CN115417937A

CN115417937A - 一种含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115417937A
Application number: CN202210971148.4A
Authority: CN
Inventors: 刘纯慧; 张桂姣; 仇亚琪; 王琳; 李婧茹
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2042-08-12
Also published as: CN115417937B; WO2024032575A1

Abstract

本发明涉及一种含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖及其制备方法与应用，具有式I所示的结构。本发明还提供含有通式I结构化合物的化学酶法制备方法以及应用。本发明的肝素十二糖合成步数明显少、总产率显著高；具有强效特异抗Xa因子活性，且其抗Xa因子活性可以被鱼精蛋白有效地中和，中和率>80％；无连续多个三硫酸双糖，不易引起连续多个三硫酸双糖(IdoA2S‑GlcNS6S)依赖的药代动力学缺陷(如半衰期短)和不良反应(如HIT等)。适合用于制备更加安全、具显著成本优势的新型抗凝血抗血栓药物。

Description

一种含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

肝素类药物用作临床抗凝剂已超过90年，至今仍广泛应用于血栓栓塞性疾病、外科手术、血液透析等，全球市场规模超过80亿美元。目前市售普通肝素即未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)是主要从猪小肠黏膜提取得到的多分散的多糖组分，重均分子量～14000Da；低分子量肝素(low-molecular-weight heparins,LMWH)如依诺肝素、达肝素、那屈肝素、亭扎肝素则是UFH经化学或酶法控制部分解聚得到的复杂低分子量混合物，重均分子量通常为3500～6000Da，已逐渐替代UFH成为首选临床抗凝药物。动物源UFH及LMWH虽然具有成本相对低廉、生产工艺成熟等优点，但结构异质性导致其无法克服的临床局限性，并存在杂质污染、原料供应链脆弱问题。研究已经证实，动物源肝素的抗凝作用高度依赖糖链中随机分布、与抗凝血酶(antithrombin，AT)特异性结合的独特五糖序列(简写为：GlcNS/Ac6S-GlcA-GlcNS6S3S-IdoA2S-GlcNS6S)，其约占整个肝素链的1/3。2001年批准上市的磺达肝癸钠(商品名Arixtra)为该五糖序列的甲基糖苷衍生物，是首个全合成的、结构确定的肝素类单一化合物，为开发新一代抗凝肝素药物提供了思路。

鱼精蛋白是最早由FDA批准的动物源肝素的解毒剂，能够消除动物源肝素的抗凝活性而恢复机体正常的凝血作用，其中UFH的抗凝活性能够完全被鱼精蛋白中和，LMWH能被部分中和。肝素的这种“可中和”特性便于根据治疗进程结束抗凝治疗，能够有效避免出血等不良反应。遗憾的是，全化学合成的磺达肝癸钠的抗凝活性完全不能被鱼精蛋白中和，导致其在临床应用中受到较大限制，因此研发可被鱼精蛋白中和的抗凝肝素新分子迫在眉睫。

据报道，美国北卡大学教堂山分校Jian Liu教授采用化学酶法合成了一种含单一AT结合五糖、4个连续三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)的肝素十二糖，并证实该分子的抗凝活性能够被鱼精蛋白有效地中和，不足之处是其合成需22～23步，步骤繁琐，总产率偏低，且化合物存在4个连续三硫酸双糖，容易导致体内半衰期短等药代动力学缺陷、潜在的肝素诱导的血小板减少症(HIT)等不良反应。

因此，研发抗凝作用更强、药代动力学更佳、副作用更低的“可中和”肝素新分子迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖新分子及其制备方法与应用。

术语说明：

AT：抗凝血酶

IdoA：艾杜糖醛酸

GlcA：葡糖醛酸

UDP-GlcNTFA：尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺

UDP-GlcNAc：尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺

UDP-GlcA：尿苷二磷酸-葡糖醛酸

PAPS：3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸。

KfiA：大肠杆菌K5 N-乙酰氨基葡糖基转移酶

PmHS2：多杀巴斯德菌Heparosan合酶2

NST：N-硫酸基转移酶

C₅-epi：C₅-异构化酶

2OST：2-O-硫酸基转移酶

6OST：6-O-硫酸基转移酶

3OST：3-O-硫酸基转移酶

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)的肝素十二糖新分子，或其药学上可接受的盐，其具有如下式I所示结构：

R₁、R₃为磺酰基(-SO₃H)或乙酰基(-COCH₃)；R₂为磺酰基或氢(-H)；

R₄选自具有特征紫外吸收的苯基或取代苯基，芳杂环或取代芳杂环；

糖残基G为葡糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)。

根据本发明优选的，取代苯基或取代芳杂环的取代基为硝基、卤素、羟基或三氟甲基。

根据本发明优选的，含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖新分子为下列之一：

根据本发明优选的，所述的含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)的肝素十二糖新分子具有显著的抗Xa因子活性，无明显的抗IIa因子活性，抗Xa因子活性可以被鱼精蛋白有效地中和，抗Xa因子活性被鱼精蛋白中和的中和率>80％。

本发明的第二个目的是提供含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)的肝素十二糖的制备方法，采用化学酶法合成策略进行。

含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的制备方法，该方法以还原末端共价连接R₄基团的葡糖醛酸(GlcA)衍生物为起始底物，为如下步骤a、b糖基转移酶催化反应至少重复一次与步骤c、d、e、f、g化学酶法修饰反应中其中四步或五步组合的方法；

步骤a，在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)或Heparosan合酶2(PmHS2)催化下，以UDP-GlcNTFA或UDP-GlcNAc为糖基供体，糖基供体的GlcNTFA残基或GlcNAc残基以α-1,4糖苷键被转移至底物非还原末端的GlcA上，得到中间体化合物；

步骤b，在PmHS2酶催化下，以UDP-GlcA为糖基供体，糖基供体的GlcA残基以β-1,4糖苷键连接至底物非还原末端的葡糖胺(GlcNTFA或GlcNAc)，得到中间体化合物；

步骤c，肝素中间体在温和的碱性水溶液中静置于冰上，糖链的GlcNTFA残基全部脱三氟乙酰基(TFA)转变为GlcNH₂，然后在N-硫酸基转移酶(NST)催化下使之转变为GlcNS，得到N-硫酸化中间体；

步骤d，在C₅-异构化酶(C₅-epi)、2-O-硫酸基转移酶(2OST)的共同催化下，N-硫酸化产物糖链中两个GlcNS之间或GlcNS(非还原端)与GlcNAc之间的特定GlcA残基被转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，得到含IdoA2S残基的中间体；

步骤e，在2OST的单独催化下，底物两个GlcNS之间或GlcNS(非还原端)与GlcNAc之间的特定GlcA残基被转变为2-O-硫酸化葡糖酸(GlcA2S)，得到含GlcA2S的中间体；

步骤f，在6-O-硫酸基转移酶1和3(6OST1、6-OST3)的共同催化作用下，底物糖链的全部GlcNS或GlcNAc残基的6-OH发生硫酸化修饰成为GlcNS6S或GlcNAc6S，得到6-O-硫酸化中间体；

步骤g，在3-O-硫酸基转移酶1(3OST1)的催化作用下，底物糖链中GlcA与IdoA2S之间的GlcNS6S的3-OH发生硫酸化(GlcNS6S3S)，得到最终目标化合物。

根据本发明优选的，起始底物为对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)。

根据本发明优选的，步骤a中，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)、Heparosan合酶2(PmHS2)是以大肠杆菌重组表达，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)。

根据本发明优选的，步骤a、b中，酶催化反应所用的缓冲液为50mmol/L Tris-HCl，Tris-HCl中含6mmol/L MnCl₂，pH＝7.0-7.5，反应温度20℃～37℃，酶与底物的加入量、反应时间不受限定；得到的酶促反应液利用反相C18或阴离子交换柱层析纯化得中间体化合物。

根据本发明优选的，步骤a、b中，糖基供体的加入量为底物的1.2倍当量以上。

根据本发明优选的，步骤c、d、e、f、g中，NST、C₅-epi、2OST、6OST1、6-OST3、3OST1肝素修饰酶是利用大肠杆菌、酵母或昆虫细胞重组表达得到；NST、2OST、6OST1、6-OST3、3OST1肝素修饰酶均以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)为硫酸基供体；各修饰酶催化反应的缓冲液为50mmol/L2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，pH＝7.0～7.5，反应温度20℃～37℃，酶与肝素中间体底物的加入量、反应时间不受限定，得到的反应液利用阴离子交换柱层析纯化得产物。

根据本发明优选的，步骤c、d、e、f、g中，硫酸基供体的加入量为底物的1.5-10倍当量。

本发明的含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖的制备方法是通过反复试验研究各糖基转移酶、肝素修饰酶对不同肝素中间体分子的催化活性和底物特异性的基础上建立的。

根据本发明优选的，所述的制备方法选自如下合成路线之一：

最为优选的，含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的制备方法，合成路线如下：

a→b→a→b→c→d→a→b→a→b→a→b→c→d→a→c→f→g。

具体的，含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的制备方法，步骤如下：

1)在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)或Heparosan合酶2(PmHS2)催化下，以UDP-GlcNTFA为糖基供体，糖基供体的GlcNTFA残基以α-1,4糖苷键被转移至底物非还原末端的GlcA上，得到二糖骨架中间体；

2)在PmHS2酶催化下，以UDP-GlcA为糖基供体，糖基供体的GlcA残基以β-1,4糖苷键被连接至二糖骨架非还原末端的GlcNTFA上，得到三糖骨架中间体；

3)重复步骤1)、步骤2)将糖链延长，得到五糖骨架中间体；

4)五糖骨架中间体在温和的碱性水溶液中静置于冰上，糖链的GlcNTFA残基全部脱三氟乙酰基(TFA)转变为GlcNH₂，然后在N-硫酸基转移酶(NST)催化下使之转变为GlcNS，得到N-硫酸化五糖中间体；

5)在C₅-异构化酶(C₅-epi)、2-O-硫酸基转移酶(2OST)的共同催化下，N-硫酸化五糖中间体糖链中两个GlcNS之间的特定GlcA残基被转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)；得到含一个IdoA2S残基的肝素五糖；

6)参照步骤1)，糖基供体更换为UDP-GlcNAc，由KfiA或PmHS2催化延长糖链，得六糖中间体；以六糖中间体为底物，参照步骤2)将糖链延长为七糖，得七糖中间体；以七糖中间体为底物交替重复步骤1)、步骤2)继续将糖链延长，得到十一糖中间体；

7)十一糖中间体在温和的碱性水溶液中静置于冰上，糖链的GlcNTFA残基全部脱三氟乙酰基(TFA)转变为GlcNH₂，然后在N-硫酸基转移酶(NST)催化下使之转变为GlcNS，得到N-硫酸化十一糖；

8)在C₅-异构化酶(C₅-epi)、2-O-硫酸基转移酶(2OST)的共同催化下，N-硫酸化十一糖糖链中两个GlcNS之间的特定GlcA被转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，得到含两个IdoA2S残基的肝素十一糖；补加适量酶与底物并延长反应时间，进一步使十一糖中GlcNS(非还原端)与GlcNAc之间的特定GlcA残基转化为IdoA2S，得到含三个IdoA2S残基的肝素十一糖；

9)步骤8)中，含两个或三个IdoA2S残基的肝素十一糖分别重复步骤1)将糖链延长，得到含两个或三个IdoA2S残基的肝素十二糖；

10)含两个或三个IdoA2S残基的肝素十二糖在温和的碱性水溶液中静置于冰上，糖链新引入的一个GlcNTFA残基脱三氟乙酰基(TFA)转变为GlcNH₂，然后在N-硫酸基转移酶(NST)催化下使之转变为GlcNS，分别得到含两个或三个IdoA2S残基的N-硫酸化肝素十二糖；

11)在6-O-硫酸基转移酶1和3(6OST1、6-OST3)的共同催化作用下，含两个或三个IdoA2S残基的N-硫酸化肝素十二糖糖链的全部GlcNS或GlcNAc残基的6-OH发生硫酸化修饰成为GlcNS6S或GlcNAc6S，得到两种6-O-硫酸化肝素十二糖；

12)在3-O-硫酸基转移酶1(3OST1)的催化作用下，两种6-O-硫酸化肝素十二糖底物糖链中GlcA与IdoA2S之间的GlcNS6S的3-OH发生硫酸化(GlcNS6S3S)，分别得到含2个IdoA2S的目标化合物I-2或含3个IdoA2S的目标化合物I-10。

本发明的第三个目的是提供含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的应用，用于制备抗凝抗血栓药物。

一种抗凝抗血栓药物，包括上述含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂，肝素十二糖与载体或赋形剂的比例不受限定。

本发明的技术特点及优点：

1、经生色底物法测定，本发明含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的新型肝素十二糖具有显著的抗Xa因子活性，无明显的抗IIa因子活性，同时本发明首次证实糖醛糖GlcA/IdoA连接的双AT结合五糖序列能够单独激活AT而表现出强效灭活Xa因子活性。肝素十二糖抗Xa因子的半数抑制摩尔浓度(IC₅₀)显著低于阳性市售磺达肝癸钠，因此，本发明含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的新型肝素十二糖的抗Xa因子活性显著优于之前Jian Liu教授报道的肝素十二糖。

2、本发明的肝素十二糖的抗Xa因子活性可以被鱼精蛋白有效地中和，例如鱼精蛋白对目标化合物I-2、I-10的抗Xa因子活性的中和率>80％，与未分级肝素接近，而市售磺达肝癸钠的活性几乎完全不能被中和，尽管本发明的肝素十二糖结构中不具有4个连续的三硫酸双糖，但抗凝活性仍可被鱼精蛋白高效中和。

3、本发明的肝素十二糖的结构(糖残基G、R_1～R₄)的轻微改变对其抗Xa活性影响较小，对其鱼精蛋白中和效率、药代动力学特征影响较大。

4、本发明的肝素十二糖可以被鱼精蛋白有效地中和，可用于制备具成本优势的、更加安全的强效抗凝血抗血栓药物。

5、本发明的肝素十二糖所含的双AT结合序列能够单独激活AT，故其抗Xa活性优于仅含单一AT结合序列的磺达肝癸钠和已报道的十二糖；其抗Xa活性可以被鱼精蛋白有效地中和，中和率>80％；无连续多个三硫酸双糖，不易引起连续多个三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)依赖的药代动力学缺陷(如半衰期短)和不良反应(如HIT等)。

6、本发明的肝素十二糖合成步数最少步数为18步，最多为21步，少于现有已报道的十二糖(22～23步)，成本更低，可用于制备具成本优势的、更加安全的强效抗凝血抗血栓药物。

附图说明

图1是实施例3制备的肝素十二糖新分子I-2的高效液相色谱图(A)、质谱图(B)以及I-10高效液相色谱图(C)、质谱图(D)；

图2是实施例3制备的肝素十二糖新分子I-2的¹H NMR(A)和HSQC(B)谱图；

图3是实施例3制备的新型肝素十二糖新分子I-2、I-10的体外抗Xa因子；

图4是鱼精蛋白体外对实施例3的肝素十二糖新分子I-2、I-10抗凝活性的中和作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述和理解，但不能限制本发明的保护范围，下列实例中的目标化合物的编号与表1相同。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1：含单一IdoA2S残基的肝素五糖中间体的化学酶法合成

称取500mg硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP，1)溶于200mL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(含6mmol/L MnCl₂，pH＝7.2)，同时加入底物1.2倍当量的UDP-GlcNTFA及5mLKfiA酶，室温搅拌过夜，反应用PAMN-HPLC检测，色谱条件为在45min内以0→100％KH₂PO₄梯度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为310nm，待产率≥95％，用三氟乙酸(TFA)调pH至2-3中止反应，反应液用C18层析柱(3.0×50cm)进行纯化，以含0.1％TFA的甲醇-水洗脱，收到目标组分，为二糖骨架中间体，将得到的二糖骨架中间体置于与200mL 50mmol/LTris-HCl缓冲液(含6mmol/L MnCl₂，pH＝7.2)中，同时加入1.2倍当量的UDP-GlcA、5mL PmHS2酶，室温搅拌过夜，PAMN-HPLC检测反应至产率≥97％，以C18层析柱纯化得三糖骨架中间体3mer-1，以3mer-1为底物，重复上述KfiA、PmHS2反应，得到五糖骨架中间体5mer-1，PAMN-HPLC测得其纯度>82.5％，ESI-MS测得其分量1181.09Da，与理论值相符。

取400mg五糖骨架中间体5mer-1溶于100mL去离子水，置于冰上，逐滴加入0.5mol/LLiOH溶液至pH＝12，继续置于冰浴中2h，PAMN-HPLC检测反应进程；反应结束后，以冰醋酸调节pH至中性，加入1mol/L MES溶液(pH＝7.5)使其终浓度为50mmol/L，同时加入2.5倍当量的PAPS、3mL NST酶，室温搅拌过夜，利用PAMN-HPLC检测反应；反应产率>95％时醋酸调pH至4-5终止反应，用Q Sepharose层析柱(30×1.6cm)纯化，流速为3mL/min，以0→100％含1mol/LNaCl、50mmol/LNaAc缓冲液(pH＝5)梯度洗脱，检测波长为260nm和310nm，收集目标组分、脱盐、干燥得N-硫酸化的肝素五糖5mer-2；PAMN-HPLC测得其纯度>78％，ESI-MS测得其分量1149.17Da，与理论值相符。

取肝素五糖5mer-2于pH＝7.0～7.5、50mmol/L的MES缓冲液中加入2mmol/L CaCl₂及酶C₅-epi，调整反应体积为100mL，于37℃水浴反应2h。然后加入约1.5倍当量的PAPS、额外C₅-epi和足量2-OST酶，室温反应过夜；PAMN-HPLC检测反应，并根据需要补加酶或PAPS，至反应结束，反应液用Q-Sepharose强阴离子柱(30×1.6cm)纯化得到产物5mer-3。PAMN-HPLC测得其纯度>95％，ESI-MS测定其分子量为1129.27Da，产物5mer-3较5mer-2增加一个硫酸酸基团。化合物5mer-3为含一个IdoA2S残基的肝素五糖。

5mer-3的合成路线如下式Ⅱ：

实施例2：含两个及三个IdoA2S残基的肝素十一糖中间体的化学酶法合成

取220mg含一个IdoA2S残基的肝素五糖5mer-3，参照实施例1，糖基供体更换为UDP-GlcNAc并由KfiA催化延长糖链，接着以UDP-GlcA为糖基供体、PmHS2酶催化进一步延长糖链，然后交替进行KfiA(糖基供体UDP-GlcNTFA)、PmHS2(糖基供体UDP-GlcA)酶促糖链延长，直至形成肝素十一糖11mer-1，Q Sepharose层析柱(1×20cm)纯化；然后LiOH处理脱三氟乙酰基、NST催化进行N-硫酸化修饰得肝素十一糖11mer-2，PAMN-HPLC测得其纯度>99％，ESI-MS测得其分子量为2442.16Da，与理论值相符。

得到的肝素十一糖11mer-2在C₅-异构化酶(C₅-epi)、2-O-硫酸基转移酶(2OST)的共同催化下，N-硫酸化十一糖糖链中两个GlcNS之间的特定GlcA被转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，反应进行一定时间后，反应液Q Sepharose层析柱(1×20cm)纯化得11mer-3(含两个IdoA2S残基的肝素十一糖)；反应液如补加适量酶与PAPS后，继续反应至完全生成新产物，Q Sepharose层析柱(1×20cm)纯化得11mer-4(含三个IdoA2S残基的肝素十一糖)。

11mer-3经ESI-MS测得其分子量为2522.21Da，较11mer-2增加1个硫酸基团，表明其新增一个IdoA2S；

11mer-4经ESI-MS测得其分子量为2602.40Da，较11mer-2增加2个硫酸基团，表明其新增两个IdoA2S，与预期相符。

11mer-3/4的合成路线如下式Ⅲ：

实施例3：含双AT结合序列的肝素十二糖I-2、I-10的制备及表征

分别以实施例2的十一糖11mer-3/4为底物，参照参照实施例1的方法进行KfiA酶法糖链延长，以Q-Sepharose强阴离子柱(1cm×20cm)纯化得十二糖中间体12mer-1/2，然后参照上述方法依次进行化学三氟乙酰基脱除、酶法N-硫酸化修饰得十二糖中间体12mer-3/4。ESI-MS测定其分子量分别为2763.56Da以及2843.39Da，与理论值相符。

将十二糖底物12mer-3/4置于pH＝7.0～7.5、50mmol/L的MES缓冲液中，加入7倍当量PAPS，4mL的6-OST-1和4mL的6-OST-3酶，调整反应体积为140mL，37℃水浴反应过夜。利用SAX-HPLC检测反应进程，根据需要补加酶或PAPS。色谱条件为：流速为1mL/min，以0→100％洗脱液B(50mmol/L NaAc+2mol/L NaCl，pH＝5)梯度洗脱为，检测波长为260nm和310nm。待12mer-5/6反应率>99％，反应液用稀醋酸调pH＝4-5终止反应，-20℃冰箱冻融除酶，无需纯化。

将上述反应液调节pH＝7.0～7.5，并加入约2.5倍当量PAPS、5mL的3-OST-1酶，调整反应体积为200mL，37℃水浴反应过夜。PAMN-HPLC检测反应至底物修饰率为99％以上，反应液用稀醋酸调pH＝4-5后，用Q-Sepharose强阴离子柱(1cm×10cm)纯化得到产物I-2，其纯度达92％以上，ESI-MS测定其分子量为3403.12Da，与理论值相符；得到产物I-10，其纯度达97％以上，ESI-MS测定其分子量为3482.97Da，与理论值相符。I-2的NMR(600MHz,D₂O)谱图见图2，结构与预期相符。

其合成路线如下式Ⅳ：

实施例4：肝素十二糖I-2、I-10的体外抗凝活性测定

利用商品化的试剂盒采用生色底物法测得本发明制备得到的新型肝素十二糖I-2、I-10抗FⅩa活性的IC₅₀值为16.77、18.03ng/mL(4.34、4.54nmol/L)，同样条件下测得未分级肝素(UFH)、和磺达肝癸钠(Arixtra)的IC₅₀值分别为139ng/mL、12.63ng/mL(7.3nmol/L)，以摩尔浓度计新型肝素十二糖I-2、I-10抗FⅩa活性的IC₅₀值远小于磺达肝癸钠。经生色底物法测定，测试结果见图3所示，本发明制备得到的新型肝素十二糖I-2、I-10无显著的抗IIa因子活性(略)。因此，本发明制备得到的新型肝素十二糖I-2、I-10均为Xa因子的特异抑制剂。

实验例5：鱼精蛋白对肝素十二糖I-2、I-10抗凝活性的中和作用测定

采用生色底物法，加入不同浓度的鱼精蛋白对新型肝素十二糖I-2、I-10抗FⅩa活性的影响，由测定结果可知，与UFH类似，新型肝素十二糖I-10的体外抗FⅩa活性可以完全被鱼精蛋白逆转；新型肝素十二糖I-2的体外抗FⅩa活性可以被鱼精蛋白逆转80％以上，见图4。因此，本发明制备得到的肝素十二糖I-2、I-10为抗凝活性可被鱼精蛋白中和的新型肝素分子。

如实施例4和图3所示，I-2、I-10抗FⅩa活性的IC₅₀值分别为4.34、4.54nmol/L，差别不大；如实施例5和图4所示，鱼精蛋白对I-2抗凝活性的中和率>80％，而对I-10抗凝活性的中和率>90％，差别明显，因此糖残基G由GlcA替换为IdoA2S对肝素十二糖的抗Xa活性影响较小，但对其鱼精蛋白中和效率影响较大。

Claims

1.一种含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)的肝素十二糖新分子，或其药学上可接受的盐，其具有如下式I所示结构：

糖残基G为葡糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)。

2.根据权利要求1所述的肝素十二糖新分子或其药学上可接受的盐，其特征在于，取代苯基或取代芳杂环的取代基为硝基、卤素、羟基或三氟甲基。

3.根据权利要求1所述的肝素十二糖新分子，其特征在于，为下列之一：

4.权利要求1所述的含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的制备方法，该方法以还原末端共价连接R₄基团的葡糖醛酸(GlcA)衍生物为起始底物，为如下步骤a、b糖基转移酶催化反应至少重复一次与步骤c、d、e、f、g化学酶法修饰反应中其中四步或五步组合的方法；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，起始底物为对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)，步骤a中，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)、Heparosan合酶2(PmHS2)是以大肠杆菌重组表达，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；

步骤a、b中，酶催化反应所用的缓冲液为50mmol/L Tris-HCl，Tris-HCl中含6mmol/LMnCl₂，pH＝7.0-7.5，反应温度20℃～37℃，酶与底物的加入量、反应时间不受限定；得到的酶促反应液利用反相C18或阴离子交换柱层析纯化得中间体化合物，糖基供体的加入量为底物的1.2倍当量以上。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤c、d、e、f、g中，NST、C₅-epi、2OST、6OST1、6-OST3、3OST1肝素修饰酶是利用大肠杆菌、酵母或昆虫细胞重组表达得到；NST、2OST、6OST1、6-OST3、3OST1肝素修饰酶均以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)为硫酸基供体；各修饰酶催化反应的缓冲液为50mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，pH＝7.0～7.5，反应温度20℃～37℃，酶与肝素中间体底物的加入量、反应时间不受限定，得到的反应液利用阴离子交换柱层析纯化得产物，步骤c、d、e、f、g中，硫酸基供体的加入量为底物的1.5-10倍当量。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自如下合成路线之一：

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，合成路线如下：

a→b→a→b→c→d→a→b→a→b→a→b→c→d→a→c→f→g。

9.含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的制备方法，步骤如下：

3)重复步骤1)、步骤2)将糖链延长，得到五糖骨架中间体；

10.含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖的应用，用于制备抗凝抗血栓药物；

抗凝抗血栓药物，包括权利要求1所述的含双AT结合序列、无连续多个三硫酸双糖的肝素十二糖和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。