CN112656808A

CN112656808A - 一种肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN112656808A
Application number: CN202110004767.1A
Authority: CN
Inventors: 何书英; 薛金冰; 张通
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-01-04
Filing date: 2021-01-04
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明涉及一种肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明研究了肝素寡糖抑制肿瘤发展的潜在价值及机制，结果显示肝素寡糖的抗肿瘤作用是通过其抑制生长因子诱导细胞表面受体而抑制黏附分子的表达从而发挥作用的。具体是通过血管内皮生长因子模拟肿瘤内环境刺激人脐静脉内皮细胞建立细胞异常模型，通过细胞黏附和qPCR等实验研究肝素寡糖抗肿瘤作用及机制，结果显示肝素寡糖抑制乳腺癌细胞对内皮细胞的黏附，且肝素寡糖下调细胞表面受体VEGFR2的mRNA和蛋白表达水平，同时下调细胞表面黏附分子E‑selectin和ICAM‑1的mRNA和蛋白表达水平，表明VEGFR2是肝素寡糖抗肿瘤活性的重要靶点之一。此研究可为治疗肿瘤生长转移提供新的途径。

Description

一种肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及肝素寡糖分子量为3200D，具有抑制乳腺癌细胞与内皮细胞黏附的作用，提供其制备抗肿瘤药物的应用。

背景技术

研究发现肝素和低分子量肝素能够延长癌症患者的生存期以及在动物体内具有显著的抗肿瘤转移作用，而且肝素抗肿瘤活性不依赖于其抗凝活性；其在体内的靶器官即为血管内皮，通过与肿瘤相关因素，如选择素、肝素酶、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)等相互作用抑制肿瘤的生长和转移实现的。肿瘤细胞的生长依赖于血管内皮细胞的增殖与迁移，肿瘤细胞的转移依赖于肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附，这都与血管内皮细胞黏附分子的表达相关。因此，抑制血管内皮细胞黏附分子的表达可能是一种有潜力的抑制恶性实体肿瘤的生长和转移的治疗策略。

然而，肝素在发挥抗肿瘤活性的同时也会带来出血及血小板减少等副作用，因此，急需寻求一种抑制肿瘤生长和转移，并避免出血及血小板减少等副作用的治疗方式，为开发靶向血管的肝素寡糖类抗肿瘤药物提供参考。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是研究肝素寡糖抑制内皮细胞与肿瘤细胞黏附的机制，提供肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞生长和/或转移的药物。

进一步的，所述肝素寡糖为肝素十二糖，分子量为3200D。

进一步的，所述肝素十二糖为结构式Ⅰ所示的肝素十二糖：

进一步的，所述抗肿瘤药物通过肝素寡糖作为VEGFR2抑制剂从而发挥抗肿瘤作用，即抑制肿瘤细胞生长和/或转移的作用。

进一步的，所述抗肿瘤药物通过肝素寡糖抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞黏附分子的表达从而发挥抗肿瘤作用，即抑制肿瘤细胞生长和/或转移的作用。

进一步的，所述肝素寡糖作为VEGFR2的抑制剂，抑制血管内皮生长因子(VEGF)与VEGFR2的相互作用，进而抑制内皮细胞表面黏附分子的表达，从而使所述抗肿瘤药物发挥抗肿瘤作用。

本发明的第二个目的是提供一种抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物以肝素寡糖为活性成分，辅以药学上可接受的载体。

进一步的，所述抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞生长和/或转移的药物。

进一步的，所述肝素寡糖为肝素十二糖，分子量为3200D。

进一步的，所述肝素十二糖为结构式Ⅰ所示的肝素十二糖。

进一步的，所述抗肿瘤药物组合物能够抑制肿瘤细胞生长和/或转移。

进一步的，所述抗肿瘤药物可以制备成临床需要的各种制剂。

本发明技术方案相对于现有技术的有益效果在于：

本发明研究肝素寡糖抑制内皮细胞与肿瘤细胞黏附的机制，采用不同浓度的肝素寡糖作用于人脐静脉内皮细胞HUVEC，选择10ng/mL VEGF生长因子刺激内皮细胞建立细胞异常模型，结果发现肝素寡糖可以剂量依赖性的抑制内皮细胞与肿瘤细胞的黏附，显著下调血管内皮生长因子受体VEGFR2的mRNA和蛋白表达水平，同时下调细胞表面黏附分子E-selectin和ICAM-1的mRNA和蛋白表达水平。此研究可为治疗血管异常导致的肿瘤生长转移提供新的途径。

本研究中肝素寡糖可以通过常规渠道获得，也可以采用中国专利专利号为CN201010139398.9，专利名称：一种肝素十二糖、其制法及其抗血管平滑肌细胞增殖的用途；中记载的肝素寡糖的制备方法制备获得。

本发明分子量为3200D左右的肝素十二糖对于血管内皮生长因子(VEGF)促血管内皮细胞的增殖作用有抑制效果，并且能够同时下调细胞表面黏附分子E-selectin和ICAM-1的表达水平，从而实现了其具有抑制肿瘤生长和转移的抗肿瘤作用，表明VEGFR2是肝素寡糖抗肿瘤活性的重要靶点之一，且具有生物利用度高和较低的出血倾向及较少的血小板减少症等优点，这有助于阐明肝素寡糖的抗肿瘤转移机制，为开发靶向血管的肝素寡糖类抗肿瘤药物提供参考。

附图说明

图1为MTT实验确定肝素寡糖对HUVEC细胞增殖影响的数据统计分析结果图

图2为细胞黏附实验确定肝素寡糖对HUVEC细胞与肿瘤细胞黏附影响的细胞图

图3为细胞黏附实验中各实验组肿瘤细胞黏附数目的数据统计分析结果图

图4为Cell-based ELISA实验确定肝素寡糖对VEGFR2蛋白表达影响的数据统计分析图

图5为Cell-based ELISA实验确定肝素寡糖对HUVEC细胞表面E-selectin蛋白表达影响的数据统计分析图

图6为Cell-based ELISA实验确定肝素寡糖对HUVEC细胞表面ICAM-1蛋白表达影响的数据统计分析图

图7为qPCR实验确定肝素寡糖对VEGFR2 mRNA水平影响的数据统计分析图

图8为qPCR实验确定肝素寡糖对E-selectin mRNA水平影响的数据统计分析图

图9为qPCR实验确定肝素寡糖对ICAM-1mRNA水平影响的数据统计分析图

具体实施方式

以下实施例中所述VEGFR2是指血管内皮细胞生长因子受体2；

以下实施例中所述E-Selectin是指E选择素；

以下实施例中所述ICAM-1是指细胞间黏附分子1；

以下实施例中所述HDO是指肝素寡糖，具体的，为结构式Ⅰ所示的肝素十二糖(分子量为3200D左右)。结构式Ⅰ：

以下实施例中所述LMWH是指低分子肝素，具体的，为结构式Ⅱ所示的达肝素钠(分子量为6000D左右)。

以下是示例中所述Vorolanib是指酪氨酸激酶抑制剂，具体的，如结构式Ⅲ所示：

实施例1肝素寡糖的制备

步骤1：称取1g的肝素钠，用蒸馏水溶解制成2％(w/v)的溶液，加入0.25g亚硝酸钠，用盐酸调节pH至2.8，制得降解液，放入摇床进行反应，25℃，150rpm/min，反应4h,反应期间间隔测定pH并调节至2.8。反应完成后用氢氧化钠调pH至6-9，即得肝素寡糖粗品液，50℃真空旋蒸后冷冻干燥。

步骤2：取上述冻干粉，用流动相溶解，采用凝胶色谱柱(Bio-Gel P6，1.0cm×100cm)进行分离，流动相为0.2mol/L NaCl，流速为0.3mL/min，每管收集5min。

步骤3：取上述收集液10μL与等体积的40％蔗糖溶液混匀，以溴酚蓝作指示剂进行电泳。电泳胶的浓度采用10％的分离胶，5％的浓缩胶，100V电泳1小时。电泳完成后用0.25％(w/v)阿利新兰染色液染色30min，用1％(v/v)醋酸洗脱至背景无色。观察分子量分布并选取分子量在3200左右的组分，旋蒸、冻干，即得结构式Ⅰ所示的肝素十二糖。

使用前，将制备的肝素十二糖溶于蒸馏水中并测定浓度，用于后续实施例中使用。

实施例2 MTT实验检测肝素寡糖对HUVEC细胞增殖的影响

培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞，来源：ATCC)至90％融合，以含0.02％(w/v)EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化，充分混匀后96孔板每孔加入100μL的5×10⁴个/ml的细胞悬液，37℃培养24h。将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含10ng/mL VEGF)及不同浓度HDO组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM，分别添加10ng/mL VEGF)，每组设6个复孔，并用含0.5％(v/v)FBS的DMEM培养基配置各组的给药培养基，37℃培养24h。每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃孵育4h，小心吸出培养基，每孔加入150μL DMSO于摇床振荡10min溶解结晶，混匀后于570nm处测吸光值。用Graph Pad Prism 5.0软件统计分析所得的数据，定量分析结果如图1。

结果显示：HUVEC细胞加入10ng/mL VEGF因子刺激后显著促进了内皮细胞的增殖；而在0.01～10μM范围内不同剂量的肝素寡糖作用后呈剂量依赖性的方式抑制了VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。

实施例3细胞黏附实验检测肝素寡糖对HUVEC细胞与肿瘤细胞黏附的影响

步骤1：培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞，来源：ATCC)至90％融合，以含0.02％(w/v)EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化，充分混匀后96孔板每孔加入100μL的5×10⁴个/ml的细胞悬液，37℃培养过夜至80％融合。将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含10ng/mL VEGF)、不同浓度HDO组(0.01μM、0.1μM、1μM，分别添加10ng/mL VEGF)、LMWH组(0.1μMLMWH+10ng/mL VEGF)及Vorolanib组(40nM Vorolanib+10ng/mL VEGF)，每组设6个复孔，并用含0.5％(v/v)FBS的DMEM培养基配置各组的给药培养基，37℃培养24h。

步骤2：给药23h后，乳腺癌(MDA-MB-231细胞,来源：ATCC)消化后离心得到细胞沉淀，取1ml钙黄绿素AM重悬细胞(避光操作)，37℃孵育30min。孵育结束后，离心后用37℃预热的无血清培养基重悬细胞，离心并重复两次，最后用37℃预热的无血清培养基调整细胞密度至1×10⁴个/ml，得到乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液。

步骤3：96孔板弃去旧培养基(即，步骤1中的含0.5％(v/v)FBS的DMEM培养基配置各组的给药培养基)，每孔加入100μL经步骤2处理的乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液，37℃共培养1h。弃去乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液，PBS洗涤2次后保留PBS，避光拍照。再经过细胞计数后用Graph Pad Prism 5.0软件分析所得的数据，定量分析结果如图2和3。图2a为空白组肿瘤细胞对内皮细胞黏附图，图2b模型组肿瘤细胞对内皮细胞黏附图，图2c-e为不同浓度HDO组肿瘤细胞对内皮细胞黏附图，图2f为LMWH组肿瘤细胞对内皮细胞黏附图，图2g为Vorolanib组肿瘤细胞对内皮细胞黏附图。

结果显示：HUVEC细胞加入10ng/mL VEGF因子刺激后显著增加了对乳腺癌细胞的黏附，而在0.01～1μM范围内不同浓度的肝素寡糖作用后同模型组相比HUVEC细胞的黏附能力得到抑制，且具有剂量依赖性；0.1μM LMWH作用后同模型组相比，存在抑制细胞黏附的效果但抑制效果不如同浓度的肝素寡糖。

实施例4 Cell-based ELISA检测肝素寡糖对HUVEC中VEGFR2、E-Selectin和ICAM-1蛋白表达的影响

步骤1：培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞，来源：ATCC)至90％融合，以含0.02％(w/v)EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化，充分混匀后96孔板每孔加入100μL的5×10⁴个/ml的细胞悬液，37℃培养过夜至80％融合，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含10ng/mL VEGF)、不同浓度HDO组(0.01μM、0.1μM、1μM，分别添加10ng/mL VEGF)、LMWH组(0.1μMLMWH+10ng/mL VEGF)及Vorolanib组(40nM Vorolanib+10ng/mL VEGF)，每组设6个复孔，分组给药孵育24h。

步骤2：用PBS洗涤，干燥后加4％(w/v)多聚甲醛室温固定20-30min。加PBS-TritonX-100洗涤，5min×3次，加0.6％(v/v)H₂O₂-PBS-Triton X-100孵育20-30min。加PBS-TritonX-100漂洗，5min×3次，加100μL 10％(w/v)BSA，37℃封闭100min。将样品分为三组，第一组96孔板中加入50μL 5％(w/v)BSA稀释的VEGFR2一抗，4℃过夜孵育。第二组96孔板中加入50μL5％(w/v)BSA稀释的E-Selectin一抗，4℃过夜孵育。第三组96孔板中加入50μL 5％(w/v)BSA稀释的ICAM-1一抗，4℃过夜孵育。

步骤3:步骤2中各组孵育结束后，弃液体，PBS-Triton X-100洗涤5min×3次，PBS洗涤5min×3次，最后每孔加入200μL TMB显色液于37℃避光显色30min。每孔加入50μL 1MH₂SO₄终止液终止反应，立刻测量450nm处吸光度。用Graph Pad Prism 5.0软件所得的数据，定量分析结果如图4、5和6。

结果显示：HUVEC细胞加入10ng/mL VEGF因子刺激后显著促进了VEGFR2、E-Selectin和ICAM-1蛋白的表达，而肝素寡糖呈剂量依赖性的抑制了由VEGF刺激引起的VEGFR2、E-Selectin和ICAM-1蛋白表达增多。

实施例5 qPCR检测肝素寡糖对HUVEC中VEGFR2、E-Selectin和ICAM-1mRNA水平的作用

步骤1：培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞，来源：ATCC)至90％融合，以含0.02％(w/v)EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化，充分混匀后6孔板每孔加入2mL的5×10⁴个/ml的细胞悬液，37℃培养过夜至80％融合，将细胞分为空白组(Control)、模型组(Model，含10ng/mLVEGF)、不同浓度HDO组(0.01μM、0.1μM、1μM，分别添加10ng/mL VEGF)、LMWH组(0.1μM LMWH+10ng/mL VEGF)及Vorolanib组(40nM Vorolanib+10ng/mL VEGF)，分组给药孵育24h。

步骤2：将步骤1处理的各组细胞分别用TRIzol提取总RNA并测定浓度后逆转录至cDNA。用SYBR绿色荧光检测试剂盒进行Real-time qPCR分析。在Real-time qPCR反应八连管中按下列组分配制PCR反应体系(冰上进行)。各组模板cDNA同时进行目的基因(VEGFR2、E-Selectin和ICAM-1)及内参基因(GAPDH)的扩增反应，设5个复孔，重复两次实验，每个PCR板均设定一个阳性对照(校正模板)和空白对照(去离子水)。

按下列组份配制PCR反应体系：

引物序列为：

上述反应液配制在冰上进行，尽量在1小时内配制好，以防止荧光染料的衰减，短暂离心后，将反应管按顺序放置qPCR仪上进行PCR。设置PCR仪反应条件，预变性：95℃，10min；变性：95℃，15s；退火：60℃，30s；延伸：72℃，30s，扩增40个循环。得出各样品的Ct值，采用2^-△△Ct法计算。内参使用GAPDH。用Graph Pad Prism 5.0软件分析所得的数据，定量分析结果如图7、8和9。

结果显示：HUVEC细胞加入10ng/mL VEGF因子刺激后显著促进了VEGFR2、E-Selectin和ICAM-1mRNA的表达，而肝素寡糖呈剂量依赖性的抑制了由VEGF刺激引起的E-Selectin和ICAM-1mRNA表达增多；肝素寡糖作用后VEGFR2 mRNA的表达受到不同程度的抑制，但是不存在剂量依赖性，其中0.1μM浓度的肝素寡糖抑制效果最为显著。

通过以上实施例可以看出：肝素寡糖，特别是肝素十二糖作为VEGFR2的抑制剂，具有抑制血管内皮生长因子(VEGF)促血管内皮细胞的增殖作用，抑制血管内皮生长因子(VEGF)与VEGFR2的相互作用，进而抑制内皮细胞表面黏附分子的表达，从而实现抑制肿瘤生长和转移，从而使所述抗肿瘤药物发挥抗肿瘤作用；同时由于肝素寡糖的分子量更小，抗凝效果降低，副作用降低，因此还能够避免出血及血小板减少等副作用，为开发靶向血管的肝素寡糖类抗肿瘤药物提供参考。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagcttaag aatgcatcct tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgctttcc ccaatacttg tc 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccgccagcc tcagaat 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctcaccaaa cccttgg 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agccaatttc tcgtgccg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtcgctgtt gaagtcagag 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaccatctt ccaggagcga g 21

Claims

1.肝素寡糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞生长和/或转移的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝素寡糖为肝素十二糖。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝素寡糖为分子量为3200D的肝素十二糖。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝素十二糖为结构式Ⅰ所示的肝素十二糖：

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物通过肝素寡糖作为VEGFR2抑制剂从而发挥抗肿瘤作用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物通过肝素寡糖抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞黏附分子的表达从而发挥抗肿瘤作用。

7.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以肝素寡糖为活性成分，辅以药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物组合物能够抑制肿瘤细胞生长和/或转移。