CN111000851B

CN111000851B - 丹参酮i在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用

Info

Publication number: CN111000851B
Application number: CN201911415271.2A
Authority: CN
Inventors: 崔树娜; 陈婷婷; 王梦梦
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111000851A

Abstract

本发明公开了丹参酮I在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用。相对于现有技术，本发明首次发现丹参酮I能够诱导肿瘤细胞自噬，对于宫颈癌、乳腺癌或肝癌，尤其是宫颈癌，治疗效果显著。研究证实丹参酮I抑制癌细胞生长，抑制癌细胞线粒体损伤和自噬，诱导肿瘤细胞自噬分子的表达，以及自噬分子LC3的切割。

Description

丹参酮I在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用

技术领域

本发明属于丹参酮I新用途技术领域，具体涉及丹参酮I在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用。

背景技术

宫颈癌是一种女性常见恶性肿瘤，其恶性程度高，发病率及术后复发率高，严重危害广大女性的身心健康。宫颈癌的治疗包括手术、放化疗和中医药治疗等。手术治疗是目前最有效可行的诊治方案，但手术主要适用于病情在IIB期以下的患者，并且具有局限性。对于中晚期的宫颈癌患者来说治疗手段主要选择放化疗。放化疗尽管能延缓肿瘤进展，延长患者生存期，但也会带来严重的放化疗毒副作用，导致患者的耐受力下降，影响治疗效果，放射疗法常对周围正常组织产生毒性，带来多项难以解决的并发症，如阴道弹性减退、放射性膀胱炎等，严重影响患者生活质量。化学治疗不仅对癌细胞具有杀伤作用更对正常机体细胞有毒副作用，并且会产生耐药性，治疗效果也不尽人意。因此寻找一种高效低毒的抗宫颈癌药物仍是临床研究和基础研究的重点和难点。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了丹参酮I在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

丹参酮I在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用。

所述丹参酮I化学结构式如下所示：

优选，所述肿瘤为宫颈癌、乳腺癌或肝癌。

丹参酮I在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

含有丹参酮I的组合物在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用。

优选，所述肿瘤为宫颈癌、乳腺癌或肝癌。

优选，所述组合物是以丹参酮I作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

含有丹参酮I的组合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

本发明所述丹参酮I在作为肿瘤细胞自噬诱导剂时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到诱导肿瘤细胞自噬的目的。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂等。

有益效果：相对于现有技术，本发明首次发现丹参酮I能够诱导肿瘤细胞自噬，对于宫颈癌、乳腺癌或肝癌，尤其是宫颈癌，治疗效果显著。研究证实丹参酮I抑制癌细胞生长，抑制癌细胞线粒体损伤和自噬，诱导肿瘤细胞自噬分子的表达，以及自噬分子LC3的切割。

附图说明

图1为采用WST-8法测定丹参酮I对Hela/Siha细胞活力的影响。使用不同浓度的丹参酮I作用宫颈癌细胞24h、48h。(

n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。DMSO为溶剂对照组；

图2为透射电镜实验观察丹参酮I对Hela细胞超微结构的影响。放大倍数：A、B、C、D：2580x，D图片中的右下角图片：3900x；

图3为透射电镜实验观察丹参酮I对Hela细胞超微结构的影响。放大倍数：A：3900xB：13500x C、D：23000x；

图4为流式实验观察丹参酮I对Hela细胞自噬蛋白LC-3B表达的影响。50μM的丹参酮I作用Hela细胞24h，DMSO为溶剂对照组。(

n＝3)。

图5为丹参酮I对Hela细胞自噬相关蛋白LC3B-I和LC3B-II的表达。DMSO为溶剂对照组(

n＝3)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例

1.实验技术和方法

(1)细胞增殖实验

将Hela和Siha细胞以1x10^5个/ml接种于96孔板，待2h后细胞贴壁，加入不同浓度丹参酮I(0，12.5，25，50μM)以及DMSO溶剂对照组，37℃、5％CO₂培养箱培育24h及48h后，每孔加入10μL的CCK8溶液，摇匀，置于温箱1h，用酶标仪检测仪波长450nm处各孔的光密度值(OD值)。

(2)细胞超微结构检测

将细胞按5*10⁵个/ml接种于10cm培养皿，对照组和实验组各8皿，培养24h后，除对照组外，50μM丹参酮I处理细胞，药物作用达24h后，将8皿细胞混悬液移入15mL离心管，加入适量PBS离心洗涤两次，将细胞收集到5ml离心管，2.5％戊二醛于4℃避光固定2.5h(固定1h后挑一下)，(戊二醛溶液对抗体有破坏作用，应避免与抗体同放一个冰箱)然后放冰床上避光送往测试中心，步骤如下：0.1M的PBS清洗3次，每次15分钟；1％锇酸固定1-1.5h，0.1M的PBS洗涤3-4次，15min/次，接着用乙醇梯度脱水(30％，50％，70％，80％，90％，95％，100％，各8min)加入100％丙酮8min；加入含无水硫酸钠的100％丙酮8min；浸透：丙酮与树脂以3:1的比例浸透(1ml，37℃烘箱1h)，丙酮与树脂以1:1的比例浸透(1.5ml，在通风橱中打开EP管盖自然挥发过夜)，纯树脂浸渍2h；包埋；聚合：(37℃烘箱放置12h后60℃烘箱放置48h)；打磨样品；超薄切片；采用CM100透射电镜下观察Hela细胞超微结构，并拍照记录。

(3)自噬相关分子LC-3B检测

取对数生长期Hela细胞，以5x10*5个/ml种于六孔板，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱培养2小时，设DMSO对照组，及50μM丹参酮I，药物刺激24h。24h后，将所有细胞转移至2mlEP管中，按400gx5min离心洗涤一次，后用0.1mlLC-3B工作液重悬，室温避光孵育1h。适量PBS离心洗涤两次。最后以0.5mlPBS重悬。采用FACS Aria SORP流式细胞仪检测Hela细胞加药刺激后是否有自噬的发生。

(4)免疫印迹检测自噬相关分子LC-3B的表达

Hela细胞以5x10*5个种于培养皿中，设DMSO组，25μM及50μM丹参酮I组，并设添加自噬抑制剂3-MA的DMSO，25μM及50μM丹参酮I组，共六组。药物刺激24h，提取蛋白。蛋白在分离胶中电泳约1.5h，后置于冰的环境下转膜约1h，5％脱脂奶粉封闭2h，孵育一抗，4度冰箱过夜。12-18h后，1％TBST洗膜，90rpm/min，每次10min，共三次。孵育二抗1.5h。洗膜三次，置于发光机下显色，观察加药后对自噬相关蛋白的影响。

2.试验结果：

(1)丹参酮I抑制宫颈癌细胞生长

CCK8结果显示丹参酮I具有显著抑制Hela/Siha细胞增殖的作用，并且与药物浓度和作用时间呈正比。药物作用24h和48h后，浓度(12.5-50μM)丹参酮I均对Hela/Siha细胞活性具有抑制作用，并且高浓度(50μM)丹参酮I抑制作用更明显，随着浓度的增加对Hela/Siha细胞活性抑制作用逐渐加强，如图1所示。

(2)丹参酮I抑制宫颈癌细胞线粒体损伤和自噬

透射电镜结果提示：对照组正常的Hela细胞表面存在丰富的微绒毛，细胞间连接较紧密，核内染色质分布均匀，核浆比约1∶1(图2.A)。胞质内可见粗面内质网，较少的线粒体，少量的脂滴(图2.C)；50μM丹参酮I刺激后的Hela细胞，可见细胞表面绒毛断裂，伪足不同程度断裂、变短、减少，细胞变大，细胞核变大，核浆比值大于1(图2.B、C)，核膜扭曲，核裂解，染色质固缩，分散成若干小块，边缘化，诱导凋亡(图2.C)，线粒体肿胀，空泡化(图3.B、D)，自噬泡增多(图3.B)，自噬小体形成(图2.D箭头指示)，丹参酮I作用Hela细胞，诱导线粒体损伤，发生自噬与凋亡。

(3)丹参酮I诱导Hela细胞自噬分子的表达

研究表明，LC3B蛋白与早期自噬过程中的吞噬泡形成有关，因此，通过流式细胞术检测丹参酮I对Hela细胞自噬相关蛋白LC3B的荧光表达的影响，结果提示，正常细胞(绿色)和溶剂对照组(红色)细胞正常情况下无自噬相关蛋白的表达，丹参酮I能够显著增强LC3B的表达(蓝色)。提示，丹参酮I能够诱导Hela细胞自噬。

(4)丹参酮I诱导Hela细胞自噬分子LC3的切割

LC3-II/I比值的变化可以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。结果显示丹参酮I可显著增加Hela细胞自噬相关蛋白LC3BII的表达。LC3-II/I比值显著增加。

Claims

1.丹参酮I作为唯一活性成分在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用，所述药物抑制Siha细胞增殖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。

3.丹参酮I作为唯一活性成分在制备治疗宫颈癌药物中的应用，所述药物抑制Siha细胞增殖。

4.含有丹参酮I作为唯一活性成分的组合物在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用，所述药物抑制Siha细胞增殖。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述组合物是以丹参酮I作为唯一活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

7.含有丹参酮I作为唯一活性成分的组合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用，所述药物抑制Siha细胞增殖。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组合物是以丹参酮I作为唯一活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。