CN113230259A - 逆转紫杉醇耐药性的化合物伊曲茶碱的药物用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种伊曲茶碱在制备逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用，涉及肿瘤细胞耐药性治疗的技术领域。本发明所述伊曲茶碱与紫杉醇联合用于制备逆转肿瘤紫杉醇耐药性的药物。研究发现，伊曲茶碱能显著降低MDR1基因和蛋白表达水平，伊曲茶碱与化疗药物紫杉醇联用能够显著提高耐药细胞对化疗药物的敏感性，从而逆转肿瘤耐药，大大提高疗效。动物实验也证明伊曲茶碱能有效抑制耐药动物模型皮下肿瘤生长速度，逆转紫杉醇耐药性。这些结果表明伊曲茶碱联用紫杉醇，能有效增强紫杉醇对耐受性肿瘤的治疗效果。临床发现许多恶性肿瘤细胞对紫杉醇具有耐药性，因此伊曲茶碱有较好的开发价值和应用前景。

Description

逆转紫杉醇耐药性的化合物伊曲茶碱的药物用途
技术领域
本发明涉及一种伊曲茶碱的新医药用途，具体涉及伊曲茶碱在逆转肿瘤紫杉醇耐药性中的应用，属于肿瘤细胞耐药性治疗的技术领域。
背景技术
肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等是全球癌症相关死亡的主要几种癌症，这些肿瘤的标准治疗方法包括手术切除、化疗和放射治疗，由于大多数癌症患者被发现时已处于癌症晚期，化疗被认为是治疗癌症的中坚力量。紫杉醇是紫杉烷抗有丝分裂剂，由于具有良好的肿瘤杀伤作用，其作为肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等癌症的一线治疗方案，在临床上已经使用多年。然而，经过一段时间的治疗后，肿瘤细胞常会通过多种机制对紫杉醇产生耐药性，这种耐药现象的发生严重限制了紫杉醇的临床化疗效果。多项研究表明，P-糖蛋白((P-glycoprotein,P-gp)的过表达是肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药的最常见和最重要的因素之一。P-gp是一种独特的ATP依赖性膜转运蛋白,在人体中存在两种P-gp基因，即MDR1和MDR2，MDR2的功能尚未确定，MDR1的过表达往往导致肿瘤细胞产生耐药性。目前，临床上解决P-gp过表达所采用的第一种方法是将P-gp抑制剂与化疗药联用。虽然已经有三代P-gp抑制剂，但是由于毒副作用较大，体内实验效果不好等原因，能用于临床且有效的少之又少。
腺苷是一种免疫抑制代谢物，可通过与免疫细胞上表达的G蛋白偶联腺苷受体A2a(A2aR)结合，抑制免疫细胞的免疫响应能力，在肿瘤微环境中这一抑制过程的结果就表现为肿瘤细胞的免疫逃逸，使肿瘤细胞无法被免疫细胞杀伤。肿瘤微环境中缺氧、低pH、高度细胞更新、高CD39和CD73的表达的环境都是腺苷高水平产生的重要因素。关于伊曲茶碱(CAS No.155270-99-8)的体外活性已经经过临床前研究证明，伊曲茶碱单药或者联合其他免疫治疗药物均可表现出良好的抗肿瘤活性。但目前没有伊曲茶碱逆转肿瘤耐药的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于寻找一种靶向A2AR通路的肿瘤治疗新途径，提出了伊曲茶碱在制备逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用。伊曲茶碱降低耐药肿瘤细胞中耐药基因MDR1表达，与抗癌药物联用可以逆转肿瘤耐药，从而大大提高疗效。
本发明提供了伊曲茶碱在制备逆转肿瘤细胞耐药性的药物中的应用，所述伊曲茶碱与紫杉醇联合用于制备所述药物。
具体的，所述伊曲茶碱用于抑制耐药性肿瘤细胞中的耐药蛋白MDR1表达。
其中，所述伊曲茶碱逆转肿瘤细胞对紫杉醇产生的耐药性。
优选地，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等。
经本发明对化疗耐药非小细胞肺癌细胞和裸鼠模型(非小细胞肺癌细胞为A549细胞，化疗药物为紫杉醇)的实验表明，伊曲茶碱通过降低MDR1蛋白和MDR1 mRNA的表达来抑制P-gp的活性，伊曲茶碱与紫杉醇联用通过调整细胞周期(延缓细胞生长)、加速细胞凋亡、抑制细胞增殖等方式改变化疗耐药的非小细胞肺癌细胞生长。经本发明的体内动物实验证明伊曲茶碱能有效抑制耐药非小细胞肺癌动物模型皮下肿瘤生长速度，逆转紫杉醇耐药性。
附图说明
图1为紫杉醇和紫杉醇联合不同浓度伊曲茶碱作用于紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞以及正常非小细胞肺癌细胞后细胞增殖变化图，其中(A)A549/Taxol细胞的细胞增殖变化；(B)A549细胞的增殖变化。
图2为不同浓度伊曲茶碱单独处理和紫杉醇联合作用于紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞以及正常非小细胞肺癌细胞后细胞形态学变化图，其中(A)A549/Taxol细胞的细胞形态学变化；(B)A549细胞的形态学变化。
图3为不同浓度伊曲茶碱单独处理和紫杉醇联合作用于紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞以及正常非小细胞肺癌细胞后细胞凋亡变化图，其中(A)A549/Taxol细胞的细胞凋亡变化；(B)A549细胞的凋亡变化。
图4为不同浓度伊曲茶碱单独处理和紫杉醇联合作用于紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞以及正常非小细胞肺癌细胞后细胞周期变化图，其中(A)A549/Taxol细胞的细胞周期变化；(B)A549细胞的周期变化。
图5为不同浓度伊曲茶碱单独处理和紫杉醇联合作用于紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞以及正常非小细胞肺癌细胞后细胞迁移变化图，其中(A)A549/Taxol细胞的细胞迁移变化；(B)A549细胞的迁移变化。
图6为浓度梯度与时间梯度下伊曲茶碱对A549/Taxol细胞中MDR1mRNA表达的影响。其中(A)伊曲茶碱(浓度分别为1μM，5μM，10μM)作用于A549/Taxol细胞(24h)(B)伊曲茶碱分别作用12h、24h、36h，48h于A549/Taxol细胞(10μM)
图7为浓度梯度与时间梯度下伊曲茶碱对A549/Taxol细胞中MDR1蛋白的抑制。其中(A)伊曲茶碱(浓度分别为1μM，5μM，10μM)作用于A549/Taxol细胞(24h)(B)伊曲茶碱分别作用12h、24h、36h，48h于A549/Taxol细胞(10μM)
图8为A549细胞和A549/Taxol细胞中细胞凋亡和细胞周期相关蛋白的表达情况。其中(A)A549/Taxol细胞；(B)A549细胞。
图9为伊曲茶碱、紫杉醇以及紫杉醇与伊曲茶碱联用在A549/Taxol细胞裸鼠移植瘤中对裸鼠体重、肿瘤重量，肿瘤体积的影响以及cleaved caspase 3免疫组化的结果。其中(A)肿瘤图；(B)肿瘤的重量；(C)实验过程中裸鼠体重变化情况；(D)实验过程中肿瘤体积变化情况；(E)cleaved caspase 3免疫组化实验结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1伊曲茶碱抑制紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞体外增殖
(1)检测不同浓度伊曲茶碱对紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞系增殖的作用
取对数期的A549/Taxol细胞和A549细胞接种于96孔板，细胞密度均为5*104/ml。将96孔板置于培养箱内培养24h，待细胞贴壁后，根据治疗组的设置，每孔加入不同浓度的紫杉醇(0.16μM,0.31μM,0.63μM,1.3μM,2.5μM,5.0μM,10μM,20μM)和固定浓度的伊曲茶碱(10μM)；同时设置阴性对照组。将96孔板置于培养箱内培养48h后，每孔加入20μl MTT工作液(5mg/ml),继续培养4h后，取出，小心倒去96孔板中的培养液，于每孔中加入10％的二甲亚砜于振荡仪上振荡直到蓝紫色结晶完全溶解，然后于酶联免疫检测仪上以480nm波长处测定吸光度值。根据吸光度(A)值分别计算出不同浓度的紫杉醇联合伊曲茶碱(10μM)对两种细胞的抑制率：细胞抑制率＝(阴性对照组A值-实验组A值)/阴性对照组A值*100％。
实验重复3次，结果取平均值±标准差。结果如图1和表1中所示，可以看出，伊曲茶碱与紫杉醇联用后，明显降低了A549/Taxol细胞的存活率，IC50值从(4.926±0.102)μM降低到了(0.2739±0.022)μM(表1)。同样的实验条件处理A549细胞(图1B)，联合处理组相较于紫杉醇组，细胞的存活率并无明显变化。MTT实验结果初步显示，伊曲茶碱能够逆转MDR1高表达的A549/Taxol细胞的紫杉醇耐药性，但是不能增加紫杉醇对于几乎没有MDR1表达的A549细胞的毒性作用。
表1：不同浓度伊曲茶碱处理条件下A549/Taxol细胞和A549细胞的IC50
Figure BDA0003014071860000041
其中，Taxol表示紫杉醇，KW-6002表示伊曲茶碱。
实施例2伊曲茶碱促进紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞株形态学变化
根据实验要求分别给予相应处理：DMSO阴性对照组，伊曲茶碱组(1μM)，伊曲茶碱组(5μM)，伊曲茶碱组(10μM)，紫杉醇组(0.15μM)，以上三个浓度伊曲分别与紫杉醇(0.15μM)联用组。作用24h后，取出在倒置显微镜下观察并拍照；弃去培养液，用1mL PBS清洗两到三次，吸去PBS,用4％多聚甲醇固定15min，然后再用1mL PBS摇晃清洗3次，每孔中避光加入500μL的Hoechst 33258染料，避光作用10min，再用1mL PBS以摇晃的方式洗涤3次；使用倒置荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变并拍照。结果如图2所示，对于A549/Taxol细胞(图2A)，联用组细胞以依赖于伊曲茶碱浓度的方式表现出明显的细胞变圆、萎缩、漂浮和密度降低等细胞凋亡现象，Hoechst33258染色后发现，联用组以依赖于伊曲茶碱浓度的方式出现了染色质凝集，细胞核固缩等很明显的细胞凋亡形态学改变。
实施例3伊曲茶碱促进紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞株凋亡
根据实验要求分别给予相应处理，DMSO阴性对照组，伊曲茶碱组(1μM)，伊曲茶碱组(5μM)，伊曲茶碱组(10μM)，紫杉醇组(0.15μM)，以上三个浓度伊曲分别与紫杉醇(0.15μM)联用组。作用24h后，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化，在倒置显微镜下观察，待绝大部分细胞悬浮起来后，立即收集细胞，用PBS洗涤细胞两次，然后离心1500rpm,5min,收集细胞5*105个；加入300μL的Bingding Buffer悬浮细胞，避光加入Annexin V-FITC混匀后，再加入3μL的Propidium Iodide,混匀；室温避光，反应15min；用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
重复实验3-4次，实验数据采用Flowjo 10软件进行数据分析。结果如图3所示，对于A549/Taxol细胞，联用组以伊曲茶碱的联用浓度依赖性增加A549/Taxol细胞的凋亡率，且差异具有显著统计学意义。
实施例4伊曲茶碱改变紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞株周期
根据实验要求分别给予相应处理，DMSO阴性对照组，伊曲茶碱组(1μM)，伊曲茶碱组(5μM)，伊曲茶碱组(10μM)，紫杉醇组(0.15μM)，以上三个浓度伊曲分别与紫杉醇(0.15μM)联用组。作用24h后，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化，在倒置显微镜下观察，待绝大部分细胞悬浮起来后，立即收集细胞，用PBS洗涤细胞两次，然后离心1500rpm,5min,收集细胞5*105个；用70％的乙醇固定收集的细胞悬液，置于4℃冰箱中过夜；第二天用PBS洗去乙醇固定液后，避光加入300μL的PI-RNase染色混匀，室温避光反应15min；用流式细胞仪进行检测。
重复实验3-4次，实验数据采用Flowjo 10软件进行数据分析。结果如图4所示，紫杉醇与伊曲茶碱的联用组合以浓度依赖性增加A549/Taxol细胞的G2/M期周期阻滞，而不能增加由紫杉醇引起的A549细胞G2/M期阻滞。
实施例5伊曲茶碱降低紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞株迁移
根据实验要求分别给予相应处理，DMSO阴性对照组，伊曲茶碱组(1μM)，伊曲茶碱组(5μM)，伊曲茶碱组(10μM)，紫杉醇组(0.15μM)，以上三个浓度伊曲分别与紫杉醇(0.15μM)联用组。作用24h后，重新消化，离心，并用无血清的RPMI1640培养基重悬，经Counstar计数后，加入无血清的RPMI1640培养基稀释细胞浓度至2.5*105/mL，取200μL于不含基质胶的Transwell上室，同时在下室加入700μL的含10％FBS的RPMI1640培养基，并放于37℃，5％CO2的培养箱内培养24h。先在显微镜下观察，看有无掉落下来的细胞。然后把小室小心放在装有PBS的孔中清洗3次，加入800μL的4％多聚甲醛固定小室15min。然后把多聚甲醛吸去，将小室放置5min，挥干，再放入加有800μL结晶紫的小孔中，染色15min，用PBS清洗小室，用棉球小心擦去上室的细胞，待小室晾干后，在正置显微镜下观察细胞分布并随机选取5个视野拍照，通过观察从Transwell上室迁移到下室的细胞数，以评价细胞的迁移能力。
重复实验3-4次，结果如图5所示，对于A549/Taxol细胞，伊曲茶碱和紫杉醇联用组细胞的迁移能力，以伊曲茶碱的联用浓度的增加逐渐降低，且与其他各组相比均有明显差异。表明，伊曲茶碱和紫杉醇联用能够逆转A549/Taxol的耐药作用，伊曲茶碱能提高紫杉醇对于A549/Taxol细胞的敏感性。
实施例6伊曲茶碱降低MDR1mRNA表达水平
不同浓度(1μM,5μM,10μM)伊曲茶碱以及不同作用时间(12h,24h,36h,48h)下，qRT-PCR实验检验MDR1mRNA表达水平。重复实验3-4次，结果如图6所示，伊曲茶碱能够以浓度和时间依赖性的方式降低MDR1 mRNA的表达水平；且各组间相比较差异具有统计学意义。
实施例7伊曲茶碱降低MDR1蛋白表达水平
不同浓度(1μM,5μM,10μM)伊曲茶碱以及不同作用时间(12h,24h,36h,48h)下，Western blot实验检验MDR1蛋白表达水平。重复实验3-4次，结果如图7所示，与上述实施例6实验结果一致，伊曲茶碱能够以浓度和时间依赖性的方式降低MDR1蛋白的表达水平。
实施例8伊曲茶碱影响相关蛋白表达水平
根据实验要求，对对数生长期的细胞A549和A549/Taxol均给予不同的处理，分别为阴险对照组，紫杉醇的含药培养基，浓度为0.15μM，伊曲茶碱的含药培养基，浓度为10μM，紫杉醇(0.15μM)和伊曲茶碱(10μM)的组合含药培养基；置于37℃，5％CO2的培养箱内培养，作用24h后取出。Western Blot检测各实验组细胞凋亡相关蛋白：bcl-xl,bax,cleaved-caspase3和细胞周期相关蛋白CDK1，cyclinB1的表达情况。重复实验3-4次，结果如图8所示，对于A549/Taxol细胞，紫杉醇与伊曲茶碱联用处理组的Bax蛋白的表达没有明显改变，但明显降低了bcl-xl蛋白的表达水平，同时cleaved caspase-3蛋白的表达水平明显升高。联用组相对于紫杉醇单独处理组，细胞周期蛋白CDK1，cyclinB1的表达水平明显降低，且与其他3组相比，具有明显差异。
实施例9伊曲茶碱抑制紫杉醇耐药非小细胞肺癌细胞体内生长，并逆转紫杉醇耐药
裸鼠饲养于室温18～22℃，相对湿度50％～70％的SPF级环境中。给予普通的饲料和清洁用水。动物实验遵守动物实验管理规范。实验步骤：将对数生长期的A549/Taxol细胞，消化离心，并重悬于200μL的PBS中，接种至4～6周，体重20～25g的无胸腺的雌性免疫缺陷裸鼠(BALB/c-nu/nu)的腋下，细胞浓度为1*106个/200μL。大约一周左右，待形成的肿瘤平均直径约0.6cm时，将裸鼠随机分为阴性对照组(生理盐水)，紫杉醇组(10mg/kg),，伊曲茶碱组(100mg/kg)，以及紫杉醇和伊曲茶碱联用组(紫杉醇,10mg/kg；伊曲茶碱,100mg/kg)。各种分别给予相应的处理。每3天记录一次裸鼠的体重变化和腋下肿瘤大小(直径A：较长直径；直径B：较短直径)，绘制各组肿瘤平均以及随时间变化的线图，结果见图9。根据公式V＝1/2*A*B2计算肿瘤体积。21天后，将各组裸鼠处死，并分离腋下肿瘤，称重，计算药物对裸鼠腋下肿瘤的生长抑制率：生长抑制率(IR)＝1-实验组肿瘤平均重量/对照组肿瘤平均重量*100％。将分离得到的肿瘤置于-80℃冰箱中，用于后续实验。
将浸泡于4％福尔马林的肿瘤组织取出做成石蜡切片，切片用苏木精和曙红染色。在电子显微镜下用不同的放大倍数观察切片组织之间的差异。
免疫组化实验步骤；
1抗原/切片的准备：切片厚度3μM，60～65℃烤片1h，备用。
2切片脱蜡，水化，依次为二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→无水乙醇→95％乙醇→90％乙醇→85％乙醇→75％乙醇各10min；
3 1×PBS缓冲液(0.01M，p H7.2)洗涤切片3×5min；
4石蜡切片组织抗原修复，高压修复方式，在高压锅喷气后开始记时，时间2min；
5高压抗原修复方法如下：
(1)配制抗原修复液，柠檬酸盐修复液(0.01M，p H6.0，方法为柠檬酸0.4g，柠檬酸钠或者柠檬酸三钠3g，加蒸馏水至1000ml即可，此时液体的pH值正好是6.0)；
(2)抗原修复采用高压修复方法。先将切片专用耐高温高压切片架放好，然后放入还没有加热的柠檬酸盐液中；
(3)将高压锅盖好放至普通电炉上加热，从开始加热至压力锅喷气约要15～20min，时间长短视抗原修复液液体量多少而不同；
(4)当压力锅喷气后盖上锅盖顶的压力阀，锅内压力会开始升高，当压力达到极限时，压力锅会通过压力阀喷气，从喷气时开始计时，约1.5～2min后将压力锅端离电炉；
(5)自然冷却压力锅，此过程约15～20min，可以用冰块或冰水在压力锅外面助冷；
(6)打开锅盖，取出切片，1×PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)洗涤切片5min，进入下一步染色程序。取出抗原修复盒，待修复液自然冷却，此过程约20～30min 1×PBS缓冲液(0.01M，p H 7.2)洗涤切片3×5min；
(7)3％H2O2(以PBS缓冲液或甲醇配置)滴加在组织切片上，室温(18～30℃)静置10min；PBS洗2～3次各5min。
6滴加正常山羊血清封闭液,室温10～15min。甩去多余液体。
7滴加第一抗体50μL，置于湿盒内，4℃过夜，防止切片干燥。
8 1×PBS洗3次各5min；
9滴加复合二抗，室温静置20min；
10 1×PBS洗3次各5min；
11统计学分析
本研究中的所有实验数据均来自于3次以上重复实验，实验数据结果以Mean±SEM表示，P值代表有无统计学差异，P>0.05为无统计学差异；P<0.05为差异有统计学意义，用*和#表示；P<0.01为有显著的统计学差异，用**和##表示；P<0.001代表有显著的统计学差异，用***和###表示。

Claims (9)

1.一种伊曲茶碱在药物制备中的应用，其特征在于，所述的伊曲茶碱或药物用于逆转肿瘤细胞耐药性。
2.根据权利要求1所述的伊曲茶碱在药物制备中的应用，其特征在于，所述的伊曲茶碱或药物用于抑制耐药性肿瘤细胞中的耐药蛋白MDR1表达。
3.根据权利要求1或2所述的伊曲茶碱在药物制备中的应用，其特征在于，所述伊曲茶碱或药物用于克服肿瘤细胞对紫杉醇产生的耐药性。
4.根据权利要求3所述的伊曲茶碱在制备逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用，其特征在于，所针对的肿瘤包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等使用紫杉醇或紫杉醇前药进行化疗的所有肿瘤。
5.根据权利要求4所述的伊曲茶碱在制备逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为对紫杉醇产生耐药性的非小细胞肺癌。
6.根据权利要求3所述的伊曲茶碱在制备逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用，其特征在于，所述伊曲茶碱的浓度范围为0.5-20μM。
7.一种药物组合物，其特征在于，由伊曲茶碱和紫杉醇组成。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的伊曲茶碱和紫杉醇的摩尔比为10：0.16～20。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药用辅料；
所述的伊曲茶碱在组合物中的浓度范围为0.5-20μM。
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