，获得香草醛保护物；
在室温下将香草醛保护物3.47～6.94份和1-甲基-4-哌啶酮1.735～3.47份的乙醇溶液搅拌20～40min，然后缓慢滴加8.2％NaOH乙醇溶液3.47～6.94份，并继续反应 12～24h，得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ通过层析柱色谱分离纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1：3， v/v，得到黄色固体化合物CuA-4。
进一步，所述3，4-二氢-2H-吡喃为28.4份、香草醛为14.14份、4-甲基苯磺酸吡啶鎓为0.16份、室温下反应时间为12h、香草醛保护物3.47份、1-甲基-4-哌啶酮 1.735份、搅拌时间为20min、8.2％NaOH乙醇溶液为3.47份、继续反应时间为12h。
进一步，任一项所述的单羰基类姜黄素类化合物 在制备抗炎以及治疗与炎症相关疾病、阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的药物中的应用。
进一步，所述的单羰基类姜黄素类化合物 在制备抗炎以及治疗与炎症相关疾病、阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症的药物中的应用，其特征在于，所述与炎症相关疾病包括有类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、骨关节炎、痛风性关节炎、皮肤炎症、自身免疫性疾病、过敏性炎症、肝炎和肺炎。
进一步，任一项所述的单羰基类姜黄素类化合物 制备的剂型包括有片剂、颗粒剂、散剂、纳米粒、注射剂、缓释剂、软膏剂栓剂及固体分散剂。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
1、本发明以F35、5B和吡啶类似物为先导化合物，设计合成了一系列新型姜黄素类化合物，并对其构效关系进行探究，这将为临床前沿提供更多供选择的潜在抗肿瘤药物，也继续推动姜黄素类化合物 的研究进展。
2、本发明以醛、酮为原料，设计合成单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-3，以3，4-二氢-2H-吡喃、香草醛、4-甲基苯磺酸吡啶鎓、1-甲基-4-哌啶酮为原料设计合成了单羰基类姜黄素类化合物 CuA-4，通过单羰基取代不稳定的β-二羰基结构得到更稳定的单羰基姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4，使其具备更好的药代动力学行为和更高的抗肿瘤活性。
3、本发明的单羰基姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4具有结构新颖、抗肿瘤活性强、广谱、合成方法简单、操作简便、适合大规模生产等优点。
本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
本发明的附图说明如下：
图1为不同浓度的CU和CuA-3对Caco2细胞凋亡的诱导作用。
图2为不同浓度的CU和CuA-3作用Caco2细胞24h后的总凋亡率统计。
图3为AKT和JNK信号通路参与CuA-3诱导结肠癌细胞凋亡。
图4为CuA-3抑制大鼠Caco2异种移植肿瘤的生长。
图5为CuA-3处理下SERT相对表达量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4的制备
1)制备CuA-1～CuA-3的具体步骤如下：
取醛3.47份和酮1.735份溶解在5mL饱和氯化氢冰醋酸溶液中，并在室温下搅拌反应12h，得到溶液Ⅰ，静置24h后，将溶液Ⅰ过滤并用纯水和无水乙醇处理，得到化合物CuA-1、CuA-2和CuA-3。
2)制备CuA-4的具体步骤如下：
取3，4-二氢-2H-吡喃28.4份和香草醛14.14份在0.16份4-甲基苯磺酸吡啶鎓的二氯甲烷悬浮液中于室温下反应12h，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ浓缩后，用饱和NaHCO3溶液洗涤3次，并用无水Na2SO2干燥，获得香草醛保护物；
在室温下将香草醛保护物3.47份和1-甲基-4-哌啶酮1.735份的乙醇溶液搅拌20min，然后缓慢滴加8.2％NaOH乙醇溶液3.47份，并继续反应12h，得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ通过层析柱色谱分离纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1：3，v/v，得到黄色固体化合物CuA-4。
实施例2：
单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4的制备
1)制备CuA-1～CuA-3的具体步骤如下：
取醛5.2份和酮1.735份溶解在5mL饱和氯化氢冰醋酸溶液中，并在室温下搅拌反应12h，得到溶液Ⅰ，静置24h后，将溶液Ⅰ过滤并用纯水和无水乙醇处理，得到化合物CuA-1、CuA-2和CuA-3。
2)制备CuA-4的具体步骤如下：
取3，4-二氢-2H-吡喃28.4份和香草醛14.14份在0.16份4-甲基苯磺酸吡啶鎓的二氯甲烷悬浮液中于室温下反应12h，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ浓缩后，用饱和NaHCO3溶液洗涤3次，并用无水Na2SO2干燥，获得香草醛保护物；
在室温下将香草醛保护物5.2份和1-甲基-4-哌啶酮1.735份的乙醇溶液搅拌20min，然后缓慢滴加8.2％NaOH乙醇溶液3.47份，并继续反应12h，得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ通过层析柱色谱分离纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1：3，v/v，得到黄色固体化合物CuA-4。
实施例3：单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4的制备
1)制备CuA-1～CuA-3的具体步骤如下：
取醛6.94份和酮3.47份溶解在10mL饱和氯化氢冰醋酸溶液中，并在室温下搅拌反应24h，得到溶液Ⅰ，静置24h后，将溶液Ⅰ过滤并用纯水和无水乙醇处理，得到化合物CuA-1、CuA-2和CuA-3。
2)制备CuA-4的具体步骤如下：
取3，4-二氢-2H-吡喃56.8份和香草醛28.18份在0.32份4-甲基苯磺酸吡啶鎓的二氯甲烷悬浮液中于室温下反应24h，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ浓缩后，用饱和NaHCO3溶液洗涤3次，并用无水Na2SO2干燥，获得香草醛保护物；
在室温下将香草醛保护物6.94份和1-甲基-4-哌啶酮3.47份的乙醇溶液搅拌40min，然后缓慢滴加8.2％NaOH乙醇溶液6.94份，并继续反应24h，得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ通过层析柱色谱分离纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1：3，v/v，得到黄色固体化合物CuA-4。
实施例4：PAC的制备
取以实施例1的条件下制得的CuA-4和对甲苯磺酸的乙醇悬浮液在室温下搅拌3～6h，用饱和NaHCO3溶液将其调节至pH＝4.6～5.0，并重结晶以获得化合物PAC。
实施例5：单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4检测
1、实验材料
实施例1中的条件下所制备的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4，实施4中所制备的化合物PAC
2、实验方法
分别取实施例1中的条件下所制备的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4进行质谱检测。
3.实验结果
CuA-1：
Figure GDA0003734005720000051
3,5-bis((E)-4-hydroxy-3,5-dimethylbenzylidene)piperidin-4-one
产率为45.8％、熔程为264-266℃、溶解度为15.04mg/100g，
结构表征：1H-NMR(400MHz,DMSO)δ9.10(s,2H,4-OH×2),7.72(s,2H,CH＝C×2),7.13 (d,J＝12.4Hz,4H,Ar-H),4.41(d,J＝41.8Hz,4H,Pi-H),2.21(s,12H,3-CH3×2,5-CH3×2). HRMS calcd for C23H26NO3[M+H]+364.19,found 364.1907.
CuA-2：
Figure GDA0003734005720000061
3,5-bis((E)-4-hydroxy-3,5-dimethylbenzylidene)-1-isopropylpiperidin-4-one
产率为57.1％、熔程为275-277℃、溶解度为3.29mg/100g，
结构表征：1H-NMR(400MHz,DMSO)δ9.10(s,2H,4-OH×2),7.77(s,2H,CH＝C×2),7.19 (s,4H,Ar-H),3.39(s,4H,Pi-H),2.23(s,12H,3-CH3×2,5-CH3×2),1.37–1.30(d,6H,CH3×2). HRMS calcd for C26H32NO3[M+H]+406.2408,found 406.2377.
CuA-3：
Figure GDA0003734005720000062
3,5-bis((E)-4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene)-1-isopropylpiperidin-4-one
产率为17.5％、熔程为230-232℃、溶解度为403.44mg/100g，
结构表征：1H-NMR(400MHz,DMSO)δ9.28(s,2H,4-OH×2),7.86(s,2H,CH＝C×2),6.88 (s,4H,Ar-H),3.85(s,12H,3-CH3×2,5-CH3×2),1.32(d,J＝26.7Hz,6H,CH3×2).HRMS calcd for C26H32NO7[M+H]+470.2147,found 470.2173.
CuA-4：
Figure GDA0003734005720000063
3,5-bis((E)-3-methoxy-4-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)benzylidene)-1-methylpiperidin-4-one
产率为13.2％、熔程为96-100℃、溶解度为1.37mg/100g，
结构表征：1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:7.57(s,2H,CH＝C×2),7.16(d,J＝5.7Hz,2H,6-Ar-H),7.14(s,2H,2-Ar-H×2),7.04(d,J＝8.5,1.7Hz,2H,5-Ar-H×2),5.50(t,J＝3.1Hz, 4H,O-CH-O),3.83(s,6H,3-O-CH3×2),3.72(s,4H,Pi-H),2.41(s,3H,CH3),1.98–1.82(m, 4H,O-CH2×2),1.83–1.71(m,4H,CH2×2),1.69–1.43(m,8H,CH2×4).HRMS calcdfor C32H40NO7[M+H]+550.2746,found 550.2799.
PAC：3,5-bis((E)-4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one
产率为80.1％、熔程为225-227℃、溶解度为0.07mg/100g，
结构表征：1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:9.63(s,2H,4-OH×2),7.54(s,2H,CH＝C×2),7.08 (d,J＝1.7Hz,2H,6-Ar-H×2),6.96(dd,J＝8.4,1.7Hz,2H,2-Ar-H×2),6.87(d,J＝8.2Hz,2H, 5-Ar-H×2),3.82(s,6H,3-O-CH3×2),3.73(s,4H,CH2×2),2.42(s,3H,CH3).
实施例6：单羰基类姜黄素类化合物 毒理学评价
1、实验材料
A549、HepG2和MCF-7细胞株(均购自中国科学院细胞库)，HeLa、Caco2和L02细胞株(均购自西南医科大学附属医院基础医学实验中心)，姜黄素(购自成都曼斯特生物科技有限公司)，以实施例1的条件下所制备的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4，以实施例4条件下所制备的PAC。
2、实验方法
将细胞株A549、HepG2、MCF-7、HeLa、Caco2和L02均培养在37℃、5％CO2细胞培养箱中，所用于实验细胞皆处于对数生长期。采用MTT比色法测定姜黄素、单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4、PAC分别对各细胞的毒性作用，并计算24h、48h各个药物的半数致死量IC50及选择指数(SI)。
3、实验结果
表1姜黄素、单羰基类姜黄素类化合物 CuA-1～CuA-4、PAC对各肿瘤细胞的IC50和选择指数
Figure GDA0003734005720000071
Figure GDA0003734005720000081
注：选择指数(SI)＝lg[IC50(L02)/IC50(A549,HepG2,MCF-7,HeLa or Caco2)]；nc(not calculated)，无法计算。
实验结果如表1所示，仅CuA-1的广谱抗肿瘤活性低于其先导化合物姜黄素，CuA-2、 CuA-3、CuA-4、PAC的抗肿瘤活性均明显强于姜黄素，另外CuA-2对部分癌细胞表现出较高活性的同时也展现高选择性，CuA-3对结肠癌细胞有最强的细胞毒性。
实施例7：单羰基类姜黄素类化合物 凋亡实验
1、实验材料
结肠癌Caco2细胞、姜黄素、以实施例6中优选的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-3。
2、实验方法
取生长对数期且长至90％以上的Caco2细胞，按1.5×105/孔的细胞密度接种于6孔板中。当细胞长至70～80％时，分别用设定的高(16μM)、中(8μM)、低(4μM)三个浓度的CuA-3和CU作用于细胞，同时设置空白组。24h后，消化并收集所有细胞，用PBS洗涤两次并计数；离心收集细胞，计数，取6×105个细胞并悬浮于500μL Binding Buffer，吹匀后转至5mL检测管中；随后加入5μL Annexin V/FITC混匀后，继续加入5μL PI，轻轻吹打使其充分混匀，室温避光下染色5min，以上所有样品应控制在1h内完成测定。仪器设置参数：激发波长：488nm，发射波长：530nm；绿色荧光通道：FITC通道(FL1)；红色荧光通道：PI通道(FL2)。
3、实验结果
表2 CU和CuA-3诱导Caco2细胞各期凋亡率的统计(
Figure GDA0003734005720000091
n＝3)
Figure GDA0003734005720000092
如图1所示，凋亡象限图中，第一象限表示早期凋亡率、第二象限表示坏死率、第三象限表示正常细胞存活率和第四象限表示晚期凋亡率。根据表2和图2对凋亡细胞数量统计分析，CU和CuA-3均能呈浓度依赖性的诱导结肠癌细胞凋亡。Caco2细胞在低(4μM/L)，中(8μM/L)，高(16μM/L)浓度作用下，CU组的总凋亡率(％)分别为8.85±2.20、14.54 ±3.14和19.77±4.22；CuA-3组的凋亡率(％)分别为9.03±2.51、28.43±4.05和47.72±5.24。简言之，CU和CuA-3均能诱导结肠癌Caco2细胞凋亡，CU主要诱导晚期凋亡；CuA-3在低中浓度主要诱导晚期凋亡，高浓度作用下能够同时明显诱导早期凋亡。新结构化合物CuA-3 的结构优势使其在诱导Caco2细胞凋亡的能力更强。
实施例8：单羰基类姜黄素类化合物 West-blotting实验
1、实验材料
结肠癌Caco2细胞、姜黄素、以实施例6中优选的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-3。
2、实验方法
1)细胞的药物干预及细胞样品总蛋白的提取：取生长状态良好的Caco2细胞，按1.5× 105/孔的密度接种于6孔板中，隔夜贴壁。弃去原液后，分别用设定的高(16μM)、中(8μM)、低(4μM)三个浓度的CuA-3和CU作用细胞，同时设置对照组。24h后，消化、离心并收集全部细胞，随即用PBS洗涤细胞2～3次。参照所购试剂盒说明书提取蛋白。简言之，取结肠癌Caco2细胞样本，加入100μL RIPA裂解液(结肠癌细胞：裂解液＝1：10；m/m) 于冰浴上裂解15min(期间震摇3次)；离心裂解液(1200rpm,4℃,10min)，收集上清液即总蛋白，随即蛋白样品于-80℃环境中保存备用。
2)蛋白样品浓度的测定：蛋白标准(60mg BSA)溶于2.4mL蛋白标准液，得25mg/mL的蛋白标准溶液(于-20℃保存)，再将标准母液经PBS稀释至0.5mg/mL。0.5mg/mL的蛋白标准溶液按0、1、2、4、8、16、18、20μL加入到96孔板中，随即每孔经PBS缓冲液补至20μL。然后，根据试剂A：试剂B＝50：1的体积比配置适量的BCA工作液。每孔均加入200μL的BCA工作液并于37℃静置30min，使用酶标仪检测孔中样品在562nm处的OD值，随后根据其理论蛋白含量建立标准曲线并获得相应线性公式。取提取的待测蛋白样品2μL于96孔板并用PBS液补至20μL，其余操作步骤同上。将测出的OD值代入标准曲线对应的公式可获得相应蛋白浓度。
3)蛋白表达量的测定：所有实验组均各取50μL，按质量比4：1加入5×十二烷基硫酸钠缓冲液(5×Loding buffer)，充分混匀后置于95℃热循环仪15min，变性的蛋白-80℃保存待用。配置浓度为10％的SDS-PAGE电泳凝胶，待凝胶充分凝固后，冲洗净孔中碎胶块并按蛋白浓度上样。开始电泳时，设置电压为100V并电泳持续15min，当染料进入分离胶时，改置电压为180V，继续电泳，直至染料到达凝胶底部为止。紧接着，依分离胶的尺寸剪出PVDF膜，并将目的蛋白的凝胶敷上PVDF膜，然后一起置于转膜液中平衡10min。接通电源后，在冰浴环境下，200mA恒流1～2h，将胶上的目的蛋白全部转移至PVDF膜上。取清洗好的PVDF膜置入经TBST Buffer稀释的5％脱脂奶粉的孵育盒中，于摇床上封闭2h (室温)。封闭完成后，用TBST洗涤3次(3×5min)。
一抗孵育：将PVDF膜放入一抗中(一抗浓度：AKT1：2000；Bcl-2 1:2000；Bax 1:5000； caspase3 1:2000；caspase9 1:1000；P-Akt 1:1000；JNK 1:1000；P-JNK 1:1000；IKBα1:2000；β-actin 1:100000)，摇床上孵育过夜(4℃)；PVDF膜经TBST洗涤3次(3×5min)。二抗孵育：PVDF膜置入二抗(稀释浓度：1:5000)中并于摇床上孵育2-3h(室温)；最后，PVDF膜再经TBST洗涤3次(3×10min)。洗涤后的PVDF膜平铺到曝光板上，往上均匀滴加ECL发光液(A：B＝1:1,v/v)，反应1min后，曝光成像。通过凝胶图像分析成像系统对样品进行扫描分析，检测蛋白相对表达情况。具体公式如下：
Figure GDA0003734005720000101
数据处理：
采用GraphPad Prism 8.0进行统计于分析，所有实验数据均以均数±标准差
Figure GDA0003734005720000102
表示。Tukey测试被用于组间比较，*p<0.05被认为具有统计学意义。
3、实验结果
如图3(A)所示，用不同浓度(4、8、16μM/L)的CuA-3和CU处理Caco2细胞后，均能以浓度依赖形式诱导P-JNK和IκBα的表达(P<0.01)，并同时抑制P-AKT的表达(P< 0.01)；如图3(B)所示，与CU相比，CuA-3在4、8、16μM/L浓度下均表现出更强的效应(P<0.05)；
在CU和CuA-3的作用下，促凋亡蛋白Bax，Caspase-3和Caspase-9也呈现出浓度依赖式递增；其中，低、中浓度下CuA-3表现出显著的优势(P<0.01)，关于对抗凋亡蛋白Bcl-2的调控，CuA-3仅在高浓度作用下对其有明显抑制作用，并且与对照组和CU组比较具有显著性差异(P<0.01)。
实施例9：单羰基类姜黄素类化合物 裸鼠体内抗肿瘤实验
1、实验材料
SPF级5周龄BALB/c免疫缺陷小鼠(购自北京斯贝福生物科技有限公司，动物实验伦理申请受理号：20200614)，姜黄素，人源性结肠癌Caco2细胞系，以实施例6中优选的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-3。
2、实验方法
1)裸鼠皮下移植瘤模型的建立：所有体内实验方案均经西南医科大学动物伦理委员会批准，实验严格按照实验动物护理和使用指南进行。新购裸鼠于SPF级饲养环境下适应性生活 1周，待所有裸鼠体重处于14～16g后，通过肿瘤细胞皮下注射的方式建立皮下移植瘤模型。将生长状态良好的Caco2细胞消化并收集后，PBS缓冲液清洗2次(除去培养基中的血清)，随后用PBS缓冲液配制成6×107个/mL的细胞悬液。将裸鼠的接种部位用碘伏消毒后采用无菌注射针(胰岛素级)于小鼠右髋关节的皮下注射100μL的Caco2细胞悬液。
2)实验分组及给药：待裸鼠瘤体成型且体积生长至100mm3左右时，20只体质均匀的裸鼠被随机分为4组，分别为：空白对照组、CU组、替加氟(Tegafur)阳性对照组及CuA-3测试组。以上每组均采用口服给药方式，所有实验组每隔1天给药一次，给药剂量为50mg/kg。所有实验组的其余实验条件均一致。
3)实验观察及瘤体体积大小的计算：所有实验组自第一次给药起，每间隔1天测量裸鼠体重，观察其生长状态和动物学行为。同时，每间隔一天通过游标卡尺测量皮下瘤体的长径 (a,mm)和短径(b,mm)并按下式计算瘤体体积，并根据测量数据绘制各组的变化曲线。
Figure GDA0003734005720000111
3、实验结果
表3给药期间裸鼠体重和瘤体体积变化(
Figure GDA0003734005720000121
n＝5)
Figure GDA0003734005720000122
表4瘤重和抑瘤率(
Figure GDA0003734005720000123
n＝5)
Figure GDA0003734005720000124
裸鼠在给药期间的体重能够间接反映出肿瘤的生长状况及药物的体内毒性。如图4(D) 和表3所示，整个给药期间，四组裸鼠的体重相对于最初体重均在增加，表明在设置的给药浓度和给药间隔下，裸鼠均能够耐受。具体而言，空白组裸鼠的体重持续增长，最终的体重最大；CU组体重虽持续增长，但增长趋势略缓于空白组；仅管CuA-3组最后两天略有下降，但最终体重位于第二梯度，这可能需要验证此药的长期安全性；Tegafur组于15天是体重明显呈下降趋势，也真实反映出Tegafur的体内毒性。如图4(A、B和C)所示，所有组的裸鼠肿瘤体都随时间呈不同程度的生长。其中，空白组瘤体生长最快，其生长曲线几乎呈线性关系。鉴于对动物福利及动物伦理的考虑，以空白组平均瘤体体积小于1000mm3作为实验终止的标准，最终瘤重和抑制率见表4。
实施例10：单羰基类姜黄素类化合物 抑制5-羟色胺再摄取实验
1、实验材料
盐酸氟西汀、肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞、以实施例6中优选的单羰基类姜黄素类化合物 CuA-3。
2、实验方法
取对数生长期的PC12细胞，种板，待24h贴壁后，加入40μM盐酸氟西汀，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养3h，加入不同浓度(25、50、100、200和400μM)的ASP染色处理后，以PBS清洗两次，在激发波长475nm，发射波长605nm处读数，进行计算统计以确定荧光物质的最佳相应浓度。
再次取对数生长期的PC12细胞，种板，待24h贴壁后，加入梯度浓度的CuA-3溶液，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养3h，加入ASP染色处理后，以PBS清洗两次，在激发波长475nm，发射波长605nm处读数，进行计算统计以确定化合物对5-HT转运体(SERT) 的抑制率。
3、实验结果
表5 CuA-3干预后5-HT转运体(SERT)相对表达量
Figure GDA0003734005720000131
通过25、50、100、200和400μM的ASP对SERT进行染色，以最大响应值确定最佳浓度，即100μM。如表5和图5所示，经CuA-3处理3h后，相较于对照组(抑制率＝0) 其各浓度下转运体抑制率呈浓度依赖性增加。简言之，CuA-3能够通过抑制5-HT转运体来抑制5-HT的再摄取。以上结果表明CuA-3可通过抑制5-HT再摄取从而实现抗抑郁作用。
最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实验而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单羰基类姜黄素类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述姜黄素类化合物由如下结构表示：
Figure DEST_PATH_GDA0003734005720000021
。
2.如权利要求1所述的单羰基类姜黄素类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括有盐酸盐、硫酸盐。
3.如权利要求1所述的单羰基类姜黄素类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述结构CuA-4的具体制备步骤如下：
取3，4-二氢-2H-吡喃28.4~56.8份和香草醛14.14~28.18份在0.16~0.32份4-甲基苯磺酸吡啶鎓的二氯甲烷悬浮液中于室温下反应12~24 h，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ浓缩后，用饱和NaHCO3溶液洗涤2~4次，并用无水Na2SO2干燥，获得香草醛保护物；
在室温下将香草醛保护物3.47~6.94份和1-甲基-4-哌啶酮1.735~3.47份的乙醇溶液搅拌20~40 min，然后缓慢滴加8.2% NaOH乙醇溶液3.47~6.94份，并继续反应12~24 h，得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ通过层析柱色谱分离纯化，乙酸乙酯：石油醚=1：3，v/v，得到黄色固体化合物CuA-4。
4.如权利要求3所述的单羰基类姜黄素类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述3，4-二氢-2H-吡喃为28.4份、香草醛为14.14份、4-甲基苯磺酸吡啶鎓为0.16份、室温下反应时间为12h、香草醛保护物3.47份、1-甲基-4-哌啶酮1.735份、搅拌时间为20min、 8.2% NaOH乙醇溶液为3.47份、继续反应时间为12h。
5.如权利要求1~2任一项所述的单羰基类姜黄素类化合物CuA-1在制备抗阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症、宫颈癌、肝癌、肺癌的药物中的应用。
6.如权利要求1~2任一项所述的单羰基类姜黄素类化合物CuA-2在制备抗阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症、宫颈癌、肝癌、结肠癌的药物中的应用。
7.如权利要求1~2任一项所述的单羰基类姜黄素类化合物CuA-3、CuA-4在制备抗阿尔兹海默症、帕金森综合症、抑郁症、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的药物中的应用。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、栓剂。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、栓剂。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、栓剂。
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