CN108309994A - 异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用 - Google Patents

异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108309994A
CN108309994A CN201711431395.0A CN201711431395A CN108309994A CN 108309994 A CN108309994 A CN 108309994A CN 201711431395 A CN201711431395 A CN 201711431395A CN 108309994 A CN108309994 A CN 108309994A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnesium isoglycyrrhetate
cancer
magnesium
antineoplastic immune
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711431395.0A
Other languages
English (en)
Inventor
周文丽
王杰军
缪雨青
董方圆
江昌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Second Affiliated Hospital Army Medical University
Original Assignee
Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Second Affiliated Hospital Army Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd, Second Affiliated Hospital Army Medical University filed Critical Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority to CN201711431395.0A priority Critical patent/CN108309994A/zh
Publication of CN108309994A publication Critical patent/CN108309994A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。本发明证实了异甘草酸镁对胃癌抗肿瘤免疫调控中的作用和机制，也为其在结直肠癌、肺癌等其他癌种中抗肿瘤免疫治疗的进一步研究奠定了坚实的理论基础。本发明为异甘草酸镁除保肝治疗外提供了一种新用途，也为抗肿瘤免疫治疗提供了新的思路。

Description

异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
背景技术
作为严重影响人类健康的恶性疾病，癌症发生与很多因素有关，而大约20％的癌症与由感染、暴露于刺激物或自身免疫疾病引起的慢性炎症有关，持续的炎症可以使病变从感染或者自身免疫性的炎症进展为肿瘤(Kundu J K,Surh Y J.Inflammation:gearingthe journey to cancer[J].Mutation Research/fundamental&Molecular Mechanismsof Mutagenesis,2008,659:15.)。慢性肝炎、肝硬化是肝细胞癌发生发展的确定性危险因素(Chan S L,Wong V W,Qin S,et al.Infection and Cancer:The Case of Hepatitis B[J].J Clin Oncol,2016,34:83-90.)；溃疡性结肠炎患者比无肠炎患者有大于10倍可能性罹患结肠癌(Itzkowitz S H,Yio X.Inflammation and cancer IV.Colorectal cancerin inflammatory bowel disease:the role of inflammation[J].AjpGastrointestinal&Liver Physiology,2004,287:G7.)；幽门螺杆菌(Hp)的慢性感染是胃癌确定的最强有力危险因素，全球90％的胃癌新发病例都归因于幽门螺杆菌(Hp)(1、Plummer M,Franceschi S,Vignat J,et al.Global burden of gastric cancerattributable to Helicobacter pylori[J].Int J Cancer,2015,136:487-90.2、deMartel C,Ferlay J,Franceschi S,et al.Global burden of cancers attributable toinfections in 2008:a review and synthetic analysis.Lancet Oncol 2012；13:607-15.)；宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)慢性感染亦有着明确的关系(Iversen O E,Miranda M J,Ulied A,et al.Immunogenicity of the 9-Valent HPV Vaccine Using2-Dose Regimens in Girls and Boys vs a 3-Dose Regimen in Women[J].Jama,2016.)；还有慢性胰腺炎与胰腺癌，慢性胆囊炎与胆囊癌，EB病毒感染与鼻咽癌，二氧化硅吸入、吸烟与肺癌、支气管癌等。在2015年的中国肿瘤统计学年报中显示，肿瘤发生的原因中可避免的最大部分为慢性感染，这部分所占比例在中国约29％(Chen W,Zheng R,Baade P D,etal.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66:115-32.)。因此，控制炎症的发生发展对减少肿瘤发病率有着重要作用。目前，预防乙肝病毒(HBV)感染的疫苗和根治Hp感染的三、四联疗法已经普遍应用，而预防宫颈癌的HPV疫苗也上市。在最近的随机试验中，筛查和根治Hp已被证实可以降低患胃癌风险(Herrero R,Parsonnet J,Greenberg E R.Prevention of gastric cancer[J].Jama,2014,312:1197-8.)。流行病学研究表明定期给予非甾体抗炎药物(NSAID)比如阿司匹林，降低了来自散发性结肠直肠癌死亡率并且在家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者中引起腺瘤消退(Oshima M,Taketo M M.COXselectivity and animal models for colon cancer[J].Current PharmaceuticalDesign,2002,8:1021-34.)。
此外，肿瘤的发展和侵袭转移也与炎症密切相关(Mantovani A,Allavena P,Sica,et al.Review Article Cancer-related inflammation[J].Nature,2008:436-444.)。肿瘤相关炎症能够通过促进血管新生、促进肿瘤转移、抑制抗肿瘤免疫应答及改变肿瘤细胞对化疗药的敏感性等方面促进肿瘤的生长和进展。这种作用主要依赖肿瘤微环境(TME，tumor microenvironment)实现。肿瘤微环境中有大量炎症细胞浸润，包括肥大细胞、树突状细胞(DC)、T细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等，他们是肿瘤微环境的重要组成成分，发挥了促进或抑制肿瘤的重要作用。持续存在的炎症细胞及其炎性细胞因子亦能将肿瘤相关炎性微环境转化为免疫抑制微环境从而促进肿瘤进展。即使在流行病学上与明显的炎症无关的肿瘤(如乳腺癌)，癌基因的活化亦会导致炎症细胞的聚集及炎症因子的产生，而这些炎性细胞因子又能募集大量免疫抑制细胞至肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫，从而造成肿瘤免疫逃逸(Mantovani A.Cancer:Inflaming metastasis[J].Nature,2009,457:36.)。很多研究提示抗肿瘤免疫能力仅仅在肿瘤最初始的阶段存在。肝癌微环境中的细胞毒T(CD8+T)细胞的密度随着肿瘤的生长逐渐下降，而肝癌微环境中Treg细胞/CD8+T细胞比例是肝癌预后的独立预测指标(Gao Q,Qiu S J,Fan J,et al.Gao Q,Qiu SJ,FanJ,Zhou J,Wang XY,Xiao YS,Xu Y,Li YW,Tang ZYIntratumoral balance of regulatoryand cytotoxic T cell is associated with prognosis of hepatocellular carcinomaafter resection.J Clin Onc 25:2586-2593[J].Journal of ClinicalOncology,2007,25:2586-2593.)。因此，2011年提出将选择性抗炎药物作为肿瘤治疗的新策略。
胃癌是全球范围内第五大常见的恶性肿瘤，据统计2012年全球有951,600例新发病例，有723，100人死于胃癌，而其发病率在东亚地区尤其高(Torre L A,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65:87-108.)。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状，大多数胃癌病例就诊时已是晚期，治疗也多局限于细胞毒性药物，预后一般都较差(Catalano V,Labianca R,Beretta G D,et al.Gastriccancer[J].Critical Reviews in Oncology/hematology,2009,71:127.)。大量研究已经证明炎症和胃癌存在相关性(Walduck A,Andersen LP,Raghavan S.Inflammation,Immunity,and Vaccines for Helicobacter pylori Infection.Helicobacter.2015,20Suppl 1:17-25.Kanae Echizen,Osamu Hirose,Yusuke Maeda,and MasanobuOshima.Inflammation in gastric cancer:Interplay of the COX-2/prostaglandinE2and Toll‐like receptor/MyD88pathways.Cancer Sci.2016,107(4):391–397.)，胃癌的发生发展常经历正常粘膜→炎症→癌前病变→早期胃癌→进展期胃癌，胃和十二指肠产生炎症，黏膜细胞变性、坏死、炎症细胞浸润，黏膜局部微环境发生变化，如果炎症反复或长期存在，黏膜细胞逐渐出现恶变，最终导致胃癌的发生。考虑到胃癌的发生发展和慢性炎症的紧密联系，寻找通过抗炎来实现抗肿瘤作用的药物并发现其机制是本发明人的工作重心。
发明人自2005年一直从事炎症与胃癌发生的研究，在胃癌荷瘤小鼠模型中通过代谢组学研究发现，约50％影响胃癌化疗敏感性的分子与炎症因子磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)密切相关(Wang X,Yan SK,Dai WX,Liu XR,Zhang WD,Wang JJ.A metabonomicapproach to chemosensitivity prediction of cisplatin plus 5-fluorouracil in ahuman xenograft model of gastric cancer.Int J Cancer.2010,127(12):2841-50)。研究表明PLA2表达与肿瘤侵入、转移和淋巴结转移相关；包括我们课题组在内的多项研究均观察到：与正常胃黏膜组织相比，炎症和早期胃癌组织中PLA2高表达，晚期胃癌低表达且与预后差相关(Xing XF,Li H,Zhong XY,et al.Phospholipase A2group IIA expressioncorrelates with prolonged survival in gastric cancer.Histopathology 2011,59(2):198-206.Zhang X,Wu Q,Gan L,Yu GZ,Wang R,Wang ZS,Wang JJ,Wang X.Reducedgroup IVA phospholipase A2expression is associated with unfavorable outcomefor patients with gastric cancer.Med Oncol 2013,30(1):454.)。我们对866例有完整临床资料胃癌患者的原发肿瘤及配对癌旁粘膜组织进行PLA2免疫组化染色，癌旁组织表达阳性率为84％(694/826)，癌组织中表达阳性率为49.3％(417/845)(Zhang X,Wu Q,Gan L,Yu GZ,Wang R,Wang ZS,Wang JJ,Wang X.Reduced group IVA phospholipaseA2expression is associated with unfavorable outcome for patients with gastriccancer.Med Oncol 2013,30(1):454.)。在高表达PLA2的胃癌细胞株SGC7901中，当通过RNA干扰或使用PLA2抑制剂后明显抑制肿瘤细胞的增殖及迁移。
甘草是广泛应用于食品和药物的草本植物，从甘草中分离提取出来的三萜类成分甘草酸，经人体代谢可产生甘草次酸(GA)，其为PLA2的抑制剂。作为甘草酸的主要代谢产物，GA具有很强的药理活性，包括抗炎、保肝、抗病毒、抗氧化、抗过敏等(Ming L J,Yin AC.Therapeutic effects of glycyrrhizic acid[J].Natural Product Communications,2013,8:415.)。异甘草酸镁(MgIG)是甘草酸的第四代制剂，较以往的甘草酸制剂疗效更好，副作用更少，目前在临床普遍用于治疗慢性病毒性肝炎，改善肝功能异常。
目前尚未有文献报道异甘草酸镁在胃癌动物模型中具有治疗胃癌的作用，并体内实验研究证明异甘草酸镁通过对调节胃癌微环境发挥治疗胃癌抗肿瘤免疫调控的作用及相关机制研究。
发明内容
本发明的目的在于提供异甘草酸镁的新用途，特别是在抗肿瘤免疫调控治疗中的应用。本发明发现约50％影响胃癌化疗敏感性的分子与PLA2密切相关，异甘草酸镁正是PLA2的抑制剂。本发明发现，异甘草酸镁并非通过对肿瘤细胞的细胞毒作用直接杀伤而发挥抗肿瘤活性，而是主要通过抑制促进癌症发展的细胞因子表达、改变炎症细胞分布及功能，发挥抗肿瘤免疫调控作用。
本发明的第一方面，提供异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
进一步的，所述的异甘草酸镁在制备胃癌抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
进一步的，所述的异甘草酸镁抑制胃癌肿瘤生长，延长生存期。
进一步的，所述的异甘草酸镁抑制促进癌症发展的细胞因子表达、改变炎症细胞分布及功能，发挥抗肿瘤免疫调控作用。
进一步的，所述的异甘草酸镁广泛调节胃癌肿瘤微环境并增强抗肿瘤免疫，表现为抑制促进癌症发展的细胞因子表达、改变炎症细胞分布及功能。
更进一步的，所述的异甘草酸镁通过广泛下调趋化因子、促癌细胞因子，上调抗癌细胞因子的表达调控胃癌的发展。
更进一步的，所述的异甘草酸镁通过上调胃癌肿瘤组织中的肥大细胞、CD8+T细胞、Treg细胞和CD4+T细胞数量及分布抑制胃癌进展。
更进一步的，所述的异甘草酸镁通过调控胃癌微环境中巨噬细胞向M1极化从而控制胃癌进展。
进一步的，所述的异甘草酸镁在制备其他肿瘤如结直肠癌、肺癌等抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
进一步的，所述的抗肿瘤免疫调控治疗药物为注射剂，给药方式包括：静脉、局部给药等。
本发明的第二方面，提供一种抗肿瘤免疫调控治疗药物，其活性成分为异甘草酸镁。
进一步的，所述的抗肿瘤治疗药物为胃癌、结直肠癌、肺癌抗肿瘤免疫调控治疗药物。
进一步的，所述的抗肿瘤治疗药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明的有益效果在于：
本发明从体内动物实验研究异甘草酸镁对胃癌免疫调控治疗作用，并在体内及体外实验中从其改善肿瘤微环境角度探讨其可能的作用机制。
本发明通过动物实验发现，异甘草酸镁能够降低小鼠皮下种植胃癌的瘤重和瘤体积，并显著延长荷瘤小鼠生存期。实验进一步证明，异甘草酸镁可以广范围调节胃癌微环境中炎症因子和免疫细胞，可能通过调节微环境，改变免疫抑制状态从而间接杀伤肿瘤，主要表现为异甘草酸镁可能通过调节小鼠胃癌组织中趋化因子、炎性细胞因子的表达调控胃癌的发展；异甘草酸镁可能通过调节小鼠胃癌组织中Treg、CD4+T、CD8+T细胞密度从而抑制胃癌进展以及异甘草酸镁极有可能是通过NF-κB调控胃癌微环境中巨噬细胞向M1极化从而控制胃癌进展。
本发明体外实验MTT法检测发现，200ug/ml异甘草酸镁对胃癌细胞株MFC、结直肠癌细胞SW620、肺癌细胞NCI-H1299的抑制率分别为21.7±4.6％、14.6±2.5％、19.2±1.2％(图6)。
本发明证实了异甘草酸镁对胃癌抗肿瘤免疫调控中的作用和机制，也为其在结直肠癌、肺癌等其他癌种中抗肿瘤免疫治疗的进一步研究奠定了坚实的理论基础。
本发明为异甘草酸镁除保肝治疗外提供了一种新用途，也为抗肿瘤免疫治疗提供了新的思路。
附图说明
图1：胃癌小鼠模型药物干预后肿瘤组织大体标本观察。
如图所示A为荷瘤小鼠+生理盐水空白对照组；B为异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)组；C为异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组；D为化疗药物(5-FU)组；E为化疗药物(5-FU)+异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)联合用药组；F为化疗药物(5-FU)+异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)联合用药组。
图2：异甘草酸镁对皮下移植瘤胃癌小鼠瘤重瘤体积及小鼠生存期的干预作用。
其中，A为异甘草酸镁对皮下移植瘤胃癌小鼠瘤重的干预作用，如图所示，5-FU组、异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组，5-FU+异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)组，5-FU+异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组与生理盐水空白对照组相比较瘤重减轻；B为异甘草酸镁对皮下移植瘤胃癌小鼠瘤体积的干预作用，异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组，5-FU组，5-FU+异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)组，5-FU+异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组与对照组相比瘤体积缩小；C为异甘草酸镁对皮下移植瘤胃癌小鼠生存期的干预作用，异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组，5-FU组，5-FU+异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)组，5-FU+异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)组与对照组相比生存期延长。
图3：异甘草酸镁对胃癌小鼠微环境中炎症细胞因子和NF-κB通路关键分子表达的调节作用。
其中A为小鼠胃癌组织的转录组芯片PCR assay实验结果的热图，黑色表示基因表达量不变，绿色表示基因的表达量下调，红色表示基因的表达量上调，且颜色越亮上调/下调幅度越大。如图所示，可以看到与对照组相比，天晴甘美低剂量组(L)、化疗和天晴甘美低剂量联合用药组(FL)大部分所测炎症和免疫相关基因下调，部分基因上调，变化的幅度较小；天晴甘美高剂量组(H)的较多基因明显下调，5-Fu化疗组(F)的基因表达水平广泛下调但下调幅度小；B-E为转录组芯片结果的分组柱状图分析，其中B为趋化因子相对表达量；C为趋化因子受体相对表达量；D为白介素及受体的相对表达量；E为TLRs/MyD88/NF-κB相对表达量。由图可见，与肿瘤相关炎性细胞募集相关的趋化因子、趋化因子受体、促进肿瘤进展的白介素类以及与肿瘤生长和转移都密切相关的NF-κB通路关键分子的表达水平都广泛下调。F-I为对芯片中关键分子的验证，其中F为异甘草酸镁对胃癌小鼠的肿瘤组织中NF-κB通路关键基因表达的调节，如图所示其关键分子表达在用药后都受到抑制，无明显的剂量依赖性，结果与芯片一致；G为异甘草酸镁对胃癌小鼠的肿瘤组织中几个趋化因子及受体表达的调节，如图所示，处理组的CXCL1、CXCL2、CXCR1表达量与对照组相比大多是有所降低的。除了甘草酸镁低剂量组，其他组结果与转录组芯片的趋势一致；H为对几个关键白介素的验证，如图所示，异甘草酸镁下调了微环境中促癌的IL1R1、IL10、IL23A表达，上调了抗癌IL2、IL12的表达。可以看出，异甘草酸镁广泛下调趋化因子、促癌白介素、NF-kB通路，上调抗癌白介的表达。
图4：异甘草酸镁对胃癌小鼠炎症微环境中免疫细胞的调节作用。
其中A-B为小鼠胃癌微环境中肥大细胞染色及阳性细胞率(×400)；C为小鼠胃癌微环境中Treg细胞染色(×200)；D-E为小鼠胃癌微环境中CD4+T细胞染色及阳性细胞率(×200)；F-G为小鼠胃癌微环境中CD8+T细胞染色及阳性细胞率(×200)。(N:空白对照组，L:异甘草酸镁低剂量组，FL:化疗联合异甘草酸镁低剂量组，F:化疗组，H:异甘草酸镁高剂量组)由图可见，异甘草酸镁处理使胃癌小鼠肿瘤组织中的肥大细胞、CD8+T细胞密度增加，而Treg细胞和CD4+T细胞密度增加。
图5：异甘草酸镁对肿瘤炎症微环境中巨噬细胞极化的调节作用。
其中A、B为HE染色观察小鼠胃癌微环境中巨噬细胞染色及阳性细胞率(×200)(N:空白对照组，L:异甘草酸镁低剂量组，FL:化疗联合异甘草酸镁低剂量组，F:化疗组，H:异甘草酸镁高剂量组)；C为体外条件培养基模拟胃癌微环境，经异甘草酸镁干预后WesternBlotting检测巨噬细胞极化相关蛋白表达情况；D为体外条件培养基模拟胃癌微环境，经异甘草酸镁干预后ELISA检测细胞因子的变化情况。由图可见，经过MFC胃癌细胞条件培养基诱导后，巨噬细胞raw264.7向M1型分化的增多，而向M2型分化的减少。
图6：异甘草酸镁对胃癌细胞株MFC、结直肠癌细胞SW620、肺癌细胞NCI-H1299的抑制率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例所用的异甘草酸镁(Magnesium isoglycyrrhizinate，商品名：天晴甘美)，生产厂商为南京正大天晴(Chia-tai Tianqing)药业股份有限公司，剂型为粉剂，纯度99％。采用细胞培养液将异甘草酸镁稀释成不同浓度的药物溶液。
实施例所用的小鼠胃癌细胞株MFC购于中科院上海生命科学研究所细胞资源中心；实施例所用的成年雄性615小鼠，4到6周龄，购自于中科院血液研究中心。
实施例1.异甘草酸镁对胃癌小鼠的抑瘤作用
一、荷瘤小鼠的制备及给药：
每只615实验鼠荷瘤数量为3×106个，溶于100μl的PBS中，无菌注射器注入每只小鼠右颈部皮下荷瘤。在荷瘤第5天，肉眼可见膨出生长的瘤体后随机分成6组，分别为生理盐水(control)组、化疗药物(5-FU)组、异甘草酸镁低剂量(MgIG Low)组、异甘草酸镁高剂量(MgIG High)组、化疗药物+异甘草酸镁低剂量(5-Fu+MgIG Low)组和化疗药物+异甘草酸镁高剂量(5-Fu+MgIG High)组，每组12只，并分别按组别给药：异甘草酸镁低剂量组和高剂量组，给药剂量分别为50mg/kg，200mg/kg，溶解在0.5ml PBS中，腹腔注射，在荷瘤成功后的第一天(荷瘤造模的第5天)起给药直至荷瘤成功后的第14天停止给药；化疗药物组，每周两次给予化疗药物氟尿嘧啶，剂量17mg/kg，溶解在0.5ml PBS中，腹腔给药，在荷瘤成功后的第一天(荷瘤造模的第5天)起给药直至荷瘤成功后的第14天停止给药；化疗药物联合异甘草酸镁低剂量组和高剂量组，每周两次给予化疗药物氟尿嘧啶，17mg/kg，溶解在0.5ml PBS中，腹腔给药，异甘草酸镁低剂量和高剂量，给药剂量分别为50mg/kg，200mg/kg，溶解在0.5ml PBS中，腹腔注射，在荷瘤成功后的第一天(荷瘤造模的第5天)起给药直至荷瘤成功后的第14天停止给药。
二、荷瘤小鼠标本的取材和测量：
每组12只小鼠中编号1-6的小鼠在腹腔给药14天后处死，通过比较各组瘤重和瘤体积大小判断异甘草酸镁对胃癌的作用：荷瘤第5天时肉眼可见肿瘤膨出生长，也可触及，每天用卡尺测量肿瘤组织的体积，用a表示肿瘤组织的最长径，用b表示肿瘤组织的最短径。瘤体积计算公式为：a×b2/2；在给药第14天后，处死小鼠，心脏采血同时剥取肿瘤组织称重。
每组12只小鼠中编号7-12的小鼠在腹腔给药后观察其生存状态和生存期长短，通过比较各组生存期长短判断异甘草酸镁对胃癌的作用。
结果如图1和图2所示，异甘草酸镁处理后胃癌小鼠瘤重和瘤体积减小，生存期延长，且该作用堪比化疗药物氟尿嘧啶。该实验结果表明，在体内异甘草酸镁对小鼠胃癌具有明显抑制作用。
实施例2.异甘草酸镁对胃癌小鼠微环境中炎症细胞因子和NF-κB通路关键分子表达的调节作用
一、转录组芯片检测细胞炎症与免疫相关因子表达情况：
我们选择了一款能检测96个与炎症和自身免疫相关的分子表达水平的转录组芯片(Inflammatory response and autoimmunity PCR Array：供应商SABiosciences，货号PAHS-0772)来检测异甘草酸镁对胃癌小鼠肿瘤组织内这些重要的细胞因子表达水平的影响，主要为趋化因子家族及受体、白介素家族及受体以及NF–κB通路关键分子。将对照组和各处理组均取每组编号前三的小鼠组织分别匀浆，用trizol提RNA后混样，即每组所提三份RNA混合成一份RNA，按组别编号后逆转录为cDNA进行转录组芯片实验。如图3A-E所示，与肿瘤相关炎性细胞募集相关的趋化因子、趋化因子受体、促进肿瘤进展的白介素类以及与肿瘤生长和转移都密切相关的NF-κB通路关键分子的表达水平在异甘草酸镁处理组都广泛下调。
二、qPCR验证转录组芯片结果：
用每组编号前三的小鼠胃癌组织所提的RNA逆转录后进行荧光定量PCR，验证了以下分子：CXCL1、CXCL2、CXCR1、TLR4、TLR6、MyD88、IL1R1、IL1β、IL23A、IL10，加测了IL2和IL12。如图3F所示，各实验组均分别与空白对照组两两相比，处理组的CXCL1、CXCR1表达量与对照组相比均有所降低，但异甘草酸镁降低CXCL1、CXCR1的作用不呈剂量依赖性。而CXCL2的表达量在异甘草酸镁低剂量组和5-Fu化疗组升高，在异甘草酸镁高剂量组和联合用药组降低，与CXCL1、CXCR1一致(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005)。除了甘草酸镁低剂量组，其他组结果与转录组芯片的趋势基本一致。总得来讲，异甘草酸镁在胃癌小鼠的肿瘤组织中下调了趋化因子及受体的表达，5-Fu也有类似的效果。图3G中处理组TLR4、TLR6、MyD88的表达量都比对照组低，但无明显的剂量依赖性，结果大致与转录组芯片结果一致(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005)。基本可以认为，异甘草酸镁在胃癌小鼠的肿瘤组织中下调了TLR炎症通路关键基因的表达，与5-Fu化疗组类似。图3H可以看出各处理组的IL1R1和IL23A表达水平均比处理组低，且异甘草酸镁处理组与化疗组没有明显的差异，与转录组芯片结果基本符合。IL10在异甘草酸镁处理组和联合用药组表达水平均降低，而化疗组表达上调，与转录组芯片结果有差别。而IL1β的表达水平在化疗组和化疗联合异甘草酸镁低剂量组略高，在单纯异甘草酸镁处理组无显著差别，这与转录组芯片结果不一致。IL2和IL12表达水平在异甘草酸镁高剂量组和化疗联合甘美低剂量组均有明显的上调，而化疗组则下调或无明显差异(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005)。结合芯片的结果基本可以认为，不同于5-Fu化疗药的作用，异甘草酸镁在胃癌小鼠的肿瘤组织中下调了的IL1R1、IL10、IL23A表达，上调了IL2、IL12的表达。
实施例3.异甘草酸镁对胃癌小鼠炎症微环境中的免疫细胞的广泛调节作用
一、胃癌小鼠肿瘤组织中肥大细胞染色情况：
使用甲苯胺蓝染色，脱蜡后清水冲洗载玻片，加入1％甲苯胺蓝溶液30分钟。蒸馏水洗去浮色。钾矾卡红液中染色30分钟后用水充分冲洗。快速用95％和无水乙醇脱水后甲苯透明和封固。如图4A所示，肥大细胞被染为紫色(放大倍数：×400)。我们对每组图片进行阳性细胞数计数并计算阳性率，计数方法为在10cm×8cm大小的图片中随机圈出3个2cm×2cm大小的方框，对方框内的细胞总数、阳性染色细胞数分别进行计数并计算阳性率，阳性率＝阳性细胞数/细胞总数(以下计数方法均相同)。图4B为计数结果，可以看出，异甘草酸镁低剂量、高剂量组和联合用药组的肥大细胞密度均略大于对照，且联合用药组阳性率最高，而化疗组则略低于对照组。可以说异甘草酸镁和5-Fu对胃癌小鼠肿瘤组织中的肥大细胞密度无明显影响。
二、胃癌小鼠肿瘤组织中Treg细胞染色情况：
使用foxp3+标记调节性T细胞，石蜡切片脱蜡至水，组织切片置于盛有柠檬酸抗原修复缓冲液的高压锅内。先把修复液烧开，再把切片放入修复液中，使修复液把切片淹没到，盖上锅盖，等喷气后计时3min。自然冷却后将玻片置于PBS中洗涤3次，每次10min。阻断内源性过氧化物酶后3％BSA封闭。在切片上滴加一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜后PBS洗涤；切片甩干后在圈内滴加HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育1h后PBS洗涤。切片甩干后滴加DAB显色液，显微镜下观察待看到阳性棕黄色时终止显色。苏木素复染细胞核。如图4C所示，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显示的阳性细胞即Treg细胞为棕黄色(放大倍数：×200)。从图中可以明显看出空白对照组Treg细胞染色阳性细胞密度大，而异甘草酸镁处理组和化疗组组以及联合用药组阳性细胞数都基本为零。因此异甘草酸镁和5-Fu均可显著降低胃癌小鼠肿瘤组织中的调节性T细胞密度。
三、胃癌小鼠肿瘤组织中CD4+T细胞染色情况：
石蜡切片脱蜡至水，将切片置于PH9.0的EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中微波炉加热，冷却后将玻片置于PBS中脱色3次，每次5min。阻断内源性过氧化物酶后3％BSA封闭。在切片上滴加一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜后PBS洗涤；切片甩干后在圈内滴加HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育1h后PBS洗涤。切片甩干后滴加DAB显色液，显微镜下观察待看到阳性棕黄色时终止显色。苏木素复染细胞核。图4D为各组CD4+T细胞的染色结果，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显示的阳性细胞即CD4+T细胞为棕黄色(放大倍数：×200)。对每组图片进行阳性细胞数计数并计算阳性率，计数结果如图4E所示，CD4+T细胞密度在异甘草酸镁处理组和化疗组组均有所降低，无明显的剂量依赖性。
四、胃癌小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞染色情况：
石蜡切片脱蜡至水，将切片置于PH9.0的EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中微波炉加热，冷却后将玻片置于PBS中脱色3次，每次5min。阻断内源性过氧化物酶后3％BSA封闭。在切片上滴加一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜后PBS洗涤；切片甩干后在圈内滴加HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育1h后PBS洗涤。切片甩干后滴加DAB显色液，显微镜下观察待看到阳性棕黄色时终止显色。苏木素复染细胞核。图4F为各组CD8+T细胞的染色结果，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显示的阳性细胞即CD8+T细胞为棕黄色(放大倍数：×200)。对每组图片进行阳性细胞数计数并计算阳性率，计数结果如图4G所示，异甘草酸镁处理组的CD8+T细胞密度明显大于对照组且呈剂量依赖性，化疗组的CD8+T细胞密度也大于对照组但小于异甘草酸镁处理组，联合用药组的CD8+T细胞密度则最高。可以得出，异甘草酸镁和5-Fu均可显著提高胃癌小鼠肿瘤组织中的CD8+T细胞密度，且异甘草酸镁作用比5-Fu更显著。
实施例4.异甘草酸镁对胃癌小鼠微环境中巨噬细胞极化的调节作用
一、胃癌小鼠肿瘤组织中巨噬细胞染色情况：
石蜡切片脱蜡至水，组织切片置于盛有柠檬酸抗原修复缓冲液的高压锅内。先把修复液烧开，再把切片放入修复液中，使修复液把切片淹没到，盖上锅盖，等喷气后计时3min。自然冷却后将玻片置于PBS中洗涤3次，每次10min。阻断内源性过氧化物酶后3％BSA封闭。在切片上滴加一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜后PBS洗涤；切片甩干后在圈内滴加HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育1h后PBS洗涤。切片甩干后滴加DAB显色液，显微镜下观察待看到阳性棕黄色时终止显色。苏木素复染细胞核。图5A为各组CD68+细胞的染色结果，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显示的阳性细胞即巨噬细胞为棕黄色(放大倍数：×200)。对每组图片进行阳性细胞数计数并计算阳性率，如图5B所示，异甘草酸镁处理组的巨噬细胞密度明显大于对照组且呈剂量依赖性，化疗组的巨噬细胞密度则略小于对照组，联合用药组的巨噬细胞密度大于对照组小于异甘草酸镁低剂量组。可以得出，异甘草酸镁可显著提高胃癌小鼠肿瘤组织中的巨噬细胞密度，而5-Fu则没有这个作用。
二、体外条件培养基模拟胃癌微环境：
将处于对数生长期的MFC细胞以1×104个/ml的细胞密度接种于6孔板中，贴壁24小时后更换为含有不同浓度异甘草酸镁的完全培养基(GIBCO公司的DMEM，10％胎牛血清，1％的青-链霉素)，以未加异甘草酸镁组为空白对照，以加20ng/ml IL4处理组、20ng/mlIFN-γ处理组为阳性对照，异甘草酸镁分别设50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml三个浓度，于药物干预72小时后收集上清，1000rpm离心10分钟后得到条件培养基(condition medium,CM)，-80℃冰箱保存备用。按1×104个/孔的细胞密度，将小鼠巨噬细胞raw264.7接种于6孔板，贴壁24小时后换成条件培养基培养，以完全培养基组为空白对照，诱导培养72h后分别收集细胞蛋白和收集上清。
采用RIPA(放射免疫测定法，radio immunoprecipitation assay，购自碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，收集细胞蛋白，通过蛋白印迹法(western blot)检测iNOS、IL12和Arg1的表达情况。如图5C所示，20ng/ml IL4已知会诱导巨噬细胞分化为高表达Arg1的M2，20ng/ml IFN-γ已知可诱导巨噬细胞分化为高表达iNOS和IL12的M1，MFC CM为MFC条件培养基培养的巨噬细胞组，MgIG CM则为在培养基中加入不同浓度异甘草酸镁培养MFC细胞后得到的条件培养基培养巨噬细胞组。可见MFC可诱导巨噬细胞高表达Arg1，与IL4处理结果一致，而培养基中加入异甘草酸镁培养的MFC上清则诱导巨噬细胞高表达iNOS和IL12，低表达Arg1，与IFN-γ处理一致。
收集的细胞上清1000rpm离心10分钟后用ELISA试剂盒(美国ebioscience)对IL6、IL10、IL12、TGF-β、TNF-α、VEGF-A的表达水平进行检测。如图5D所示，MFC细胞的条件培养基培养RAW264.7后培养基中的IL6、IL10、TGF-β、TNF-α、VEGF-A表达水平较DMEM完全培养基培养RAW264.7后的培养基高，而IL12表达水平下调。而在MFC的培养基中加入不同浓度异甘草酸镁后获得的条件培养基再去培养RAW264.7细胞，其升高的IL6、IL10、TGF-β、TNF-α、VEGF-A水平又下调，下调的IL12水平复上调，但该作用无明显的剂量依赖性(***p<0.0005)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁在制备胃癌抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁抑制胃癌肿瘤生长，延长生存期。
4.根据权利要求2所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁抑制促进癌症发展的细胞因子表达、改变炎症细胞分布及功能，发挥抗肿瘤免疫调控作用。
5.根据权利要求2所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁广泛调节胃癌肿瘤微环境并增强抗肿瘤免疫，表现为抑制促进癌症发展的细胞因子表达、改变炎症细胞分布及功能。
6.根据权利要求2所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁通过广泛下调趋化因子、促癌细胞因子，上调抗癌细胞因子的表达调控胃癌的发展。
7.根据权利要求2所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁通过上调胃癌肿瘤组织中的肥大细胞、CD8+T细胞、Treg细胞和CD4+T细胞数量及分布抑制胃癌进展。
8.根据权利要求2所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁通过调控胃癌微环境中巨噬细胞向M1极化从而控制胃癌进展。
9.根据权利要求1所述的异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用，其特征在于，所述的异甘草酸镁在制备结直肠癌、肺癌抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用。
10.一种抗肿瘤免疫调控治疗药物，其活性成分为异甘草酸镁。
CN201711431395.0A 2017-12-26 2017-12-26 异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用 Pending CN108309994A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711431395.0A CN108309994A (zh) 2017-12-26 2017-12-26 异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711431395.0A CN108309994A (zh) 2017-12-26 2017-12-26 异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108309994A true CN108309994A (zh) 2018-07-24

Family

ID=62892721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711431395.0A Pending CN108309994A (zh) 2017-12-26 2017-12-26 异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108309994A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113140321A (zh) * 2021-05-20 2021-07-20 中国药科大学 运用PK-sim预测异甘草酸镁在人体中暴露浓度的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任炳楠，等: "异甘草酸镁对H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子表达的影响", 《中国老年学杂志》 *
董方圆: "异甘草酸镁在胃癌中的抗炎抗肿瘤作用及其机制的初步研究", 《第二军医大学硕士学位论文》 *
郭曼,等: "异甘草酸镁对奥沙利铂在人胃癌裸鼠模型中抗肿瘤作用的影响研究", 《川北医学院学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113140321A (zh) * 2021-05-20 2021-07-20 中国药科大学 运用PK-sim预测异甘草酸镁在人体中暴露浓度的方法
CN113140321B (zh) * 2021-05-20 2023-12-19 中国药科大学 运用PK-sim预测异甘草酸镁在人体中暴露浓度的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Anti-tumor effect of evodiamine by inducing Akt-mediated apoptosis in hepatocellular carcinoma
Huang et al. Deoxyelephantopin, a novel multifunctional agent, suppresses mammary tumour growth and lung metastasis and doubles survival time in mice
Wang et al. Anti-tumor bioactivities of curcumin on mice loaded with gastric carcinoma
Fu et al. Targeting of the tumor microenvironment by curcumin
Wang et al. Osthole inhibits pancreatic cancer progression by directly exerting negative effects on cancer cells and attenuating tumor-infiltrating M2 macrophages
Yang et al. Tanshinone IIA inhibits the growth, attenuates the stemness and induces the apoptosis of human glioma stem cells
Kang et al. Total flavonoids of Taraxacum mongolicum inhibit non-small cell lung cancer by regulating immune function
Zhao et al. Nifuroxazide prompts antitumor immune response of TCL-loaded DC in mice with orthotopically-implanted hepatocarcinoma
Li et al. Curcumol Inhibits Lung Adenocarcinoma Growth and Metastasis via Inactivation of PI3K/AKT and Wnt/β-Catenin Pathway
Liang et al. β-elemene suppresses the malignant behavior of esophageal cancer cells by regulating the phosphorylation of AKT
Song et al. Gecko crude peptides induce apoptosis in human liver carcinoma cells in vitro and exert antitumor activity in a mouse ascites H22 xenograft model
Fan et al. Protective effects of recombinant lactoferrin with different iron saturations on enteritis injury in young mice
Shen et al. Low-dose salinomycin inhibits breast cancer metastasis by repolarizing tumor hijacked macrophages toward the M1 phenotype
Huang et al. Antrodia cinnamomea produces anti-angiogenic effects by inhibiting the VEGFR2 signaling pathway
Ren et al. Co-expression of ING4 and P53 enhances hypopharyngeal cancer chemosensitivity to cisplatin in vivo
Li et al. Multi-omics joint analysis reveals the mechanism of action of the traditional Chinese medicine Marsdenia tenacissima (Roxb.) Moon in the treatment of hepatocellular carcinoma
CN104586873B (zh) 木蝴蝶苷a在制备治疗癌症药物中的应用
Tan et al. Erchen Plus Huiyanzhuyu Decoction Inhibits the Growth of Laryngeal Carcinoma in a Mouse Model of Phlegm‐Coagulation‐Blood‐Stasis Syndrome via the STAT3/Cyclin D1 Pathway
WO2011011984A1 (zh) 甾醇衍生物及其合成和应用
CN108309994A (zh) 异甘草酸镁在制备抗肿瘤免疫调控治疗药物中的应用
CN113230259A (zh) 逆转紫杉醇耐药性的化合物伊曲茶碱的药物用途
WO2023151202A1 (zh) 用于治疗实体肿瘤的免疫治疗组合药物
McCubrey et al. Novel approaches to target cancer initiating cells–Eliminating the root of the cancer
Zhang et al. Multiple antigenic polypeptide composed of heparanase B‑cell epitopes shrinks human hepatocellular carcinoma in mice
CN108403941B (zh) 一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180724