CN106994123A

CN106994123A - 吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用

Info

Publication number: CN106994123A
Application number: CN201710200157.2A
Authority: CN
Inventors: 董子钢; 刘康栋; 刘方方
Original assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Current assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2017-08-01

Abstract

本发明涉及吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用。吲哚美辛，分子式为C₁₉H₁₆ClNO₄，分子量为357.79。本发明验证了吲哚美辛在人源化移植瘤模型（PDX）上预防食管癌和小鼠4T1乳腺癌细胞株移植模型上预防乳腺癌的显著效果。本发明通过分别将吲哚美辛处理人源性食管癌肿瘤和乳腺癌细胞移植小鼠，当对照组肿瘤体积达到1500立方毫米以上，结束实验。试验发现：吲哚美辛处理组小鼠的肿瘤体积与对照组比较明显变小，且具有显著的统计学差异，从而显示了吲哚美辛在预防食管癌和乳腺癌上能有显著的效果。通过给患者服用吲哚美辛，在临床上可预防和治疗食管癌和乳腺癌。

Description

吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用，尤其是其用作食管癌和乳腺癌预防、治疗药物在临床治疗中的应用。

背景技术

癌症已成为中国首位死亡原因，是严重的公共卫生问题。据统计结果显示，中国食管癌和乳腺癌也是最常见的癌症类型，也是最多见的癌症死亡原因。食管癌是常见的一种恶性肿瘤疾病，据相关的数据统计表明，食管癌的死亡率在我国恶性肿瘤死亡率的第二位，其中河北省的食管癌比较严重，占到了恶性肿瘤死亡率的第一位。乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，在过去的20年中，世界上多数国家乳腺癌的发病率均呈持续增长。根据相关文献报道，随着社会经济水品的发展，我国癌谱也发生了明显变化，今年我国女性乳腺癌发病率在城乡均呈明显上升趋势，居女性恶性肿瘤发病率的首位，乳腺癌成为了严重威胁我国妇女健康的疾病。

癌症是由环境、饮食以及生活方式与遗传因素协同作用的结果，由致癌物作用结合细胞遗传因素导致细胞遗传基因突变而逐渐发展为癌。癌症早期的临床症状不明显 ,当临床症状较为突出时,患者的病情已经处于中期或者晚期 , 所以选择安全有效的预防和治疗癌症的方法对于改善患者的预后及生活质量都具有重要意义。

吲哚美辛为非选择性的环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2）COX-2抑制剂，为常用的非甾体类抗炎药，是最强的前列腺素（PG）合成酶抑制剂之一，常用于解热及缓解炎性疼痛。目前还未有研究涉及吲哚美辛对癌症，尤其是食管癌或乳腺癌的作用。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用，尤其是其用作食管癌和乳腺癌预防、治疗药物在临床治疗中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用。吲哚美辛，化学名称：2-甲基-1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸，CAS号为53-86-1，分子式为C₁₉H₁₆ClNO₄，分子量为357.79。

具体的，吲哚美辛在制备预防和治疗食管癌或乳腺癌药物方面的应用，以及用作预防乳腺癌术后复发的药物，也就是说吲哚美辛在食管癌和乳腺癌的预防、术后复发的预防及临床治疗中的应用。

吲哚美辛可以与本领域常规辅料复配后制成片剂、胶丸、栓剂、针剂或乳膏剂等，用作预防和治疗癌症药物。吲哚美辛的剂量范围为1－4mg /kg。吲哚美辛包括以下几种规格，片剂：每片25mg。胶丸：每粒25mg、75mg。栓剂：每个25mg、75mg、100mg。针剂：1mg、10mg、20mg。乳膏剂：100mg、10g。

此外，吲哚美辛还可以与依氟鸟氨酸（DFMO）复配（吲哚美辛剂量为2mg/kg，DFMO剂量为3g/kg）后用作预防和治疗癌症药物，两者联合使用时可增强治疗效果。

本发明使用的PDX（patient derived xenograft）模型是利用癌症患者的癌组织在免疫缺陷小鼠身上建立的皮下移植瘤模型，依靠小鼠提供的微环境进行生长。该模型生物学稳定，保持了原代肿瘤的特点，异种移植的模型可能是最接近目前人类癌症特点。PDX模型减少了体外处理过程，能更好地保持患者临床肿瘤组织的原有生物学特性和组织学特征，并且PDX 模型取材于不同的患者，可以保留患者肿瘤的异质性，不仅可以检测治疗功效，也是符合癌症生物学治疗基本原则的一种工具和手段，还可以帮助测试新的抗肿瘤药物的疗效，同时也为肿瘤发生发展的机制研究提供了新的方法，为一对一的个体化抗癌治疗提供了可能. 本发明通过将吲哚美辛处理于食管癌PDX模型小鼠，发现：与对照组相比，小鼠肿瘤明显减小。在4T1小鼠乳腺癌细胞移植瘤小鼠模型上也有相同的抑制肿瘤生长效果。

本发明发现吲哚美辛在利用人新鲜肿瘤组织接种于免疫缺陷SCID小鼠皮下建立的食管癌PDX模型上有显著的抗肿瘤生长效果，能够起到食管癌复发预防的效果，并且吲哚美辛在4T1乳腺癌细胞移植瘤模型上有显著的抗肿瘤生长效果。本发明中，吲哚美辛在SCID小鼠的体内肿瘤治疗浓度为1－4mg/kg，也可以0.1－0.4mg/kg的剂量供患者服用。

本发明利用了COX1、COX2非选择性抑制剂吲哚美辛在食管癌和乳腺癌的复发预防中的增效作用，显著提高了食管癌和乳腺癌的复发预防效果。试验发现：吲哚美辛在预防食管癌和乳腺癌上能有显著的效果。通过给患者服用吲哚美辛，在临床上可预防和治疗食管癌和乳腺癌。

附图说明

图1为吲哚美辛在食管癌（编号：EG37P6）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为给药期间小鼠体重变化趋势图；

图2为吲哚美辛在食管癌（编号：EG37P6）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图；

图3为吲哚美辛在食管癌（编号：EG37P6）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为实验结束后，处死小鼠，称量出肿瘤的重量；

图4为吲哚美辛在食管癌（编号：EG37P6）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为对照组与给药组的肿瘤图片；

图5为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG5P3）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为给药期间小鼠体重变化趋势图；

图6为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG5P3）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图；

图7为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG5P3）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为实验结束后，处死小鼠，称量出肿瘤的重量；

图8为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG5P3）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为对照组与给药组的肿瘤图片；

图9为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG18P5）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为给药期间小鼠体重变化趋势图；

图10为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG18P5）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图；

图11为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG18P5）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为实验结束后，处死小鼠，称量出肿瘤的重量；

图12为吲哚美辛在食管癌（编号：HEG18P5）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为对照组与给药组的肿瘤图片；

图13为吲哚美辛在4T1乳腺癌移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为实验结束后，处死小鼠，称量出肿瘤的重量；

图14为吲哚美辛在4T1乳腺癌移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为乳腺癌肺转移情况；

图15为吲哚美辛在4T1乳腺癌移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为小鼠血浆里血栓素B2浓度；

图16为吲哚美辛在4T1乳腺癌移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为小鼠血浆里前列腺素E2浓度；

图17为吲哚美辛在4T1乳腺癌移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：图中为对照组与给药组小鼠肿瘤图片。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

吲哚美辛为非选择性的环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2）COX-2抑制剂，在很多肿瘤中有抗肿瘤作用，但未有研究表明吲哚美辛在治疗食管癌和乳腺癌上有效果。本发明主要特点在于使用了人源性异种移植模型。该模型保留了固有的基因和表型，是一种更接近人体肿瘤发生、发展过程的模型，对个体化治疗非常有意义的模型。本发明使用了两例PDX模型，试验结果表明：吲哚美辛可以治疗或者预防人食管癌的异种肿瘤移植模型鼠上肿瘤的生长，并且使用4T1乳腺癌细胞移植瘤模型鼠证实了吲哚美辛可以预防及治疗乳腺癌。

实施例：

材料与方法

1材料

1.1肿瘤组织

本发明使用了3例人食管癌组织标本。3种模型编号分别为EG37、HEG5和HEG18。EG37来源于河南省郑州大学一附院，男性，69岁。术后病理切片提示为：低分化，淋巴结无转移，病理分期：T2N0M0Ⅱa。HEG5来源于河南省肿瘤医院，男性，63岁，食管鳞癌，低分化。HEG18来源于河南省肿瘤医院，女性，73岁，食管低分化鳞癌，侵及外膜。本发明使用的EG37模型为第6代，HEG5为第3代，HEG18为第5代。

1.2 4T1乳腺癌细胞

4T1乳腺癌细胞购于ATCC细胞库。

1.3实验动物

本实施例中Cb-17SCID免疫缺陷小鼠与balb/c小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号为：SCXK(京)2012-0001。SPF级，SCID小鼠为5-6周龄，体重16-18g，雌鼠；balb/c小鼠为8周龄，体重20-22g，雌鼠。小鼠饲料购于北京科澳协力饲料有限公司。许可证号为：SCXK(京)2014-0010。实验动物饲养于中美（河南）荷美尔肿瘤研究院的动物设施内，在恒温（25-27℃）、恒湿（45%-50%）、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌（SPF级）饲养室条件下饲养，动物先放于有机塑料盒内（苏州市冯氏实验动物设备有限公司），再置于IVC系统饲养，每个饲养盒内饲养3-4只动物，经无菌处理的饲料供动物自由摄入，高温消毒的垫料每三天更换一次，笼具及饮水每三天紫外线消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。将实验动物在12:12小时光照/黑暗循环下饲养，可以自由接近食物和水，室温控制在21℃。

1.4 试剂

0.4%戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）：称量0.2g戊巴比妥钠溶解于50mL无菌蒸馏水中过滤；双抗：青霉素和链霉素（华北制药股份有限公司），两者浓度为500U/mL；生理盐水500mL一瓶（辰欣药业股份有限公司）；吲哚美辛（Sigma）；DFMO（武汉大华伟业医药化工有限公司）；RPMI-1640 细胞培养基；Trypsin-EDTA 胰酶消化液；细胞培养皿。

1.5仪器与器材：

海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Thermo 超净工作台；IVC饲养系统（苏州市冯氏实验动物设备有限公司）；眼科剪，手术镊，无菌培养皿，手术刀，溶药针，1ML注射器；细胞培养箱。

2. 人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

将新鲜肿瘤组织取出坏死组织，剪成直径为3立方毫米左右，塞入6周龄、18g左右的雌性小鼠的背部皮下。将小鼠放入小鼠IVC系统饲养。等待肿瘤形成约15mm左右，无菌切除皮下肿瘤，选择实性肿块，取材剪成3立方毫米小块，移植于另外小鼠。颈椎脱臼处死小鼠，肿瘤周围皮肤用75%酒精消毒，用溶药针扎开一个小口，用镊子撑开后取出肿瘤放到小鼠皮下。

用上述方法进行肿瘤传代，至第三代小鼠，小鼠皮下移植瘤均出现且肿瘤大小差异不大。再移植至免疫缺陷小鼠皮下，传三代。分别记录每一次皮下移植瘤小鼠肿瘤生长情况及成瘤率，皮下移植瘤等待肿瘤长到1.5mm时，取第四代小鼠皮下移植瘤标本，将组织10%甲醛固定，石蜡包埋，切片HE染色。

3. 4T1乳腺癌细胞移植瘤模型鼠的建立

将2×10⁵的4T1乳腺癌细胞溶于100uL无菌PBS中，注射于8周龄balb/c雌鼠的第四个乳房垫下。一周后小鼠乳房垫下有肿瘤凸起则视为模型建立成功。

4. 实验动物的治疗研究

4.1 吲哚美辛抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤生长

接种后一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组分10只以上。3组小鼠分别按照以下剂量自由饮水。当对照组小鼠肿瘤长到1500立方毫米左右时，终止实验，取下背部皮下肿瘤并称重。每周两次记录小鼠体重以及肿瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到15立方毫米左右（约40天），终止实验，取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照。分组如下所示。

（1）.饮用无菌蒸馏水（对照组），

（2）.每天以100mg/kg灌胃阿司匹林（阿司匹林组），

（3）.每天以1mg/kg 灌胃低剂量吲哚美辛（吲哚美辛低剂量组），

（4）.每天以4mg/kg 灌胃高剂量吲哚美辛（吲哚美辛高剂量组），

（5）.每天以2%剂量饮水依氟鸟氨酸，1mg/kg 灌胃高剂量吲哚美辛（依氟鸟氨酸DFMO与吲哚美辛低剂量组）。

4.2 吲哚美辛预防4T1乳腺癌细胞移植瘤小鼠肿瘤生长

4T1乳腺癌细胞移植于小鼠乳房垫下一周后开始给药。给药4周后处死小鼠，称量肿瘤重量。取小鼠血液。留取小鼠肿瘤组织和肺组织，将组织10%甲醛固定。分组如下所示。

（1）.饮用无菌蒸馏水（对照组），

（2）.每天以100mg/kg灌胃阿司匹林（阿司匹林组），

（4）.每天以4mg/kg 灌胃高剂量吲哚美辛（吲哚美辛高剂量组）。

实验结果

1.图1至图8为吲哚美辛在人食管癌PDX模型上对肿瘤的治疗效果。

1.1如图1所示，高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组对小鼠体重从给药第九天起与饮用蒸馏水的对照组相比有较明显的下降。如图2所示，阿司匹林与高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组抑制肿瘤生长效果明显，吲哚美辛高剂量组在给药第22天起小鼠肿瘤体积较对照组有显著差异p<0.05。图3可观察到高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组的肿瘤体积和对照组相比得到更明显的抑制p<0.01。图4小鼠肿瘤图片可观察到阿司匹林与高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组的肿瘤生长与对照组相比得到明显抑制。由此得出，高剂量吲哚美辛在食管癌（编号：EG37P6）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果显著。

1.2. 如图5所示，各给药组对小鼠体重没有影响。如图6所示，高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组在给药第25天起小鼠肿瘤体积较对照组比有显著差异p<0.05，从第50天起差异更加显著p<0.01。低剂量组（1mg/kg）从给药第36天起较对照组有差异p<0.05。阿司匹林给药组较对照组相比，肿瘤体积也有所下降。图7肿瘤重量以及图8小鼠肿瘤图片可观察到，所有给药组与对照组相比，小鼠肿瘤生长均得到抑制，其中，高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组最为明显p<0.01。由此得出，高剂量（4mg/kg）吲哚美辛（编号：HEG5P3）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果很显著，吲哚美辛能够抑制肿瘤的生长。

1.3 如图9所示，各给药组对小鼠体重没有影响。如图10所示，高剂量（4mg/kg）吲哚美辛组在给药第35天起小鼠肿瘤体积较对照组比有显著差异p<0.05，从第53天起差异更加显著p<0.01。DFMO与吲哚美辛低剂量联合给药组在给药第36天起小鼠肿瘤体积较对照组比有显著差异p<0.05，之后差异更加明显p<0.01。低剂量组（1mg/kg）与阿司匹林给药组较对照组相比，肿瘤体积也有所下降，但无明显统计学差异。图11肿瘤重量以及图12小鼠肿瘤图片可观察到，所有给药组与对照组相比，小鼠肿瘤生长均得到抑制，其中DFMO与吲哚美辛低剂量联合给药组、及吲哚美辛高剂量组最为明显p<0.01。由此得出，高剂量（4mg/kg）吲哚美辛（编号：HEG18P5）PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果很明显，与DFMO联合使用时能够增强其抑制肿瘤的生长的效果。

2.图13至图17为吲哚美辛在4T1乳腺癌细胞移植瘤小鼠模型上对肿瘤的治疗效果。

图13、图17分别为小鼠肿瘤重量与肿瘤图片，如图所示：吲哚美辛处理组较对照组肿瘤重量明显减小p<0.05。图14为乳腺癌肺转移实验结果统计，阿司匹林与吲哚美辛给药组较对照组相比转移均减小，低剂量的吲哚美辛转移最不明显p<0.05。图15与图16分别为小鼠血浆血栓素B2与前列腺素E2的浓度检测结果，给药组与对照组相比血栓素B2与前列腺素E2的浓度明显降低，且有显著统计学差异, 其中吲哚美辛比阿司匹林效果更为明显（吲哚美辛组:P<0.01;阿司匹林组:P<0.05）。

由此得出，吲哚美辛与阿司匹林对4T1乳腺癌移植瘤小鼠有显著的肿瘤治疗效果，并且对乳腺癌肺转移有明显抑制作用，其中吲哚美辛效果更为显著。

Claims

1.吲哚美辛在制备预防和治疗癌症药物方面的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为食管癌或乳腺癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，吲哚美辛与本领域常规辅料复配后制成片剂、胶丸、栓剂、针剂或乳膏剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，吲哚美辛的剂量范围为1－4mg /kg。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，吲哚美辛与依氟鸟氨酸复配后用作预防和治疗癌症药物。