CN108079032A - 八宝丹在制备抑制胃癌恶性发展的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药用途领域。具体涉及八宝丹在制备抑制胃癌恶性发展的药物中的用途，所述胃癌恶性发展包括胃癌的复发、胃癌细胞的转移和扩散。八宝丹具有良好的开发应用前景，属于首次公开的新用途。所述八宝丹的成分主要包括牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠粉、三七、麝香。

Description

八宝丹在制备抑制胃癌恶性发展的药物中的用途

技术领域

本发明属于中医药领域，具体涉及八宝丹在制备抑制胃癌恶性发展的药物中的应用。

背景技术

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，每年约有100万新诊断患者和约74万患者死亡。大多数胃癌患者在首诊时已是晚期阶段同时还伴有远端转移或局部浸润。事实上，大部分癌症患者不是因为原位癌而死亡，而是转移癌。转移是恶性肿瘤的典型特征之一，显著增加了癌症相关死亡率。在晚期胃癌患者治疗中，放化疗仍然是首选方法，常见的化疗药物包括奥沙利铂，5-FU，司莫司汀等。虽然还有越来越多的新药被研发出来并逐步推广，但胃癌患者的5年生存率却不容乐观，只有23％～32％。

胃癌是世界上死亡率高的恶性肿瘤之一。其中，复发和转移是胃癌患者死亡的主要原因。因此防治胃癌的转移是治疗的关键。目前胃癌仍以手术治疗为主，辅以化疗、放疗、生物治疗和中医药治疗等综合治疗，其中化疗是其重要的治疗手段之一，但化疗后肿瘤细胞易对药物产生耐药性，继而导致胃癌的复发、转移，并最终导致死亡。此外，胃癌等恶性肿瘤是以局部细胞过度增生为特征的系统性疾病，使得以“筛选和设计作用于某个疾病相关靶点的高选择性配体”、或“一个基因、一种药物、一种疾病”的现代药物在治疗肿瘤等复杂性疾病时临床疗效有限。因此，寻找更加有效预治胃癌转移的治疗成为亟待解决的重要问题。

八宝丹起源于明代，距今已经有四百多年的临床应用历史，组方包括6味名贵中药材，即麝香、羚羊角、牛黄、蛇胆、三七、珍珠，具有清利湿热、活血解毒、去黄止痛的功效，辅助抗菌、调节机体免疫功能，长期服用可以减轻化疗药物的毒副作用。除肝胆疾病、泌尿系统疾病外，在恶性肿瘤、自身免疫性疾病以及其他疑难杂症的治疗方面也取得了良好的效果，但是八宝丹对胃癌细胞的抑制作用及其分子机制尚不明确。

发明内容

中成药八宝丹以天然牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠、麝香、三七等八味中药精制而成，具有清热解毒、活血化瘀、止痛的功效。本发明通过探讨八宝丹对胃癌细胞的迁移能力的影响，为八宝丹的临床新应用提供进一步的实验依据。

本发明的目的在于提供八宝丹在制备抑制胃癌恶性发展的药物中的用途。

所述胃癌恶性发展包括胃癌的复发、胃癌细胞的转移和扩散等。

具体的，

所述用途包括八宝丹在制备抑制胃癌复发的药物中的用途；

所述用途包括八宝丹在制备抑制胃癌细胞转移和/或扩散的药物中的用途；

本发明所述八宝丹可以用于胃癌患者术后使用，即所述用途包括八宝丹在制备抑制术后胃癌恶性发展的药物中的用途。

具体的，

所述用途包括八宝丹在制备抑制术后胃癌复发的药物中的用途；

所述用途包括八宝丹在制备抑制术后胃癌细胞转移和/或扩散的药物中的用途。

本发明所述八宝丹主要成分包括牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠粉、三七、麝香；优选为厦门中药厂股份有限公司生产的八宝丹胶囊，国药准字Z10940006。

肿瘤转移的关键环节有：细胞外基质和基底膜的降解与重建，它们依赖多种蛋白水解酶的表达和启动；肿瘤细胞黏附；肿瘤微血管形成。肿瘤细胞的损伤修复能力和粘附能力直接反应肿瘤细胞的转移能力。因此，本发明观察八宝丹对肿瘤转移关键环节的影响。

研究结果发现八宝丹能抑制AGS和MGC803细胞的活力，抑制细胞的损伤修复能力，抑制细胞的迁移能力，抑制细胞的粘附能力，呈现明显的剂量依赖作用，提示八宝丹具有抑制胃癌细胞转移的作用。可以用于抑制胃癌恶性发展的药物的制备，也可以用于抑制术后胃癌恶性发展的药物的制备。

附图说明

图1为八宝丹对AGS细胞损伤修复能力影响的显微镜照片(100×)；其中，A为对照组(八宝丹0mg/mL)；B为低剂量组(八宝丹0.25mg/mL)；C为中剂量组(八宝丹0.5mg/mL)；D为高剂量组(八宝丹0.75mg/mL)。

图2为八宝丹对MGC803细胞损伤修复能力的影响的显微镜照片(100×)；其中，A为对照组(八宝丹0mg/mL)；B为低剂量组(八宝丹0.25mg/mL)；C为中剂量组(八宝丹0.5mg/mL)；D为高剂量组(八宝丹0.75mg/mL)。

图3为八宝丹对细胞迁移能力的影响的显微镜照片(100×)；其中，A为对照组(八宝丹0mg/mL)；B为低剂量组(八宝丹0.25mg/mL)；C为中剂量组(八宝丹0.5mg/mL)；D为高剂量组(八宝丹0.75mg/mL)。

图4为八宝丹对细胞粘附能力的影响的显微镜照片(200×)；其中，A为对照组(八宝丹0mg/mL)；B为低剂量组(八宝丹0.25mg/mL)；C为中剂量组(八宝丹0.5mg/mL)；D为高剂量组(八宝丹0.75mg/mL)。

具体实施方式

为了更好地理解本发明专利，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明专利的内容不仅仅局限于下面的实施例。

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

实施例1细胞试验

1材料

1.1药物和细胞株

八宝丹购自厦门中药厂股份有限公司。人胃癌细胞株AGS和MGC803购自中科院上海细胞生物研究所，保存于福建中医药大学医学实验中心液氮中。

1.2试剂与耗材

RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、双抗(青霉素、链霉素)、0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、二甲亚砜(DMSO)(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)干粉(北京索莱宝科技有限公司公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Hyclone公司)。

1.3仪器

超净工作台(苏州净化设备公司)；二氧化碳培养箱、-80℃冰箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜系统(德国Leica仪器有限公司)；全自动细胞计数仪(美国Life公司)；全自动酶标仪(远生公司)。

2方法

2.1八宝丹溶液的制备

将八宝丹粉末，用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成25mg/mL的溶液，超声溶解后高压灭菌，于4℃贮存备用。

2.2细胞培养

将胃癌细胞株AGS、MGC803置于含10％灭活的胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置于37℃、5％CO₂和饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，当汇合度至80％～90％左右时，用0.25％EDTA胰蛋白酶消化，按1:5传代培养。

2.3 MTT检测分析

取对数生长期的AGS和MGC803以0.8×10⁵个/mL接于96孔培养板中，每孔100μL，置37℃含5％CO₂培养箱中培养，当细胞汇合度达到50～60％，吸弃培养液，每孔加入含不同浓度八宝丹溶液(0mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL)培养液100μL，即分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，培养24h后每孔加入MTT(0.5mg/mL)100μL继续培养4h，然后吸弃液体并加入DMSO 100μL/孔，室温放置10min，于全自动酶标仪570nm测定各组吸光度值(A值)，并计算细胞生长抑制率(％)＝(1－实验组A值/对照组A值)×100％。

2.4划痕实验分析

取对数生长期的AGS和MGC803细胞以2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板，置于37℃细胞培养箱中培养过夜，细胞汇合度达到80～90％时，进行划痕，并于不同时间点(0h、6h、12h、24h)进行拍照(100×)。

2.5 Transwell实验

取对数生长期的AGS和MGC803以2×10⁵个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，置37℃含5％CO₂培养箱中培养，当细胞汇合度达到50～60％，吸弃孔内溶液，分别加含有不同浓度八宝丹溶液(终浓度分别为0、0.25、0.5、0.75mg/mL)的培养基，即分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每孔2mL，干预24h后，吸弃各孔溶液，各孔分别进行消化，用不含胎牛血清的培养基重悬细胞。按5×10⁴个/孔接种于Tranwell的上室(内室)，下室于实验前2h加0.7mL含10％胎牛血清的培养基(置于37℃含5％CO₂培养箱中)。12h后用棉签擦去Tranwell内室上层的细胞，其下层用结晶紫染色15min，最后在倒置显微镜拍照(100×)。

2.6粘附实验分析

取对数生长期的AGS和MGC803以2×10⁵个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，置37℃含5％CO₂培养箱中培养，当细胞汇合度达到50～60％，吸弃孔内溶液，分别加含有不同浓度八宝丹溶液(终浓度分别为0、0.25、0.5、0.75mg/mL)的培养基，即分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每孔2mL，干预24h后，吸弃各孔溶液，各孔分别进行消化，重悬，调整细胞密度为2×10⁴个/mL，重新接于6孔板中，培养4h后，吸弃各孔溶液，用PBS洗两遍，用0.1％结晶紫染色15min，最后在倒置显微镜下拍照(200×)。

2.7统计学处理

运用SPSS22.0软件包进行数据处理、分析，结果用均数±标准差(x±s)表示，多组数据之间比较使用单因素方差分析，组间采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1八宝丹对AGS和MGC803细胞增殖的影响

使用MTT法检测对照组和给药组在药物干预24h后的细胞活力。与对照组比较，八宝丹具有抑制AGS和MGC803细胞活力的作用，并呈剂量依赖性，见表1。

表1八宝丹对AGS和MGC803细胞的抑制作用(抑制率/％(x±s))

注：与对照组相比，^*P＜0.05。

3.2八宝丹对AGS和MGC803细胞划痕损伤修复能力的影响

不同浓度药物干预24h后，用细胞划痕的愈合程度来判断八宝丹对肿瘤细胞的迁移能力的影响。结果显示，在0h，各给药干预组与对照组对比迁移距离无明显影响，经给药24h后，各给药组与对照组相比，迁移距离明显减少。这提示，八宝丹显著抑制细胞的损伤修复能力，并呈剂量依赖性，见图1、图2。

3.3八宝丹对AGS和MGC803细胞迁移能力的影响

Transwell实验用于检测肿瘤细胞的迁移能力。结果显示，在经过药物干预24h后，对照组有较多的细胞穿过小孔膜，而不同浓度的八宝丹干预后穿过小孔的细胞数量逐渐减少，呈剂量依赖性，提示八宝丹抑制细胞的迁移能力，见图3。

3.4八宝丹对AGS和MGC803细胞粘附能力的影响

与对照组相比，不同浓度的八宝丹干预后细胞的数目逐渐较少，呈剂量依赖性，提示八宝丹抑制细胞的粘附能力，见图4。

细胞试验结果表明：

①八宝丹能抑制AGS和MGC803细胞的活力，抑制细胞的损伤修复能力，从而抑制胃癌细胞的复生以及化疗或术后胃癌的复发；

②八宝丹能抑制细胞的迁移能力，抑制细胞的粘附能力，呈现明显的剂量依赖作用，提示八宝丹具有抑制胃癌细胞的转移和扩散的作用。

实施例2动物试验

1材料

1.1药物

八宝丹购自厦门中药厂股份有限公司。将八宝丹粉末，分别用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成2.5mg/mL的八宝丹溶液，超声溶解后高压灭菌，于4℃贮存备用。

1.2实验动物

近交系615小鼠，雄性，体重20±2g。

2方法与结果

取移植后8天的可移植性前胃鳞状细胞癌(FC)组织，制成1×10¹⁰/L的细胞悬液，于小鼠右腋皮下注射细胞悬液0.2mL/只。接种成功的小鼠随机分为对照组和给药组，每组5只。每组动物于接种后第二天开始灌胃给药，给药组用配制的八宝丹溶液给药(按照八宝丹胶囊内容物粉末重量折算的给药剂量分别为：低剂量组26mg/kg、中剂量组52mg/kg、高剂量组78mg/kg)，对照组给予等量的生理盐水。每天给药一次，连续给药2周。实验结束后解剖小鼠，取出肝脏、肺脏，观察胃癌细胞向肝脏、肺脏的转移情况。转移灶为边缘光滑的米黄色类圆形结节，计算转移灶数和转移抑制率，转移抑制率(％)＝(对照组转移灶数-给药组转移灶数)/对照组转移灶数×100％，每组5只小鼠取平均值。实验结果见下表。

动物试验研究发现，相较于对照组，给药组的转移灶数明显下降，高剂量组对肝脏和肺脏的平均转移抑制率均达到50％以上。结果显示八宝丹具有抑制胃癌细胞向刚脏和肺脏转移和扩散的作用。

实施例3临床案例

病例1：陈某，男，1964年生，2009年被诊断为胃癌，诊断分期II期(T2N1M0),进行胃癌根治性切除术(远端为切除术)，术后服用八宝丹胶囊，每天2次，每次2粒，坚持连续服药，B超、CT随访67个月，未发生复发或转移现象。

病例2：黄某，女，1969年生，2012年被诊断为胃癌，诊断分期IIIA期(T2N2M0),进行胃癌根治性切除术(全胃切除术)，术后服用八宝丹胶囊，每天2次，每次2粒，坚持连续服药，CT每3-6月随访，随访至2017年11月，未发生复发或转移现象。

上述案例仅为举例，更多临床案例显示，八宝丹有抑制胃癌患者术后复发或转移的作用。

Claims (8)

1.八宝丹在制备抑制胃癌恶性发展的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述胃癌恶性发展包括胃癌的复发、胃癌细胞的转移和扩散。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途为八宝丹在制备抑制胃癌复发的药物中的用途。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途为八宝丹在制备抑制胃癌细胞转移和/或扩散的药物中的用途。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途为八宝丹在制备抑制术后胃癌恶性发展的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述用途为八宝丹在制备抑制术后胃癌复发的药物中的用途。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述用途为八宝丹在制备抑制术后胃癌细胞转移和/或扩散的药物中的用途。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其特征在于：所述八宝丹的成分主要包括牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠粉、三七、麝香。