CN107028957B

CN107028957B - 中药单体川楝素作为stat3抑制剂及其在制备抗骨肉瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN107028957B
Application number: CN201710318698.5A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 李静婕; 尹飞; 华莹奇; 蔡郑东
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2017-05-08
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2037-05-08
Also published as: CN107028957A

Abstract

本发明公开了一种中药单体川楝素作为STAT3抑制剂及其在制备抗骨肉瘤药物中的应用。本发明通过从体外、体内和生化分子水平等多个层面探讨川楝素的抗肿瘤活性及其具体作用机制。机制研究表明川楝素通过直接靶向STAT3，抑制STAT3的活性；体外实验结果显示，川楝素能抑制多种骨肉瘤细胞株的增殖，诱导细胞凋亡，阻断细胞的侵袭并逆转骨肉瘤癌的上皮‑间质细胞转化；在体内，川楝素能抑制骨肉瘤的生长与转移并延长荷瘤小鼠生存期；最后，利用人源骨肉瘤模型发现川楝素显著抑制人源的骨肉瘤的生长。上述结果表明，川楝素可作为STAT3抑制剂用于制备抗骨肉瘤的药物。

Description

中药单体川楝素作为STAT3抑制剂及其在制备抗骨肉瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及中药单体川楝素作为STAT3抑制剂及其在制备抗骨肉瘤药物中的应用。

背景技术

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的原发性骨恶性肿瘤，其好发生于儿童和青少年。骨肉瘤的发病率在原发性恶性肿瘤中占据首位。该肿瘤恶性程度甚高，预后极差，可于数月内出现肺部转移，截肢后3～5年存活率仅为5～20％。约80％～90％的骨肉瘤发生于四肢长管状骨干骺端，尤其是股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。临床上，手术切除仍然是骨肉瘤治疗的首选方案，术前和术后多采取化疗放疗的治疗方法。但对于无法手术及术后复发患者的治疗仍然没有有效的治疗药物和策略。近二十年来这些病人的生存率仍然没有根本性的改善。临床数据显示，骨肉瘤的治疗遇到了瓶颈，尤其对于有肺转移及化疗耐药的患者治疗，需要研发新的药物和治疗策略，因此研发新的有效的抗骨肉瘤药物和探索新的治疗方案是目前骨肉瘤治疗中迫切需要解决的问题。中草药单体越来越被科学家重视，中草药单体所具有安全性、有效性和即时可用性等优点，使得他们成为药物以及先导化合物的重要来源。一些中草药单体在抗肿瘤方面的效果也引起人们的重视，但是中草药单体的分子靶标不明确，也是基于中草药单体的抗肿瘤研发的最大障碍，因此筛选并鉴定新的候选新药、寻找其直接作用的分子靶点、并应用于骨肉瘤的转移和复发的治疗，对于延长骨肉瘤肿瘤患者生命具有重要意义，也一直是基于中草药单体抗骨肉瘤新药研发的主要方向。我国的药用植物资源丰富，从传统中草药中挖掘出具有抗骨肉瘤活性的有效单体在抗骨肉瘤的新药研发方面具有广阔应用前景。

发明内容

本发明目的在于揭示一种名为川楝素的中草药单体作为一种新的STAT3抑制剂治疗骨肉瘤的小分子化合物，包括其可用盐、溶剂化合物(水合物)以及中成药复方等。

中药单体川楝素(Toosendanin，简写为TSN)是一种三萜类化合物，是从川楝树根皮及树皮提出的有效成分。研究表明川楝素在可以作为植物源杀虫剂，同时作为药物具有驱蛔虫，蛲虫和鞭虫的作用。川楝素在治疗肿瘤方面也有初步的研究，比如对乳腺癌的生长有一定的抑制作用，诱导细胞的凋亡，另外发现对肝癌和白血病也有一定的杀伤作用。以上研究表明，川楝素可能具有一定抗肿瘤效果。但是其在骨肉瘤上的作用以及其具体抗肿瘤的机制没有相关的研究。

本发明提出一种中草药单体小分子化合物川楝素或其水合物或药学上可接受的盐在制备治疗骨肉瘤疾病产品中的应用，所述产品为药物、试剂、食品或保健品中的一种或多种，所述川楝素具有以下式(I)结构：

进一步，所述川楝素或其水合物或药学上可接受的盐作为唯一活性成分。

进一步，所述药物包括治疗骨肉瘤的药物。

进一步，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。

进一步，所述药物还包括治疗骨肉瘤恶性肿瘤的药物。

进一步，所述药物被配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

本发明还提出了一种单体小分子化合物式(I)川楝素在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

本发明还提出了一种单体小分子化合物式(I)川楝素应用于治疗骨肉瘤疾病的方法，所述方法包括：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、滴眼、鼻腔喷雾、口腔喷雾，也可经皮肤表面局部或全身经皮用药。

本发明还提出了一种单体小分子化合物式(I)川楝素应用于治疗骨肉瘤疾病的具体作用机制。

本发明还提出了一种中草药单体小分子化合物式(I)川楝素或其水合物或药学上可接受的盐在抑制骨肉瘤生长和转移的应用。

本发明还提出了一种单体小分子化合物式(I)川楝素应用于抑制骨肉瘤细胞增殖和浸润的方法。所述方法包括MTS实验检测肿瘤细胞增殖速率、克隆形成实验检测肿瘤细胞生长能力、Transwell实验检测肿瘤细胞纵向迁移与浸润的能力、通过观察细胞形态特征的变化检测肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)表型变化、裸鼠胫骨注射动物模型检测抑制肿瘤生长和转移能力、人源骨肉瘤动物模型检测抑制肿瘤生长的能力。

本发明还提出了一种药物组合物，其含有如式(I)所示的川楝素或其水合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

进一步，所述药物组合物被配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

本发明还提出了川楝素或其水合物或药学上可接受的盐的新用途，用于制备试剂，所述试剂用于：

a)抑制STAT3的活性；或

b)抑制STAT3的二聚化；或

c)抑制骨肉瘤细胞的增殖、克隆形成和诱导骨肉瘤细胞凋亡；或

d)抑制骨肉瘤细胞侵袭、降解基质的能力以及逆转EMT。

本发明还提出了一种STAT3抑制剂，所述STAT3抑制剂以川楝素或其水合物或药学上可接受的盐作为有效成分。

进一步，所述STAT3抑制剂还包括药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料包括维生素C、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁、蔗糖。

本发明通过实验验证了川楝素抑制其他几种肿瘤的增殖以及STAT3的活性，结果显示川楝素对结肠癌(HCT116)、胃癌(SGC7901)、卵巢癌(SKOV3)、乳腺癌(MDA-MB231)、前列腺癌(DU145)、宫颈癌(HeLa)、以及胰腺癌(SW-1990)在100nM就具有较好的抑制效果。免疫印迹实验结果显示，川楝素对这些类型肿瘤的STAT3的活性也具有很好的抑制作用。川楝素可作为结肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、以及胰腺癌的抗肿瘤药物。进一步，所述川楝素可体外抑制上述肿瘤细胞的生长。

在本发明的一个具体实施方案中，该中草药单体式(I)川楝素在较低的浓度(100nM)便能强烈抑制骨肉瘤细胞的体外生长和侵袭。在本发明的一个具体实施方案中，在小鼠动物模型中，2mg/kg/2day的川楝素给药能有效抑制骨肉瘤体内生长和转移。在本发明的一个具体实施方案中，该单体式(I)川楝素是主要通过靶向STAT3信号通路来发挥抗骨肉瘤的功能。

本发明通过从体外、体内和生化分子水平等多个层面探讨川楝素的抗肿瘤活性及其具体作用机制。机制研究表明川楝素通过直接靶向(signal transducer and activatorof transcription 3)STAT3，抑制STAT3的活性。体外实验结果显示，川楝素能抑制多种骨肉瘤细胞株的增殖，诱导细胞凋亡，阻断细胞的侵袭并逆转骨肉瘤癌的上皮-间质细胞转化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)；在体内，川楝素能抑制骨肉瘤的生长与转移并延长荷瘤小鼠生存期，我们利用人源骨肉瘤模型发现川楝素显著抑制人源的骨肉瘤的生长。因此川楝素通过直接靶向(signal transducer and activator oftranscription3)STAT3实现其抑制骨肉瘤生长与转移的生物学机制。

附图说明

附图1所示为川楝素抑制STAT3的活性。

附图2所示为川楝素直接结合STAT3以及抑制STAT3二聚化。

附图3所示为川楝素抑制骨肉瘤细胞的增殖、克隆形成和诱导凋亡。

附图4所示为川楝素抑制骨肉瘤侵袭、降解基质和逆转EMT。

附图5所示为川楝素对小鼠骨肉瘤癌原位荷瘤生长和转移模型中的抑制作用。

附图6所示为川楝素对人源骨肉瘤模型的抑制作用。

附图7所示为川楝素抑制其他几种肿瘤的增殖。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：川楝素(TSN)抑制STAT3的活性

一、技术方法

1.免疫印迹(Western Blot)实验

细胞用不同浓度药物处理48小时后，经裂解液裂解细胞提取蛋白，煮沸变性后经过聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳分离的蛋白质样品，转移到PVDF上，用相应一抗蛋孵育过夜，PBST洗三次，每次10分钟。再用HPR标记的二抗体进行孵育1小时，然后用PBST洗三次，每次10分钟。ECL显色。

2.免疫荧光

将143B细胞接种在预先包被的细胞“爬片”上，24小时后，加入含不同浓度的川楝素的基本培养基，24小时后，用50ng/mL的IL6刺激30分钟。用4％的多聚甲醛固定细胞，再于0.5％Triton X-100的PBS通透10min，最后用1％BSA封闭30min。之后孵育相应的一抗4℃过夜，然后用PBS清洗，之后用Alexa-488偶联的二抗孵育。DAPI用细胞核的标记，最后用共聚焦显微镜拍照。

3.聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR))实验

细胞用和不同浓度药物处理48小时后，用TRIzol分离提取RNA，经反转录后，用相应基因特异性引物通过PCR检测其mRNA水平。

二、实验结果

如图1所示，TSN显著的抑制p-STAT3(Tyr 705)的表达(图1A)。同时可以明显的抑制STAT3的入核(图1B)，STAT3入核是其发挥转录因子功能所必需的。同时我们检测了TSN对STAT3靶基因在基因和蛋白水平的调控作用，我们发现TSN浓度梯度的抑制STAT3靶基因(Survivin、Mcl-1、Bcl2、VEGF和MMP2)的表达(图1C和D)。

实施例2：川楝素(TSN)和STAT3-SH2结构域结合

一、技术方法

1.Molecular docking实验

初步的研究TSN和STAT3的结合情况，我们利用数据库中结构STAT3(PDB Id:1BG1)进行计算机模拟。将TSN小分子人为模拟送入STAT3口袋中。寻找TSN和STAT3潜在的结合部位。

2.SH2结构域蛋白纯化

构建了STAT3-SH2结构域原核表达质粒，载体是pGEX-4T-1。将构建好的表达质粒转化E.coli BL21(DE3)表达菌。待菌液的OD值在0.6左右，加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃诱导目的蛋白的表达，超声获取可溶性蛋白。利用GST bead纯化目的蛋白，SDS凝胶电泳以及考马斯染色鉴定目的蛋白。

3.表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology,SPR)是基于SPR检测生物传感芯片(biosensor chip)上配位体与分析物作用的前沿技术，与传统手段比较，SPR具有无需对样品进行标记、实时监测、灵敏度高等突出优点。为了将蛋白固化到CM5芯片上，利用GST Capture Kit(GE Healthcare)将GST抗体首先固化在CM5芯片上。然后根据方法将带有GST的SH2结构域蛋白固定在有GST抗体的CM5芯片。待基数稳定后，不同浓度的TSN(PBS含5％DMSO,pH 7.4)水平流入芯片，结果数据用BIA evaluation software，通过该实验可以检测TSN在何种浓度下可以与蛋白相互结合，结合与分离的时间等参数。

4.TSN影响SH2结构域和STAT3的结合

为了验证TSN和STAT3的结合在SH2结构域，我们利用pull-down实验检测，TSN对外源性的SH2结构域和STAT3结合的影响。构建STAT3过表达质粒(STAT3-pcDNA3.1-3xFlag)，利用lipo2000将质粒转染293T细胞，48小时后，收取细胞。制备STAT3蛋白样。将纯化的SH2蛋白和不同浓度的TSN共孵育2小时，然后加入到制备的STAT3蛋白样中，孵育过夜。进行pull-down实验。

5.TSN影响STAT3的二聚化结合

为了验证TSN影响STAT3的二聚化，我们利用IP实验检测，TSN对外源性的STAT3二聚化影响。构建STAT3过表达质粒(STAT3-pcDNA3.1-3xHA和STAT3-pcDNA3.1-3xFlag)，利用lipo2000将这两种质粒转染293T细胞，48小时后，加入不同浓度的TSN收取细胞。利用FLAG或HA的抗体进行Co-Immunoprecipitation(CoIP)实验。

二、实验结果

我们根据Docking assay预测TSN和STAT3蛋白结合的结合情况，我们发现TSN和Arg-609和Lys-591氨基酸残基能直接结合(图2A)，这说明TSN主要结合在STAT3的SH2结构域，我们纯化出带有GST标签的STAT3-SH2蛋白进行SPR实验(图2B)。我们发现TSN确实能结合在STAT3-SH2结构域(图2C)。我们利用Pull down以及COIP实验进一步验证TSN确实能影响SH2结构域所介导的相关功能，我们发现TSN可以很显著的抑制STAT3-SH2结构域蛋白和STAT3的结合(图2D)，同时TSN可以显著的抑制外源STAT3的二聚化(图2E)。这些实验结果说明TSN是一个新的STAT3的抑制剂。

实施例3：川楝素(TSN)抑制骨肉瘤细胞的增殖、克隆形成和诱导凋亡

一、技术方法

1、细胞培养及细胞存活实验

本发明中所用骨肉瘤细胞143B、HOS、MG63.2、MG63、DUNN、LM8以及人成骨细胞培养于37℃恒温培养箱(湿度95％，CO₂浓度5％)中。用MTS法测定细胞存活。细胞以5×10³/孔密度接种至96孔板，24小时后加入不同浓度本单体化合物，对照组加入等量的DMSO，各组设6个复孔。分别继续培养48小时后，加20μl MTS于37℃孵育1-4小时，用酶标仪检测490nm处的吸光度值。实验独立重复3次。细胞存活率(％)＝加药物OD值/对照组OD值×100％。

2、克隆形成实验

消化处理处于对数生长期的相应细胞并进行计数，每孔1×10³个细胞接种于六孔板中，确保接种的细胞分布均匀。待细胞贴壁后换液加入含有对应浓度本单体化合物的完全培养基。培养一周后，用吸泵吸掉原来的培养基，PBS清洗3次，用4％多聚甲醛溶液固定细胞(20min)，然后0.5％结晶紫染液将细胞染色5min，最后用缓慢流动的自来水轻轻清洗，以洗掉未结合的结晶紫染液，室温自然干燥。显微镜下拍照，计算细胞克隆形成数量。

3、细胞凋亡(Apoptosis)实验

143B和MG63.2细胞分别接种于6孔板，24小时待细胞贴壁后，加入含有不同浓度本单体化合物的完全培养基，48小时后，利用凋亡检测试剂盒进行凋亡检测。流式细胞凋亡检测时，细胞分为不染组、单染PI组、单染Annexin V组以及PI、Annexin V双染组。收集培养基上清，1mL PBS洗细胞后回收。消化细胞，终止消化后收集细胞到对应的离心管中，离心。用Milli-Q水将10×Binding Buffer稀释至1×溶液。离心后的细胞用PBS洗2次，再次离心。吸净PBS后，每管加入100μL稀释至1×的结合缓冲液，用移液枪轻轻吹打，使细胞重悬，不染组不加PI以及Annexin V，单染PI组加入PI 5μL，单染Annexin V组加入Annexin V 5μL，Annexin-V-PI双染组均加入PI和Annexin V各5μL，混匀。室温避光孵育15分钟，将细胞转移到5mL流式管中，流式细胞仪上机检测。流式细胞仪检测，统计凋亡细胞数。

4、免疫印迹实验

免疫印迹方法同上。

二、实验结果

MTS实验结果表明川楝素可以浓度梯度的抑制骨肉瘤细胞的生长，在100nM就有很显著的抑制效果(图3A)。而对成骨细胞却没有明显的抑制作用。克隆形成实验表明川楝素在25nM就可以明显抑制细胞克隆的形成(图3B)。此外，川楝素还能剂量依赖性地诱导143B和MG63.2细胞的凋亡。同时，Western Blot实验发现，川楝素可以诱导细胞凋亡标志蛋白CL-PARP的表达(图3C)。以上实验结果表明，川楝素在体外可以抑制骨肉瘤细胞的生长。

实施例4：川楝素(TSN)抑制骨肉瘤细胞侵袭、降解基质的能力以及逆转EMT

1.Transwell小室迁移侵袭实验

消化并计数处于对数生长期的143B和MG63.2细胞，细胞重悬在无血清并溶有不同浓度本单体化合物的基础培养基中，细胞以10×10⁴个/孔(200μL)接种至Transwell小室的上室中。下室中则加入600μL含有对应浓度本单体化合物的完全培养基。置于细胞培养箱中培养12小时。取出Transwell小室用多聚甲醛固定小室细胞，固定20分钟后。0.5％结晶紫染液将细胞染色处理5分钟，清洗小室，将未结合的结晶紫洗掉，用棉签轻轻擦拭Transwell小室的上侧，将未迁移到下侧的细胞擦掉。显微镜下拍照，统计多个视野的细胞数目。细胞侵袭实验需提前在小室隔膜上铺一层基质胶。细胞迁移率(％)＝加药物细胞迁移数/对照组细胞迁移数×100％。

2.Fluorescein isothiocyante(FITC)-gelatin降解实验

细胞发生迁移和侵袭首先要分泌一些基质金属蛋白酶降解基底膜。我们利用这个实验模拟gelatin降解的情况。简单地说，用50mg/ml的多聚赖氨酸包被“爬片”。PBS洗三次，用0.15％的戊二醛孵育10分钟，PBS洗三次，将0.1％fluorescein FITC-gelatin和0.2％porcine gelatin按1:9混匀加到处理好的“爬片”上，PBS洗三次，用10％FBS/DMEM孵育2小时，将骨肉瘤细胞接种在“爬片”，加入不同浓度的TSN。孵育12小时，然后固定进行免疫荧光染色。统计降解率。

3.Western blot实验

免疫印迹方法同上。

4.免疫荧光

将143B细胞接种在预先包被的细胞“爬片”上，24小时后，加入不同浓度的川楝素，48小时后，用4％的多聚甲醛固定细胞，再于0.5％Triton X-100的PBS通透10min，最后用1％BSA封闭30min。之后孵育相应的一抗4℃过夜，然后用PBS清洗，之后用Alexa-488偶联的第二抗体孵育。DAPI用细胞核的标记，最后用共聚焦显微镜拍照。

二、实验结果

侵袭实验表明川楝素可以浓度梯度抑制骨肉瘤细胞的侵袭(图4A)，(FITC)-gelatin降解实验表明，经过TSN处理后，骨肉瘤细胞降解基底膜的能力被明显的抑制。这样可以部分解释TSN抑制骨肉瘤细胞侵袭的能力(图4B)。Westernblot和免疫荧光实验说明TSN可以逆转骨肉瘤EMT(图4C和D)。为其抑制骨肿瘤的转移提供良好的依据。

实施例5：川楝素(TSN)抑制骨肉瘤生长、转移以及延长荷瘤小鼠生存时间

一、技术方法

1.川楝素对小鼠骨肉瘤生长和转移的抑制作用

将10×10⁵个细胞注射到裸鼠的胫骨中，7天后，将小鼠随机分成三组，即：对照组、低浓度组(1mg/kg/2天)和高浓度组(2mg/kg/2天)，给药28天，终止实验，处死小鼠，玻璃肿瘤以及肺组织。统计肿瘤重量和肺部结节数。肿瘤组织保存用于后续实验。

2.免疫印迹实验

免疫印迹实验方法同上。

3.H&E染色

将肺组织固定，包埋。于切片机上切成4μm薄片。进行脱蜡脱水。按照H&E试剂盒染色方法进行染色。

4.川楝素对荷瘤小鼠生存率的影响

将10×10⁵个细胞注射到裸鼠的胫骨中，7天后，将小鼠随机分成三组，即：对照组、低浓度组(1mg/kg/2天)和高浓度组(2mg/kg/2天)，持续给药，实时监测每组小鼠的生存情况，统计生存率。

二、实验结果

如图5A所示，川楝素可以浓度依赖的抑制小鼠骨肿瘤的生长，紧接着我们发现处理组小鼠骨肿瘤肺转移的情况得到明显的改善。对照组小鼠的肺部出现大量的转移结节，而处理组的肺转移结节很少或几乎没有(图5B和C)。免疫印迹结果发现川楝素在体内也可以很明显的抑制STAT3的活性及其靶基因的表达，同时可以影响EMT相关蛋白的表达(图5D)。图5E的结果表明，川楝素可以明显延长荷瘤小鼠的生存时间。

实施例6：川楝素(TSN)抑制人源骨肉瘤的生长

一、技术方法

1.人源性骨肉瘤动物模型

将病人来源的新鲜组织皮下接种到裸鼠(我们记为F1)，待肿瘤能顺利存活并生长，我们认为接种成功，传代(F2)。第三代(F3)的肿瘤我们用于TSN抑制活性的研究。将F2的肿瘤接种到裸鼠，待七天后，小鼠被随机分为三组(对照组、低浓度组和高浓度组)，给予不同浓度的TSN。在给药的过程中，每周用游标卡尺测量肿瘤体积一次。待对照组的体积长到1500mm³左右，终止实验，肿瘤被剥离、称重。

2.组织免疫印迹

免疫印迹方法同上。

实验结果：为了更好的验证川楝素抑制骨肉瘤的效果，我们成功建立了人源骨肉瘤动物模型，结果如图6A所示。利用这个模型，我们发现川楝素可以很明显的抑制人源骨肉瘤的生长(图6B和C)。同时也大大减少了肿瘤的重量(图6D)。机制上我们发现川楝素很好抑制STAT3的活性以及靶基因的表达(图6E)。

实施例7：川楝素(TSN)抑制其他几种肿瘤的增殖以及STAT3的活性

一、技术方法

1.细胞增殖实验

MTS方法同上。

2.免疫印迹实验

免疫印迹实验方法同上。

二、实验结果

为了验证川楝素对其他STAT3异常表达的恶性肿瘤的抑制活性，我们进行了MTS实验，结果显示川楝素对结肠癌(HCT116)、胃癌(SGC7901)、卵巢癌(SKOV3)、乳腺癌(MDA-MB231)、前列腺癌(DU145)、宫颈癌(HeLa)、以及胰腺癌(SW-1990)在100nM就具有较好的抑制效果(图7A)。免疫印迹实验结果显示，川楝素对这些类型肿瘤的STAT3的活性也具有很好的抑制作用(图7B)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.中草药单体小分子化合物川楝素或药学上可接受的盐在制备治疗骨肉瘤疾病药物中的应用，所述川楝素具有以下式(I)结构：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述川楝素或药学上可接受的盐作为唯一活性成分。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物单独使用或与其他药性成分联合使用。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括其他治疗骨肉瘤恶性肿瘤的药性成分。

5.中草药单体小分子化合物川楝素或药学上可接受的盐在制备抑制骨肉瘤生长和转移的药物中的应用，所述川楝素的结构如式(I)所示：

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述药物配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂或透皮贴剂。