CN102008715B

CN102008715B - 抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN102008715B
Application number: CN200910195266.5A
Authority: CN
Inventors: 刘明耀; 罗剑; 李成海; 杨正峰; 仇文卫; 汤杰
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: Bioray Laboratories Inc
Priority date: 2009-09-07
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2029-09-07
Also published as: CN102008715A

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合及其应用。这种组合物包含山楂酸或其生理上可以接受的盐或其衍生物和肿瘤坏死因子α联合使用。这种组合物的作用效果优于每种药物单独使用时的加合作用。而且这种联合使用能够有效的降低单独使用肿瘤坏死因子α所产生的毒副作用，因此可以将这种联合用药物用于治疗肿瘤和相关病症。

Description

抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其应用，尤其是涉及一种抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物及其应用。

背景技术

癌症的发病率仍在逐年增加，癌症目前已居死亡原因的首位。虽然，近年来集中广泛的研究和调查，对肿瘤产生的机理已经有了比较深入的了解。在理论上阐明了可以通过各种手段控制肿瘤发展的各个过程。实践中也研究发现并积累了许多不同的作用于癌症不同阶段的通过不同机理的抗肿瘤药物。尤其是近三十年来，已经有很多抗肿瘤的药物相继进入临床。但是由于肿瘤是一种多因素导致的复杂病症。实践证明，现有的单一的抗肿瘤药物其治疗效果都极为有限。这是因为，某一个单一药物长期使用，容易产生耐药性，降低了药物效果，其次，肿瘤的发生发展是多因素作用后的结果，单一化合物作用往往效果只限于一个方面，再次，单一的药物虽然具有较好的抗肿瘤效果，但往往同时具有较强的毒副作用，因此比较可取的方法是选择疗效可靠，安全性更高的化合物。近年来，几个药物共同联合用药治疗肿瘤的方法取得不错的治疗效果，并且受到人们的关注，成为抗肿瘤药物开发的一种新的策略。这种组合用药策略的目的在于尽可能的发挥每种药物的抗癌效果，同时尽量减少各自的毒副作用。而且这种组合策略可以尽量的减少药物抵抗的问题。

自从肿瘤坏死因子α(TNFα)被发现开始，其具有的抗肿瘤潜能就成为大家关注的重点。经过数十年的研究，肿瘤坏死因子已经成为第一个在临床上运用的抗肿瘤的细胞因子。研究发现肿瘤坏死因子在许多癌症中均表现出抗癌效果。但是，随着研究运用的深入，肿瘤坏死因子的毒副作用也暴露出来，其主要的毒副作用表现在：全身性的毒副作用以及许多肿瘤对TNFα产生药物抵抗。.因此，肿瘤坏死因子的临床运用被局限在很少的实体肿瘤方面。为了克服其毒副作用，现在临床上主要采用肿瘤坏死因子隔离灌注的方法来来治疗某些晚期的癌症患者，尤其是在四肢末端肌肉瘤方面运用较多。经过过去几十年的研究，现在已经知道，肿瘤坏死因子在与其细胞表面受体结合后主要行驶两个方面的功能。一方面激活细胞凋亡信号，通过死亡受体途径引起细胞凋亡，另一方面，能够激活核转录因子κB(NF-κB)抑制细胞凋亡，使肿瘤细胞对肿瘤坏死因子和相关化疗药物产生耐受和药物抵抗。研究发现肿瘤坏死因子的毒副作用产生的原因是多方面的，其中最为主要的原因是，肿瘤坏死因子在体内启动活化了核转录因子κB(NF-κB)。由于NF-κB的活化导致大量抗凋亡的基因表达，大大减弱了肿瘤坏死因子抗肿瘤的效果，同时也导致了炎症，引起了肿瘤复发，转移等副作用。因此寻找能够增强肿瘤坏死因子抗肿瘤的作用，同时又能够减轻或者抑制其毒副作用的化合物成为增强肿瘤坏死因子抗肿瘤药效的有效策略。

本发明的抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物，正是克服现有背景技术的缺陷，解决这一技术问题，实现了既增强肿瘤坏死因子抗肿瘤作用，又同时减轻或者抑制其毒副作用的最佳治疗效果。

发明内容

本发明提供了一种抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物，所述药物组合物包含有效量的式(I)山楂酸(MA，maslinic acid)或其生理上可以接受的盐或其衍生物，和有效量的肿瘤坏死因子α(TNFα)联合使用，治疗肿瘤。

式(I)

本发明的抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物，其特点在于，除了自身具有抗肿瘤效果外，还能够抑制或者减轻肿瘤坏死因子的毒副作用，增强其抗肿瘤效果。更确切地说，本发明的技术方案在于提供治疗肿瘤的新的药物组合物，其中的山楂酸或其生理上可以接受的盐或其衍生物与肿瘤坏死因子α联合使用，达到抑制肿瘤细胞增殖和迁移、转移，诱导肿瘤细胞凋亡的效果。

另外，本发明的研究表明，在一些内源性肿瘤坏死因子高表达的肿瘤，如胰腺癌，单独使用山楂酸，其抗肿瘤效果也很优越。由于很多癌症组织本身就有很高的内源性肿瘤坏死因子分泌，山楂酸或其生理上可接受的盐或其衍生物不需要外源的肿瘤坏死因子同样可以达到相同的治疗效果。因此，对于本发明MA-TNFα药物组合物的使用，肿瘤坏死因子可以是外源的也可以是机体内源分泌的。更确切地讲，本发明MA-TNFα药物组合物可由其组分山楂酸和(或)及其生理上可以接受的盐及其衍生物与肿瘤坏死因子(内源的或者外源的)联合作用，治疗肿瘤。

本发明的研究表明，山楂酸及其盐和衍生物具有联合肿瘤坏死因子的特性，具有优异地抑制肿瘤细胞增殖、迁移侵入，诱导肿瘤细胞凋亡的效果。并且，本发明的各种研究表明，山楂酸及其盐和衍生物能够有效促进肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用，在增强肿瘤坏死因子的抗肿瘤效果的同时，抑制或者减弱肿瘤坏死因子的毒副作用，从而实现本发明。

更具体地讲，本发明公开的抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物，即山楂酸或其生理上可以接受的盐或其衍生物与肿瘤坏死因子的联合使用，包括各类抗肿瘤剂，优先地包括，可抑制肿瘤增殖的抗肿瘤剂，可诱导癌细胞凋亡的抗肿瘤剂，和可抑制肿瘤细胞侵润转移的抗肿瘤剂。

此外，本发明的抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物，包括各抗肿瘤剂，其中所述的作为有效成分的山楂酸或其生理可以接受的盐或其衍生物，可以是从天然原料中提取得到，也可以是通过商业市场上购买得到的，也可以是化学改造或化学合成的产物。同样，作为所述有效成分的肿瘤坏死因子α，可以是加入的外源性的，也可以是内源分泌性的。

本发明的山楂酸是广泛存在于诸如橄榄、薄荷，山楂，石榴和枣树中。其生理上可以接受的盐是从化学结构式(I)中的基团-COOH衍生形成的化学结构，其盐的种类不限于上述特定的结构，也可以是常用食品饮料或医药组合物中的那些化学结构。

本文所用术语“一定有效量的”，是指抗肿瘤剂MA-TNFα药物组合物中的各组分的量，该量足以实现所需的抑制肿瘤细胞增殖，迁移，促进凋亡的效果。本发明MA-TNFα药物组合物的各组分不论其比例如何，只要是该组合物能够有效地发挥作用，实现抑制肿瘤细胞增殖，迁移，促进凋亡的效果的，均属于该发明范畴。本发明研究也表明不同的肿瘤细胞类型对该组合物的敏感程度是有区别的。

本发明MA-TNFα药物组合物，所治疗的肿瘤疾病包括肿胀和真正的肿瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。这类肿瘤的具体实施例是肝肿瘤、胰腺(炎)肿瘤、乳腺肿瘤、消化道肿瘤，肺癌等。

本发明MA-TNFα药物组合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。所述肿瘤疾病包括内源性肿瘤坏死因子α高表达而导致的疾病，如复发性肿瘤，肿瘤术后复发等的治疗。所述治疗肿瘤疾病的药物可抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管新生。

本发明MA-TNFα药物组合物在制备治疗内源性的核转录因子NF-kB活性异常导致的疾病的药物中的应用，所述药物组合物能够抑制NF-kB的活化，所述疾病包括炎症、感染性疾病等由于NF-κB活性增高导致的相关病症。

本发明MA-TNFα药物组合物的抗肿瘤效果明显，山楂酸和TNFα联合用药增强了TNFα的抗肿瘤疗效，同时减少了其毒副作用。又，因山楂酸是一种广泛在于水果和天然食用植物中的微量成分，山楂酸属于传统食用水果中的微量成分，安全可靠，其药物安全性已经得到了充分的证明。并且，MA-TNFα药物组合物实施起来方便。作为第一个在临床上用来治疗肿瘤的细胞因子，肿瘤坏死因子具有较好的运用前景，但是由于其系统的细胞毒副作用，严重影响了其临床实际运用。现在普遍采取的是局部回流灌注地方法来减轻其系统毒性。这种给药方式和操作都比较繁琐，而且有风险，所以只有一些晚期的实体肿瘤才采用这样的治疗手段，这就阻碍了肿瘤坏死因子的临床运用。通过寻找肿瘤坏死因子的增敏剂，联合使用治疗可以减少这些步骤，从而降低风险，不需要专业人员即可进行治疗。而且本发明组合物的药物作用机理明确，有助于掌握正确的治疗用药。

附图说明

图1：山楂酸抑制TNF诱导的胰腺癌细胞迁移和细胞增殖

图1(A)：山楂酸抑制胰腺癌细胞迁移。

图1(B)、图1(C)：山楂酸抑制胰腺癌细胞增殖。

图2：山楂酸增强TNF诱导的胰腺癌细胞凋亡。

图2(A)：山楂酸增强TNF的致死效果。

图2(B)、(C)：山楂酸增强TNF的凋亡效应。

图2(D)：山楂酸启动凋亡信号分子活化。图3：山楂酸抑制核因子NF-κB的活性。

图3(A)：山楂酸剂量依赖性的抑制TNF诱导的NF-κB的活化。

图3(B)：山楂酸抑制TNF诱导的NF-kB的活化没有细胞特异性。

图3(C)：山楂酸抑制NF-κB与其下游基因(cox₂)启动子的结合。

图3(D)：山楂酸抑制B NF-报告基因表达。

图4：山楂酸抑制核因子NF-κB信号的活化。

图4(A)：免疫组化发现山楂酸抑制p65亚单位入核。

图4(B)：蛋白印迹的方法证实山楂酸抑制p65在细胞内的分布。

图4(C)：山楂酸抑制NF-κB抑制亚单位(IκBα)降解。

图5：山楂酸抑制核因子NF-κB下游基因表达

图5(A)：山楂酸抑制核因子NF-kB下游抗凋亡相关基因的表达。

图5(B)：山楂酸抑制核因子NF-kB下游增殖相关基因的表达。

图5(C)：山楂酸抑制核因子NF-kB下游迁移相关基因的表达。

图6：山楂酸抑制体内肿瘤的生长

图6(A)：山楂酸抑制肿瘤生长。

图6(B)：山楂酸对小鼠体重影响不明显。

图6(C)：山楂酸诱导肿瘤组织凋亡。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

实施例1：细胞增殖实验

材料和试剂：

采用Promega CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒。微孔板式紫外可见连续波长酶标仪细胞株人胰腺癌细胞株PANC-28，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231/435，人结肠癌细胞株HCT116，人肝癌细胞株HepG2，SK-HEP-1，血液淋巴细胞K562.人重组肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)。

实验方法：

1、将细胞以4.0×10⁸/L密度接种于用96孔培养板中，每孔100μL，37℃，5％ CO₂。

2、孵箱中培养至细胞贴壁，加入不同浓度的山楂酸(0，0.5，1，1.5，3，5，10，25，50μM)预处理6小时候，加0.1nM TNF处理36小时，(或者预先加入5μM山楂酸处理6小时后加不同浓度TNF处理36小时)每一浓度重复3孔。

3、37℃、5％CO2孵箱中培养24~36h，每孔加入MTS solution I20μL，继续培养1~4h。

4、用酶标仪检测各组细胞的A 490nm吸光值，以A 490代表细胞活力，并以0μmol/L药物作为对照组，其细胞存活率为100％，其余各组按：存活率＝(各浓度组吸光值/对照组吸光值)×100％与之比较，作图。计算IC50.

实验结果：

如图1(B)，图1(C)所示，山楂酸抑制胰腺癌细胞生长，当与TNF联合使用时，这种抑制效果显著增强。单独使用山楂酸或者TNF(圆圈虚线)，对胰腺癌细胞增殖均有一定的抑制效果，而当两者联合使用时，这种效果可被极其显著地增强(方块实线)。

实施例2：细胞浸润实验

实验材料：

Transwell小试购自millipore公司。

实验方法：

1、将细胞以4.0×10⁸/L密度接种于用10cm培养皿中，8ml/皿，37℃、5％ CO₂孵箱中培养。

2、待细胞长到80％满的时候，换成无血清的不完全培养基继续饥饿培养8h。

3、胰酶消化，用不含血清的不完全培养基调整细胞到1×105/ml的细胞悬液，然后在Transwell上层加入100ul细胞悬液/孔(对照组和TNF组)或者加入含有山楂酸的100ul细胞悬液/孔(山楂酸组和山楂酸加TNF组)，在Transwell下层分别加入600ul培养基(对照)，或者600ul含0.2nM TNF的培养基，2~4h后，计数迁移到Transwell下层膜表面的细胞数。

4、按如下公式计算细胞迁移率：细胞迁移率＝实验组细胞数/对照组细胞数×100％

实验结果：

如图1(A)所示，与对照组相比，胰腺癌细胞在TNF的诱导下，迁移穿过的细胞数目显著增多，加入山楂酸后，迁移的细胞数目显著下降，说明TNF能够增强胰腺癌细胞的侵袭能力，而山楂酸能够有效抑制TNF引起的细胞迁移。

实施例3：Live/Dead assay

试剂和方法：

试剂材料Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells(Biotium，Inc.30002)

实验步骤，按照试剂盒说明书的操作步骤。

1.将细胞以4.0×10⁸/L密度接种于用96孔培养板中，每孔100μL，37℃、5％C02孵箱中培养至细胞贴壁，加入相应药物，每一浓度重复3孔。

2.37℃、5％CO2孵箱中培养24~36h。

3.用PBS洗涤细胞一次，分别加入1ulethidium homodimer和calcein-AM，室温放置30分钟，荧光显微镜下观测计数细胞，红色为死亡细胞，绿色为活细胞。

4.按如下公式计算细胞死亡率：细胞死亡率＝死细胞数目/细胞总数×100％。

实验结果：

如图2(A)所示，图中被染成绿色的是活细胞，而红色的是死细胞。单独使用山楂酸能够诱导细胞死亡，当TNF和山楂酸同时使用时，死亡的细胞数目显著增加。说明山楂酸能够显著地增强TNF的致死效应。

实施例4：细胞凋亡检测

实验材料：

annexinV-FITC，TUNNEL-FITC凋亡检测试剂盒购自sigma.

实验方法：

(1)annexinV检测早期凋亡；(2)TUNNEL法检测凋亡。分别按照凋亡检测试剂盒说明书的操作步骤进行检测。

将细胞以4.0×10⁸/L密度接种于用12孔培养板中，每孔1000μL，37℃、5％CO2孵箱中培养过夜，加入25uM山楂酸预处理6小时，再加0.1nM TNF继续培养12小时(36小时)。用冷的PBS洗细胞两次，然后用胰酶消化，离心，染色，固定、上流式细胞仪检测分析。

实验结果：

如图2(B)所示，用annexinV法检测，单独使用山楂酸能够诱导细胞死亡，当TNF和山楂酸分别使用时，均有一定的诱导细胞凋亡的作用，同时使用时，凋亡的细胞比例显著增加。说明山楂酸能够显著增强TNF引起的细胞凋亡。如图2(C)所示，用TUNNEL法检测，检测结果与annexinV法相似的结果，山楂酸能够显著增强TNF引起的细胞凋亡。

实施例5：免疫组织化学分析NF-κB复合物的细胞内定位分布。

实验方法：

1、将5000细胞接种到玻片上，待贴壁后，加入25uM山楂酸预先处理3小时；

2、加0.1nM TNF刺激10分钟；

3、PBS洗3次，加4％多聚赖氨酸固定15分钟；

4、PBS洗3次，加0.05％BSA室温封闭30分钟；

5、PBS洗3次，加入p65抗体，(1∶20)4℃孵浴过夜；

6、PBS洗3次，加入荧光二抗60分钟，

7、加入DAPI 5分钟，PBS洗3次后，封片，荧光显微镜下观测拍照。

实验结果：

如图4(A)所示，在生理状态下，p65大部分定位在细胞质中，当受到TNF刺激时，在大约10分钟左右，p65会迅速转移到细胞核里，当预先用山楂酸处理后再加入TNF刺激，p65仍然大部分定位在细胞质中，这些现象说明，山楂酸能够抑制TNF诱导的p65入核。为了进一步确认这一现象，我们分别分离得到细胞质和细胞核部分的蛋白，然后利用Western Blot的方法检测细胞质和细胞核里p65的分布情况，实验结果如图4(B)所示，在生理状态下，细胞质中的p65占据大部分，用TNF刺激5分钟后，p65开始进入到细胞核中，15分钟左右几乎全部进入到核里，山楂酸能够有效地阻止这种入核。这些实验结果证明，山楂酸能够有效抑制TNF引起的p65入核。我们还进一步发现，山楂酸能够有效抑制抑制TNF引起的NF-kB亚单位IkBa的降解，这就进一步证明，山楂酸抑制p65入核可能是通过抑制IkBa的降解来实现的，如图4(C)所示。

实施例6：电泳迁移率实验(EMSA)

细胞处理及细胞核提取液制备

1、1×10⁵cells/ml细胞接种6孔板，2ml/孔；

2、待细胞贴壁过夜后，用25uM山楂酸预处理细胞3小时，后加0.1nM TNF处理细胞20分钟。

3、冷PBS洗细胞两次，胰酶消化，离心去上清，1ml冰PBS重悬细胞，并将其移到预冷的tube管中，

(以下步骤全部在冰上操作)

4、14000g离心一分钟，彻底去除上清，不要打起沉淀

5、加1ml冷的PBS离心去上清

6、加100um lysis buffer，用枪悬起细胞

7、冰上抚育15min(期间不断votex)

8、加3.5ul的10％NP40/管

9、剧烈震荡10s

10、14000g 1min，上清为细胞质提取物

11、保存-70度

12、彻底去除上清

13、加50ul核抽提液buffer

14、冰上30min，期间不断震荡。

15、14000g 1min，上清为细胞核提取物

16、保存-70度备用

电泳迁移率实验

按照试剂盒说明书进行操作。Odyssey Infrared EMSA Kit购自LICOR公司。

实验结果

如图3(A)所示，TNF刺激能够显著增强NF-kB的活性，随着加入的山楂酸浓度的增加，其活性也被逐渐抑制，说明山楂酸能够浓度梯度的抑制NF-kB的活性。不仅如此，我们还在另外几株胰腺癌细胞中也进行了实验，发现山楂酸同样能够抑制NF-kB的活化，如图3(B)所示，这些结果显示：山楂酸能够抑制NF-kB激活。

实施例7：报告基因分析

实验材料：

荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promaga公司，lipofectamin2000转染试剂购自invitrogen。

实验方法：

1、A293T细胞传代并接种到10cm培养皿(7ml/皿，1×10⁵cells/ml)；

2、12小时后，转染含有NF-kB启动子报告基因，转染方法根据lipofectamin2000试剂说明书进行。

3、转染12小时后，转接到48孔板，待细胞贴壁过夜后，加不同浓度的山楂酸(0，5，10，15，25，50uM)预处理6～8h。

4、加0.1nM TNF处理24小时。

5、吸弃培养基，用PBS洗细胞1次，加入适当的1x裂解缓冲液，置-80冻存至少30分钟。

6、取出，12000离心，取上清，检测蛋白浓度，按试剂盒说明书检测酶活。

7、计算公式：

报告基因活性＝实验组光子数/对照组光子数x100％

实验结果：

如图3(D)所示，当TNF刺激时，NF-kB启动子报告基因的表达显著升高10倍以上，说明TNF可以诱导报告基因的表达，而加入不同浓度的山楂酸(0，5，10，15，25，50uM)预处理后，报告基因的表达逐渐降低，这些结果显示，山楂酸能够抑制NF-kB启动子报告基因的表达。

实施例8：染色质免疫沉淀分析(Chromatin IP(CHIP assay))

实验方法

1、1×10⁵cells/ml细胞接种6孔板，2ml/孔，待细胞贴壁过夜后，25uM山楂酸处理或不处理细胞3小时后，加入0.1nM TNF处理不同时间(0，4，12，24小时)；

2、不要吸掉培养液，直接在培养皿中加入福尔马林，在生理条件下固定细胞15分钟；

3、加入甘氨酸终止固定，PBS洗2次，收取细胞；

4、加入裂解液([50mM Tris，pH 8.1/10mM EDTA/1％ SDS]裂解10分钟；

5、5000/分钟，离心5分钟，收取细胞核；

6、重悬细胞核，超声打断DNAP片段为1000~500bp；

7、4℃最大速度离心10分钟，取上清到5X稀释液[0.01％SDS/1.1％ Triton X-100/1.2mM EDTA，16.7mM Tris，pH 8.1/167mM NaCl plus protease inhibitors].

8、(可选步骤)用80ul DNA/protein A beads与样品孵育30分钟，4℃。后短暂离心，取上清；

9、保存1/5的样品作为input；

10、剩下的样品分成两部分，一部分加抗体，一部分不加抗体，4℃，孵育过夜；

11、样品与60ul DNA/protein A beads 4℃孵育1小时；

12、用以下溶液分别洗涤珠子：

a，低盐溶液[0.1％ SDS/1％ Triton X-100/2mM EDTA，20mM Tris，pH 8.1/150mM NaCl]；

b，高盐溶液[0.1％ SDS/1％ Triton X-100，2mM EDTA，20mM Tris，pH 8.1，500mM NaCl]；

c，LiCl洗液[0.25M LiCl/1％ NP40/1％ deoxycholate，1mMEDTA/10mM Tris，pH 8.0]

d，用1xTE洗两次；

13、用250ul洗脱液洗脱。[1％ SDS/0.1 M NaHCO3]

14、加入RNAse和NaCl复性，65℃孵育4~5小时；

15、氛氯仿抽提DNA.

16、取2ulDNA做PCR检验。

实验结果：

如图3(C)所示，随着TNF刺激时间的延长，与NF-kB结合的DNA逐渐增多，说明TNF可以有效地促进NF-kB与cox2启动子的结合，当加入10uM山楂酸后，山楂酸能够有效地抑制这种结合，这些结果进一步证明了山楂酸能够抑制NF-kB的活化。

实施例9：免疫印迹分析(Western Blot)

实验方法：

细胞处理

1、1×105cells/ml细胞接种6孔板，2ml/孔，待细胞贴壁过夜后，25uM山楂酸处理或不处理细胞6小时后，加入0.1nM TNF处理不同时间(0，4，12，24，36小时)；

2、细胞用PBS洗三遍，用细胞裂解buffer RIPA溶液(50mM Tris-HCl，ph7.4，150mMNaCl，1％NP40，0.25％Na-deoxycholate，1mMPMSF使用时现加1∶100cocktail)裂解细胞，4℃混合15分钟，12000rpm 4℃离心20分钟，收集上清。

电泳及免疫反应

流程如下：A、制胶(8％浓缩胶，10％分离胶)；B、50ug蛋白样品加入上样缓冲液，煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶60V电压，分离胶100V电压：D、转膜，100V，1.5h；E、5％脱脂牛奶，封闭1h；F、一抗反应，4℃，过夜；G、TBST洗膜，三次，每次10分钟；H、二抗反应，避光1h；I、TBST洗膜，三次，每次10分钟；J、显色、曝光。

实验结果：

为了进一步检验山楂酸能否抑制NF-kB的活性，我们利用western blot的方法分析了NF-kB下游相关基因的表达情况。如图5所示：实验结果发现，随着TNF处理的时间的增加，NF-kB下游相关基因，(如凋亡相关基因Survivin，bcl-xl，bcl-2，XIAP，IAP等(见图5(A))，增殖相关基因cox2，cmyc，cyclinD1等(见图5(B))，迁移相关基因VEGF，MMP9，ICAM1等(见图5(C))，均有不同程度的表达升高。而加入10uM山楂酸预处理后，这些基因的表达都不同程度的被抑制。这些实验结果更进一步的说明：山楂酸不仅能够抑制NF-kB的活性，而且能够抑制其下游基因的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。

实施例10：动物体内试验

实验动物来源：实验裸鼠购自中科院上海生命科学研究所

动物饲养：按常规裸鼠饲养条件饲养

肿瘤接种：待裸鼠长到大约5周龄时，小鼠皮下注射胰腺癌细胞3.5×10⁶细胞/只。

药物治疗：待肿瘤长大到100mm³时，小鼠随机分组，并进行药物治疗；分三个组，对照组注射DMSO，另外两组分别注射高剂量(50mg/kg)和低剂量(10mg/kg)的山楂酸，给药持续6周，采取隔天皮下给药方式。每次给药时记录瘤子大小和小鼠体重；给要完成后，处死小鼠，取瘤子，并称重量和测量大小后；石蜡包埋。

组织切片染色分析：按常规免疫组织化学方法进行。

1.样本制备与包埋

取自裸鼠皮下注射的新鲜肿瘤块置4％多聚甲醛中固定12小时，利用不同浓度酒精对组织块脱水，分别为50％酒精1次，70％酒精1次，95％酒精2次，100％酒精2次，每次脱水1小时；后利用不同浓度梯度二甲苯透化，分别为50％二甲苯(酒精稀释)1次，100％二甲苯2次，每次30分钟。之后置石蜡油中1小时，再置于新鲜石蜡油过夜，最后再置于新鲜石蜡油中2小时，包埋。置零下20度冰箱过夜

2.切片及组化

1)蜡块置切片机上，切5微米薄片，42度、60度烤片，分别2小时。37度恒温恒湿环境中保存，备用。

2)切片置于60度烘箱中一个半小时化蜡，依次通过浸入含有下列东西的特别容器来脱蜡/再水化组织：

二甲苯2×5分钟

100％乙醇2×2分钟

95％乙醇2×2分钟

70％乙醇1×2分钟

50％乙醇1×2分钟

蒸馏水2×5分钟

3)切片置10mM柠檬酸三钠，100度水浴35分钟进行抗原复性，冷却30分钟左右。吸干组织周围区域水份，然后用PAP笔在每块切片周围划一个圈。让PAP笔划的圈在室温下干燥两分钟，但是确保组织还是含水的。而后用溶于甲醇的3％过氧化氢于湿盒中处理15分钟，PBS洗2次，每次5分钟。再用10mg/ml的BSA封闭30分钟，PBS洗15秒。上感兴趣的一抗(1∶200)，4度于湿盒中过夜。

4)回收一抗后，切片以PBS洗3次，每次5分钟；加相应二抗，室温下湿盒中孵育15分钟，PBS洗3次，每次5分钟；加生物素标记的HRP，室温下湿盒中孵育15分钟，PBS洗3次，每次5分钟；铬精溶液孵育10分钟，流水浸泡冲洗10分钟；苏木精复染20分钟，水洗10分钟；切片依次置70％乙醇1×2分钟，95％乙醇2×2分钟，100％乙醇2×2分钟，以mountingmedium封片。

5)拍照分析。

实验结果：

为检测山楂酸在体内抑制肿瘤的效果，将胰腺癌细胞接种到裸鼠皮下，等肿瘤长到100mm3时，开始注射山楂酸，如图6(A)所示，对照组肿瘤继续生长，体积和重量不断增加，而注射山楂酸能够抑制肿瘤生长，但对裸鼠体重无太大影响，见图6(B)。用药四周后，取瘤子做组织免疫发现，山楂酸处理的老鼠瘤子内，TUNEL阳性细胞明显增加，说明细胞发生明显凋亡，并且，相关抗凋亡基因的表达也受到抑制，(如：bcl-xl，surviving)，见图6(C)。这些实验结果表明，山楂酸不但能够在体外抑制肿瘤生长促进其凋亡，在体内同样也能够有效地抑制胰腺肿瘤生长、促进胰腺肿瘤凋亡。

Claims

1.一种抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物，其中，所述药物组合物包含一定有效量的式(I)山楂酸或其生理上可以接受的盐，和肿瘤坏死因子α。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述式(I)山楂酸或其生理上可以接受的盐可以是自然提取的或化学合成修饰的；所述肿瘤坏死因子α是外源的，也可以是内源自身表达的。

3.如权利要求1所述的药物组合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用；其中，所述肿瘤疾病是内源性肿瘤坏死因子α高表达而导致的疾病；所述治疗肿瘤疾病的药物可抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移、促进肿瘤细胞凋亡。

4.如权利要求1所述的药物组合物在制备治疗内源性的核转录因子κB(NF-κB)活性异常导致的疾病的药物中的应用。