CN1675250A - 硫酸盐化程度非常高的k5多糖的差向异构衍生物 - Google Patents

硫酸盐化程度非常高的k5多糖的差向异构衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN1675250A
CN1675250A CNA038195607A CN03819560A CN1675250A CN 1675250 A CN1675250 A CN 1675250A CN A038195607 A CNA038195607 A CN A038195607A CN 03819560 A CN03819560 A CN 03819560A CN 1675250 A CN1675250 A CN 1675250A
Authority
CN
China
Prior art keywords
epik5
persulphate
derivative
vitriol
lmw
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA038195607A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1675250B (zh
Inventor
帕斯夸·安娜·奥雷斯特
乔治·佐派蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glycores 2000 S R L
Glycores 2000 Srl
Original Assignee
Glycores 2000 S R L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IT2002MI001346A external-priority patent/ITMI20021346A1/it
Priority claimed from IT2002MI001345A external-priority patent/ITMI20021345A1/it
Priority claimed from ITMI20021854 external-priority patent/ITMI20021854A1/it
Application filed by Glycores 2000 S R L filed Critical Glycores 2000 S R L
Publication of CN1675250A publication Critical patent/CN1675250A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1675250B publication Critical patent/CN1675250B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C08B37/0078—Degradation products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

描述了一种新的使epiK5－N－硫酸盐过硫酸盐化以得到有很高硫酸盐化程度的epiK5－胺－O－过硫酸盐的新方法，通过随后的N－硫酸盐化，它可提供新的硫酸盐化程度至少为4的epiK5－N，O－过硫酸盐－衍生物，其对凝固参数基本没有活性，并可用于美容或药物领域。还描述了新的低分子量的epiK5－N－硫酸盐，它可用作相应的LMW－epiK5－N，O－过硫酸盐衍生物制备中的中间体。

Description

硫酸盐化程度非常高的K5多糖的差向异构衍生物
发明目的
本发明涉及一种新的硫酸盐化程度非常高的K5多糖的衍生物，它们的一种制备方法，用于其合成的高度O-硫酸盐化的新型中间体，以及含有作为基本没有凝固活性的活性成分的所述K5多糖的衍生物药物组合物。
特别地，本发明涉及一种从至少20％预先被N-脱乙酰化、N-硫酸盐化和C5-差向异构化的K5多糖开始，通过在合适的条件下O-过硫酸盐化并随后N-硫酸盐化，来制备epiK5-N，O-过硫酸盐的方法，涉及所述具有血管生成抑制活性和抗病毒活性的epiK5-N，O-过硫酸盐，并涉及所述epi-K5-N-硫酸盐的低分子量的中间体。
发明背景
氨基葡聚糖，如肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和透明质酸，是从各种动物器官工业提取的生物聚合物。
特别地，肝素(主要从猪或牛肺的肠粘膜提取获得)是一种由链状混合物构成的多分散的共聚物，其分子量分布在约3,000至约30,000D之间，所述链状混合物基本上由通过α-1→4或β-1→4键连接的糖醛酸(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)和氨基糖(葡糖胺)构成。在肝素中，所述糖醛单元可在2位被O-硫酸盐化，同时所述葡糖胺单元被N-乙酰化或N-硫酸盐化、6-O-硫酸盐化，且所存在的葡糖胺单元约有0.5％被3-O-硫酸盐化。
Lindahl等(1986，见Lane，D.和Lindahl，U.(主编)的“Heparin.Chemical andBiological Properties；Clinical Applications”，Edward Arnold，London，159-190页)、Lindahl，U，Feingold D.S.和Ridén L(1986 TIBS，11，221-225)和ConradH.E.(“Heparin Binding Proteins″，第2章：类肝素的结构。Academic Press，1998”)已经描述了哺乳动物中肝素的特性和天然生物合成。肝素的生物合成从其由链状混合物构成的前体N-乙酰-肝素糖开始，所述链状混合物由重复的二糖单元葡糖醛酸基-β-l→4-N-乙酰葡糖胺构成。所述前体被酶修饰，它将N-乙酰基部分水解，用SO3 -基团将其取代，将部分葡糖醛单元5位的羧基差向异构，将其转化成艾杜糖醛单元，并引入O-硫酸基以得到产物，产物(一度用工业方法提取)中每个二糖单元中羧基的数目是硫酸基团的两倍。此外，这些酶修饰导致形成与抗凝血酶III(ATIII)的连接的戊多糖区域，这被称为活性戊多糖，它是肝素与ATIII高亲和连接必需的结构，并且还是肝素本身抗凝血和抗血栓形成活性的基础。这种只存在于部分形成肝素的链中的戊多糖在3位含有一个硫酸盐葡糖胺单元，并有一个在含有艾杜糖醛酸的二糖之间被隔开的葡糖醛酸。
天然情况下，部分糖醛酸单元的羧基在葡糖醛酸基-C5-差向异构酶(C5-差向异构)的作用下进行差向异构反应变为艾杜糖醛单元，并进行适当的硫酸盐化以在葡糖胺3位的羟基中引入硫酸盐基团，这样便可形成活性戊多糖。更具体的，天然情况下，基于C5-差向异构发生在簇内(即部分链上)的这一事实，活性戊多糖的形成是可能的，此外，这会导致产物中含有的艾杜糖醛单元多于葡糖醛单元。实际上，市售的肝素含有约70％的艾杜糖醛单元和30％的葡糖醛单元。
除了主要的抗凝血活性和抗血栓形成活性，肝素还具有抗脂血、抗增殖、抗病毒、抗肿瘤和抗转移活性，但由于会导致出血的抗凝血作用，使得这一副作用妨碍了它作为药物的应用。
现有技术
已知分离自大肠杆菌的荚膜K5多糖(Vann W.F.等在European Journal ofBiochemistry，1981，116，359-364(″Vann 1981″)中有叙述)由链状混合物构成，所述链状混合物由重复的二糖单元葡糖醛酸基-β-1→4-N-乙酰葡糖胺构成，因此显出肝素前体N-乙酰-肝素糖的相同的重复序列(A)
所述荚膜K5多糖，以后称为″K5多糖″或更加简单地称为″K5″，被Lormeau等(如US5,550,116中所述)和Casu等(如Carbohydrate Research，1994，263，271-284中所述)化学修饰。EP 333243和WO 98/34958中描述到K5-O-硫酸盐具有抗肿瘤、抗转移、抗病毒、尤其是抗HIV活性。K5还被化学修饰和酶修饰，以获得与提取自动物器官的肝素(提取肝素)具有相同体外生物凝固活性的产物。
采用模拟天然情况下发生的过程，并用D-葡糖醛酸基C5差向异构酶进行整个关键的C5-差向异构步骤，便可得到与提取肝素具有相同凝固活性的产物。IT1230785、WO 92/17507、WO 96/14425和WO 97/43317所描述的方法采用K5作为起始物质。通过发酵得到的K5被N-脱乙酰化，然后被N-硫酸盐化，所得K5-N-硫酸盐在溶液中用C5-差向异构酶进行C5-差向异构，通过层析来自小鼠肥大细胞瘤(IT1230 785)或来自牛肝脏(WO 92/17507，WO 96/14425和WO 97/43317)的微粒体酶溶液获得。
按照Campbell，P.等在J.Biol.Chem.，1994，269/43，26953-26958(″Campbell1994″)所述的方法纯化来自牛肝脏的D-葡糖醛酸基C5差向异构酶，Campbell还提供了该酶在氨基酸中的组合物，并描述了其在溶液中将K5-N-硫酸盐转化成相应的30％差向异构的产物的应用，用HPLC法证实了艾杜糖醛酸的形成，然后将其全部亚硝酸解聚成二糖。
文献WO 98/48006描述了编码D-葡糖醛酸基C5差向异构酶的DNA序列和D-葡糖醛酸基C5差向异构酶重组体，这是由含有所述DNA的重组表达载体获得的，然后用Campbell等的方法纯化，如Jin-Ping L.等在J.Biol Chem.2001，276，20069-20077(″Jin-Ping 2001″)中所述。
完整的C5-差向异构酶由Crawford B.E.等在J.Biol.Chem.，2001，276(24)，21538-21543(Crawford 2001)中描述。
文献WO 01/72848描述了制备N-脱乙酰化的K5多糖的N-硫酸盐衍生物的方法，其中，总糖醛酸的至少40％被差向异构成艾杜糖醛酸，其分子量为2,000-30,000，含有25-50％对ATIII高度亲和的链并具有抗凝血和抗血栓形成活性，这表现为HCII/抗Xa比例为1.5-4。所述文献描述了K5-N-硫酸盐的过硫酸盐化，40-60％差向异构，并显示了所得产物，其13C-RMN显示，每个二糖单元硫酸盐基团的含量为2-3.5。在所述条件下重复上述过硫酸盐化并检查13C-RMN，这可确定所得产物实际上是游离的胺，其6-O-硫酸盐含量为80-95％，氨基糖上的3-O-硫酸盐含量为30％，但其硫酸盐化程度为3.2。还观察到，在WO 01/72848中所述的过硫酸盐化条件下未获得高于3.2的硫酸盐化程度。文献US 2002/0062019描述了制备epiK5-N，O-硫酸盐的方法，它具有控制凝固的活性，其硫酸盐化程度为2.3-2.9，分子量为2,000-30,000，或从4,000到8,000，或从18,000到30,000。上述方法包括以下步骤：(p-a)将K5多糖N-脱乙酰化，并将所得K5-胺N-硫酸盐化，(p-b)将K5-N-硫酸盐差向异构，(p-c)将epiK5-N-硫酸盐O-过硫酸盐化，(p-d)部分O-脱硫酸盐化，(p-e)选择性6-O-硫酸盐化，(p-f)将所得产物N-硫酸盐化，完成步骤(p-b)-(p-f)之一后所得的任何产物可被解聚。所述文献描述了一种epiK5-N，O-硫酸盐，其分子量为7,400，通过上述步骤(p-a)-(p-f)、然后在步骤(p-f)结束后进行亚硝酸解聚而获得，其硫酸盐化程度为2.3-2.9。
该文献还描述了分子量约为5,000的K5部分，也可对其进行步骤(p-a)-(p-f)。
为使术语更加规范并使文本更加容易理解，在本发明的描述中将使用常规的术语或表述，以单数或复数形式。尤其是以下术语：
—″K5″或″K5多糖″是指通过发酵得到大肠杆菌的荚膜多糖，即由二糖单元(A)构成的链状混合物，所述二糖单元在上述非还原端任选含有一个双键，总之，它是用文献，尤其是Vann 1981；Manzoni M.等，Journal of Bioactive CompatiblePolymers，1996，11，301-311(″Manzoni 1996″)中所述的方法，或WO O1/72848和WO 02/068447中所述的方法制备并纯化的；对于精通此领域的技术人员不言而喻的是，上述方法可用于任何N-乙酰肝素糖；
—″C5-差向异构酶″是指提取或重组的D-葡糖醛酸基C-5差向异构酶，它可用任何方法制备、分离和纯化，尤其是用Campbell 1994，WO 98/48006，Jin-Ping L.等在J.Biol Chem.2001，276，20069-20077中所述的方法(Jin-Ping 2001)或Crawford2001；
—K5-胺是指至少95％N-脱乙酰化的K5，但其中N-乙酰基用常规的NMR设备不可检测；
—″K5-N-硫酸盐″是指至少95％N-脱乙酰化的N-硫酸盐K5，通常是100％，如上所述，N-乙酰基用常规的NMR设备不可检测；
—″epiK5″是指K5及其衍生物，其中，20-60％的葡糖醛单元被C5-差向异构成艾杜糖醛单元；
—″epiK5-N-硫酸盐″是指K5-N-硫酸盐，其中，20-60％的葡糖醛单元被C5-差向异构成艾杜糖醛单元；
—″epiK5-胺-O-过硫酸盐″是指epiK5-胺-O-硫酸盐，其硫酸盐化程度至少为3.4；
—″epiK5-N，O-过硫酸盐″是指被完全N-硫酸盐化的epiK5-胺-O-硫酸盐，其硫酸盐化程度至少为4；
此外：
—本文上面定义的常规术语和表述是针对发酵后分离的K5，其分子量分布通常约为1,500至约50,000，平均分子量为10,000-25,000，15,000-25,000较好；
—当在这里上面定义的常规的术语和表述前加上首字母缩写″LMW″(低分子量)时，例如LMW-K5-N-硫酸盐，LMW-epiK5-N-硫酸盐，是指低分子量的产物，这是通过分级分离或解聚K5-N-硫酸盐获得的，它含有或衍生自K5-N-硫酸盐，平均分子量为约1,500至约12,000，以100％N-硫酸盐化产物来计算；
—当在这里上面定义的常规的术语和表述后加上″-衍生物″时是指天然K5的衍生物和低分子量衍生物；
—用于分子量时，术语″大约″是指用粘度测定法测得的分子量±二糖单元的理论分子量，包括钠的重量，计算出epiK5-N-硫酸盐-衍生物为461，epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物为806，其硫酸盐化程度为4.26；
—表述″优势种类″是指在构成LMW-epiK5-N-硫酸盐、LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐或LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐的混合物中最具代表性的化合物，这是通过用HPLC测得的分子量曲线的峰值确定的；
—除非另有说明，″硫酸盐化程度″是指SO3 -/COO-比例，还可表示为每个二糖单元中硫酸盐基团的数目，用Casu B.等Carbohydrate Research，1975，39，168-176(Casu 1975)中所述的方法测量，或用WO 01/72848中所述的方法；
—″O-过硫酸盐化条件″是指按照例如B.Casu等在Carbohydrate Research，1994，263，271-284(Casu 1994)中的描述的方法C进行极端O-硫酸盐化；
—术语″烷基″是直链或支链烷基，而″四丁铵″是指四-正-丁基铵基团。
发明概述
我们现在惊奇地发现，与IT 1230785，WO 92/17507，WO 96/14425，WO 97/43317，WO 01/72848和US 2002/0062019中所述的方法不同，从epiK5-N-硫酸盐开始有可能得到一种硫酸盐化程度高于文献中所述任何其它epiK5-胺-O-硫酸盐(例如WO01/72848中所述)的epiK5-胺-O-过硫酸盐，方法是用所述epiK5-N-硫酸盐的三元或四元有机碱来制备盐，将所述反应混合物小心放置30-60分钟，用同样的有机碱保持pH约为7，然后在O-过硫酸盐化条件下用O-硫酸盐化试剂处理所得盐。
将所得epiK5-胺-O-过硫酸盐N-硫酸盐化，与IT 1230785，WO 92/17507，WO96/14425，WO 97/43317，WO 01/72848和US 2002/0062019中所述产物不同，所得新的epiK5-N，O-过硫酸盐不具有凝固活性，并可用于制备药物，尤其是具有抗血管发生(antiangiogenetic)和抗病毒活性的药物组合物或美容组合物。
用硝酸解聚所述epiK5-N，O-过硫酸盐可得到新的LMW-epiK5-N，O过硫酸盐，它不具有凝固活性，并具有抗血管发生和抗病毒活性。
在制备K5多糖的N，O-硫酸盐N-脱乙酰化衍生物时，按照WO 01/72848所述的方法，总糖醛酸的至少40％被差向异构成艾杜糖醛酸，并具有低分子量，已证实在将该方法最后的N-硫酸盐化步骤结束后得到的高分子量产物解聚可得到不同的结果，因为这通常会产生一些解聚产物，就凝固参数而言，其活性远低于产生它们的高分子量的产物。估计这是由于硫酸盐基团的存在影响了亚硝酸的解聚而发生的。尤其是葡糖胺3位的硫酸盐导致了异型产物，如Nagasawa等在Thrombosis Research，1992，65，463-467(Nagasawa 1992)中所述。
现在发现，将epiK5-N-硫酸盐进行亚硝酸解聚，其中艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸20-60％，较好为40-60％，优选约50％，可得到LMW-epiK5-N-硫酸盐，它构成了新的制备LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐的有效中间体，LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐在不同生物参数上都具有较高活性，在凝固参数上有或没有活性。特别地，发现可将epiK5-N-硫酸盐解聚以得到新的平均分子量约为2,000至约4,000的LMW-epiK5-N-硫酸盐，更特别地是，这种特殊的LMW-epiK5-N-硫酸盐由混合物构成，混合物中的优势化合物是十糖或十二糖或十四糖。此外，除非无法得到，这些LMW-epiK5-N-硫酸盐具有我们感兴趣的生物特性并且是制备LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐的有效中间体，其具有抗病毒和/或抗血管发生活性且令人惊奇地是不具有凝固活性。
用三元或四元有机碱通过上述成盐方法处理LMW-epiK5-N-硫酸盐，将反应混合物小心放置30-60分钟，用同样的有机碱保持pH约为7，然后在O-过硫酸盐化条件下用O-硫酸盐化试剂处理所得盐，就可得到新的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐。将LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐进行N-硫酸盐化，即可得到新的N-硫酸盐和O-过硫酸盐的衍生物(LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐)，令人惊奇的是，它不具有凝固活性而具有抗病毒和/或抗血管发生活性，可有效用于制备药物组合物或美容组合物。
这些LMW-epiK5-N-硫酸盐是从K5-N-硫酸盐开始，用固定在固体支持物上的分离纯化的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行C5-差向异构，温度约30℃，pH约7，时间为12-24小时，并存在选自钙、镁、钡和锰的二价离子，随后将所得差向异构产物亚硝酸解聚获得的，或者反之亦然。
奇怪的是，通过观察在上述反应条件下发生的差向异构反应，可以估计，与天然发生的肝素的生物合成不同，每两个葡糖醛酸单元就会产生常规但非“簇”类型的底物的C5-差向异构，这就会产生以重复的四糖单元为特征的epi-K5-N-硫酸盐-衍生物，上述四糖单元由两个被葡糖醛单元和之后被一个艾杜糖醛单元分隔(或者反之亦然)的葡糖胺单元构成。
发明详述
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制造epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物的方法，其特征在于
(a)用三元或四元有机碱处理酸形式的epiK5-N-硫酸盐-衍生物，使反应混合物静置30-60分钟，通过加入相同的三元或四元有机碱使反应混合物保持在pH约7的溶液中，并用有机碱分离其盐；
(b)在O-过硫酸盐化条件下用O-硫酸盐化试剂处理所述epiK5-N-硫酸盐-衍生物的所述有机碱的盐；
(c)然后用N-硫酸盐化试剂处理由此制得的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，并分离这样所得到的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物。
通常，epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物以钠盐形式分离，且所述钠盐可任选被转化成其它化学或药学上可接受的盐。
在本文中，术语″化学上可接受的″是指一种可用于化学合成的阳离子，如钠，铵，(C1-C4)四烷基铵离子，或用于纯化产物，而″药学上可接受的″一词本身就说明了它的含义。较好的阳离子是那些来自碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的离子。优选的阳离子是钠、钙和四丁铵离子。
根据该方法一个有利的方面，步骤(a)是使epiK5-N-硫酸盐-衍生物，即K5多糖的钠盐溶液通过酸性离子交换树脂，例如IR-120H+型树脂，所述溶液已经预先(通常100％地)N-脱乙酰化，N-硫酸盐化，同时20-60％被C5-差向异构，并任选用亚硝酸解聚，其平均分子量为约1,000至约25,000，优选从约1,500至约25,000，收集洗脱液(还包含树脂的洗涤水)，并用三元或四元有机碱中和洗脱液，优选用氢氧化四丁基铵的水溶液。将溶液放置1小时，通过加入同样的碱将pH保持在7，并通过冻干分离所得的盐。
在步骤(b)中，O-过硫酸盐化是用过量的O-硫酸盐化试剂发生的，并在20-70℃的温度下操作，反应在非质子极性溶剂中最多进行24小时。
有利地是，epiK5-N-硫酸盐-衍生物，即K5多糖的三元或四元有机碱的盐，已经预先(通常100％地)N-脱乙酰化，N-硫酸盐化，同时20-60％被C5-差向异构，并任选用亚硝酸解聚，其平均分子量为约1,000至约25,000，优选从约1,500至约25,000，如步骤(a)所分离的，它被溶于二甲基甲酰胺，每个游离羟基在40-60℃的温度下用2-10摩尔O-硫酸盐化试剂处理10-20小时。一种优选使用的O-硫酸盐化试剂是吡啶。SO3加合物的量为每个二糖每个游离羟基2.5-5摩尔，优选2.5-4摩尔，反应优选在50-60℃进行，优选55℃，过夜。终止反应后得到的反应产物通过加入0.1-1体积的水分离，并优选用氢氧化钠中和，用饱和氯化钠的丙酮溶液沉淀，过滤，可能的话进行超滤。
所得产物通常是epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的钠盐，其艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸的20-60％，平均分子量为约3,500至约40,000，优选从约4,500至约40,000，且其硫酸盐化程度至少为3.4，优选至少3.5，更优选从3.55到4，优选从3.55到3.8。所得钠盐可被转化成其它的盐。例如，可用超滤膜与钙离子进行交换。
在步骤(c)中，硫酸盐化程度非常高的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物用文献中已知的N-硫酸盐化方法进行N-硫酸盐化。
在实践中，N-硫酸盐化可用以下方法进行：用碳酸钠和一种N-硫酸盐化试剂，例如(C1-C4)三烷基胺.SO3或吡啶.SO3加成物处理含有来自步骤(b)的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物的水溶液，将混合物在30-50℃保持8-24小时并通过例如渗滤分离所需的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物。N-硫酸盐化步骤可被任意重复直至达到超过95％的取代，优选完全取代。
所得新的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物通常为其钠盐形式。所述钠盐可被转化成其它化学或药学上可接受的盐。特别优选的盐是碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的盐。优选的是钠、钙和四丁铵的盐。
本发明方法步骤(a)的起始物质epiK5-N-硫酸盐衍生自K5多糖，已经预先(实际上是100％地)N-脱乙酰化，N-硫酸盐化，同时20-60％被C5-差向异构，并任选用亚硝酸解聚，其平均分子量为约1,000至约25,000，优选从约1,500至约25,000。优选地，所述起始物质是平均分子量为10,000-25,000的epi-K5-N-硫酸盐，或LMW-epiK5-N-硫酸盐，其平均分子量为约1,000至约12,000，优选从约1,000至约10,000，优选在约1,500和约8,000之间。
通过将K5-N-硫酸盐C5-差向异构制得的EpiK5-N-硫酸盐是文献中已知的，并被广泛描述，例如在WO 92/17507，WO 01/72848，WO 98/14425，WO 97/43317或US2002/0062019中。在上面所引用的文献中描述了通过用D-葡糖醛酸基C5差向异构酶将K5-N-硫酸盐的葡糖醛单元进行C-5差向异构来制备它们的方法。
通过N-脱乙酰化，N-硫酸盐化并C5-差向异构平均分子量为5,000的K5部分所得的LMWepiK5-N-硫酸盐的艾杜糖醛单元含量约20％，这描述在WO 92/17507。然而，这种LMW-K5-N-硫酸盐含有相当多的乙酰基。
一种特别优选的起始物质是艾杜糖醛酸含量为40-60％的epiK5-N-硫酸盐，它是通过差向异构实际上不含乙酰基的K5-N-硫酸盐获得的，依次从特别纯的K5(尤其是不含亲脂性物质)制备的，这描述在WO 02/068477中。根据该方法优选的方面，K5-N-硫酸盐的差向异构是从不含亲脂性物质的K5获得的，如WO 02/068477所述，且所述C5差向异构是用固定在固体支持物上的分离纯化的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行的，反应pH约7，温度约30℃，时间为12-24小时，并存在至少一种选自钙、镁、钡和锰的二价离子。
具有较高的艾杜糖醛单元含量，特别是40-60％，优选50-55％，的LMW-epiK5-N-硫酸盐在制备LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物时是新的特别有利的起始物质。
上述LMW-epiK5-N-硫酸盐是用一种方法获得的，这种方法的特征在于以任何顺序对K5-N-硫酸盐进行以下操作：
@@(i)在至少一种选自钙、镁、钡和锰的二价离子存在下，在pH约7，温度约30℃，时间为12-24小时的条件下，用在溶液或固定在固体支持物上的分离纯化的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行C5-差向异构；和
(ii)进行亚硝酸解聚，任选进行还原。
表述″以任何顺序″是指该方法可按照(i)-(ii)的顺序进行，即按照上述顺序，同时可以相反顺序进行，即以(ii)-(i)的顺序，先对K5-N-硫酸盐进行亚硝酸解聚反应，然后任选用硼氢化钠还原，并在上述条件下进行C5-差向异构。优选以(i)→(ii)的顺序进行。当从平均分子量超过4,000，优选约6,000的LMW-K5-N-硫酸盐开始时，顺序(ii)-(i)是优选的。例如，可以确定亚硝酸钠的量，它可使1克epiK5-N-硫酸盐变为分子量超过4000，尤其是至少为6000的LMW-epiK5-N-硫酸盐，以得到用来制备LMWepiK5-N，O-过硫酸盐的有用的中间体。实际上，在步骤(ii)中得到了差向异构的最佳比例。
根据本发明的一个优选方面，C5-差向异构酶被固定在惰性固体支持物上。
按照例如Campbell 1994，WO 98/48006，Jin-Ping 2001或Crawford 2001分离纯化的C5-差向异构酶(优选重组体)被固定在一含有底物，即含有起始物质K5-N硫酸盐-衍生物或含有LMW-K5-N-硫酸盐的惰性支持物上，所述LMW-K5-N-硫酸盐的平均分子量最好超过4,000，优选至少为6,000。固定是按照常规的方法，例如WO01/72848中所述的方法进行的。
C-5差向异构是通过以下步骤进行的：将20-1,000ml 25mM HEPES溶液在pH约7、含有0.001-10g底物(K5-N-硫酸盐或LMW-K5-N-硫酸盐，优选其分子量超过4,000，尤其是至少为6,000)和选自钙、镁、钡和锰的浓度在10和60mM之间的阳离子的条件下通过含有1.2×107至3×1011cpm固定的酶的柱再循环，保持pH约为7，温度约30℃，流速为每小时30-220ml，时间为12-24小时，优选15-24小时。
优选所述溶液以约200ml/小时的流速再循环过夜(15-20小时)。所得产物用已知的方法纯化和分离，例如通过超滤并用乙醇沉淀。所得产物由epiK5-N-硫酸盐(此时将其溶于水并进行解聚)或LMW-epiK5-N-硫酸盐(此时即为最终产物)构成。差向异构的比例，即艾杜糖醛单元占葡糖醛单元的比例，按照WO 96/4425中所述的方法用1H-RMN来计算。
亚硝酸解聚反应是按照已知方法进行的，例如按照EP 37319，WO 82/03627中所述解聚肝素的方法，或按照EP 544592所述解聚K5-N-硫酸盐的方法，但从K5-N-硫酸盐或从含有0％至不超过10％，优选不超过5％乙酰基的epiK5-N-硫酸盐开始。优选地，所述解聚用亚硝酸钠和盐酸在实际上不含乙酰基的epiK5-N-硫酸盐上进行，然后用硼氢化钠原位还原。
实践中，用盐酸将冷的epiK5-N-硫酸盐的水溶液酸化至pH(约2)，并趁其还是冷的时候用亚硝酸钠处理，保持温度(约4℃)和pH(约2)恒定，并在解聚结束时(约15-30分钟)用氢氧化钠将溶液中和并仍在4℃下用硼氢化钠水溶液处理。在反应结束后(约4小时)用盐酸除去过量的硼氢化钠，溶液用氢氧化钠中和，并用已知方法如用乙醇或丙酮直接沉淀来分离解聚(还原)产物。解聚结束后得到的产物可以是LMW-epiK5-N-硫酸盐(此时它构成最终产物)或LMW-K5-N-硫酸盐(此时可在分离后按上述方法直接进行C5-差向异构，无需预先分离，直接在溶液中进行)，尤其是当其平均分子量大于4,000，优选至少6,000时，或它被用于制备具有抗血管发生和抗病毒活性的LMW-K5-N，O-过硫酸盐时。通过适当控制解聚反应，尤其是用不同量的亚硝酸钠/盐酸，可得到平均分子量从约1,500至约12,000，优选从约1,500至约10,000，优选从约1,500至约7,500的LMW-K5-N-硫酸盐或LMW-epiK5-N-硫酸盐，分子量是利用13C-RMN谱通过代表2，5-脱水甘露醇的C2与多糖链内葡糖胺的异头碳信号的强度计算的。
根据该方法的一个一般方式，例如从1克epiK5-N-硫酸盐开始，将起始物质溶于100-200ml去离子水中，并将恒温箱的温度设定为4℃。然后加入一定量的亚硝酸钠以获得所需的平均分子量，例如从约2,000至约4,000。因此，从分子量为20,000(用装有BioRad BioSil 250柱的HPLC法测得，使用已知分子量的标准肝素)的epiK5-N-硫酸盐开始，将需要加入330-480mg溶于0.2％水溶液的亚硝酸钠。将含有epiK5-N-硫酸盐和亚硝酸钠的溶液保持在4℃，通过加入0.1N冷却至4℃的HCl使其pH变为2。缓慢振荡20-40分钟使其反应，然后用0.1N NaOH中和。使所得产物回复室温并用还原剂如硼氢化钠(250-500mg，溶于50-100ml水)处理，使反应进行4-8小时。过量的硼氢化钠用0.1N HCl使pH升至5-5.5除去，在放置2-4小时。最后用0.1N NaOH中和，产物用丙酮或乙醇沉淀回收，浓缩后减压蒸发产物。
类似地，从1g K5-N-硫酸盐或epiK5-N-硫酸盐开始，可以确定亚硝酸钠的量，以使LMW-K5-N-硫酸盐或LMW-epiK5-N-硫酸盐的平均分子量为约4,000至约12,000，优选从约4,000至约7,500，尤其是6,000-7,500。
这样获得的LMW-epiK5-N-硫酸盐(其艾杜糖醛酸含量为20-60％，优选为40-60％，优选为50-55％，且实质上不含NH2和N-乙酰基，平均分子量为约1,500至约12,000，优选约1,500至约10,000，优选约1,500至约7,500)及其化学或药学上可接受的盐构成了一种新的产物，它作为制备LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐的起始物质特别有利，但也可作为药物组合物或美容组合物的活性成分，这构成了本发明的另一方面。优选地，用于制备本发明的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物的起始物质是由链状混合物构成的epiK5-N-硫酸盐-衍生物，其中，所述链至少有90％具有式I
Figure A0381956000211
其中，糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，较好是3-100；且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
更优选地，所述起始物质epiK5-N-硫酸盐-衍生物由链状混合物构成，其中，至少90％的所述链具有式I，其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，优选3-100的整数，且相应的阳离子是化学上可接受的。优选的起始物质是上述由链状混合物构成的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其中，至少90％的所述链具有式I，其中，所述糖醛单元的20-60％，优选40-60％，优选50-55％由艾杜糖醛酸构成，n是2-20的整数，优选为3-15，且相应的阳离子是化学上可接受的。
在实践中，所述优选的LMW-epiK5-N-硫酸盐由链状混合物构成，其中，至少90％的所述链具有式I’
Figure A0381956000221
其中，所述糖醛单元的20-60％，较好是40-60％，更好是50-55％由艾杜糖醛酸构成，q是2-20的整数，较好是3-15；且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
在本文中，术语“化学上”是指可用于化学合成的阳离子，如钠，铵，(C1-C4)四烷基铵离子，或用于纯化产物。
较好的阳离子是那些来自碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的离子。优选的阳离子是钠、钙和四丁铵离子。
特别感兴趣的是由链状混合物构成的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其中，至少90％的所述链具有上述式I’，它是通过亚硝酸解聚相应的epiK5-N-硫酸盐随后用例如硼氢化钠进行可能的还原获得的。其中，优选的LMW-epiK5-N-硫酸盐由链状混合物构成，其中，优势种类具有式I’a
Figure A0381956000222
其中，所述糖醛单元的60-40％由葡糖醛酸构成，且40％-60％为由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数。这些产物的平均分子量为约2000至约4000，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
来自亚硝酸解聚步骤的epiK5-N-硫酸盐的起点包括，在所述链状混合物中大部分链的还原点处，存在2，5-脱水甘露糖单元，或者如果用例如硼氢化钠还原则存在结构(a)所示的2，5-脱水甘露醇
其中，X代表甲酰基或羟甲基。因此，大部分链(60-70％的链)的还原点实际上以结构(b)表示
其中，X的定义如上。
结构(a)的出现对epiK5-N-硫酸盐及其衍生物的化学特性没有任何影响，因为任何硫酸盐化将可能引入一个或两个硫酸盐基团，然而这不会显著改变O-硫酸盐衍生物的硫酸盐化程度。然而优选的是，亚硝酸解聚在用例如硼氢化钠还原后进行，因此，按照本发明的方法，所述LMW-epiK5-N-硫酸盐进行硫酸盐化和酰化，结构(a)的2，5-脱水甘露糖残基对甲酰基的影响是未知的，其中，X代表甲酰基。此外，结构(a)的存在不会影响产物的生物活性，stergaard P.B.等在ThrombosisResearch，1987，45，739-749(stergaard 1987)中已经证实。
特别优选本发明的LMW-epiK5-N-硫酸盐由链状混合物构成，其中，优势种类具有式I’b
其中，X是甲酰基，或优选羟甲基，m是4，5或6，相应的阳离子是化学或药学上可接受的离子，葡糖醛和艾杜糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始。此时，葡糖醛/艾杜糖醛比例为45/55至55/45，即约50/50。
优选在上述条件下使用重组的，被固定在固体支持物上的C5-差向异构酶，这样不会使K5-N-硫酸盐-衍生物像自然条件下一样发生″簇″差向异构变为epiK5-N-硫酸盐-衍生物，而是常规的类型。
因此，根据本发明的另一方面，本发明提供了分离纯化的C5-差向异构酶在将K5-N-硫酸盐-衍生物转化成相应的以重复的四糖单元为特征的epi-K5-N-硫酸盐-衍生物中的应用，上述四糖单元由两个被葡糖醛单元和随后的一个艾杜糖醛单元分隔的葡糖胺单元构成。
所述差向异构优选在平均分子量大于4,000，优选从6,000-7,500的K5-N-硫酸盐-衍生物上进行。
根据本发明，所述起始的epiK5-N-硫酸盐-衍生物优选被100％N-硫酸盐化(尤其是由链状混合物构成的epiK5-N-硫酸盐-衍生物，其中，所述链至少90％具有式I或I’；或其中优势种类具有式I’a或I’b，其中X是羟甲基)，对该起始物质进行上述步骤(a)和(b)，然后分离相应的新的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其中，所述胺未被取代，通常为钠盐形式，它可被转化成另一种化学或药学上可接受的盐。特别有利的是那些来自碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的离子。优选的阳离子是钠、钙和四丁铵离子。
因此，根据本发明的另一方面，本发明涉及一种新的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物及其化学或药学上可接受的盐，它们可用一种方法获得，该方法的特征在于
(a)用三元或四元有机碱处理酸形式的epiK5-N-硫酸盐-衍生物，将反应混合物放置30-60分钟，通过添加所述三元或四元有机碱将溶液的pH保持在7，然后用所述有机碱分离其盐；
(b)在O-过硫酸盐化条件下用O-硫酸盐化试剂处理所述epiK5-N-硫酸盐-衍生物的有机碱的盐，并分离epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
作为优选的步骤(a)的起始物质，使用由链状混合物构成的epiK5-N-硫酸盐-衍生物，其中，所述链至少90％具有上述式I，其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是3-100的整数，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的，在步骤(b)结束时，得到由链状混合物构成的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其中，所述链至少90％具有式II
Figure A0381956000241
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，优选从3-100，R、R’和R″是氢或SO3 -，其硫酸盐化程度至少为3.4，优选至少3.5，更优选从3.55-4，优选从3.55-3.8，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
这些具有高硫酸盐化程度的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物是一种新的产物，它是制备其N-硫酸盐化或N-(C2-C4)酰化衍生物的中间体，这种衍生物在凝固参数上基本没有活性，但具有其它感兴趣的药理特性。
优选的具有非常高硫酸盐化程度的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物是由链状混合物构成的，其中，所述链至少90％具有式II，其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，优选从3-100，其平均分子量为约2,000至约40,000，优选从约4,500至约40,000，R至少有40％，优选50-80％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -，硫酸盐化程度大于3.4，优选至少3.5，更优选从3.55-4，优选从3.55-3.8，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
优选的具有非常高硫酸盐化程度的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物是由链状混合物构成的，其中，所述链至少90％具有式II，其中，所述糖醛单元的40-60％，优选50-55％由艾杜糖醛酸构成，R至少有40％，优选50-80％，优选约65％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -，n是2-20的整数，优选从3-15，其平均分子量为约4,000至约8,000，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
实践中，所述优选的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式II’
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，q是2-20的整数，优选为3-15，R、R’和R″是氢或SO3 -，其硫酸盐化程度至少为3.4，优选至少3.5，更优选从3.55-4，优选从3.55-3.8，且相应的阳离子是一种化学或药学上可接受的离子。
优选的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐由链状混合物，其中，优势种类具有式II’a
Figure A0381956000252
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数，R、R’和R″如上面的定义，其硫酸盐化程度至少是3.4，优选至少3.5，更优选从3.55-4，优选从3.55-3.8，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
由LMW-epiK5-硫酸盐通过亚硝酸解聚随后用例如硼氢化钠还原获得的新的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐的起点包括，在所述链状混合物中大部分链的还原点处，存在结构(a’)所示的2，5-脱水甘露醇
Figure A0381956000261
其中，R″代表氢或SO3 -。
因此，大部分链的还原点实际上以结构(b’)表示
Figure A0381956000262
其中，糖醛单元可以是葡糖醛或艾杜糖醛单元。
在上述新的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐中，优选由混合物构成的那些，其中，优势种类是式II’b的化合物
其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，m是4，5或6，R、R’和R″是氢或SO3 -，X″是OH或OSO3 -，其硫酸盐化程度至少为3.4，优选至少3.5，更优选从3.55-4，优选从3.55-3.8，艾杜糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始，且相应的阳离子是一种化学或药学上可接受的离子。
所有这些具有非常高硫酸盐化程度的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物都是新的产物，它们是制备新的N-取代的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物的有用的中间体，因此构成了本发明的另一方面。
特别地，根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述具有非常高硫酸盐化程度的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物在制备新的N-取代的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物，尤其是N-硫酸盐化或N-酰化衍生物中的应用。
在结束本发明方法的步骤(c)后，获得了由在步骤(b)获得的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物(尤其是由链状化合物构成的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其中，所述链至少90％具有式II或II’；或其中优势种类具有式II’a或II’b)的N-硫酸盐构成的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸的20-60％，且其硫酸盐化程度至少是4，优选从4-4.6。
因此，根据本发明的另一方面，本发明提供了新的K5多糖的N-脱乙酰化的衍生物，该衍生物被O-硫酸盐和N-硫酸盐化，且总糖醛单元的至少20％被C5-差向异构成艾杜糖醛酸，其平均分子量为约2,000至约45,000，硫酸盐化程度至少为4，所述衍生物在凝固参数上基本没有活性。
类似地，所述新的衍生物作为一个整体通常被称为″epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物″，以其分子量进行划分。
特别地，其平均分子量在约2,000至约45,000之间，由于所述衍生物来自epi-K5-N-硫酸盐，它是将发酵所得的K5 N-脱乙酰化并N-硫酸盐化，然后在亚硝酸盐解聚获得的。通过控制亚硝酸解聚可以得到实际上在上述所有范围内的低分子量的衍生物。然而，为将本发明的衍生物用作药物或美容产品，较好制造低分子量的衍生物，所述衍生物的平均分子量为约2,000至约16,000，优选从约3,500至约13,000，其分子量分布在约1,000和约15,000之间，优选从约4,500至约9,000，其分子量分布从约2,000至约10,000，或是制造高分子量的衍生物，它来自未分级的K5，其平均分子量在约20,000和约45,000之间，分子量分布从约2,000至约70,000。
在本发明的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物中，其硫酸盐化程度非常高，优选为4-4.6，葡糖胺的氮实际上被100％硫酸盐化。此外，epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物的葡糖胺单元100％被6-O-硫酸盐化，并有50-80％被3-O-硫酸盐化，葡糖醛单元有5-10％被O-单硫酸盐化，艾杜糖醛单元有10-15％被3-O-单硫酸盐化，且其余的糖醛单元被2.3-二-O-硫酸盐化，认为其硫酸盐化程度至少是4。
优选的本发明的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物是由epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物获得的，后者是从由链状混合物构成的epiK5-N-硫酸盐-衍生物制备的，其中，所述链至少90％具有上述式I，其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，优选为3-100，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
这种情况下，所述新的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，优选从3-100，R、R’和R″是氢或SO3 -，Z是SO3 -，其硫酸盐化程度至少是4，优选为4-4.6，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
较好的阳离子是那些来自碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的离子。优选钠盐、钙盐和四丁基铵盐。
上述新的epiK5-胺-N，O-过硫酸盐-衍生物由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有上述式III，其中，在50％-80％、优选约65％的所述链中R是SO3 -，且其硫酸盐化程度至少是4，优选为4-4.6，优选为4-4.3。
具有非常高硫酸盐化程度的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物优选由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III，其中，Z是SO3 -，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，优选从3-100，其平均分子量为约2,000至约45,000，优选约4,500至约45,000，R至少有40％，优选50-80％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在单硫酸葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在单硫酸艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -，其硫酸盐化程度至少是4，为4-4.6，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
优选的N-取代的epiK5-胺-O-过硫酸盐的衍生物是由链状混合物构成的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐，其中，所述链至少90％具有式III，其中，所述糖醛单元的40-60％，优选50-55％由艾杜糖醛酸构成，R至少有40％，优选50-80％，优选约65％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -，Z 100％是SO3 -或(C2-C4)酰基，n是2-20的整数，优选为3-15，其平均分子量为约4,000至约8,500，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
在实践中，所述具有非常高硫酸盐化程度的epiK5-N，O-硫酸盐-衍生物由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III’
Figure A0381956000281
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，q是2-20的整数，优选为3-15，R、R’和R″代表氢或SO3 -基团，Z是SO3 -，其硫酸盐化程度至少为4，优选从4-4.6，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的离子。
特别感兴趣的是式III’的链状混合物，其中，所述糖醛单元的40-60％，优选50-55％由艾杜糖醛酸构成，R至少有40％，优选50-80％，优选约65％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -，n是2-20的整数，优选为3-15，其平均分子量为约2,000至约16,000，优选从约3,500至约13,000，优选从约4,500至约9,000，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
在这些LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐中，较好的是由链状混合物构成的那些，其中，优势种类具有式III’a
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数，Z是SO3-，R、R’和R″是氢或SO3 -，其硫酸盐化程度至少为4，优选从4-4.6，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
由LMW-epiK5-硫酸盐通过亚硝酸解聚随后用例如硼氢化钠还原获得的新的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐的起点包括，在所述链状混合物中大部分链的还原点处，存在上述结构(a’)所示的硫酸化的2，5-脱水甘露醇单元，其中，R″代表氢或SO3 -。
因此，大部分链的还原点实际上以结构(b”)表示
Figure A0381956000292
其中，Z代表SO3 -且糖醛单元可以是葡糖醛或艾杜糖醛单元。
在上述新的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐中，优选的是由混合物构成的那些，其中，优势种类是式III’b的化合物
Figure A0381956000293
其中，R、R’和R″是氢或SO3 -，Z是SO3 -，X″是OH或OSO3 -，m是4，5或6，其硫酸盐化程度至少为4，优选从4-4.6，所述糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的离子。较好的阳离子是那些来自碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的离子。优选的阳离子是钠、钙和四丁铵离子。
如果将epiK5用作本发明所述方法的起始epiK5-衍生物，即预先(通常100％地)N-脱乙酰化，N-硫酸盐化，同时20-60％被C5-差向异构，且未解聚的K5多糖，在结束步骤(c)后，epiK5-N，O-过硫酸盐被分离，对其进行亚硝酸解聚，可能的话随后用例如硼氢化钠还原，以得到相应的具有相同硫酸盐化程度的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐。特别地，所得LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐由链状化合物构成，其中，所述链至少90％具有式III’或III’a，其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，q，R，R’R″和Z具有上面的定义，其硫酸盐化程度至少为4，优选为4-4.6，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的离子。这种情况下，通过解聚反应，可能的话随后用例如硼氢化钠还原获得的这些LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐的起点包括，在所述链状混合物中大部分链的还原点处，存在结构(a″)所示的2，5-脱水甘露醇单元
其中，X是甲酰基或羟甲基，R″代表氢或SO3 -。
所述新的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，尤其是它们的盐形式，是高度阴离子化的产物，它们能够捕获自由基，并可在化妆品工业中用作抗落发的佐剂或用来制备“抗衰老”的乳膏，以及在制药工业中用作治疗皮炎的产品。此外，本发明的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，尤其是LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，具有抗血管发生和抗病毒活性，因此可作为药物制备的活性成分。
因此，更加另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，它含有与药物赋形剂混合的、药物活性量的上述epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物或一种其药学上可接受的盐作为其活性成分之一。
在供口服、皮下给药、静脉内给药、透皮给药或局部给药的本发明的药物组合物中，所述活性成分优选以剂量单元的形式给予，并与常规的药物赋形剂或载体混合。
所述剂量取决于患者的年龄、体重和健康状况。用药剂量包括每天1-3次通过静脉内、皮下、口服、透皮或局部给药给予1-1000mg，优选10-750mg，优选250-500mg剂量。
本发明的药物组合物是用适合不同给药途径的典型的赋形剂制备的。特别优选霜剂、软膏剂、搽剂、凝胶剂、泡沫剂、香膏、阴道栓剂、栓剂、溶液剂或适合局部给药的悬液剂形式的制剂。
优选地，本发明的组合物含有与药物赋形剂混合的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物或一种其药学上可接受的盐作为其活性成分之一，该衍生物是从epiK5-衍生物开始，按照上述步骤(a)，(b)和(c)制得的，或从未解聚的epiK5开始，按照上述步骤(a)，(b)和(c)制得的，有可能在步骤(c)之后进行亚硝酸解聚。优选地，所述epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III或III’，或者其中的优势种类是式III’a或III’b的化合物。优选的活性组分是LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其硫酸盐化程度至少为4，优选从4-4.6，最好平均分子量为约3,500至约11,000，更优选从约3,500至约5,200，且基本上没有N-乙酰基。
最后，根据另一个方面，本发明提供了一种美容组合物，它含有与美容赋形剂混合的有效量的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物或其药学上可接受的盐之一。
本发明的药物组合物或美容组合物的一种有效的活性组分包括一种盐，该盐选自epiK5-N，O-过硫酸盐衍生物的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锌盐，所述衍生物尤其是由链状混合物构成的，其中，所述链至少90％具有式III或III’，或者其中的优势种类具有式III’a或III’b。
以下实施例例证了本发明，但未对其进行限制。
制备方法I
从大肠杆菌制备K5多糖
首先在锥形烧瓶中用以下培养基进行发酵：
脱脂黄豆粉             2g/l
K2HPO4              9.7g/l
KH2PO4              2g/l
MgCl2                0.11g/1
柠檬酸钠              0.5g/l
硫酸铵                1g/l
葡萄糖                2g/l
泉水                  1000ml
pH＝7.3
将此培养基在120℃灭菌20分钟。单独制备溶液形式的葡萄糖，将其在120℃灭菌30分钟，并在无菌条件下加到上述培养基中。在锥形烧瓶中接种原本在Triptic大豆琼脂中斜面培养的大肠杆菌细胞Bi 8337/41(010∶K5∶H4)的悬液，并在受控振荡下(160rpm，6cm振幅)在37℃温育24小时。通过用显微镜计算细胞数目来测量细胞的生长状况。在随后的操作中，在含有上述相同培养基的14I Chemap-Braun发酵罐中以0.1％的比例接种上述锥形烧瓶中的培养物，发酵在1vvm换气(vvm＝每分钟每体积液体的空气体积)、400rpm振荡和37℃的条件下进行18小时。在发酵时测量pH、氧气、葡萄糖余量、制得的K5多糖和细菌生长。在发酵终点将温度调至80℃，保持10分钟。以10,000rpm从培养基中离心分离细胞，上清液用装有PES膜的SS 316(MST)装置超滤，该膜的标称截断值800-10,000D，以便将体积减至1/5。然后在4℃下加4体积丙酮，并在4℃静置过夜以沉淀K5多糖。最后以10,000rpm离心分离20分钟或通过过滤将其回收。用来自曲霉(Aspergillus orizae)的II型蛋白酶对所得固体进行脱蛋白，该处理在37℃、在由0.1M NaCl和0.15M EDTA组成的pH为8并含有SDS(0.5％十二烷基硫酸钠)(每升滤液10mg)的缓冲液中进行90分钟。所得溶液在装有标称截断值为10,000D的膜的SS 316上超滤，用1M NaCl提取，并用水洗涤直至超滤液的吸光度消失。然后用丙酮沉淀K5多糖，可得到每升发酵罐850mg的产量。所得多糖的纯度可通过测量糖醛酸(咔唑法)、质子和碳13 NMR、UV和蛋白质含量来确定。其纯度大于80％。
所得多糖由两种分子量不同的部分组成，通过测定可知其分别为30,000和5,000D，测定是用Pharmacia 75 HR柱进行HPLC，并用两个Bio-sil SEC 250无菌柱(Bio Rad)以Na2SO4作为流动相以0.5ml/分钟的流速在室温下进行，一个部分的保留时间约为9分钟。测定是与用已知分子量的肝素部分获得的标准曲线比较进行。
这样得到的纯化的K5的1H-RMN谱显示了不同的信号，这是由于亲脂性物质的甲基造成的。
制备方法II
K5的纯化
将制备方法I最后得到的1g K5溶于100ml饱和的恒温在4℃的氯化钠水溶液，并在所得溶液中加入3体积的冷的异丙醇。通过添加计算量的饱和的氯化钠溶液将上述溶液的盐浓度调至3M，然后将所得溶液在冷环境(约4℃)下过夜。通过以10,000rpm离心20分钟，分离所形成的沉淀，产物的纯度通过渗析过夜来检查，随后用1H-RMN谱来检验，其中1.5ppm下的区域中必需没有信号。或者可重复进行溶于饱和的氯化钠的水溶液并用异丙醇沉淀的处理。将沉淀溶于水并在截断值为10,000D的Miniplate Millipore膜上超滤直到没有盐出现。这样可得到纯度至少为99％的K5，其1H-RMN谱在1.5ppm以下的区域中没有亲脂性杂质的痕迹。
制备方法III
K5-N-硫酸盐的制备
(i)N-脱乙酰化
将按照制备方法II制备的10g纯的K5多糖溶于1000ml 2N氢氧化钠并将此溶液在60℃下放置24小时。将溶液置于室温，然后用6N盐酸使其pH变为中性(pH7)。
(ii)N-硫酸盐化
在保持在40℃的含有脱乙酰化的K5的溶液中加入16克碳酸钠，然后在4小时后加入16克吡啶.SO3 -。在反应结束时，即24小时后，使溶液回复室温，然后用5％的盐酸溶液使pH至6.5-7。用1,000D的螺旋创伤膜(helically wound membrane)(购自cartridge-Millipore)通过渗滤从盐中纯化产物。当渗透物的电导率小于1000μS，优选小于100μS时结束渗滤。采用同样浓度的透析系统减少透析液体积直到多糖浓度为10％。通过冻干法干燥浓缩的溶液。13C-RMN谱分析未显示N-乙酰或NH2残基。
制备方法IV
LMW-K5-N-硫酸盐
用亚硝酸降解法将按照WO 02/068477实施例1、步骤(i)和(ii)得到的产物解聚，然后还原所形成的醛。继续将1克K5-N-硫酸盐溶于200ml蒸馏水并在其中加入480mg溶于240ml蒸馏水的亚硝酸钠。然后将溶液置于4℃，用0.1N HCl将pH调至2并保持30分钟。反应结束后用0.1M NaOH使其pH变为7然后回复室温。然后在溶液中加入450mg NaBH4并使其反应4小时。用HCl将pH调至5-6以除去过量的NaBH4。产物用0.1M NaOH中和，在4℃下用3体积丙酮通过沉淀回收，用过滤漏斗过滤并于40℃在真空容器中干燥。得到900mg平均分子量约为2,000的LMW-K5-N-硫酸盐，它是由链状混合物构成的，其中的优势种类是式I’b的化合物，其中，m是4，且糖醛单元是葡糖醛酸单元。
实施例1
LMW-epiK5-N-硫酸盐，顺序(i)→(ii)
(i)epiK5-N-硫酸盐的差向异构
将10克按照WO 02/068477实施例1、步骤(i)和(ii)得到的K5-N-硫酸盐(在其1H-RMN谱中未得到有关乙酰基或NH2的信号)溶于600ml 25mM的HEPES缓冲液(pH7，其中含有50mM的CaCl2)，使所得溶液通过填装有Sepharose 4B树脂的50ml的柱子再循环，其中含有5克固定的C5-差向异构酶重组体(WO 96/14425)，如WO 01/72848实施例1所述。反应在30℃、pH 7、流速为200ml/h的条件下进行24小时。所得产物通过超滤纯化并用乙醇沉淀。这样就得到了epiK5-N-硫酸盐，其艾杜糖醛酸含量为54％。
(ii)epiK5-N-硫酸盐的解聚
将1克如此所得的产物溶于25ml蒸馏水，在该溶液中加入230mg溶于115ml蒸馏水的亚硝酸钠。然后将溶液置于4℃，用0.1N HCl将pH调至2并保持30分钟。反应结束后使溶液回复室温，并用0.1M NaOH使其pH变为7。然后在溶液中加入450mg NaBH4并使其反应4小时。产物在4℃下用3体积丙酮通过沉淀回收，用过滤漏斗过滤并于40℃在真空容器中干燥。得到900mg LMW-epiK5-N-硫酸盐，其艾杜糖醛酸含量为54％，用HPLC法测得其分子量分布从1,000-4,000。
实施例2
LMW-epiK5-N-硫酸盐，顺序(ii)→(i)
(ii)K5-N-硫酸盐的解聚
如制备方法I所述，用100mg亚硝酸钠和300mg硼氢化钠将2克按照WO02/068477实施例1、步骤(i)和(ii)得到的K5-N-硫酸盐解聚。得到1.8克LMW-K5-N-硫酸盐，其其平均分子量为5,000。
(i)LMW-K5-N-硫酸盐的差向异构
按照实施例1步骤(i)的描述处理由上述步骤(ii)得到的1克LMW-K5 N-硫酸盐。得到差向异构的产物，其艾杜糖醛酸/葡糖醛酸比例为44/56，这有别于起始物质的0/100的比例，其分子量分布从2,000-10,000，平均分子量为5,000D。采用咔唑法(Bitter和Muir，Anal.Biochem.1971，39，88-92)，通过测量糖醛酸相对标准物质的含量而测得的产率为90％。
实施例3
LMW-epiK5-N-硫酸盐，顺序(i)→(ii)
(i)epiK5-N-硫酸盐的差向异构
将2克按照WO 02/068477实施例l、步骤(i)和(ii)得到的K5-N-硫酸盐溶于120ml 25mM的HEPES缓冲液(pH7，其中含有50mM的CaCl2)，使所得溶液通过填装有树脂的50ml的柱子再循环，其中含有固定的酶，如WO 0l/72848所述。反应在30℃、流速为200ml/h的条件下进行24小时。所得产物在1000D的膜上通过超滤纯化，并使其通过IR 120 H+离子交换柱，用1N NaOH中和洗脱液。用乙醇或丙酮通过沉淀回收样品。得到差向异构的产物，其艾杜糖醛酸/葡糖醛酸比例为55/45，这有别于起始物质的0/100的比例。按照WO 96/14425所述的方法用1H-RMN计算差向异构的比例。采用咔唑法(Bitter和Muir，Anal.Biochem.1971，39，88-92)，通过测量糖醛酸相对标准物质的含量而测得的产率为90％。
(ii)epiK5-N-硫酸盐的解聚
用亚硝酸降解法将1克在步骤(a)得到的产物解聚，然后还原所形成的醛。继续将产物溶于25ml蒸馏水并在其中加入230mg溶于115ml蒸馏水的亚硝酸钠。然后将溶液置于4℃，用0.1N HCl将pH调至2并保持30分钟。反应结束后使溶液回复室温并用0.1M NaOH使其pH变为7。然后在溶液中加入450mg NaBH4并使其反应4小时。产物在4℃用3体积丙酮通过沉淀回收，用过滤漏斗过滤并于40℃在真空容器中干燥。得到900mg LMW-epiK5-N-硫酸盐，用HPLC法测得其分子量分布从1,000-4,000，葡糖醛单元含量为45％，艾杜糖醛单元含量为55％。
实施例4
EpiK5-N，O-过硫酸盐
(a)epiK5-N-硫酸盐的四丁基铵盐
将实施例1步骤(i)最后得到的400mg epiK5-N-硫酸盐溶于40ml水，将此溶液恒温在4℃，使其通过用4℃的水预处理的IR 120+离子交换树脂。所得洗脱液含有100ml pH1.94的溶液，用15％的氢氧化四丁基铵溶液将其中和并在室温下放置1小时，加入15％的氢氧化四丁基铵，将pH保持在7，最后进行冻干。这样得到805mgepiK5-N-硫酸盐的四丁基铵盐。
(b)EPI-K5-胺-O-过硫酸盐
将这样得到的805mg盐溶于30ml二甲基甲酰胺，将溶液置于55℃并用30ml含有2.26克吡啶.SO3加成物的二甲基甲酰胺处理。使反应物在55℃过夜，然后在混合物中加入60ml水。用1N NaOH中和后，产物用3体积用NaCl饱和的丙酮沉淀，并在4℃放置过夜。沉淀在guch G4上通过过滤回收，然后用1000D TFF Millipore系统超滤并减压干燥。得到550mg epi-K5-胺-O-过硫酸盐，其艾杜糖醛酸含量为54％，葡糖胺-6-O-硫酸盐含量为100％，葡糖胺3-O-硫酸盐含量为60％，单硫酸葡糖醛酸含量为10％，单硫酸盐艾杜糖醛酸含量为15％，其余的糖醛单元被二硫酸盐化，其硫酸盐化程度为3.55，这是用Casu等1975的电导测定法测得的。
(c)epiK5-胺-O-过硫酸盐化的N-硫酸盐
将250mg在步骤(b)中得到的epi-K5-胺-O-过硫酸盐溶于15ml水，在此溶液中加入400mg碳酸钠，然后用4小时在所得混合物中一点点加入400mg固态的吡啶.SO3加成物。使反应混合物在55℃过夜，然后用0.1N HCl使pH变为7，以终止反应。在1000D的膜上超滤后加入3体积用氯化钠饱和的丙酮，并以5000rpm离心5分钟回收沉淀。由此得到244mg epiK5-N，O-过硫酸盐，用Casu等1975的电导测定法测定其硫酸盐化程度为4.25。通过1H-RMN谱分析得知，所得epiK5-N，O-过硫酸盐的艾杜糖醛酸含量为54％，6-O-硫酸盐含量为100％，N-硫酸盐含量为100％，葡糖胺3-O-硫酸盐含量为60％，单硫酸盐葡糖醛酸含量为10％，单硫酸盐艾杜糖醛酸含量为15％，其余的糖醛单元被二硫酸盐化。因此从1H-RMN谱计算出其硫酸盐化程度为4.35，其中考虑了该方法的误差余量，这与步骤(b)结束后得到的epiK5-胺-O-过硫酸盐的硫酸盐化程度相符，是100％N-硫酸盐化的。因此可以估计，当硫酸盐基团超过一定比例时，产物的强阴离子特性会导致低估了用电导测定法测得的硫酸盐化程度。

Claims (70)

1.制备epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物的方法，其特征在于，
(a)用三元或四元有机碱处理平均分子量在约1,500和约25,000之间的酸形式的epiK5-N-硫酸盐-衍生物，使反应混合物在pH约7下静置30-60分钟，并用有机碱分离其盐；
(b)在O-过硫酸盐化条件下用O-硫酸盐化试剂处理所述epiK5-N-硫酸盐-衍生物的所述有机碱的盐；
(c)然后用N-硫酸盐化试剂处理epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的三元或四元有机碱的盐，并分离这样所得到的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物以钠盐形式分离，并任选转化成其它化学或药学上可接受的盐。
3.如权利要求1和2任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，氢氧化四丁基铵被用作有机碱。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，O-过硫酸盐化是在二甲基甲酰胺中进行的，每个二糖每个可用OH用2-4摩尔O-硫酸盐化试剂，温度为40-60℃，时间为15-20小时。
5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述epiK5-N-硫酸盐-衍生物被用作平均分子量为约1,000至约25,000的起始物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述起始epiK5-N-硫酸盐-衍生物是40-60％C5-差向异构的。
7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述起始epiK5-N-硫酸盐-衍生物的平均分子量为约1,500至约25,000。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述起始epiK5-N-硫酸盐-衍生物的平均分子量在10,000和25,000之间。
9.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述起始物质的平均分子量为约1,000至约12,000。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述起始物质的平均分子量为约1,500至约8,000。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述epiK5-N-硫酸盐-衍生物被用作由链状混合物构成的起始物质，其中，所述链至少有90％具有式I
其中，糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述起始物质由链状混合物构成，其中，至少90％的所述链具有式I，其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成。
13.如权利要求11和12中任一所述的方法，其特征在于，在上所述式I中，n表示3-100的整数。
14.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述起始物质由链状混合物构成，其中，至少90％的所述链具有式I’
Figure A038195600003C2
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，q是2-20的整数，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述起始物质由链状混合物构成，其中，至少90％的所述链具有式I’，其中，n是3-15的整数。
16.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述起始物质由链状混合物构成，其中，优势种类具有式I’a
Figure A038195600003C3
其中，所述糖醛单元的60-40％由糖醛酸构成，且40％-60％为由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述所述起始物质的平均分子量为约2000至约4000。
18.如权利要求16和17中任一所述的方法，其特征在于，所述起始物质由链状混合物构成，其中，优势种类具有式I’b
其中，X是羟甲基，m是4，5或6，且葡糖醛和艾杜糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始。
19.如权利要求5-18中任一所述的方法，其特征在于，所述起始物质来自基本上不含亲脂性物质的K5的N-脱乙酰化和N-硫酸盐化。
20.一种可用权利要求1-19任一项所述方法获得的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物。
21.一种epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其艾杜糖醛酸含量为20-60％，平均分子量为约2,000至约45,000且硫酸盐化程度至少为4，或其化学或药学上可接受的盐之一，所述衍生物对凝固参数基本无活性。
22.如权利要求21所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其平均分子量在约15,000和约45,000之间。
23.如权利要求21所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其平均分子量在约4,500和约8,500之间。
24.如权利要求21-23中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，所述硫酸盐化程度为4-4.6。
25.如权利要求21-24中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，其葡糖胺单元有100％被6-O-硫酸盐化，并有50-80％被3-O-硫酸盐化，葡糖醛单元有5-10％被O-单硫酸盐化，艾杜糖醛单元有10-15％被3-O-单硫酸盐化，且其余的糖醛单元被2.3-二-O-硫酸盐化。
26.如权利要求21-25中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，R、R’、R″代表氢或SO3 -，在至少40％的所述链状混合物中R是SO3 -，Z是SO3 -基团，n是2-100的整数，硫酸盐化程度至少是4，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
27.如权利要求26所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III，其中，所述糖醛单元的40-60％是艾杜糖醛酸。
28.如权利要求26和27中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III，其中，n是3-100的整数。
29.如权利要求26-28中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，它是由链状混合物构成的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其中，所述链至少90％具有式III’
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，q是2-20的整数，R、R’和R″代表氢或SO3 -基团，Z是SO3 -，其硫酸盐化程度为4-4.6，至少为4，且相应的阳离子是一种化学或药学上可接受的离子。
30.如权利要求29所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III’；其中，q是3-15的整数。
31.如权利要求30所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III’；其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成。
32.如权利要求31所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其艾杜糖醛酸含量是50-55％。
33.如权利要求29-32中任一所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III’，其中，R至少40％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -。
34.如权利要求33所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其平均分子量为约2,000至约16,000。
35.如权利要求34所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其分子量从约4,500至约9,000。
36.如权利要求33-35中任一所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式III’；其中，R有50-80％是SO3 -。
37.如权利要求32-36中任一所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，优势种类具有式III’a
Figure A038195600006C1
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数，Z是SO3 -，R、R’和R″是氢或SO3 -，其硫酸盐化程度为4-4.6，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
38.如权利要求33-37中任一所述的LMW-epiK5-N，O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，优势种类具有式III’b
Figure A038195600006C2
其中，R、R’和R″是氢或SO3 -，Z是SO3 -，X″是OH或OSO3 -，m是4，5或6，其硫酸盐化程度为4-4.6，葡糖醛和艾杜糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始，且相应的阳离子是化学式或药学上可接受的离子。
39.如权利要求20-38中任一项所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，所述化学或药学上可接受的盐或阳离子是碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)四烷基铵、铝和锌的盐或阳离子。
40.如权利要求39所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，所述化学或药学上可接受的盐或阳离子是钠、钙或四丁铵的盐或阳离子。
41.一种epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其化学或药学上可接受的盐之一，按照权利要求1步骤(a)和(b)获得，以钠盐形式分离并任选被转化成其它化学或药学上可接受的盐。
42.一种epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其艾杜糖醛酸含量为总糖醛酸的20-60％，其平均分子量为约2,000至约40,000且硫酸盐化程度至少为3.4，或一种其化学或药学上可接受的盐。
43.如权利要求42所述的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，所述epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式II
Figure A038195600007C1
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，n是2-100的整数，R、R’和R″是氢或SO3 -，其硫酸盐化程度至少是3.4，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
44.如权利要求43所述的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，在式II中，n表示3-100的整数。
45.如权利要求42-44中任一所述的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式II，其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，其平均分子量为约2,000至约40,000，R至少40％是SO3-，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在单硫酸盐葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在单硫酸盐艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -。
46.如权利要求42-45中任一所述的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，它是由链状混合物构成的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐，其中，所述链至少90％具有式II，其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，R至少40％是SO3 -，R’和R″都是SO3 -，或者一个是氢，在葡糖醛酸中其它的5-10％是SO3 -，在艾杜糖醛酸中其它的10-15％是SO3 -，n是3-15的整数，其平均分子量为约4,000至约8,000，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
47.如权利要求42-46中任一所述的epiK5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于，它是由链状混合物构成的LMW-epiK5-胺-O-过硫酸盐，其中，优势种类具有式II’a
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数，R、R’和R″是氢或SO3 -，其硫酸盐化程度至少是3.4。
48.如权利要求47所述的LMW epiK5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，优势种类是式II’b的化合物
Figure A038195600008C1
其中，所述糖醛单元的40-60％由艾杜糖醛酸构成，m是4，5或6，R、R’和R″是氢或SO3 -，X″是OH或OSO3 -，其硫酸盐化程度至少为3.4，所述艾杜糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始。
49.一种实质上不含NH2和N-乙酰基的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其艾杜糖醛酸含量为20-60％，平均分子量为约1,500至约12,000，或是其化学或药学上可接受的盐。
50.如权利要求49所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，所述艾杜糖醛酸含量为40-60％，且平均分子量为约1,500至约10,000。
51.如权利要求49所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，所述艾杜糖醛酸含量为50-55％，且平均分子量为约1,500至约7,500。
52.如权利要求49-51中任一所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，它是用一种方法获得的，其特征在于，以任何顺序对K5-N-硫酸盐进行以下操作：
(i)在至少一种选自钙、镁、钡和锰的二价离子存在下，在pH约7，温度约30℃，时间为12 24小时的条件下，用在溶液或固定在固体支持物上的分离纯化的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行C5-差向异构；和
(ii)进行亚硝酸解聚，任选进行还原。
53.如权利要求52所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，在步骤(ii)中，在解聚后用硼氢化钠进行还原。
54.如权利要求53所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式I’
Figure A038195600008C2
其中，所述糖醛单元的20-60％由艾杜糖醛酸构成，q是2-20的整数，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
55.如权利要求54所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式I’，其中，所述糖醛单元的40-60％是艾杜糖醛酸。
56.如权利要求54和55中任一所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，所述链至少90％具有式I’，其中，n是3-15的整数。
57.如权利要求54和55中任一所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，优势种类具有式I’a
其中，所述糖醛单元60-40％由葡糖醛酸构成，40％-60％由艾杜糖醛酸构成，p是4-8的整数，且相应的阳离子是化学或药学上可接受的。
58.如权利要求55-57中任一所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，其由链状混合物构成，其中，优势种类具有式I’b
Figure A038195600009C2
其中，X是羟甲基，m是4，5或6，相应的阳离子是一种化学或药学上可接受的离子，且所述葡糖醛和艾杜糖醛单元交替出现，以葡糖醛或艾杜糖醛单元开始。
59.如权利要求49-58中任一所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，所述盐或阳离子选自碱金属，碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵、铝和锌。
60.如权利要求59所述的LMW-epiK5-N-硫酸盐，其特征在于，所述盐或阳离子选自钠、钙和四丁铵。
61.一种制备LMW-epiK5-N-硫酸盐的方法，其特征在于，以任何顺序对K5-N-硫酸盐进行下列操作，
(i)在至少一种选自钙、镁、钡和锰的二价离子存在下，在pH约7，温度约30℃，时间为12-24小时的条件下，用在溶液中或固定在固体支持物上的分离纯化的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行C5-差向异构；和
(ii)进行亚硝酸解聚，任选进行还原。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，它按照(i)-(ii)的顺序进行。
63.如权利要求61所述的方法，其特征在于，它按照(ii)-(i)的顺序进行。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，终止解聚后得到的产品是LMW-K5-N-硫酸盐，对其直接进行C5-差向异构。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述LMW-K5-N-硫酸盐的平均分子量大于4,000。
66.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学有效量的如权利要求20-40中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物作为其活性成分之一，与药物赋形剂混合。
67.一种美容组合物，其包含有效量的如权利要求20-40中任一所述的epiK5-N，O-过硫酸盐-衍生物，与美容赋形剂混合。
68.分离纯化的C5-差向异构酶在将K5-N-硫酸盐-衍生物转化成相应的epiK5-N-硫酸盐-衍生物中的应用，其特征在于，重复的四糖单元由被葡糖醛单元以及之后被艾杜糖醛单元分隔的两个葡糖胺单元构成，或由被艾杜糖醛单元以及之后被葡糖醛单元分隔的两个葡糖胺单元构成。
69.如权利要求68所述的应用，其特征在于，所述K5-N-硫酸盐-衍生物的平均分子量大于4,000。
70.如权利要求69所述的应用，其特征在于，所述平均分子量为6,000-7,500。
CN038195607A 2002-06-18 2003-06-17 硫酸盐化程度非常高的k5多糖的差向异构衍生物 Expired - Fee Related CN1675250B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI2002A001345 2002-06-18
IT2002MI001346A ITMI20021346A1 (it) 2002-06-18 2002-06-18 Polisaccaridi a basso peso molecolare e procedimento per la loro preparazione
IT2002MI001345A ITMI20021345A1 (it) 2002-06-18 2002-06-18 Derivati epimerizzati del polissacaride k5 a elevatissimo grado di solfatazione
ITMI2002A001346 2002-06-18
ITMI2002A001854 2002-08-27
ITMI20021854 ITMI20021854A1 (it) 2002-08-27 2002-08-27 Polisaccaride supersolfatato a basso peso molecolare.
PCT/IB2003/002338 WO2003106504A1 (en) 2002-06-18 2003-06-17 Epimerized derivatives of k5 polysaccharide with a very high degree of sulfation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1675250A true CN1675250A (zh) 2005-09-28
CN1675250B CN1675250B (zh) 2012-11-14

Family

ID=29740492

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN038195607A Expired - Fee Related CN1675250B (zh) 2002-06-18 2003-06-17 硫酸盐化程度非常高的k5多糖的差向异构衍生物
CNA038175711A Pending CN1671744A (zh) 2002-06-18 2003-06-17 低分子量过硫酸化多糖
CNA03818933XA Pending CN1675249A (zh) 2002-06-18 2003-06-17 N－酰基－(表)k5－胺－o－硫酸盐衍生物及其产品的制备方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA038175711A Pending CN1671744A (zh) 2002-06-18 2003-06-17 低分子量过硫酸化多糖
CNA03818933XA Pending CN1675249A (zh) 2002-06-18 2003-06-17 N－酰基－(表)k5－胺－o－硫酸盐衍生物及其产品的制备方法

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20050256079A1 (zh)
EP (3) EP1517924A1 (zh)
JP (3) JP2005530877A (zh)
CN (3) CN1675250B (zh)
AT (1) ATE485308T1 (zh)
AU (3) AU2003242881A1 (zh)
BR (3) BR0312182A (zh)
CA (3) CA2489862C (zh)
DE (1) DE60334617D1 (zh)
IL (2) IL165808A0 (zh)
MX (3) MXPA04012714A (zh)
NO (3) NO20050247L (zh)
NZ (3) NZ537216A (zh)
PL (3) PL375087A1 (zh)
WO (3) WO2003106504A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20032498A1 (it) 2003-12-17 2005-06-18 Pasqua Anna Oreste Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e
ITMI20010397A1 (it) * 2001-02-27 2002-08-27 Giorgio Zoppetti Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione
MXPA04012714A (es) * 2002-06-18 2005-08-15 Glycores 2000 Srl Derivados epimerizados del polisacarido k5 con un grado muy alto de sulfatacion.
US20120253029A1 (en) 2002-06-18 2012-10-04 Pasqua Anna Oreste Process for the preparation of highly o-sulfated epimerized derivatives of k5 polysaccharide and intermediates therein
US8513407B2 (en) * 2002-06-18 2013-08-20 Glycores 2000 S.R.L. Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
ITMI20031618A1 (it) * 2003-08-06 2005-02-07 Inalco Spa Derivati polisaccaridici dotati di alta attivita'
FR2871476B1 (fr) * 2004-06-14 2011-04-01 Ifremer Derives depolymerises sulfates d'exopolysaccharides (eps) provenant de bacteries marines mesophiles, leur procede de preparation et leurs utilisations en regeneration tissulaire
FR2871379B1 (fr) * 2004-06-14 2006-09-29 Ifremer Utilisation de derives polysaccharidiques hautement sulfates et de faible masse molaire pour moduler l'angiogenese
US8318973B2 (en) * 2005-10-21 2012-11-27 Bezwada Biomedical, Llc Functionalized sinapic acid and methyl sinapate
AU2021301259A1 (en) * 2020-07-02 2023-02-02 Fondation Sanfilippo Suisse Marine bacterial exopolysaccharide derivatives and uses thereof in the treatment of mucopolysaccharidoses

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1141483B (it) * 1980-04-18 1986-10-01 Crinos Industria Farmaco Resina poliamminica per la separazione selettiva di eparina da altri glucosamminoglicani e procedimento per la sua preparazione
FR2503714B1 (fr) * 1981-04-10 1986-11-21 Choay Sa Procede d'obtention de mucopolysaccharides biologiquement actifs, de purete elevee, par depolymerisation de l'heparine
DE3787996T2 (de) * 1986-05-16 1994-03-03 Italfarmaco Spa Heparine, frei von E.D.T.A., Fraktionen und Fragmente von Heparin, Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
EP0333243A3 (en) * 1988-03-10 1989-09-27 Akzo N.V. Sulphated k5 antigen and sulphated k5 antigen fragments
FR2669932B1 (fr) * 1990-12-03 1994-07-01 Sanofi Sa Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent.
GB2254083A (en) 1991-03-28 1992-09-30 Italfarmaco Spa Anticoagulants from e.coli saccharide
FR2684385B1 (fr) * 1991-11-28 1997-08-01 Sanofi Elf Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
IT1271057B (it) * 1994-11-04 1997-05-26 Inalco Spa Polisaccaridi aventi un elevato contenuto di acido iduronico
US5798356A (en) * 1995-08-07 1998-08-25 Alcon Laboratories, Inc. Angiostatic compounds
IT1282994B1 (it) * 1996-05-10 1998-04-03 Inalco Spa Derivati del polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante
IT1284143B1 (it) * 1996-09-06 1998-05-08 Istituto Scient Di Chimica E B Eparansolfati semi-sintetici ad elevata attivita' antimetastica e ridotto rischio emorragico
GB9620459D0 (en) 1996-10-01 1996-11-20 Mclaughlin Andrew Improvements in or relating to blocked isocyanates and their production
IT1289613B1 (it) * 1997-02-07 1998-10-15 Inalco Spa Polisaccaridi batterici o-solfatati
IT1290814B1 (it) * 1997-03-24 1998-12-11 Istituto Scient Di Chimica E B Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica
US6329351B1 (en) * 1997-08-28 2001-12-11 Istituto Scientifico Di Chimica E Biochimica “G. Ronzoni” Semi-synthetic sulphaminoheparosansulphates having high anti-metastatic activity and reduced haemorrhagic risk
US6388060B1 (en) * 1998-11-06 2002-05-14 Vascular Therapeutics Inc. Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides
US20020062019A1 (en) * 2000-03-30 2002-05-23 Pasqua Oreste Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation
IT1318432B1 (it) * 2000-03-30 2003-08-25 Inalco Spa Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride k5 aventi elevataattivita' anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro
ITMI20032498A1 (it) * 2003-12-17 2005-06-18 Pasqua Anna Oreste Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e
US20050027117A1 (en) * 2000-12-18 2005-02-03 Pasqua Oreste Anticoagulant and antithrombotic LMW-glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide and process for their preparation
ITMI20010397A1 (it) * 2001-02-27 2002-08-27 Giorgio Zoppetti Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione
ITMI20010779A1 (it) * 2001-04-12 2002-10-12 Giorgio Zoppetti Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi
ITMI20011633A1 (it) * 2001-07-27 2003-01-27 San Raffaele Centro Fond Uso di polisaccaridi batterici supersolfatati inibitori dell'hiv
ITMI20012200A1 (it) * 2001-10-22 2003-04-22 Ibsa Inst Biochimique Sa Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti
ITMI20021294A1 (it) * 2002-06-12 2003-12-12 Inalco Spa Polisaccaridi batterici o-solfatati e loro uso
MXPA04012714A (es) * 2002-06-18 2005-08-15 Glycores 2000 Srl Derivados epimerizados del polisacarido k5 con un grado muy alto de sulfatacion.
ITMI20032614A1 (it) * 2003-12-30 2005-06-30 Altergon Sa Nuova composizione comprendente cs

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA04012721A (es) 2005-08-15
BR0312182A (pt) 2005-04-05
EP1513880A1 (en) 2005-03-16
NO20050247L (no) 2005-03-16
JP2005536577A (ja) 2005-12-02
BR0312179A (pt) 2005-04-05
WO2003106504A1 (en) 2003-12-24
WO2003106505A1 (en) 2003-12-24
DE60334617D1 (de) 2010-12-02
MXPA04012805A (es) 2005-08-19
US7838644B2 (en) 2010-11-23
CA2489862A1 (en) 2003-12-24
US20060014718A1 (en) 2006-01-19
MXPA04012714A (es) 2005-08-15
WO2003106505A9 (en) 2004-02-26
JP2005533878A (ja) 2005-11-10
US20050245736A1 (en) 2005-11-03
NZ537215A (en) 2006-11-30
NO20050244L (no) 2005-03-16
AU2003240191A1 (en) 2003-12-31
BR0312197A (pt) 2005-04-05
CA2489866A1 (en) 2003-12-24
AU2003240190B2 (en) 2009-07-09
PL375088A1 (en) 2005-11-14
EP1519961A1 (en) 2005-04-06
AU2003242881A1 (en) 2003-12-31
ATE485308T1 (de) 2010-11-15
US20050256079A1 (en) 2005-11-17
PL373004A1 (en) 2005-08-08
JP5053512B2 (ja) 2012-10-17
CN1675249A (zh) 2005-09-28
EP1513880B1 (en) 2010-10-20
NO20050245L (no) 2005-03-16
NZ537217A (en) 2005-09-30
WO2003106506A1 (en) 2003-12-24
PL375087A1 (en) 2005-11-14
CA2489870A1 (en) 2003-12-24
CN1675250B (zh) 2012-11-14
AU2003240190A1 (en) 2003-12-31
US20110021766A1 (en) 2011-01-27
IL165807A (en) 2011-10-31
IL165807A0 (en) 2006-01-15
EP1517924A1 (en) 2005-03-30
JP2005530877A (ja) 2005-10-13
CA2489862C (en) 2012-03-27
CN1671744A (zh) 2005-09-21
IL165808A0 (en) 2006-01-15
US8193166B2 (en) 2012-06-05
NZ537216A (en) 2005-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1097058C (zh) 血小板生成促进剂
CN1295251C (zh) 由k5多糖衍生具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖及其制备方法
CN1009096B (zh) 一种具有抗血栓形成，溶解纤维蛋白，消炎活性的解聚的硫酸氨基己糖聚糖，其制方法以及有关药品组合物
CN1241932C (zh) 新的低聚糖、其制备方法及其药物组合物
US8193166B2 (en) Epimerized derivatives of K5 polysaccharide with a very high degree of sulfation
CN1466594A (zh) 含有至少一个具有生物素或生物素衍生物共价键的具有抗血栓形成形成活性的多糖
HUE027178T2 (en) Process for producing high purity polysilic acid
CN1067249A (zh) 脒基苯丙氨酸衍生物和其制备方法及用途
CN1044299A (zh) 抗菌素bu-3608的丝氨酸类似物
CN1798771A (zh) 由肝素衍生的多糖混合物、其制备方法以及含有它们的药物组合物
CN1900081A (zh) 水溶性青蒿素衍生物、制法、药物组合物及用途
CN88102932A (zh) 新的嘌呤取代的氧杂环丁烷类化合物
CN1284800C (zh) K5多糖高硫酸化衍生物及其制备方法
CN1261450C (zh) 抗血栓形成化合物
KR20120090948A (ko) Ｋ5 헤파로산 발효 및 정제
CN1040539C (zh) 3-脱氧低聚糖,其制备方法和含有它们的药物组合物
CN1177865C (zh) K5多糖衍生的具有高抗凝和抗血栓形成活性的葡糖胺聚糖及其制备方法
CN1819833A (zh) 促进hgf产生的含肝素类寡糖的药剂
EP0179679B1 (fr) Polysaccharides membranaires utiles notamment comme médicament et procédé pour leur préparation
CN101039963A (zh) 生物素化十六糖，它们的制备方法及其用途
CN1852926A (zh) 由肝素衍生的寡糖混合物、其制备方法与含有所述混合物的药物组合物
US6423320B1 (en) Inhibitor of immunoglobulin E antibody production
JPWO2003070264A1 (ja) マツタケ由来陰イオン交換樹脂吸着画分、免疫増強剤、及びストレス負荷回復促進剤
CN1039422A (zh) 新的s-腺苷基甲硫氨酸脱羧酶抑制剂
JP2005519860A (ja) Ｈｉｖ抑制剤としての過硫酸化多糖の使用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20121114

Termination date: 20150617

EXPY Termination of patent right or utility model