JP2005533878A - 非常に大きい硫酸化度を持つｋ５多糖体のエピマー化誘導体 - Google Patents

非常に大きい硫酸化度を持つｋ５多糖体のエピマー化誘導体 Download PDF

Info

Publication number
JP2005533878A
JP2005533878A JP2004513334A JP2004513334A JP2005533878A JP 2005533878 A JP2005533878 A JP 2005533878A JP 2004513334 A JP2004513334 A JP 2004513334A JP 2004513334 A JP2004513334 A JP 2004513334A JP 2005533878 A JP2005533878 A JP 2005533878A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
epi
acid
lmw
derivative
persulfate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2004513334A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5053512B2 (ja
JP2005533878A5 (ja
Inventor
アンナ オレステ パスクア
ゾペッティ ジョルジオ
Original Assignee
グリコレス ２０００ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IT2002MI001345A external-priority patent/ITMI20021345A1/it
Priority claimed from IT2002MI001346A external-priority patent/ITMI20021346A1/it
Priority claimed from ITMI20021854 external-priority patent/ITMI20021854A1/it
Application filed by グリコレス ２０００ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ filed Critical グリコレス ２０００ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ
Publication of JP2005533878A publication Critical patent/JP2005533878A/ja
Publication of JP2005533878A5 publication Critical patent/JP2005533878A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5053512B2 publication Critical patent/JP5053512B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C08B37/0078—Degradation products

Abstract

エピＫ５-Ｎ-硫酸を過硫酸化して、非常に高い硫酸化度を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸を得る方法を開示する。該生成物は、続くＮ-硫酸化によって、硫酸化度少なくとも４を持ち、基本的に凝固パラメーターに対する活性を有しておらず、化粧品又は医薬品の分野において有用である新規なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を提供する。さらに、相当するlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の製造における中間体として有用な低分子量エピＫ５-Ｎ-硫酸を開示する。

Description

本発明は、非常に大きい硫酸化度を持つＫ５多糖体の新規誘導体、その製法、その合成において有用な高度にＯ-硫酸化された新規中間体、及び基本的に凝固に関する活性を持たない有効成分としてＫ５多糖体の前記誘導体を含有する医薬組成物に関する。
特に、本発明は、予めＮ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化及び少なくとも２０％Ｃ５-エピマー化したＫ５-多糖体を原料として、好適な条件下におけるＯ-過硫酸化及び続くＮ-硫酸化を介して、抗血管形成（antiangiogenetic）活性及び抗ウイルス活性の前記エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸及びエピ-Ｋ５-Ｎ-硫酸とする、エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の製法に関する。
ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の如きグリコサミノグリカンは、各種の動物の臓器から産業的に抽出される生体高分子である。
特に、主にブタの腸粘膜又はウシの肺からの抽出によって得られるヘパリンは、ofa鎖混合体（基本的に、ウロン酸（グルクロン酸又はイズロン酸）及びα-１→４又はβ-１→４結合によって結合されたアミノ糖（グルコサミン）でなる）でなる、分子量分布約3,000〜約30,000Ｄを持つ多分散コポリマーである。ヘパリンでは、ウロン酸単位は、２位において硫酸化され、グルコサミン単位は、存在するグルコサミン単位の約０.５％で、Ｎ-アセチル化又はＮ-硫酸化、６-Ｏ-硫酸化、及び３-Ｏ-硫酸化される。
哺乳動物におけるヘパリンの特性及び天然の生合成は、Lindahlらにより、1986年に、Lane D. 及びLindahal U. (編集), ヘパリン−化学的及び生物学的特性；Clinical Applications, Edward Arnold, London, p.159-190に、Lindahal U., Feingold, D.S. 及びRoden L. によって、1986 TIBS, 11, 221-225 に、及びConrad H.E.によって、ヘパリン結合タンパク質, Chapter 2：ヘパリノイドの構造, Academic Press, 1998に記載されている。ヘパリンの生合成は、鎖混合物（反復単位グルクロニル-β-１→４-Ｎ-アセチルグルコサミンでなる）でなる、その前駆体Ｎ-アセチル-ヘパロサンを原料として生ずる。前記前駆体は、Ｎ-アセチル基を部分的に加水分解して、これをSO3 -基によって置換し、グルクロン酸の一部の５位におけるカルボキシル基をエピマー化して、これらをイズロン酸に変化させ、及びＯ-硫酸基を導入する酵素変性を受けて、一旦工業的に抽出されると、ジサッカライド単位当たり、カルボキシ基と比べて、約２倍の数の硫酸基を有する生成物を生成する。これらの酵素変性は、これ以外にも、抗トロンビンIII（ATIII）への結合のペンタサッカライド領域（活性ペンタサッカライドと称される）の生成を生じ、この領域は、ATIIIへのヘパリンの高親和性結合に必要な構造体であり、ヘパリン活性自体の抗凝固及びアンチトロンビン活性にとって必須である。このペンタサッカライド（ヘパリンを形成する鎖のいくつか内にのみ存在する）は、３位に硫酸化されたグルコサミン単位、及びイズロン酸を含有するジサッカライド間で間隔を置いたグルクロン酸を含有する。
本質的に、活性ペンタサッカライドの生成は、グルクロニル-Ｃ５-エピメラーゼによって行われる、グルクロン酸単位の一部のカルボキシル基のイズロン酸単位へのエピマー化反応によって、及び硫酸化（グルコサミンの３位におけるヒドロキシキル基における硫酸基の導入をもたらす）によって可能になる。さらに詳述すれば、本質的に、活性ペンタサッカライドの生成は、Ｃ５-エピマー化がクラスターにおいて、すなわち、鎖の部分上で、かつ広範囲に生じ、グルクロン酸よりもイズロン酸単位を多く含有する生成物を生ずるとの事実によって可能である。実際、市販のヘパリンは、イズロン酸単位約７０％及びグルクロン酸単位３０％を含有する。
主な抗凝固及び抗トロンビン活性と共に、ヘパリンは、抗高脂血症、抗増殖性物質、抗ウイルス、抗腫瘍及び癌転移予防活性を発揮するが、医薬品としての使用は、抗凝固作用による副作用（出血を生じうる）によって妨げられている。
大腸菌（Escherichia Coli）から単離された莢膜多糖体Ｋ５（Vann W.F.らによってEuropean Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359-364（「Vann 1981」）に開示されている）は、反復ジサッカライド単位グルコロニル-β-１→４-Ｎ-アセチルグルコサミンでなる鎖混合体でなり、従って、ヘパリンのＮ-アセチル-ヘパラン前駆体の同じ反復配列（Ａ）
Figure 2005533878
 を示すことが知られている。莢膜多糖体（以後、「Ｋ５-多糖体」又はより簡単に「Ｋ５」と表示する）は、Lormeauらによって米国特許第5,550,116号に、及びCasuらによってCarbohydrate Research, 1994, 263, 271-284に開示されているように化学的に変性される。抗腫瘍、癌転移予防、特に抗-HIV活性を有するＫ５-Ｏ-硫酸は、ヨーロッパ特許第333243号及び国際出願公開98/34959号に開示されている。Ｋ５は、動物の臓器から抽出されたヘパリン（抽出ヘパリン）と同じタイプの凝固に関するインビトロ生物学的活性を示す生成物を得るためにも、化学的及び酵素的に変性されている。
抽出ヘパリンのものと同じタイプの凝固に対する活性を有する生成物の獲得は、天然由来のものを原料として、Ｄ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼによるＣ５-エピマー化を全体のキー工程とする方法によって行われる。
イタリー国特許第1,230,785号、国際出願公開92/17507号、国際出願公開96/14425号及び国際出願公開97/43317号に開示されている方法は、原料物質としてＫ５を使用する。発酵由来のＫ５を、Ｎ-脱アセチル化し、続いて、Ｎ-硫酸化を行い、このようにして得られたＫ５-Ｎ-硫酸について、溶液中において、Ｃ５-エピメラーゼ（マウスの肥満細胞腫からの（イタリー国特許第1,230,785号）又はウシの肝臓からの（国際出願公開92/17507号、国際出願公開96/14425号及び国際出願公開97/43317号）ミクロソーム酵素の溶液のクロマトグラフィーによって得られたもの）でのＣ５-エピマー化を行う。
ウシ肝臓からのＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼは、Campbell, P.らによって精製されている（J. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953-26958: 「Compbell 1994」）。Campbellらは、また、アミノ酸における組成を提供し、Ｋ５-Ｎ-硫酸の相当する３０％エピマー化生成物への変換のための溶液中での使用を開示しており、イズロン酸の生成を、HPLC法、続くジサッカライドへの完全亜硝酸解重合によって実証している。
国際出願公開98/48006号は、Ｄ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼをコードするDNA配列、及び前記DNAを含有する組み換え発現ベクターから得られた組み換えＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼを開示しており、この組み換えエピメラーゼは、Jin-Ping L.らによってJ. Biol. Chem., 2001, 276, 20069-20077（「Jin-Ping 2001」）に記載されているように、その後、Campbellらによって精製されている。
完全なＣ５-エピメラーゼ配列は、Crawford B.E.らによって、J. Biol. Chem., 2001, 276(24), 21538-21543（「Crawford 2001」）に開示されている。
国際出願公開01/72848号は、ウロン酸の総量に関してイズロン酸の少なくとも４０％がエピマー化され、分子量2,000〜30,000を有し、ATIIIに関する高度の親和性鎖２５〜５０％を含有し、及び抗凝固活性及び抗トロンビン活性（HCII/抗Xa比として表される）１.５〜４を有するＫ５-多糖体のＮ-脱アセチル化Ｎ-硫酸誘導体の製法を開示している。この文献は、４０〜６０％エピマー化されたＫ５-Ｎ-硫酸の過硫酸化を開示し、得られた生成物（その13C-RMNが示されている）は、ジサッカライド単位当たり２〜３.５個の硫酸基含量を有することを示している。記載された条件下にて上記の過硫酸化を追試し、13C-RMNを検討したところ、得られる生成物は、実際には、６-Ｏ-硫酸含量が８０〜９５％であり、アミノ糖上の３-Ｏ-硫酸含量は３０％であるが、硫酸化度は３.２である遊離アミンであることが確認された。また、国際特許公開01/72848号に開示された過硫酸化条件下では、３.２より大きい硫酸化度は得られないことも観察された。米国特許公開第2002/0062019号は、硫酸化度２.３〜２.９及び分子量2,000〜30,000、又は4,000〜8,000、又は18,000〜30,000を有する、凝固の制御において活性なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-硫酸の製法を開示している。この方法は、（p-a）Ｋ５-多糖体のＮ-脱アセチル化及び得られたＫ５-アミンのＮ-硫酸化；（p-b）Ｋ５-Ｎ-硫酸のエピマー化；（p-c）エピＫ５-硫酸のＯ-過硫酸化；（p-d）部分的Ｏ-脱硫酸化；（p-e）選択的６-Ｏ-硫酸化；（p-f）このようにして得られた生成物のＮ-硫酸化の工程を包含し、工程（p-b）〜（p-f）の１工程の終了時に得られる生成物は、解重合に供されうる。かかる文献は、上記工程（p-a）〜（p-f）、続く工程（p-f）終了時における亜硝酸解重合によって得られる、分子量7,400を有し、硫酸化度２.３〜２.９を持つエピＫ５-Ｎ,Ｏ-硫酸を開示している。
また、同文献は、分子量約5,000を持つＫ５モイエティーを開示しており、このＫ５モイエティーは工程（p-a）〜（p-f）にも供される。
用語を標準化し、テキストをより理解されうるものとするため、本明細書にでは、一般的な用語又は表現を、単数又は複数の形で使用する。特に：
−「Ｋ５」又は「Ｋ５多糖体」は、発酵によって大腸菌から得られた莢膜多糖体、すなわち、上記のように、非還元末端に、任意に二重結合を含有する多糖体単位（Ａ）でなる鎖混合物（いずれの場合にも、文献、特に、Vann 1981、又はManzoni M.ら, Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311（「Manzoni 1996」）、又は国際特許公開01/72848号及び国際特許公開02/068447号に開示された方法に従って調製及び精製される）を意味する（当業者にとって、以後に示すものは、いずれのＮ-アセチルヘパロサンにも適用されることは明白である）；
−「Ｃ５-エピメラーゼ」は、いずれの場合にも、特に、Campbell 1994、国際特許公開98/48006、Jin-Pingら, J. Biol. Chem., 2001, 276, 20069-20077（「Jin-Ping 2001」）又はCrawford 2001に開示されているようにして調製、単離及び精製された抽出又は組み換えによるＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼを意味する。
−「Ｋ５-アミン」は、少なくとも９５％脱アセチル化されたＫ５（ただし、Ｎ-アセチル基は、通常のNMR装置では検知されない）を意味する；
−「Ｋ５-Ｎ-硫酸」は、少なくとも９５％Ｎ-脱アセチル化され及びＮ-硫酸化された（通常100％）Ｋ５（Ｎ-アセチル基が、後述のように、通常のNMR装置では検知されないため）；
−「エピＫ５」は、グルクロン酸単位の２０〜６０％が、イズロン酸単位にＣ５-エピマー化されたＫ５及びその誘導体を意味する；
−「エピＫ５-Ｎ-硫酸」は、グルクロン酸単位の２０〜６０％が、イズロン酸単位にＣ５-エピマー化されたＫ５-Ｎ-硫酸を意味する；
−「エピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸」は、少なくとも３.４の硫酸化度を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-硫酸を意味する；
−「エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸」は、少なくとも４の硫酸化度を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-硫酸化、100％Ｎ-硫酸化生成物を意味する。
加えて、
−上記の一般的な用語及び表現は、発酵後、単離された、一般に、分子量分布約1,500〜約50,000、平均分子量約10,000〜25,000、有利には、15,000〜25,000を持つＫ５に関し；
−上記の一般的な用語及び表現は、頭文字「lmw（low molecular weight：低分子量）」が先頭に付けられる場合（例えば、lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸）、分別によって又はＫ５-Ｎ-硫酸の解重合によって得られ、100％Ｎ-硫酸化生成物について算定して平均分子量約1,500〜12,000を有するＫ５-Ｎ-硫酸からなり又は誘導される低分子量生成物を表示する；
−上記の一般的な用語及び表現は、後に「誘導体」が付けられる場合、全体として、本来のＫ５からの誘導体及び低分子量のものの両方を表示する；
−分子量に関する用語「約」は、エピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体の場合461として、硫酸化度4.26を持つエピ-Ｋ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の場合806として算定される（ナトリウムの重量を含む）ジサッカライド単位の粘度測定法によって測定された分子量±理論的重量を意味する；
−表現「主な化学種」は、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸、lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸又はlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を構成する混合物において、HPLCによって測定された分子量曲線のピークによって決定された最も代表的なタイプである化合物を意味する；
−他に特別に述べない限り、「硫酸化度」は、Casu B.らによりCarbohydrate Research, 1975, 39, 168-176（「Casu 1975」）に開示された導電率法（同方法は、国際特許公開01/72848においても利用されている）にて測定されたSO3 -/COO-比（ジサッカライド単位当たりの硫酸基の数としても表示される）を意味する；
−「Ｏ-過硫酸化の条件」は、例えば、B. CasuらによってCarbohydrate Research, 1994, 263, 271-284（「Casu 1994」）に開示された方法Ｃに従って行われる過激なＯ-硫酸化を意味する；
−用語「アルキル」は、直鎖状又は分枝状のアルキルを意味し、「テトラブチルアンモニウム」は、テトラ-ｎ-ブチルアンモニウム基を示す。
驚くべきことには、イタリー国特許第1,230,785号、国際特許公開92/17507号、国際特許公開96/14425号、国際特許公開97/43317号、国際特許公開01/72848号及び米国特許公開第2002/0062019号に開示された方法によって行われるものとは異なり、エピＫ５-Ｎ-硫酸を原料として、ｐＨを同じ有機塩基にて約７に維持しながら、反応混合物を、３０〜６０分間静置して、前記エピＫ５-Ｎ-硫酸の３級又は４級有機塩基との塩を調製し、ついで、得られた塩を、Ｏ-過硫酸化の条件下、Ｏ-硫酸化剤にて処理することによって、文献、例えば、国際特許公開01/72848号に開示された他のエピＫ５-アミン-Ｏ-硫酸よりも大きい硫酸化度を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸が得られることが新たに見出された。
このようにして得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸をＮ-硫酸化に供する場合、イタリー国特許第1,230,785号、国際特許公開92/17507号、国際特許公開96/14425号、国際特許公開97/43317号、国際特許公開01/72848号及び米国特許公開第2002/0062019号に開示された生成物とは異なり、凝固に関する活性を持たず、医薬品、特に、抗血管形成活性及び抗ウイルス活性の医薬組成物又は化粧品組成物の製造に有用である新規なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸が得られる。
前記エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の亜硝酸での解重合によって、凝固に関する活性を持たず、抗血管形成活性及び抗ウイルス活性を持つ新規なlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸が得られる。
国際特許公開01/72848号に開示された方法に従って、ウロン酸の総量に関してイズロン酸の少なくとも４０％がエピマー化されたＫ５多糖体のＮ,Ｏ-硫酸Ｎ-脱アセチル化誘導体を調製する場合、方法の最終Ｎ-硫酸化工程の終了時において得られる高分子量の生成物の解重合は、一般に、すべての凝固パラメーターに関して、それらが生ずる高分子量生成物のものよりもかなり低い活性を示すいくつかの解重合生成物を生ずるため、異なった結果を生ずることが確認された。これは、亜硝酸による減成が硫酸基の存在に影響されることによるものと考えられる。特に、グルコサミンの３位の硫酸基は、NagasawaらによってThrombosis Research, 1992, 65, 463-467（Nagasawa 1992）に開示されているように、異種起源の生成物をもたらす。
ウロン酸の総量に関してイズロン酸含量が２０〜６０％、有利には４０〜６０％、好ましくは約５０％であるエピＫ５-Ｎ-硫酸を亜硝酸解重合に供する場合、異なる生物学的パラメーターに関する高度の活性を有し、凝固パラメーターに関する活性を持つ又は持たないlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の調製用の新規、かつ効果的な中間体を構成する、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸が得られることが新たに見出された。特に、エピＫ５-Ｎ-硫酸を解重合することによって、平均分子量約2,000〜約4,000の新規なlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸、さらに詳しくは、主な化合物が、デカサッカライド又はドデカサッカライド又はテトラデカサッカライドである混合物でなる特殊なlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸が得られることが見出された。他の方法では得られないこれらのlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸も、興味深い生物学的特性を有し、抗ウイルス活性及び／又は抗血管形成活性の、驚くべきことには凝固に関する活性を持たないlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸化生成物の調製用の有用な中間体である。
lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸を、同じ有機塩基にてｐＨを約７に維持しながら、反応混合物を３０〜６０分間静置して、上述の３級又は４級有機塩基での塩化に供し、ついで、得られた塩を、Ｏ-過硫酸化条件下、Ｏ-硫酸化剤にて処理することによって、新規なlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸が得られる。lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸をＮ-硫酸化に供することによって、驚くべきことには、凝固に関する活性持たず、抗ウイルス活性及び／又は抗血管形成活性であり、医薬又は化粧品組成物の調製に有用である新規なＮ-硫酸化及びＯ-過硫酸化誘導体（lmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸）が得られる。
これらのlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、Ｋ５-Ｎ-硫酸を原料として、単離され、精製され、固体支持体上に不動化された組み換えＣ５-エピメラーゼによる、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる２価カチオンの存在下、温度約３０℃、ｐＨ約７、１２〜２４時間でのエピマー化反応、続く、このようにして得られたエピマー化生成物の亜硝酸解重合、又はその逆によって得られる。
驚くべきことには、上述の条件下におけるエピマー化反応の過程で行った観察から、自然界でのヘパリンの生合成における場合に反して、基質の普通の及び非「クラスター」タイプのＣ５-エピマー化は、グルクロン酸単位２個毎に生じ、グルクロン酸単位によって分離され、後にイズロン酸単位が続く、又はその逆のグルコサミン単位２個でなる反復テトラサッカライド単位によって特徴付けられるエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を生ずる。
このように、１態様によれば、本発明は、エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を製造する方法であって、
（ａ）酸形のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を、３級又は４級有機塩基にて処理し、反応混合物を、同じ３級又は４級有機塩基の添加によって、溶液のｐＨを７に維持しながら、３０〜６０分間静置し、前記有機塩基との塩を単離し；
（ｂ）エピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体の有機塩基との前記塩を、Ｏ-過硫酸化条件下、Ｏ-硫酸化剤にて処理し；
（ｃ）このようにして得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体を、Ｎ-硫酸化剤にて処理し、このようにして得られたエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を単離する、
ことを特徴とするエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の製法を提供する。
一般に、エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、ナトリウム塩の形で単離され、任意に、このナトリウム塩は、他の化学的に又は薬学的に許容される塩に変換される。
この明細書では、用語「化学的に許容される」は、化学合成で使用されるカチオン、例えば、ナトリウム、アンモニウム、(Ｃ1-Ｃ4)テトラアルキルアンモニウムイオン、又は生成物の精製に関するものであり、一方、「薬学的に許容される」は説明を要しない。
有利なカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1-Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛に由来するものである。好適なカチオンは、ナトリウム、カルシウム及びテトラブチルアンモニウムイオンである。
方法の有利な態様によれば、工程（ａ）は、平均分子量約1,000〜約25,000、有利には、約1,500〜約25,000を有するエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体、すなわち、予めＮ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化（通常100％）及び２０〜６０％Ｃ５-エピマー化し、任意に、亜硝酸にて解重合したＫ５多糖体のナトリウム塩の溶液を、例えば、IR-120 H+タイプの酸形イオン交換樹脂を通過させ、樹脂の洗浄水を含む溶出液を集め、３級又は４級有機塩基、好ましくは、水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液にて溶出液を中和することによって行われる。溶液を、そのｐＨを同じ塩基の添加によって７に維持しながら１時間静置し、このようにして得られた塩を凍結乾燥にて単離する。
工程（ｂ）では、過剰量のＯ-硫酸化剤を使用し、非プロトン性の極性溶媒中、温度２０〜７０℃において２４時間未満で操作することによって、Ｏ-過硫酸化を行う。
有利には、工程（ａ）において単離された、平均分子量約1,000〜約25,000、有利には、約1,500〜約25,000を有するエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体、すなわち、予めＮ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化（好ましくは100％）及び２０〜６０％Ｃ５-エピマー化し、及び任意に、亜硝酸にて解重合したＫ５多糖体の３級又は４級有機塩基との塩を、ジメチルホルムアミドに溶解し、各遊離水酸基当たりＯ-硫酸化剤２〜１０モルにより、温度４０〜６０℃において１０〜２０時間処理する。Ｏ-硫酸化剤として、有利には、ピリジン・SO3付加物が、ジサッカライド当たり２.５〜５モル、好ましくは、２.５〜４モルの量で使用され、反応は、有利には、５０〜６０℃、好ましくは５５℃において、一夜で行われる。反応終了時に得られた生成物を、水０.１〜１容の添加によって単離し、好ましくは、水酸化ナトリウムにて中和し、塩化ナトリウムの飽和アセトン溶液にて沈殿させ、濾過、及び可及的に限外濾過する。
このようにして得られた生成物は、一般に、ウロン酸の総量の２０〜６０％のイズロン酸含量を有し、平均分子量約3,500〜約40,000、有利には、約4,500〜約40,000及び硫酸化度少なくとも３.４、有利には、少なくとも３.５、さらに有利には、3.55〜４、好ましくは、3.55〜３.８を有するエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体のナトリウム塩である。このようにして得られたナトリウム塩は、他の塩に変換される。例えば、限外濾過膜にて操作することによって、カルシウムイオンとの交換が行われる。
工程（ｃ）では、文献公知のＮ-硫酸化法を使用して、非常に大きい硫酸化度を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体をＮ-硫酸化する。
実際には、Ｎ-硫酸化は、工程（ｂ）からのエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体を含有する水溶液を、炭酸ナトリウム及びＮ-硫酸化剤、例えば、(Ｃ1〜Ｃ4)トリアルキルアミン・SO3又はピリジン・SO3付加物にて、混合物を３０〜５０℃に維持しながら、８〜２４時間処理し、例えば、ダイアフィルトレーションにより、所望のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を単離することによって行われる。任意に、Ｎ-硫酸化工程は、９５％以上の置換、好ましくは完全な置換が達成されるまで繰り返される。
このようにして得られた新規なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、一般に、ナトリウム塩形である。このナトリウム塩は、他の化学的又は薬学的に許容される塩に変換される。特に有利な塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属の塩、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛の塩である。
本発明の方法の工程（ａ）に供される原料のエピＫ５-Ｎ-硫酸は、予めＮ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化（通常100％）及び２０〜６０％Ｃ５-エピマー化し（有利には、４０〜６０％）、任意に、亜硝酸にて解重合した、平均分子量約1,000〜約25,000、有利には、約1,500〜約25,000を有するＫ５多糖体から誘導される。好ましくは、このような原料物質は、平均分子量10,000〜25,000を有するエピＫ５-Ｎ-硫酸、又は平均分子量約1,000〜約12,000、有利には、約1,000〜約10,000、好ましくは、約1,500〜約8,000を有するlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸である。
エピＫ５-Ｎ-硫酸（Ｋ５-Ｎ-硫酸のＣ５-エピマー化によって調製される）は、文献においてよく知られており、例えば、国際特許公開92/17507号、国際特許公開01/72848号、国際特許公開98/14425号、国際特許公開97/43317号又は米国特許公開第2002/0062019号に広く開示されている。Ｋ５-Ｎ-硫酸のグルクロン酸単位のＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼでのＣ５-エピマー化による調製は、この明細書において引用する文献に開示されている。
平均分子量5,000を有するＫ５モイエティーのＮ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化及びＣ５-エピマー化によって得られるイズロン酸単位含量約２０％を有するlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、国際特許公開92/17507号に開示されている。しかし、このようなlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、かなりの量のアセチル基を含有する。
原料物質として特に有利なイズロン酸含量４０〜６０％を持つエピＫ５-Ｎ-硫酸は、国際特許公開02/068477号に開示された、実質的にアセチル基を含有しないＫ５-Ｎ-硫酸（それ自体、特に純粋な、特に親油性物質を含有しないＫ５から調製される）のエピマー化によって得られたものである。方法の良好な態様によれば、エピマー化によって、国際特許公開02/068477号に開示されたものと同様の親油性物質を含有しないＫ５から得られ、このＣ５-エピマー化は、単離され、精製され、固体支持体上に不動化されたＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼにて、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる少なくとも１つの２価イオンの存在下、ｐＨ約７、温度約３０℃において、１２〜２４時間で行われる。
高イズロン酸単位含量、特に、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％を有するlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は新規であり、lmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の調製における原料物質として特に有利な生成物である。
上述のように、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、いずれかの順序で、Ｋ５-Ｎ-硫酸を、
（ｉ）単離され、精製され、溶液中に存在する又は固体支持体上に不動化されたＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼによる、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる少なくとも１つの２価イオンの存在下、ｐＨ約７、温度約３０℃における１２〜２４時間のＣ５-エピマー化に：及び
（ii）亜硝酸解重合、続いて、任意に、通常ナトリウムボロヒドリッドによる還元に供することを特徴とする方法によって調製される。
表現「いずれかの順序で」とは、方法が、順序（ｉ）-（ii）、すなわち、上述の順序、及び逆の順序、すなわち、順序（ii）-（ｉ）（Ｋ５-Ｎ-硫酸を、初めに、亜硝酸解重合に供し、任意に、ナトリウムボロヒドリッドによる還元を行った後、上述の条件下でＣ５-エピマー化を行う）の両方で、差なく行われることを示す。順序（ii）-（ｉ）は、平均分子量約4,000以上を有するlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸を原料とする場合、好ましくは、約6,000を持つものを原料とする場合に、好適に使用される。例えば、エピＫ５-Ｎ-硫酸１ｇを原料として、分子量4,000より大、特に、少なくとも6,000を持つlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸を生成して、lmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の調製のための有用な中間体を得ることを可能にする亜硝酸ナトリウムの量を決定することができる。実際、この場合には、工程（ii）において最適なエピマー化の百分率が得られる。
本発明の好適な態様によれば、Ｃ５-エピメラーゼは、不活性な固体支持体上に不動化される。
例えば、Cambell 1994、国際特許公開98/48006号、Jin-Ping 2001又はCrawford 2001に従って、単離し、精製した、好ましくは組み換えのＣ５-エピメラーゼを、基質の存在下、すなわち、原料のＫ５-Ｎ-硫酸の存在下、又は有利には平均分子量4,000以上、好ましくは、少なくとも6,000を有するlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸の存在下において、不活性支持体上に不動化される。不動化は、例えば、国際特許公開01/72848号に開示されているように、一般的な方法に従って行われる。
Ｃ５-エピマー化反応は、基質（Ｋ５-Ｎ-硫酸又は好ましくは平均分子量4,000より大、特に、少なくとも6,000を有するlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸）0.001〜１０ｇ及びカルシウムマグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる濃度１０〜６０mMのカチオンを含有するｐＨ約７の２５mM HEPES溶液２０〜1,000mlを、ｐＨを約７に維持しながら、約３０℃、流量３０〜220ml/時間で、１２〜２４時間、有利には、１５〜２４時間、不動化酵素１.２×１０7〜３×１０11cpmを収容するカラムを循環させることによって行われる。好ましくは、上記溶液を、流量約200ml/時間で一夜（１５〜２０時間）循環させる。得られた生成物を精製し、公知の方法、例えば、限外濾過及びエタノールでの沈澱によって分離する。このようにして得られた生成物は、エピＫ５-Ｎ-硫酸（この場合、水に溶解され、解重合に供される）又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸（この場合、最終生成物を構成する）でなる。エピマー化の百分率（実際には、グルクロン酸単位に対するイズロン酸単位の量）は、国際特許公開96/4425号に開示された方法によって1H-RMNを使用して算定される。
亜硝酸解重合は、例えば、ヨーロッパ特許第37319号、国際特許公開82/03627号に開示された方法に従い、ヘパリンの解重合による公知の方法に従って、又は、ヨーロッパ特許第544592号に開示されたＫ５-Ｎ-硫酸の解重合による方法に従って（ただし、０〜１０％以下、好ましくは、５％以下のアセチル基を含有するＫ５-Ｎ-硫酸又はエピＫ５-Ｎ-硫酸を原料とする）行われる。好ましくは、亜硝酸ナトリウム及び塩酸を使用し、実質的にアセチル基を含有しないエピＫ５-Ｎ-硫酸について行った解重合では、続いて、ナトリウムボロヒドリッドによるその場での還元を行う。
実際には、エピＫ５-Ｎ-硫酸の冷たい水溶液を、塩酸にて酸性ｐＨ（約２）とし、なお冷たい間に、温度（約４℃）及びｐＨ（約２）を一定に維持しながら、亜硝酸ナトリウムにて処理し、解重合（約１５〜３０分間）の終了後、溶液を水酸化ナトリウムにて中和し、なお４℃において、ナトリウムボロヒドリッドの水溶液にて処理する。還元（約４時間）の終了後、過剰のナトリウムボロヒドリッドを塩酸にて破壊し、溶液を水酸化ナトリウムにて中和し、解重合された（及び還元された）生成物を、例えば、エタノール又はアセトンでの簡単な沈澱による公知の方法に従って単離する。解重合の終了時に得られた生成物は、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸（この場合、最終生成物を構成する）又はlmw-Ｋ５Ｎ-硫酸（この場合、上記のように、直接Ｃ５-エピマー化に供され、その後、単離されるか又は予め単離されることなく溶液中に存在する）であり、特に、平均分子量4,000より大、好ましくは、少なくとも6,000を有する場合には、抗血管形成活性及び抗ウイルス活性のlmw-Ｋ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を調製するために使用される。特に、各種の量の亜硝酸ナトリウム／塩酸を使用して、解重合反応を適切に制御することによって、平均分子量約1,500〜約12,000、有利には、約1,500〜約10,000、好ましくは、約1,500〜約7,500（２,５-アンヒドロマンニトールのＣ２によるシグナルと、多糖体鎖内のグルコサミンのアノマー炭素によるシグナルとの積分を介して、13C-RMNスペクトルにおいて算定される）を有するlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸が得られる。方法の一般的態様によれば、例えば、エピＫ５-Ｎ-硫酸１ｇを原料とする場合、原料を脱イオン水100〜200mlに溶解し、４℃に維持する。ついで、所望の平均分子量、例えば、約2,000〜約4,000が得られるような量の亜硝酸ナトリウムを添加する。従って、BioRad BioSil 250カラム及び既知分子量のヘパリン基準を使用するHPLC方法にて測定して分子量20,000を有するエピＫ５-Ｎ-硫酸を原料とする場合、０.２％水溶液中に溶解した亜硝酸ナトリウム330〜480mgの添加が必要である。エピＫ５-Ｎ-硫酸及び亜硝酸ナトリウムを含有する溶液を４℃に維持し、４℃に冷却した０.１Ｎ HClの添加を介してｐＨ２とする。ゆっくりと攪拌しながら、２０〜４０分間反応させ、ついで、０.１Ｎ NaOHにて中和する。得られた生成物を室温とし、還元剤、例えば、ナトリウムボロヒドリッド（水５０〜100mlに溶解した250〜500mg）にて処理し、４〜８時間反応させる。０.１Ｎ HClにてｐＨを５〜５.５とすることによって、過剰のナトリウムボロヒドリッドを除去し、さらに２〜４時間放置する。その後、０.１Ｎ NaOHにて中和し、生成物を、アセトン又はエタノールでの沈澱によって回収し、減圧下での蒸発によって生成物を濃縮する。
同様に、Ｋ５-Ｎ-硫酸又はエピＫ５-Ｎ-硫酸１ｇを原料として、分子量4,000〜約12,000、有利には、約4,000〜約7,500、特に、6,000〜7,500を持つlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸の調製を可能にする亜硝酸ナトリウムの量が決定される。
イズロン酸含量２０〜６０％、有利には、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％を持ち、NH2基及びＮ-アセチル基を実質的に含有せず、平均分子量約1,500〜約12,000、有利には、約1,500〜約10,000、好ましくは、約1,500〜約7,500を有する、このようにして得られたlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸及びその化学的又は薬学的に許容される塩は、lmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の調製における特に興味深い原料物質として有用な新規生成物を構成するだけでなく、それら自体、医薬品又は化粧品組成物の有効成分として有用であり、本発明の他の態様を構成する。
有利には、本発明のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の調製における原料物質は、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100、有利には、３〜100の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体である。
さらに有利には、原料のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100、有利には、３〜100の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなる。好適な原料物質は、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）（ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％、有利には、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％がイズロン酸でなり；ｎは２〜２０、有利には、３〜１５の整数であり；対応するカチオンは、化学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなる上記のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸である。
実際、上記の好適なlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、鎖の少なくとも９０％が、式（I'）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％、有利には、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％がイズロン酸でなり；ｑは２〜２０、有利には、３〜１５の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなる。
この明細書において、用語「化学的」は、化学合成で使用されるカチオン、例えば、ナトリウム、アンモニウム、(Ｃ1-Ｃ4)テトラアルキルアンモニウムイオンに関するものであり、又は生成物の精製に関するものである。
有利なカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1-Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛に由来するものである。好適なカチオンは、ナトリウム、カルシウム及びテトラブチルアンモニウムイオンである。
鎖の少なくとも９０％が、上記式（I'）を有するものである鎖混合物でなり、対応するエピＫ５-Ｎ-硫酸の亜硝酸解重合及び続く可及的な還元（例えば、ナトリウムボロヒドリッドによる）によって得られるlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は特に興味深い。これらの中でも、主な化学種が、式（I'a）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、６０〜４０％がグルクロン酸でなり、４０〜６０％がイズロン酸でなり；ｐは４〜８の整数である）を有するものである鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸が好適である。これら生成物の平均分子量は、約2,000〜約4,000であり、対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである。
亜硝酸解重合工程からのこれらエピＫ５-Ｎ-硫酸の源は、前記鎖混合物における大部分の鎖の還元末端における、２,５-アンヒドロマンノース単位又は、例えば、ナトリウムボロヒドリッドでの還元の場合には、構造（ａ）
Figure 2005533878
 （ここで、Ｘは、ホルミル基又はヒドロキシメチル基を表す）で表される構造の２,５-アンヒドロマンニトールの存在を包含する。従って、大部分（鎖の６０〜７０％）の還元末端は、実際には、構造（ｂ）
Figure 2005533878
 （ここで、Ｘは上記のとおりである）で表される。
硫酸化は１又は２個の硫酸基の導入を生ずるが、この導入は、Ｏ-硫酸化誘導体の硫酸化度を格別変動させるものではないため、構造（ａ）の存在は、エピＫ５-Ｎ-硫酸及びその誘導体の化学特性に何ら影響を及ぼさない。しかし、本発明の方法によれば、前記lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、硫酸化及びアセチル化反応に供されるが、これら反応の、構造（ａ）の２,５-アンヒドロマンノース（Ｘはホルミルを表す）のホルミル基に対する影響は未知であるため、亜硝酸解重合に続いて、例えば、ナトリウムボロヒドリッドでの還元を行うことは好適である。さらに、構造（ａ）の存在は、低分子量ヘパリンに関して、Φstergaard P.B.らによって実証された（Thrombosis Reaserch, 1987, 45, 739-749（「Φstergaard 1987」））ように、生成物の生物学的活性に影響を及ぼさない。
本発明による特に有利なlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸は、主な化学種が、式（I'b）
Figure 2005533878
 （ここで、Ｘは、ホルミル基又は、好ましくは、ヒドロキシメチル基であり；ｍは４、５又は６であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものであり；グルクロン酸単位又はイズロン酸単位を原料とする場合、グルクロン酸単位とイズロン酸単位とが交互に存在する）を有するものである鎖混合物でなる。このような場合、グルクロン酸単位/イズロン酸単位の比は、４５/５５〜５５/４５、例えば、ほぼ５０/５０である。
従って、上述の条件下においてＣ５-エピメラーゼ（好ましくは、固体支持体上に不動化された、好ましくは、組み換え酵素）を使用しても、自然界において生ずるような（ただし、通常のタイプである）、Ｋ５-Ｎ-硫酸誘導体のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体への「クラスター」エピマー化は生じない。
このように、他の１態様によれば、本発明は、単離し、精製したＣ５-エピメラーゼの使用であって、Ｋ５-Ｎ-硫酸誘導体の、グルクロン酸単位によって分離され、後にイズロン酸単位が続く、又はイズロン酸単位によって分離され、後にグルクロン酸単位が続く２つのグルコサミン単位でなる反復テトラサッカライド単位によって特徴付けられる相当するエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体への変換における使用を提供する。
前記エピマー化は、平均分子量4,000より大、好ましくは、6,000〜7,500を有するＫ５-Ｎ-硫酸誘導体について行われる場合に生ずる。
本発明によれば、好ましくは、100％Ｎ-硫酸化された原料のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体（特に、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）又は（I'）を有するものである、又は主な化学種が、式（I'a）又は（I'b）（ここで、Ｘはヒドロキシメチル基である）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体）を、上述の工程（ａ）及び（ｂ）に供し、終了後、対応する、新規な、通常ナトリウム塩形のエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体（アミンは未置換である）を単離し、該生成物は、他の化学的又は薬学的に許容される塩に変換される。特に有利な塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛の塩であり、これらの中でも、ナトリウム、カルシウム及びテトラブチルアンモニウムの塩が好ましい。
このように、他の態様によれば、本発明は、新規なエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体及びその化学的又は薬学的に許容される塩に関し、これら化合物は、
（ａ）酸形のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を、３級又は４級有機塩基にて処理し、反応混合物を、溶液のｐＨを、前記３級又は４級有機塩基の添加によって７に維持しながら、３０〜６０分間静置し、前記有機塩基との塩を単離し；
（ｂ）エピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体の有機塩基との前記塩を、Ｏ-過硫酸化条件下、Ｏ-硫酸化剤にて処理し、エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体を単離することを特徴とする方法によって得られる。
工程（ａ）の有利な原料物質として、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）（ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは３〜100の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を使用する場合、工程（ｂ）の終了時、鎖の少なくとも９０％が、式（II）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは、２〜100、好ましくは、３〜100の整数であり；硫酸化度少なくとも３.４、有利には、少なくとも３.５、さらに有利には、3.55〜４、好ましくは、3.55〜３.８に関して、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3 -であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体が得られる。
これらの非常に高い硫酸化度を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体は、基本的に、凝固パラメーターに関する活性を持たないが、他の興味ある薬理特性を有するそのＮ-硫酸又はＮ-(Ｃ2〜Ｃ4)アセチル化誘導体の調製における有用な新規生成物である。
非常に高い硫酸化度を持つ有利なエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（II）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100、好ましくは、３〜100の整数であって、平均分子量は、約2,000〜約40,000、有利には、約4,500〜約40,000を有し；Ｒは少なくとも４０％、好ましくは、５０〜８０％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方は、モノ硫酸化グルクロン酸において５〜１０％がSO3 -であり、モノ硫酸化イズロン酸において１０〜１５％がSO3 -であり；硫酸化度は、３.４より大、有利には、少なくとも３.５、さらに有利には、3.55〜４、好ましくは、3.55〜３.８であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものであるofa鎖混合物でなる。
非常に高い硫酸化度を持つ好適なエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（II）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％がイズロン酸でなり；Ｒは、少なくとも４０％、有利には、５０〜８０％、好ましくは、約６５％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方は、グルクロン酸において５〜１０％がSO3 -であり、イズロン酸において１０〜１５％がSO3 -であり；ｎは２〜２０、有利には、３〜１５の整数であって、平均分子量は、約4,000〜約8,000を有し；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものであるofa鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸である。
実際に、前記の好適なlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸は、鎖の少なくとも９０％が、式（II'）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸であり；ｑは、２〜２０、有利には、３〜１５の整数であり；硫酸化度少なくとも３.４、有利には、少なくとも３.５、さらに有利には、3.55〜４，好ましくは、3.55〜３.８に関して、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンである）を有するものである鎖混合物でなる。
これらのlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸の中でも、主な化学種が、式（II'a）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸であり；ｐは４〜８の整数であり；Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、上記のとおりであり；硫酸化度は、少なくとも３.４、有利には、少なくとも３.５、さらに有利には、3.55〜４、好ましくは、3.55〜３.８である）を有するものである鎖混合物でなるものが好適である。
lmw-エピＫ５-硫酸から、亜硝酸解重合及び続く、例えば、ナトリウムボロヒドリッドによる還元によってlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸を得るためには、前記鎖混合物における大部分の鎖の還元末端における構造（a'）
Figure 2005533878
 （ここで、Ｒ''は、水素又はSO3 -である）の２,５-アンヒドロマンニトール硫酸化単位の存在が必要である。
このように、前記鎖混合物における大部分の鎖の還元末端は、構造（b'）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、グルクロン酸単位又はイズロン酸単位である）によって表される。
上述の新規なlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸の中でも、主な化学種が、式（II'b）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸であり；ｍは４、５又は６であり；硫酸化度少なくとも３.４、有利には、少なくとも３.５、さらに有利には、3.55〜４、好ましくは、3.55〜３.８に関して、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり、Ｘ''は、ＯＨ又はOSO3 -であり；グルクロン酸単位又はイズロン酸単位を原料とする場合、イズロン酸単位は交互に存在し；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンである）を有する化合物である鎖混合物でなるものが好適である。
これらの非常に高い硫酸化度を持つlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体は、いずれも、新規なＮ-硫酸化エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体の調製用の有用な中間体であり、従って、本発明のさらに他の態様を構成する。
特に、他の態様によれば、本発明は、新規なＮ-置換、特に、Ｎ-硫酸化又はＮ-アセチル化エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体の調製における、上記エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体の使用に関する。
本発明の方法の工程（ｃ）（工程（ｃ）は、工程（ｂ）の終了時に得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体（特に、鎖の少なくとも９０％が、式（II）又は（II'）を有するものである又は主な化学種が式（II'a）又は（II'b）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体）のＮ-アセチル化でなる）の終了時、イズロン酸単位含量が、ウロン酸の総量の２０〜６０％であり、硫酸化度が、少なくとも４、好ましくは、４〜４.６であるエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体が得られる。
このように、他の態様によれば、本発明は、Ｏ-硫酸化及びＮ-硫酸化され、ウロン酸単位の総量の少なくとも２０％においてイズロン酸にＣ５-エピマー化され、平均分子量約2,000〜約45,000、硫酸化度少なくとも４を有するＫ５多糖体の新規なＮ-脱アセチル化誘導体を提供し、これら誘導体は、基本的に、凝固パラメーターに関して不活性である。
上記と同様に、上記の新規な誘導体は、全体として、その分子量とは無関係に、一般的用語「エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体」で示される。
特に、平均分子量は、前記誘導体が、発酵によるＫ５のＮ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化によって、又は後者の亜硝酸解重合によって得られるエピＫ５-Ｎ-硫酸に由来するため、約2,000〜約45,000である。前記亜硝酸解重合を制御することによって、上記の範囲の実質的に全てにおいて、低分子量誘導体を得ることが可能である。しかし、本発明の誘導体の医薬品又は化粧品としての使用に関しては、平均分子量約2,000〜約16,000、有利には、約3,500〜約13,000、分子量分布約1,000〜約15,000、好ましくは、約4,500〜約9,000を持つ、又は分子量分布約2,000〜約10,000を持つ低分子量誘導体、又は平均分子量約20,000〜約45,000を持ち、分子量分布約2,000〜約70,000を持つ、未分別Ｋ５を起源とする高分子量誘導体を調製することが有利である。
本発明のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体では、硫酸化度は非常の高く、好ましくは、４〜４.６であり、グルコサミンの窒素は、実質的に100％が硫酸化される。さらに、エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、硫酸化度が少なくとも４であるとすると、そのグルコサミン単位において、100％６-Ｏ-硫酸化され、５０〜８０％３-Ｏ-硫酸化され、グルクロン酸単位において、５〜１０％３-Ｏ-モノ硫酸化され、イズロン酸単位において１０〜１５％Ｏ-モノ硫酸化され、残りのウロン酸単位において２,３-ジ-Ｏ-硫酸化される。
本発明によるエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、それ自体、鎖の少なくとも９０％が、上記式（Ｉ）（ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100、有利には、３〜100の整数であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体から調製されるエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体を介して得られる。
このようなケースでは、新規なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（III）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100、好ましくは、３〜100の整数であり；Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3 -であり；ＺはSO3 -であり；硫酸化度は、少なくとも４、好ましくは、４〜４.６であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなる。
上記カチオンは、有利には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛のカチオンであり、これらの中でも、ナトリウム、カルシウム及びテトラブチルアンモニウムの塩が好適である。
上記の新規なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の中でも、鎖の少なくとも９０％が、式（III）（ここで、Ｒは、前記鎖の５０〜８０％、好ましくは、約６５％においてSO3 -であり；及び硫酸化度は、少なくとも４、有利には、４〜４.６、好ましくは、４〜４.３である）を有するものである鎖混合物でなるものが好適である。
有利には、非常に高い硫酸化度を持つエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（III）（ここで、ＺはSO3 -であり；ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは、２〜100、好ましくは、３〜100の整数であって、平均分子量約2,000〜約45,000、有利には、約4,500〜約45,000を持ち；Ｒは、少なくとも４０％、好ましくは、５０〜８０％SO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方が、モノ硫酸化グルクロン酸において５〜１０％SO3 -及びモノ硫酸化イズロン酸において、１０〜１５％SO3 -であり；硫酸化度は、少なくとも４、有利には、４〜４.６であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものであるofa鎖混合物でなる。
好適なＮ-置換エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（III）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％がイズロン酸でなり；Ｒは、少なくとも４０％、有利には、５０〜８０％、好ましくは、約６５％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方が、グルクロン酸において５〜１０％SO3 -及びイズロン酸において１０〜１５％SO3 -であり；Ｚは、100％SO3 -又は(Ｃ2〜Ｃ4)アシルであり；ｎは、２〜２０、好ましくは、３〜１５の整数であって、平均分子量約4,000〜約8,500を持ち；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものであるofa鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体である。
実際、上記の非常に高い硫酸化度を持つ好適なエピＫ５-Ｎ,Ｏ-硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（III'）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｑは２〜２０、有利には、３〜１５の整数であり；硫酸化度少なくとも４、好ましくは、４〜４.６に関して、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -基であり、ＺはSO3 -であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンである）を有するものである鎖混合物でなる。
特に、式（III'）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％、好ましくは、５０〜５５％がイズロン酸でなり；Ｒは、少なくとも４０％、有利には、５０〜８０％、好ましくは、約６５％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方が、グルクロン酸において５〜１０％がSO3 -、イズロン酸において１０〜１５％がSO3 -であり；ｎは２〜２０、有利には、３〜１５の整数であって、平均分子量約2,000〜約16,000、有利には、約3,500〜約13,000、好ましくは、約4,500〜約9,000を持ち；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有する鎖混合物である。
これらのlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の中でも、主な化学種が、式（III'a）
Figure 2005533878
 （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｐは４〜８の整数であり；硫酸化度少なくとも４、好ましくは、４〜４.６に関して、ＺはSO3 -であり、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなるものである。
lmw-エピＫ５-硫酸から、亜硝酸解重合及び続く、例えば、ナトリウムボロヒドリッドによる還元によって新規なlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を得るためには、前記鎖混合物における大部分の鎖の還元末端における上記構造（a'）（ここで、Ｒ''は、水素又はSO3 -である）の硫酸化２,５-アンヒドロマンニトール単位の存在が必要である。
このように、前記鎖における大部分の還元末端は、構造（b''）
Figure 2005533878
 （ここで、ＺはSO3 -を表し；及びウロン酸単位は、グルクロン酸又はイズロン酸である）で表される。
上記の新規なlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸の中でも、主な化学種が、式（III'b）
Figure 2005533878
 （ここで、硫酸化度少なくとも４、好ましくは、４〜４.６に関して、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3 -であり、ＺはSO3 -であり、Ｘ''はＯＨ又はOSO3 -であり、ｍは４、５又は６であり；グルクロン酸単位又はイズロン酸単位を原料とする場合、ウロン酸単位は交互に存在し；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンである）を有する化合物である鎖混合物でなるものが好適である。前記カチオンは、有利には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛のカチオンであり、これらの中でも、ナトリウム、カルシウム及びテトラブチルアンモニウムのイオンが好適である。
本発明の方法における原料エピＫ５-誘導体としてエピＫ５、すなわち、予めＮ-脱アセチル化、通常100％Ｎ-硫酸化及び２０〜６０％Ｃ５-エピマー化され、解重合されていないＫ５多糖体を使用する場合には、工程（ｃ）の終了時、エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を単離し、これを亜硝酸解重合及び、可能であれば、続いて、例えば、ナトリウムボロヒドリッドによる還元に供して、同じ硫酸化度を有する対応するlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を得る。特に、鎖の少なくとも９０％が、式（III'）又は式（III'a）（ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；硫酸化度少なくとも４、好ましくは、４〜４.６に関して、ｑ、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''及びＺは、上記の意義を有し；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンである）を有するものである鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸が得られる。このようなケースにおいて、解重合反応及び可能であれば、続く、例えば、ナトリウムボロヒドリッドによる還元から、これらlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を得るには、前記鎖混合物における大部分の鎖の還元末端での、構造（a''）
Figure 2005533878
 （ここで、Ｘは、ホルミル基又はヒドロキシメチル基であり；Ｒ''は、水素又はSO3 -を表す）の２,５-アンヒドロマンノ単位の存在が必要である。
新規なlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体（特に、塩形）は、フリーラジカルを捕捉しうる高度にアニオン性の生成物であり、化粧品工業では、脱毛症に対するアジュバントとして、又は老化防止クリームの調製に使用され、医薬品工業では、皮膚炎の治療用製品として使用される。さらに、本発明のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体（特に、lmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸）は、抗血管形成活性及び抗ウイルス活性を有し、従って、医薬品の調製における有効成分を構成する。
このように、他の１態様によれば、本発明は、有効成分の１つとして、薬学的に有効な量の、上記エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体又はその薬学的に許容される塩の１つを、医薬賦形剤との混合物の形で含む医薬組成物を提供する。
経口、皮下、静脈内、経皮又は局所投与用の本発明の医薬組成物では、有効成分は、好ましくは、典型的な医薬賦形剤又はビヒクルとの混合物として、用量単位の形で投与される。薬量は、患者の年齢、体重、及び健康状態に応じて、広い範囲で変動する。この薬量として、静脈内、皮下、経口、経皮又は局所投与によって、１日１〜３回、用量１〜1000mg、有利には、１０〜750mg、好ましくは、250〜500mgの投与を包含する。本発明の医薬組成物は、各種の投与方法に適した従来の賦形剤と配合される。クリーム、軟膏、リニメント、ジェル、フォーム、バルサム、膣ペッサリー、坐剤、局所投与用の溶液又は懸濁液の形の処方が特に有利である。
有利には、本発明の組成物は、その有効成分の１つとして、上記方法の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に従って、エピＫ５-誘導体を原料として、又は上記方法の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に従い、工程（ｃ）の後、続いて、亜硝酸解重合を行うことによって、解重合されていないエピＫ５-誘導体を原料として得られるエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体又はその薬学的に許容される塩の１を、医薬賦形剤との混合物として含む。有利には、前記エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体は、鎖の少なくとも９０％が、式（III）又は（III'）有するものである、又は、主な化学種が、式（III'a）又は（III'b）を有する化合物である鎖混合物でなる。好適な有効成分は、硫酸化度少なくとも４、好ましくは、４〜４.６を有し、有利には、平均分子量約3,500〜約11,000、より有利には、約3,500〜約5,200を有し、及び基本的にＮ-アセチル基を含有しないlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸である。
最後に、他の態様によれば、本発明は、有効な量のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体又はその薬学的に許容される塩の１つを、化粧品賦形剤との混合物の形で含む化粧品組成物を提供する。
エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体、特に、鎖の少なくとも９０％が、式（III）又は（III'）有するものである、又は、主な化学種が、式（III'a）又は（III'b）を有する化合物である鎖混合物でなるもののナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛の塩でなる群から選ばれる塩は、本発明の化粧品組成物の有効成分を構成する。
下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明は、これらに限定されない。
調製例Ｉ
大腸菌（Escherichia coli）からのＫ５多糖体の調製
初めに、下記の組成の培地：
脱脂大豆ミール ２ g/l
K2HPO4 ９.７ g/l
KH2PO4 ２ g/l
MgCl2 0.11 g/l
クエン酸アンモニウム ０.５g/l
硫酸ナトリウム １ g/l
グルコース ２ g/l
湧水 1000 ml
ｐＨ ７.３
を使用し、三角フラスコにおいて発酵を行う。培地を、120℃において２０分間殺菌する。グルコース溶液を別個に調製し、これを120℃において３０分間殺菌し、無菌状態で培地に添加する。三角フラスコに、トリプシン大豆寒天培地において保持された斜面培地に由来する大腸菌細胞 Bi 8337/41（O10:K5:H4）の懸濁液を接種し、制御した撹拌（160rpm、
６cmストローク）下、３７℃において２４時間インキュベートする。細菌の生育を、顕微鏡を使用して細胞を計数することによって測定する。続く操作において、上記のものと同一の培地を収容するChemap-Braun発酵槽（１４Ｌ）に、上記三角フラスコの培養物を０.１％で接種し、通気１vvm（vvm：空気の容積／液体の容積／分）、撹拌400rpm及び温度３７℃にて、発酵を１８時間行う。発酵の間、ｐＨ、酸素、残留グルコース、生成したＫ５多糖体及び細菌の生育を測定する。発酵終了時、温度を１０分間８０℃とする。10,000rpmでの遠心分離によって、細胞を培地から分離し、カットオフ800〜10,000Ｄを持つPES膜を具備するSS 316 (MST)モジュールを使用して、上澄み液を限外濾過し、容積を１／５に減少させる。ついで、４℃のアセトン４容を添加してＫ５多糖体を沈殿させ、４℃において一夜沈降させる。最後に、10,000rpm、２０分間の遠心分離又は濾過によって、Ｋ５多糖体を回収する。得られた固体タンパク質の除去を、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus orizae）からのタイプIIプロテアーゼを使用し、SDS（０.５％ナトリウムドデシルスルフェート）（濾液１０mg/l）を含有する０.１Ｍ NaCl及び0.15Ｍ EDTAの緩衝液（ｐＨ８）中、３７℃において９０分間で実施する。得られた溶液を、カットオフ10,000Ｄの膜を具備するモデル SS 316にて限外濾過し、１M NaClにて２回抽出し、濾液において吸収が消失するまで水によって洗浄する。ついで、Ｋ５多糖体をアセトンにて沈殿させ、発酵槽１Ｌ当たり850mgの収率が得られる。得られた多糖体の純度を、ウロン酸（カルバゾール法）、プロトン及び13C-NMR、ＵＶ及びタンパク質含量の測定を介して測定した。純度は、８０％以上である。
得られた多糖体は、異なる分子量、それぞれ、30,000及び5,000Ｄ（Pharmacia 75 HRカラムを使用するHPLCによる測定から決定）の２つのモイエティー及びBio-sil SEC 250（Bio Rad）の２個の連続カラム及び移動相としてNa2SO4を使用し、室温及び流速０.５ml/分で操作する際の保持時間約９分を持つシングルモイエティーからなる。
このようにして得られた精製Ｋ５の1H-RMNスペクトルは、親油性物質のメチルによる各種のシグナルを示す。
調製例II
Ｋ５の精製
４℃において恒温とした塩化ナトリウム飽和水溶液100mlに、調製例Ｉの終了時に得られたＫ５ １ｇを溶解し、このようにして得られた溶液に、冷たいイソプロパノール３容を添加する。算定した量の飽和塩化ナトリウム溶液を添加することによって、溶液の塩濃度を３Ｍとし、得られた溶液を、冷たい環境（約４℃）に一夜放置する。形成された沈澱を、10,000rpm、２０分間の遠心分離によって分離し、生成物の純粋性を、一夜の透析及び続く1H-RMNスペクトルの測定（１.５ppm以下の領域にはシグナルが存在してはならない）によってチェックする。任意に、NaClにて飽和した水における分離及びイソプロパノールでの沈澱の操作を繰り返し行う。沈殿物を水に溶解し、塩が消失するまで、カットオフ10,000ＤのMiniplate Millipore膜上にて限外濾過する。このようにして、純度少なくとも９９％を有するＫ５が得られ、その1H-RMNスペクトルから、１.５ppm以下の領域には、痕跡量の親油性不純物が存在しないことが認められる。
調製例III
Ｋ５-Ｎ-硫酸の調製
（ｉ）Ｎ-脱アセチル化
調製例IIに記載のようにして調製された純粋なＫ５多糖体１０ｇを、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液1000mlに溶解し、このようにして調製された溶液を６０℃に２４時間放置する。溶液を室温とし、ついで、６Ｎ塩酸にて中性ｐＨ（ｐＨ７）とする。
（ii）Ｎ-硫酸化
４０℃に維持した脱アセチル化Ｋ５を含有する溶液に、炭酸ナトリウム１６ｇを添加し、その後、４時間で、ピリジン・SO3付加物１６ｇを添加する。反応終了時（２４時間後）、溶液を室温とし、ついで、５％塩酸溶液にてｐＨ６.５〜７とする。螺旋状に巻いた1,000Ｄの膜（prepscaleカートリッジ, Millipore）を使用するダイアフィルトレーションによって、生成物を塩から精製する。透過物の伝導度が1000μS未満、好ましくは、100μS未満の時点で操作を終了する。濃縮透析システムにおいて同じものを使用して、多糖体の１０％濃縮が達成されるまで、内部透析（intradialysis）を低減させる。濃縮された溶液を、凍結乾燥によって乾燥させる。13C-RMNスペクトル分析では、Ｎ-アセチル又はNH2残基は認められない。
調製例IV
lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸
国際特許公開02/068477号の実施例１、工程（ｉ）及び（ii）に記載されたようにして得られた生成物を、亜硝酸での減成法によって解重合し、続いて、精製したアルデヒドの還元を行う。続いて、Ｋ５-Ｎ-硫酸１ｇを蒸留水200mlに溶解し、蒸留水240mlに溶解した亜硝酸ナトリウム480mgを添加する。ついで、溶液を４℃とし、０.１Ｎ HClにてｐＨ２とし、３０分間維持する。反応終了時、溶液を、０.１Ｍ NaOHにてｐＨ７とし、ついで、室温とする。ついで、溶液にNaBH4 450mgを添加し、４時間反応させる。HClにてｐＨを５〜６にすることによって、過剰のNaBH4を除去する。０.１Ｍ NaOHにて中和した生成物を、４℃のアセトン３容での沈澱、濾過ロートでの濾過によって回収し、真空オーブンにおいて、４０℃で乾燥させる。平均分子量約2,000を有し、主な化学種が式（I'b）（ここで、ｍは４であり；ウロン酸単位はグルクロン酸のものである）を有する化合物である鎖混合物でなるlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸900mgが得られる。
LMW-エピＫ５-Ｎ-硫酸 順序（ｉ）→（ii）
（ｉ）Ｋ５-Ｎ-硫酸のエピマー化
国際特許公開02/068477号の実施例１、工程（ｉ）及び（ii）に記載されたようにして得られたＫ５-Ｎ-硫酸（その1H-RMNスペクトルから、アセチル基及びNH2基に関するシグナルは認められない）１０ｇを、濃度５０mMでCaCl2を含有する２５mM HEPES緩衝液（ｐＨ７）600mlに溶解し、このようにして得られた溶液を、国際特許公開01/72848号の実施例１に記載されたように不動化した組み換えＣ５-エピメラーゼ５ｇを含有するSepharose 4B樹脂を充填した５０mlカラムを通して循環させる。反応を、３０℃、ｐＨ７、流速200ml/時間で２４時間行う。得られた生成物を、限外濾過及びエタノールでの沈澱によって精製する。このようにして、イズロン酸含量が５４％であるエピＫ５-Ｎ-硫酸が得られる。
（ii）エピＫ５-Ｎ-硫酸の解重合
このようにして得られた生成物１ｇを含有する蒸留水２５mlの溶液に、蒸留水115mlに溶解した亜硝酸ナトリウム230mgを添加する。ついで、溶液を４℃とし、０.１Ｎ HClにてｐＨを２とし、３０分間維持する。反応終了時、溶液を室温とし、０.１Ｍ NaOHにてｐＨを７とする。ついで、溶液に、NaBH4 450mgを添加し、４時間反応させる。生成物を、４℃のアセトン３容での沈澱、濾過ロートでの濾過によって回収し、真空オーブンにおいて、４０℃で乾燥させる。イズロン酸含量５４％及び分子量分布1,000〜4,000（HPLC法にて測定）を持つlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸900mgが得られる。
LMW-エピＫ５-Ｎ-硫酸 順序（ii）→（ｉ）
（ii）Ｋ５-Ｎ-硫酸の解重合
国際特許公開02/068477号の実施例１、工程（ｉ）及び（ii）に記載されたようにして得たＫ５-Ｎ-硫酸２ｇを、調製例Ｉに記載のように、亜硝酸ナトリウム100mg及びナトリウムボロヒドリッド300mgを使用して、解重合する。平均分子量5,000を持つlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸１.８ｇが得られる。
（ｉ）lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸のエピマー化
上記の工程（ii）で得られたlmw-Ｋ５Ｎ硫酸１ｇを、実施例１の工程（ｉ）に記載のように処理する。原料では０/100の比であるのに対して、イズロン酸/グルクロン酸の比４４/５６、分子量分布2,000〜10,000及び平均分子量5,000Ｄを持つエピマー化生成物が得られる。収率（カルバゾール法（Bitter及びMuir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88-92）により標準に対するウロン酸含量を測定することによって算定）は９０％である。
lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸 順序（ｉ）→（ii）
（ｉ）Ｋ５-Ｎ-硫酸のエピマー化
国際特許公開02/068477号の実施例１、工程（ｉ）及び（ii）に記載されたようにして得たＫ５-Ｎ-硫酸２ｇを、５０mM CaCl2を含有する２５mM HEPES緩衝液（ｐＨ７）120mlに溶解した。得られた溶液を、国際特許公開96/14425号に記載されたようにして得られた不動化酵素を含有する樹脂を充填した５０mlカラムを通して循環させる。この操作を、３０℃、流速200ml/時間で２４時間行う。得られた生成物を、1000Ｄ膜上での限外濾過及びIR-120 H+イオン交換樹脂上の通過及び溶出液の１Ｎ NaOHでの中和を介して精製する。サンプルを、エタノール又はアセトンでの沈澱によって回収する。原料では０/100の比であるのに対して、イズロン酸/グルクロン酸の比５５/４５を持つエピマー化生成物が得られる。エピマー化の百分率（カルバゾール法（Bitter及びMuir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88-92）により標準に対するウロン酸含量を測定することによって算定）は９０％である。
（ii）エピＫ５-Ｎ-硫酸の解重合
工程（ｉ）で得られた生成物１ｇを、亜硝酸での減成法によって解重合し、続いて、生成したアルデヒドの還元を行う。続いて、生成物を蒸留水２５mlに溶解し、蒸留水115mlに溶解した亜硝酸ナトリウム230mgを添加する。ついで、溶液を４℃とし、０.１Ｎ HClにてｐＨ２とし、３０分間維持する。反応終了時、溶液を、室温とし、０.１Ｍ NaOHにてｐＨ７とする。ついで、溶液にNaBH4 450mgを添加し、４時間反応させる。４℃のアセトン３容での沈澱、濾過ロートでの濾過によって、生成物を回収し、真空オーブンにおいて、４０℃で乾燥させる。分子量分布（HPLC法により測定）1,000〜4,000及びグルクロン酸含量４５％及びイズロン酸含量５５％を有するlmw-Ｋ５-Ｎ硫酸900mgが得られる。
エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸
（ａ）エピＫ５-Ｎ-硫酸のテトラブチルアンモニウム塩
実施例１の工程（ｉ）の終了時に得られたエピＫ５-Ｎ-硫酸400mgの水（４０ml）溶液を、４℃で恒温とし、ついで、４℃の水で予調整したIR-120 H+イオン交換樹脂上を通過させる。得られた溶出液（ｐＨ1.94の溶液100mlでなる）を、１５％水酸化テトラブチルアンモニウム溶液にて中和し、１５％水酸化テトラブチルアンモニウム溶液の添加によってｐＨを７に維持しながら、室温において１時間放置し、最終的に、凍結乾燥させる。このようにして、エピＫ５-Ｎ-硫酸のテトラブチルアンモニウム塩805mgが得られる。
（ｂ）エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸
ジメチルホルムアミド３０ml中に、上記のようにして得られた塩805mgを含有する溶液を、５５℃にセットし、ピリジン・SO3付加物2.26ｇを含有するジメチルホルムアミド３０mlにて処理する。５５℃において、反応を一夜続け、ついで、混合物に水６０mlを添加する。１Ｎ NaOHにて中和した後、生成物を、NaClにて飽和したアセトン３容にて沈殿させ、４℃において一夜放置する。沈殿物を、guch Ｇ４上での濾過によって回収し、ついで、1000Ｄ TFF Milliporeシステムにて限外濾過し、減圧下で乾燥させる。イズロン酸含量５４％、グルコサミン-６-Ｏ-硫酸含量100％、グルコサミン-３-Ｏ-硫酸含量６０％、モノ硫酸化グルクロン酸含量１０％、モノ硫酸化イズロン酸含量１５％を有し、ウロン酸単位の残部がジ硫酸化されており、硫酸化度（「Causeら 1975」に従い、伝導度法によって測定）3.35を持つエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸550mgが得られる。
（ｃ）エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸化-Ｎ-硫酸
工程（ｂ）で得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸250mgの水（１５ml）溶液に、炭酸ナトリウム400mgを添加し、ついで、このようにして得られた混合物に、固体状のピリジン・SO3付加物400mgを、少量ずつ、４時間で添加する。反応混合物を一夜５５℃に維持し、ついで、０.１Ｎ HClにてｐＨを７とすることによって反応を停止させる。1000Ｄ膜上での限外濾過の後、塩化ナトリウムにて飽和したアセトン３容を添加し、沈殿物を、5000rpm、５分間の遠心分離によって回収する。このようにして、硫酸化度（「Casueら 1975」に従い、伝導度法によって測定）が4.25であるエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸244mgが得られる。1H-RMNスペクトルの分析によって、このようにして得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸は、イズロン酸含量５４％、６-Ｏ-硫酸含量100％、Ｎ-硫酸含量100％、グルコサミン-３-Ｏ-硫酸含量６０％、モノ硫酸化グルクロン酸含量１０％、モノ硫酸化イズロン酸含量１５％を有し、ウロン酸単位の残部がジ硫酸化されていることが示される。1H-RMNスペクトルから、硫酸化度4.35が算定され、これは、方法の誤差を考慮して、工程（ｂ）の終了時に得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸の硫酸化度が、100％Ｎ-硫酸化であることに相当する。従って、硫酸基の特定の百分率以上では、生成物の強いアニオン性により、硫酸化度（伝導度法によって測定）の過小評価を生ずることが推測される。

Claims (70)

  1. エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を製造する方法であって、
    （ａ）平均分子量約1,500〜約25,000を有する酸形のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を、３級又は４級有機塩基にて処理し、反応混合物を、ｐＨ約７において３０〜６０分間静置し、前記有機塩基との塩を単離し；
    （ｂ）エピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体の有機塩基との前記塩を、Ｏ-過硫酸化条件下、Ｏ-硫酸化剤にて処理し；
    （ｃ）このようにして得られたエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸誘導体の３級又は４級有機塩基との塩を、Ｎ-硫酸化剤にて処理し、得られたエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を単離する、
    ことを特徴とするエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体の製法。
  2. エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体をナトリウム塩の形で単離し、任意に、他の化学的に又は薬学的に許容される塩に変換することを特徴とする請求項１に記載の製法。
  3. 工程（ａ）において、有機塩基として、水酸化テトラブチルアンモニウムを使用することを特徴とする請求項１又は２に記載の製法。
  4. 工程（ｂ）において、Ｏ-過硫酸化を、Ｏ-硫酸化剤２〜４モル/利用できるＯＨ/ジサッカライドを使用し、ジメチルホルムアミド中、温度４０〜６０℃において、１５〜２０時間で行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製法。
  5. 原料として、平均分子量約1,000〜約25,000を有するエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を使用することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製法。
  6. 原料のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体が、４０〜６０％Ｃ５-エピマー化されたものであることを特徴とする請求項５に記載の製法。
  7. 原料のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体が、平均分子量約1,500〜約25,000を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製法。
  8. 原料のエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体が、平均分子量10,000〜25,000を有するものであることを特徴とする請求項７記載の製法。
  9. 原料が、平均分子量約1,000〜約12,000を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製法。
  10. 原料が、平均分子量約1,500〜約8,000を有するものであることを特徴とする請求項９に記載の製法。
  11. 原料として、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなるエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体を使用することを特徴とする請求項５に記載の製法。
  12. 原料が、鎖の少なくとも９０％が、式（Ｉ）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなるである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項１１に記載の製法。
  13. 式（Ｉ）において、ｎが３〜100の整数であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の製法。
  14. 原料が、鎖の少なくとも９０％が、式（I'）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｑは２〜２０の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項５に記載の製法。
  15. 原料が、鎖の少なくとも９０％が、式（I'）（ここで、ｑは３〜１５の整数である）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項１４に記載の製法。
  16. 原料が、主な化学種が、式（I'a）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、６０〜４０％がグルクロン酸でなり、４０〜６０％がイズロン酸でなり；ｐは４〜８の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項５に記載の製法。
  17. 原料の平均分子量が約2,000〜約4,000であることを特徴とする請求項１６に記載の製法。
  18. 原料が、主な化学種が、式（I'b）
    Figure 2005533878
     （ここで、Ｘはヒドロキシメチルであり；ｍは４、５又は６であり；グルクロン酸単位又はイズロン酸単位を持つものを原料とする場合、グルクロン酸単位とイズロン酸単位とが交互に存在する）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の製法。
  19. 原料が、基本的に親油性物質を含まないＫ５のＮ-脱アセチル化から及びＮ-硫酸化からのものであることを特徴とする請求項５〜１８のいずれかに記載の製法。
  20. 請求項１〜１９のいずれかに記載の製法によって得られたエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  21. イズロン酸含量２０〜６０％、平均分子量約2,000〜約45,000及び硫酸化度少なくとも４を有するエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体、又はその化学的又は薬学的に許容される塩の１つであって、前記誘導体は、凝固パラメーターに対して基本的に非活性である、エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体又はその塩。
  22. 平均分子量が約15,000〜約45,000である請求項２１に記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  23. 平均分子量が約4,500〜約8,500である請求項２１に記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  24. 硫酸化度が４〜４.６であることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  25. グルコサミン単位において、100％６-Ｏ-硫酸化及び５０〜８０％３-Ｏ-硫酸化され、グルクロン酸単位において５〜１０％Ｏ-モノ硫酸化され、イズロン酸単位において１０〜１５％３-Ｏ-モノ硫酸化され、及び残りのウロン酸単位において２,３-ジ-Ｏ-硫酸化されていることを特徴とする請求項２１〜２４のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  26. 鎖の少なくとも９０％が、式（III）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3 -を表し、Ｒは鎖混合物の少なくとも４０％においてSO3 -であり；ＺはSO3 -であり；ｎは２〜100の整数であり；硫酸化度は、少なくとも４であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  27. 鎖の少なくとも９０％が、式（III）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなる）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項２６に記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  28. 鎖の少なくとも９０％が、式（III）（ここで、ｎは３〜100の整数である）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項２６又は２７に記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  29. 鎖の少なくとも９０％が、式（III'）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｑは２〜２０の整数であり；硫酸化度少なくとも４、好ましくは、４〜４.６に関して、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3 -を表し、ＺはSO3 -であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンである）を有するものである鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸であることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  30. 鎖の少なくとも９０％が、式（III'）（ここで、ｑは３〜１５の整数である）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項２９に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  31. 鎖の少なくとも９０％が、式（III'）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなる）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項３０に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  32. イズロン酸含量が５０〜５５％であることを特徴とする請求項３１記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  33. 鎖の少なくとも９０％が、式（III'）（ここで、Ｒは、少なくとも４０％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方は、グルクロン酸において５〜１０％がSO3 -及びイズロン酸において１０〜１５％がSO3 -である）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項２９〜３２のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  34. 平均分子量約2,000〜約16,000を有することを特徴とする請求項３３に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  35. 分子量約4,500〜約9,000を有することを特徴とする請求項３４に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  36. 鎖の少なくとも９０％が、式（III'）（ここで、Ｒは、５０〜８０％がSO3 -である）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項３３〜３５のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  37. 主な化学種が、式（III'a）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｐは４〜８の整数であり；硫酸化度４〜４.６に関して、ＺはSO3 -であり、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項３２〜３６のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  38. 主な化学種が、式（III'b）
    Figure 2005533878
     （ここで、硫酸化度４〜４.６に関して、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり、ＺはSO3 -であり、Ｘ''は、ＯＨ又はOSO3 -であり、ｍは、４、５又は６であり；グルクロン酸単位又はイズロン酸単位を原料とする場合、グルクロン酸単位及びイズロン酸単位は交互に存在し；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項３３〜３７のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸。
  39. 化学的又は薬学的に許容される塩又はカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛の塩又はカチオンであることを特徴とする請求項２０〜３８のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  40. 化学的又は薬学的に許容される塩又はカチオンが、ナトリウム、カルシウム又はテトラブチルアンモニウムの塩又はカチオンであることを特徴とする請求項３９に記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体。
  41. 請求項１に記載の製法の工程（ａ）及び（ｂ）に従って得られ、ナトリウム塩の形で単離され、任意に、他の化学的又は薬学的に許容される塩に変換される、エピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体又はその化学的又は薬学的に許容される塩の１つ。
  42. イズロン酸含量が、総ウロン酸量の２０〜６０％であり、平均分子量約2,000〜約40,000及び硫酸化度少なくとも３.４を有するエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体又はその化学的又は薬学的に許容される塩の１つ。
  43. 鎖の少なくとも９０％が、式（II）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｎは２〜100の整数であり；Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3 -であり；硫酸化度は、少なくとも３.４であり；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項４２に記載のエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体。
  44. 式（II）において、ｎが３〜100の整数であることを特徴とする請求項４３に記載のエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体。
  45. 鎖の少なくとも９０％が、式（II）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなり；平均分子量約2,000〜約40,000を有し；Ｒは少なくとも４０％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方は、モノ硫酸化グルクロン酸において５〜１０％がSO3 -であり、モノ硫酸化イズロン酸において１０〜１５％がSO3 -である）を有するものであるofa鎖混合物でなることを特徴とする請求項４２〜４５のいずれかに記載のエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体。
  46. 鎖の少なくとも９０％が、式（II）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなり；Ｒは、少なくとも４０％がSO3 -であり、Ｒ'及びＲ''は、共にSO3 -であるか、又は一方が水素であり、他方は、グルクロン酸において５〜１０％がSO3 -であり、イズロン酸において１０〜１５％がSO3 -であり；ｎは３〜１５の整数であり；平均分子量約4,000〜約8,000を有し；及び対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものであるofa鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸であることを特徴とする請求項４２〜４５のいずれかに記載のエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体。
  47. 主な化学種が、式（II'a）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸であり；ｐは４〜８の整数であり；Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり；硫酸化度は少なくとも３.４である）を有するものである鎖混合物でなるlmw-エピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸であることを特徴とする請求項４２〜４６のいずれかに記載のエピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸誘導体。
  48. 主な化学種が、式（II'b）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸であり；ｍは４、５又は６であり；硫酸化度少なくとも３.４に関して、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3 -であり、Ｘ''は、ＯＨ又はOSO3 -であり；グルクロン酸単位又はイズロン酸単位を原料とする場合、イズロン酸単位は交互に存在する）を有する化合物である鎖混合物でなることを特徴とする請求項４７に記載のlmw-エピＫ５-アミノ-Ｏ-過硫酸。
  49. 実質的にNH2及びＮ-アセチル基を含有せず、イズロン酸含量２０〜６０％及び平均分子量約1,500〜約12,000を有するlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸又はその化学的又は薬学的に許容される塩の１つ。
  50. イズロン酸含量が４０〜６０％であり、及び平均分子量が約1,500〜約10,000であることを特徴とする請求項４９に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  51. イズロン酸含量が５０〜５５％であり、及び平均分子量が約1,500〜約7,500であることを特徴とする請求項４９に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  52. Ｋ５-Ｎ-硫酸を、いずれかの順序で、
    （ｉ）単離し、精製した、溶液中に存在する又は固体支持体上に不動化したＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼによる、ｐＨ約７、温度約３０℃、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンから選ばれる少なくとも１の２価イオンの存在下、１２〜２４時間でのＣ５-エピマー化；及び
    （ii）亜硝酸解重合及び続く任意の還元
    に供することを特徴とする方法によって得られた、請求項４９〜５１のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  53. 工程（ii）において、解重合に続いて、ナトリウムボロヒドリッドによる還元を行うことを特徴とする請求項５２に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  54. 鎖の少なくとも９０％が、式（I'）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％がイズロン酸でなり；ｑは２〜２０の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項５３に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  55. 鎖の少なくとも９０％が、式（I'）（ここで、ウロン酸単位は、４０〜６０％がイズロン酸でなる）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項５４に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  56. 鎖の少なくとも９０％が、式（I'）（ここで、ｎは３〜１５の整数である）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項５４又は５５に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  57. 主な化学種が、式（I'a）
    Figure 2005533878
     （ここで、ウロン酸単位は、６０〜４０％がグルクロン酸でなり、４０〜６０％がイズロン酸でなるであり；ｐは４〜８の整数であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるものである）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項５４又は５５に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  58. 主な化学種が、式（I'b）
    Figure 2005533878
     （ここで、Ｘはヒドロキシメチルであり；ｍは４、５又は６であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学的に許容されるイオンであり；及びグルクロン酸単位又はイズロン酸単位を持つものを原料とする場合、グルクロン酸単位とイズロン酸単位とが交互に存在する）を有するものである鎖混合物でなることを特徴とする請求項１５〜５７のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  59. 塩又はカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛の塩又はカチオンから選ばれるものであることを特徴とする請求項４９〜５８のいずれかに記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  60. 塩又はカチオンが、ナトリウム、カルシウム又はテトラブチルアンモニウムの塩又はカチオンから選ばれるものであることを特徴とする請求項５９に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸。
  61. Ｋ５-Ｎ-硫酸を、いずれかの順序で、
    （ｉ）単離し、精製した、溶液中に存在する又は固体支持体上に不動化したＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼによる、ｐＨ約７、温度約３０℃、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンから選ばれる少なくとも１の２価イオンの存在下、１２〜２４時間でのＣ５-エピマー化；及び
    （ii）亜硝酸解重合及び続く任意の還元
    に供することを特徴とするlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸の製法。
  62. 工程（ｉ）−（ii）の順序で行うことを特徴とする請求項６１に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸の製法。
  63. 工程（ii）−（ｉ）の順序で行うことを特徴とする請求項６１に記載のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸の製法。
  64. 解重合の終了時に得られた生成物が、Ｃ５-エピマー化に直接供されるlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸であることを特徴とする請求項６３に記載の製法。
  65. lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸が、平均分子量約4,000より大を有することを特徴とする請求項６４に記載の製法。
  66. 有効成分の１つとして、医薬品賦形剤との混合物の形で、請求項２０〜４０のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を、薬学的に有効な量で含有することを特徴とする医薬組成物。
  67. 化粧品賦形剤との混合物の形で、請求項２０〜４０のいずれかに記載のエピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を、有効量で含有することを特徴とする化粧品組成物。
  68. 単離し、精製したＣ５-エピメラーゼの使用であって、Ｋ５-Ｎ-硫酸誘導体の、グルクロン酸単位によって分離され、後にイズロン酸単位が続く、又はイズロン酸単位によって分離され、後にグルクロン酸単位が続く２つのグルコサミン単位でなる反復テトラサッカライド単位によって特徴付けられる相当するエピＫ５-Ｎ-硫酸誘導体への変換における使用。
  69. Ｋ５-Ｎ-硫酸誘導体が、平均分子量4,000より大を有するものであることを特徴とする請求項６８に記載の使用。
  70. 平均分子量が6,000〜7,500であることを特徴とする請求項６９に記載の使用。
JP2004513334A 2002-06-18 2003-06-17 非常に大きい硫酸化度を持つｋ５多糖体のエピマー化誘導体 Expired - Fee Related JP5053512B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2002MI001345A ITMI20021345A1 (it) 2002-06-18 2002-06-18 Derivati epimerizzati del polissacaride k5 a elevatissimo grado di solfatazione
ITMI2002A001345 2002-06-18
IT2002MI001346A ITMI20021346A1 (it) 2002-06-18 2002-06-18 Polisaccaridi a basso peso molecolare e procedimento per la loro preparazione
ITMI2002A001346 2002-06-18
ITMI20021854 ITMI20021854A1 (it) 2002-08-27 2002-08-27 Polisaccaride supersolfatato a basso peso molecolare.
ITMI2002A001854 2002-08-27
PCT/IB2003/002338 WO2003106504A1 (en) 2002-06-18 2003-06-17 Epimerized derivatives of k5 polysaccharide with a very high degree of sulfation

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2005533878A true JP2005533878A (ja) 2005-11-10
JP2005533878A5 JP2005533878A5 (ja) 2012-05-10
JP5053512B2 JP5053512B2 (ja) 2012-10-17

Family

ID=29740492

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004513336A Pending JP2005530877A (ja) 2002-06-18 2003-06-17 低分子量過硫酸化多糖類
JP2004513335A Pending JP2005536577A (ja) 2002-06-18 2003-06-17 Ｎ−アシル−（エピ）ｋ５−アミン−ｏ−硫酸塩誘導体の製造方法およびｎ−アシル−（エピ）ｋ５−アミン−ｏ−硫酸塩誘導体
JP2004513334A Expired - Fee Related JP5053512B2 (ja) 2002-06-18 2003-06-17 非常に大きい硫酸化度を持つｋ５多糖体のエピマー化誘導体

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004513336A Pending JP2005530877A (ja) 2002-06-18 2003-06-17 低分子量過硫酸化多糖類
JP2004513335A Pending JP2005536577A (ja) 2002-06-18 2003-06-17 Ｎ−アシル−（エピ）ｋ５−アミン−ｏ−硫酸塩誘導体の製造方法およびｎ−アシル−（エピ）ｋ５−アミン−ｏ−硫酸塩誘導体

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20050245736A1 (ja)
EP (3) EP1519961A1 (ja)
JP (3) JP2005530877A (ja)
CN (3) CN1675249A (ja)
AT (1) ATE485308T1 (ja)
AU (3) AU2003240190B2 (ja)
BR (3) BR0312197A (ja)
CA (3) CA2489866A1 (ja)
DE (1) DE60334617D1 (ja)
IL (2) IL165807A (ja)
MX (3) MXPA04012714A (ja)
NO (3) NO20050244L (ja)
NZ (3) NZ537216A (ja)
PL (3) PL375087A1 (ja)
WO (3) WO2003106505A1 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20032498A1 (it) * 2003-12-17 2005-06-18 Pasqua Anna Oreste Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e
ITMI20010397A1 (it) * 2001-02-27 2002-08-27 Giorgio Zoppetti Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione
US20120253029A1 (en) 2002-06-18 2012-10-04 Pasqua Anna Oreste Process for the preparation of highly o-sulfated epimerized derivatives of k5 polysaccharide and intermediates therein
NZ537216A (en) * 2002-06-18 2005-05-27 Glycores 2000 S Process for the manufacture of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
US8513407B2 (en) * 2002-06-18 2013-08-20 Glycores 2000 S.R.L. Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
ITMI20031618A1 (it) * 2003-08-06 2005-02-07 Inalco Spa Derivati polisaccaridici dotati di alta attivita'
FR2871476B1 (fr) * 2004-06-14 2011-04-01 Ifremer Derives depolymerises sulfates d'exopolysaccharides (eps) provenant de bacteries marines mesophiles, leur procede de preparation et leurs utilisations en regeneration tissulaire
FR2871379B1 (fr) 2004-06-14 2006-09-29 Ifremer Utilisation de derives polysaccharidiques hautement sulfates et de faible masse molaire pour moduler l'angiogenese
US8318973B2 (en) * 2005-10-21 2012-11-27 Bezwada Biomedical, Llc Functionalized sinapic acid and methyl sinapate

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001072848A1 (en) * 2000-03-30 2001-10-04 Inalco S.P.A. Glycosaminoglycans derived from the k5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activity and process for their preparation
US20020062019A1 (en) * 2000-03-30 2002-05-23 Pasqua Oreste Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1141483B (it) * 1980-04-18 1986-10-01 Crinos Industria Farmaco Resina poliamminica per la separazione selettiva di eparina da altri glucosamminoglicani e procedimento per la sua preparazione
FR2503714B1 (fr) * 1981-04-10 1986-11-21 Choay Sa Procede d'obtention de mucopolysaccharides biologiquement actifs, de purete elevee, par depolymerisation de l'heparine
DE3787996T2 (de) * 1986-05-16 1994-03-03 Italfarmaco Spa Heparine, frei von E.D.T.A., Fraktionen und Fragmente von Heparin, Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
EP0333243A3 (en) * 1988-03-10 1989-09-27 Akzo N.V. Sulphated k5 antigen and sulphated k5 antigen fragments
FR2669932B1 (fr) * 1990-12-03 1994-07-01 Sanofi Sa Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent.
GB2254083A (en) 1991-03-28 1992-09-30 Italfarmaco Spa Anticoagulants from e.coli saccharide
FR2684385B1 (fr) * 1991-11-28 1997-08-01 Sanofi Elf Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
IT1271057B (it) * 1994-11-04 1997-05-26 Inalco Spa Polisaccaridi aventi un elevato contenuto di acido iduronico
US5798356A (en) * 1995-08-07 1998-08-25 Alcon Laboratories, Inc. Angiostatic compounds
IT1282994B1 (it) * 1996-05-10 1998-04-03 Inalco Spa Derivati del polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante
IT1284143B1 (it) * 1996-09-06 1998-05-08 Istituto Scient Di Chimica E B Eparansolfati semi-sintetici ad elevata attivita' antimetastica e ridotto rischio emorragico
GB9620459D0 (en) 1996-10-01 1996-11-20 Mclaughlin Andrew Improvements in or relating to blocked isocyanates and their production
IT1289613B1 (it) * 1997-02-07 1998-10-15 Inalco Spa Polisaccaridi batterici o-solfatati
IT1290814B1 (it) * 1997-03-24 1998-12-11 Istituto Scient Di Chimica E B Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica
US6329351B1 (en) * 1997-08-28 2001-12-11 Istituto Scientifico Di Chimica E Biochimica “G. Ronzoni” Semi-synthetic sulphaminoheparosansulphates having high anti-metastatic activity and reduced haemorrhagic risk
US6388060B1 (en) * 1998-11-06 2002-05-14 Vascular Therapeutics Inc. Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides
US20050027117A1 (en) * 2000-12-18 2005-02-03 Pasqua Oreste Anticoagulant and antithrombotic LMW-glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide and process for their preparation
ITMI20032498A1 (it) * 2003-12-17 2005-06-18 Pasqua Anna Oreste Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e
ITMI20010397A1 (it) * 2001-02-27 2002-08-27 Giorgio Zoppetti Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione
ITMI20010779A1 (it) * 2001-04-12 2002-10-12 Giorgio Zoppetti Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi
ITMI20011633A1 (it) * 2001-07-27 2003-01-27 San Raffaele Centro Fond Uso di polisaccaridi batterici supersolfatati inibitori dell'hiv
ITMI20012200A1 (it) * 2001-10-22 2003-04-22 Ibsa Inst Biochimique Sa Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti
ITMI20021294A1 (it) * 2002-06-12 2003-12-12 Inalco Spa Polisaccaridi batterici o-solfatati e loro uso
NZ537216A (en) * 2002-06-18 2005-05-27 Glycores 2000 S Process for the manufacture of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
ITMI20032614A1 (it) * 2003-12-30 2005-06-30 Altergon Sa Nuova composizione comprendente cs

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001072848A1 (en) * 2000-03-30 2001-10-04 Inalco S.P.A. Glycosaminoglycans derived from the k5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activity and process for their preparation
US20020062019A1 (en) * 2000-03-30 2002-05-23 Pasqua Oreste Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
US20050256079A1 (en) 2005-11-17
BR0312197A (pt) 2005-04-05
CN1675250B (zh) 2012-11-14
AU2003240190B2 (en) 2009-07-09
MXPA04012805A (es) 2005-08-19
NO20050245L (no) 2005-03-16
NO20050244L (no) 2005-03-16
WO2003106504A1 (en) 2003-12-24
AU2003240191A1 (en) 2003-12-31
CA2489862C (en) 2012-03-27
JP2005536577A (ja) 2005-12-02
CA2489862A1 (en) 2003-12-24
ATE485308T1 (de) 2010-11-15
CA2489866A1 (en) 2003-12-24
WO2003106506A1 (en) 2003-12-24
US8193166B2 (en) 2012-06-05
IL165807A (en) 2011-10-31
US7838644B2 (en) 2010-11-23
PL373004A1 (en) 2005-08-08
BR0312182A (pt) 2005-04-05
PL375087A1 (en) 2005-11-14
NZ537215A (en) 2006-11-30
CN1671744A (zh) 2005-09-21
CA2489870A1 (en) 2003-12-24
DE60334617D1 (de) 2010-12-02
US20110021766A1 (en) 2011-01-27
WO2003106505A1 (en) 2003-12-24
JP2005530877A (ja) 2005-10-13
JP5053512B2 (ja) 2012-10-17
MXPA04012714A (es) 2005-08-15
AU2003242881A1 (en) 2003-12-31
CN1675249A (zh) 2005-09-28
EP1513880A1 (en) 2005-03-16
EP1517924A1 (en) 2005-03-30
IL165808A0 (en) 2006-01-15
NZ537216A (en) 2005-05-27
EP1513880B1 (en) 2010-10-20
CN1675250A (zh) 2005-09-28
EP1519961A1 (en) 2005-04-06
NZ537217A (en) 2005-09-30
NO20050247L (no) 2005-03-16
IL165807A0 (en) 2006-01-15
MXPA04012721A (es) 2005-08-15
US20060014718A1 (en) 2006-01-19
PL375088A1 (en) 2005-11-14
BR0312179A (pt) 2005-04-05
AU2003240190A1 (en) 2003-12-31
US20050245736A1 (en) 2005-11-03
WO2003106505A9 (en) 2004-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8193166B2 (en) Epimerized derivatives of K5 polysaccharide with a very high degree of sulfation
EP1358215B1 (en) Glycosaminoglycans derived from k5 polysaccharide having high antithrombin activity and process for their preparation
EP1366082B1 (en) Highly sulfated derivatives of k5 polysaccharide and their preparation
US8513407B2 (en) Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
AU2002236118A1 (en) Highly sulfated derivatives of K5 polysaccharide and their preparation
EP1694714B1 (en) Low molecular weight polysaccharides having antithrombotic activity
US9346893B2 (en) Process for the preparation of highly O-sulfated, epimerized derivatives of K5 polysacchride and intermediates therein
RU2333222C2 (ru) Эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования
ES2357320T3 (es) Derivados epimerizados de polisacárido k5 con un grado de sulfatación muy alto.
KR20050024349A (ko) 매우 높은 황산화도를 가진 케이5 폴리사카라이드의에피머화된 유도체

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060612

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100518

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100729

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100805

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101117

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110927

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20111220

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111228

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20120314

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120710

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120726

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150803

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees