CN1067249A

CN1067249A - 脒基苯丙氨酸衍生物和其制备方法及用途

Info

Publication number: CN1067249A
Application number: CN92103438A
Authority: CN
Inventors: W·思士博; G·迪克奈特; R·考辛思库
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1991-05-11
Filing date: 1992-05-09
Publication date: 1992-12-23
Anticipated expiration: 2007-05-09
Also published as: EP0513543A1; DE59204094D1; CY2121B1; DK0513543T3; KR920021503A; ATE129503T1; NZ242668A; EP0513543B1; DE4115468A1; JPH089634B2; NO921835L; IE68884B1; CA2068263A1; GR3018182T3; CN1039125C; RU2088591C1; US5627283A; MX9202166A; NO921835D0; HK1006717A1

Abstract

本发明叙述了式I的脒基苯丙氨酸衍生物，

Description

本发明涉及脒基苯丙氨酸衍生物、这些化合物的合成、它们的应用以及含有这些化合物的药物制剂。

众所周知，一系列病理生理状态会导致抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）的消耗，抗凝血酶Ⅲ是血浆中最重要的凝血酶抑制剂。ATⅢ的下降会增加血栓形成的危险，如同已知先天性缺乏ATⅢ也会出现的情况。ATⅢ降到正常值的75%以下，会引起血栓并发症。这种并发症在手术后或休克状态时常常以散布性的血管内结块的形式出现。因而在许多情况下出现有生命危险的血块。为了治疗和预防血栓疾患，医学上迄今使用有不同作用方式的抗凝剂。为了急救血栓危险，所用的物质有如ATⅢ、肝素以及最近使用的水蛭素。长期预防用香豆素和二氢茚二酮衍生物。然而提及的这些抗凝剂都部分地具有显著的缺点。例如肝素由于它有多糖结构只能是胃肠道外用药，并且它的作用也取决于有功效的抗凝血酶Ⅲ的水平。香豆素类直接对抗蛋白质生物合成，通过蛋白质的生物合成，使依赖于维生素K的凝结因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ不能被充分地提供，因而降低了栓块生成的可能。所以表现出作用的短暂的延迟。已知的副作用有出血性皮肤坏死，恶心和脱毛发。

与此相反，低分子量的凝血酶抑制剂具有直接以辅因子独立地作用于凝血酶的优点，它直接与酶的活性中心结合，因而几乎完全抑制了酶。这些物质由于其化学结构可口服应用。

以精氨酸和脒基苯丙氨酸为基础的氨基酸衍生物尤为闻名。第一组中所属的化合物如D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-精氨醛和（2R，4R）-4-甲基-1-〔N2-（3-甲基-1，2，3，4-四氢-8-喹啉磺酰）-L-精氨酰〕-2-哌啶羧酸-水合物（“MD805”）。MD805是凝血酶的特异的竞争性抑制剂，已用作治疗药。另一个已知的脒基苯丙氨酸衍生物是β-萘磺酰-甘氨酰-R，S-4-脒基苯丙氨酰哌啶（NAPAP）。在EP0236163和EP0236164中叙述了NAPAP的衍生物。即甘氨酸（NH₂-CH₂-COOH）被另一个结构为（NH₂-CHR1-COOH）的氨基酸所取代，式中R1是低碳烷基，低碳羟烷基，苯基或4-羟苯基。4-脒基苯丙氨酸（Aph）可被甲基化成N-甲基-Aph。此外，还叙述了在NAPAP的芳磺基上、“桥”-甘氨酸上和哌啶环上的各种衍生物，最适宜的是在N-端处有α-或β-萘磺酰基，而杂环芳磺酰基如8-喹啉磺酰基作用效果差一个数量级。这些化合物的另一个缺点，特别是NAPAP结构类型的缺点是其较小的耐受性，不利的药物动力学性质以及部分地有较低的特异性，特别应提及的是有很强的抗胰蛋白酶作用。含有对一脒基苯丙氨酸的物质在口服应用时有不利的实际情况，即对肠和肝中酶的稳定性不好，以致这些物质在肠和肝中迅速被代谢。将NAPAP中的哌啶环用脯氨酸代替，可改善耐受性和适宜的药物动力学。不过，脯氨酸化合物的一个非常显著的缺点是关于它抑制凝血酶作用与NAPAP相比丧失了大约100倍。迄今尚不能通过引入取代基显著地改善化合物对凝血酶和胰蛋白酶的特异性。

本发明的目的是提供以脒基苯丙氨酸为基础的新的化合物，它的抗血栓作用超过已知的化合物，这些化合物有很高的抗酶解性，有改良的耐受性，改良的特异性和良好的药物动力学。

本发明的内容是式Ⅰ的化合物，

式中

R′是连结于α-位或β-位的萘环，环上可任选地被至多含3个碳原子的烷基和/或是含多至3个碳原子的烷氧基取代;或者是连结于α-或β-位的四氢萘环或茚环，环上可任选地含有最多为3个碳的烷基，和/或有多至3个碳原子的烷氧基;或者是苯环，苯环上任选地含有多至4个碳原子的烷基，和/或具有多至3个结构为O-X的基团，O为氧，X为氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基或叔丁基，和/或具有结构为-COOY的基团，Y为氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基，叔丁基，异丁基，异戊基或新戊基;或者是苯并二氢吡喃环系，环上可有多至5个烷基，烷基可最多有3个碳原子;

R1是结构为A-B的基团，A＝-（CH₂）n-，n＝1-4，B为酸功能基，可以是羧酸基，可任选地被酯化或成为酰胺，酯醇最多可含17个碳原子;可以是磺酸基，磷酸基，硼酸基或四唑基;R1或者是结构为A-B-C的基团，A的含义同上，B是羰基或磺酰基，C是由N-连结的α，β，γ或δ氨基酸或经N-糖苷键连结醛糖酸的基团;

R2和R3可相同或相异，为最多是4个碳原子的烷基，或R2与R3共同形成最多为8元环的杂环，环上可以有羟基取代或碳原子数可多至3个的羟烷基取代，羟基可任选地被酯化，酯化的相应羧酸可最多含17个碳原子，＊代表R或S构型的碳原子，以R-构型为优选。

这些新型化合物的特征是，式Ⅰ中的氨基酸R1是酸性氨基酸。酸性氨基酸例如是蛋白质中存在的氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸或者还有磺基丙氨酸，也可以是非天然的氨基酸，如氨基已二酸或3-磷酰基丙氨酸或2-氨基-3-硼酰基丙氨酸。因为这些氨基酸存在有一个不对称取代的碳原子成为手性物质，所以用这些氨基酸制成的新化合物也会有不同的作用，以相应的L-构型氨基酸制成的终产物高活性的为多。

在R1结构中所说的基团A的特征优选为，n为1或2，尤其以1为优选。若基团C是个氨基酸，则优选为α-，β-，γ-，或δ-氨基酸。例如是α-氨基己二酸，α-氨基丁酸，γ-氨基丁酸，4-氨基苯甲酸，2-氨基苯甲酸，ε-氨基己酸，1-氨基环己酸，2-氨基环己酸，3-氨基环己酸，4-氨基环己酸，1-氨基环戊酸，2-氨基-4，5-二甲基吩噁嗪酮（3）-1，8-二羧酸，2-氨基-3-羟基-4-甲基苯甲酸，α-氨基异丁酸，氨基羟基丁酸，β-氨基异丁酸，丙氨酸，β-丙氨酸，去氢丙氨酸，C-烯丙基甘氨酸，蒜氨酸，2-氨基-3-甲基-丁基-1，3-噻唑烷-5-羧酸，6-氨基青霉烷酸，α-氨基-庚二酸，1-氨基环丙酸，天冬酰胺，天冬氨酸，α-氨基辛二酸，氮杂环丁酸，氮杂环丙酸，蓓豆氨酸，C-苄基苯丙氨酸，刀豆氨酸，瓜氨酸，半胱氨酸，胱硫醚，黎豆氨酸，3，4-二羟基苯丙氨酸，4-磺酰苯丙氨酸，2，2-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸，猫尿氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，六氢烟酸，高半胱氨酸，组氨酸，高丝氨酸，δ-羟基赖氨酸，γ-羟基脯氨酸，β-羟基脯氨酸，异亮氨酸，异丝氨酸，异缬氨酸，犬尿氨酸，羊毛硫氨酸，含羞草氨酸，亮氨酸，麦角氨酸，蛋氨酸，含羞草碱，吡咯甲酸，正亮氨酸，正缬氨酸，注氨酸，2-哌啶酸，青霉胺，苯丙氨酸，C-苯基甘氨酸，吡啶甲酸，脯氨酸，去氢脯氨酸，β-苯基丝氨酸，吡啶-2-丙氨酸，5-吡咯烷酮-2-羧酸，3-吡唑丙氨酸，喹喔啉-2-羧酸，玫瑰氨酸，肌氨酸，硒代半胱氨酸，硒代蛋氨酸，丝氨酸，Statin，（1，3-噻唑基（2））-丙氨酸，β-（2-噻唑基）-丙氨酸，苏氨酸，甲状腺原氨酸，甲状腺素，1，3-噻唑烷-2-羧酸，叔亮氨酸，色氨酸，tryptathionin，酪氨酸，缬氨酸。这些氨基酸可以光学活性的D-或L-构型出现。

若C是氨基二羧酸，例如是D-或L-谷氨酸或天冬氨酸，其中一个羧基可衍生化，尤以α-羧基被衍生化为优选。这些衍生物优选为酰胺，例如是氨、甲胺、二甲胺、苄胺、哌啶或吗啉的酰胺。

若基团C是N-糖苷连结的醛糖酸，这类化合物有如下的通式：

X1＝-H，-OH，-CH₃，O-乙酰基

X2＝-H，-OH，-CH₃，O-乙酰基

X3＝-H，-OH，-CH₃，O-乙酰基

这些新化合物意外地是非常强的凝血酶抑制剂。还意外地发现对肠和肝匀浆有稳定性，并且与已知化合物相比，对胰蛋白酶和糜蛋白酶也有决定性的改善。

还意外地发现本发明的化合物的R′基团对作用强度和特异性有决定性影响。当化合物的R′＝β-萘磺酰基，R1＝天冬氨酸时，对凝血酶和胰蛋白酶的抑制作用非常相似，因而特异性较低。若在磺酸基上引入烷基和/或羟烷基和/或羟基和/或羧基时，其中优选的是多至3个碳原子的基团，尤其优选的是甲基和/或甲氧基时，可显著地提高对凝血酶的选择性。这意味着用一个或多个这类基团取代后，得到的物质的性质表明对凝血酶抑制作用提高了，同时对胰蛋白酶的抑制作用减少了。

因此，这类作为凝血酶抑制剂的重要物质，它们的性质可通过这里所述的衍生化模式产生有决定性的影响，得到优良的化合物。

本发明的特别有效的化合物（可由Ki值测出）是结构为R′＝苯基，R1＝-CH₂-CO₂H（即L-天冬氨酸），以及由此得到的化合物，其中R′或者是含有直到4个碳原子的烷基，或者是结构为O-X基团，O-氧，X＝氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基或叔丁基，也可是结构为-COOY的基团，Y＝氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基，叔丁基，异丁基，异戊基或新戊基。

下面的有近似意义但并无限制性实例中，优选的R′为如下的基团：

6，7-二甲氧基萘基（β-Dmn）

5-甲氧基萘基（β-Mns）

2，2，5，7，8-五甲基色酮基（Pmc）

5，6，7，8-四氢萘基（Thn）

5，6，7，8-四甲基萘基（Tmn）

苯基（Phl）

4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基（Mtr）

2，3，4，5，6-五甲基苯基（Pme）

4-甲氧基-2，3，5，6-四甲基苯基（Mte）

4-羟基-2，3，6-三甲基苯基（Htr）

4-羧苯基（Cph）

特别有效的是Mtr基，即由4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰氯得到的有关结构。

适宜的C基团是α-，β-，γ-或δ-氨基酸及其衍生物，以及N-糖苷连结的糖醛酸，例如β-D-氨基葡萄糖醛酸。

本发明化合物还意外地具有改良的耐受性的特征，因而从技术的角度优胜于其它化合物。例如化合物β-萘磺酰-L-Asp-D，L-Aph-Pip的LD₅₀值（大鼠，静脉注射）大约为120mg/kg，而NAPAP的LD₅₀大约为20mg/kg。还证明本发明化合物的R′基上再有一羧基时，耐受性进一步改善。

本发明的具有酸性基团的化合物有改善的耐受性，表现在组胺释放的减少和血压降低作用的减低。

这些化合物除有较强的抗凝血酶效用、特异性和由于对酶有改善的稳定性而有良好的耐受性，例如对胰蛋白酶和糜蛋白酶以及对肝和肠匀浆的稳定性，因而使这些物质成为一类重要的抗血凝药物。

本发明化合物的另一个优点是口服生物利用度，这使这些化合物尤其令人注日。

本发明化合物作为抗栓塞药用于治疗，用于阻止血栓形成或用于诊断。

本发明还提供了这些物质的衍生物，特别是酯化合物。其特征是，在氨基酸R1的羧基被多至17个碳原子脂肪醇酯化。这些酯是由诸如甲、乙、异丙、正丙、正丁、异丁、叔丁、正戊、异戊、新戊、辛、癸、十二、十六或十七碳醇制得的。通过用醇衍生化后，本发明物质的脂溶性改善了，这表现在肠道中有适宜的吸收性。

若于R2或R3基团上有羟基时，可任选地用羧酸酯化，这类羧酸例如有乙酸，琥珀酸，新戊酸，己酸，辛酸，十碳酸，十二碳酸或十六碳酸。

由于脒基的碱性通常以盐的形式存在，本发明的凝血酶抑制剂可以各种盐的形式存在。盐的形式对化合物的溶解度和在治疗应用时的吸收作用有重要影响。盐类可有甲酸盐，乙酸盐，己酸盐，油酸盐或直到含16个碳原子的羧酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，至多有10个碳原子的烷基磺酸盐，二元和三元羧酸盐，如柠檬酸盐或酒石酸盐。

特别优选的是：

式Ⅰ化合物，R′为β-萘基，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，R′为β-6，7-二甲氧基萘基，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，R′为β-四氢萘，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，R′为4-甲氧基-2，3，6-三甲苯基，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，R′为4-羧苯基，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，R′为4-羟基-2，3，6-三甲苯基，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，R′为2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃，R1为-CH₂COOX，X等于氢，R2和R3共同形成哌啶。

式Ⅰ化合物，其特征是，X是一醇基，最多为17个碳原子。

式Ⅰ化合物，R1的结构为-（CH₂）n-SO₃H，n＝1-4。

式Ⅰ化合物，R1的结构为-（CH₂）n-PO（OH）₂，n＝1-4，

式Ⅰ化合物，其特征是，R2和R3共同形成3-羟甲基哌啶。

式Ⅰ化合物，其特征是，羟基被羧酸酯化，羧酸含有最多17个碳原子。

本发明内容也涉及制备式Ⅰ化合物的方法，其特征是，将α-位羧基被保护的酸性氨基酸偶联到对-氰基苯丙氨酸酰胺衍生物的α-氨基上，再除掉N-α-保护基，磺酰氯再偶联到该含氮基团上，氰基再转变成脒基，并且任选地裂解掉在酸性氨基酸上的第三个功能基上存在的保护基。

对于酸性氨基酸的反应，特别是天冬氨酸（Asp）或谷氨酸（Glu）等氨基酸，必须使用保护的氨基酸。因此得用保护基屏盖住N-α-功能基。用作保护基的优选基团是乌拉坦型，如叔丁氧羰基（Boc），苄氧羰基（Z或Cbo），二苯基异丙氧羰基（Bpoc），二甲氧基二甲基苄氧羰基（Ddz）或9-芴甲氧羰基（Fmoc）。要特别重视侧链上羧基的保护。为此引入的酯基最好根据需要在合成后能裂解掉。在合成后若欲裂解掉侧链基团的保护基，最好是引入叔丁酯。作为N-α-保护基可提及例如碱性可裂解的Fmoc基或对酸特别敏感的Bpoc或Ddz基，最终化合物中酸性氨基功能基的侧链若仍应酯化时，优选的是用所要求的醇将相应的N-α-Z保护的氨基酸酯化成α-叔丁酯。用氢解法除去Z基，用相应的磺酰氯与氨基酸衍生物反应，酸性裂解掉叔丁酯，并将分离出的产物偶联到氰基苯丙氨酸衍生物的氨基上。磺酸胺键合通常用标准方法进行，是把相应的磺酰氯连结到酸性氨基酸的氨基上，制备的化合物的R′含有酚基时，要进行相应的酚醚保护，特别优选的是叔丁醚，与磺酰氯反应制成磺酰胺键后用酸性法裂解，得到所需的终成化合物。

游离的酚基也可用其它已知的方法制备。例如用脱甲基试剂，特别优选的是在有机溶剂中的三溴化硼，优选的溶剂可提及二氯甲烷。

第二个可能性是首先把酸性氨基酸制成磺酰胺键，然后与对一氰基苯丙氨酸衍生物缩合。为了制备芳基磺酰氨基酸-叔丁酯或杂芳环基磺酰氨基酸-叔丁酯，在二甲基甲酰胺中有碱存在下，例如在N-甲基吗啉或二异丙基乙胺存在下，将相应的磺酰氯与氨基酸-叔丁酯-α-甲基酯反应。甲基酯用苛性碱皂化，并经碳二亚胺反应连接到Aph-或氰基苯丙氨酸衍生物上。具有磺酸基（B＝SO₃H）的本发明化合物，优选为具有半胱氨酸磺酸，可用N-α-保护的半胱氨酸磺酸制备，此时氨基酸的氮连接Boc基，并将该化合物接到氰基苯丙氨酸酰哌啶上。裂解掉保护基后，再与所需的磺酰氯进行反应。具有游离巯基的相应的半胱氨酸化合物也可适宜地制取，然后与氧化剂例如过甲酸反应，变成磺酸。为此，优选使用BocCys（SStBu）或Boc-Cys（Trt）。裂解掉硫保护基后进行氧化反应。

具有基团C为α-，β-，γ-或δ-氨基酸的本发明化合物可按已知的方法制备。优选的N-保护酸性氨基酸（例如天冬氨酸），作为保护基的最好是引入最后的磺酰胺结构，与羧基保护的氨基酸偶连、因而α-羧基要加以保护，优选为甲酯。偶联反应最好用碳二亚胺型缩合剂进行，优选为二环己基碳二亚胺。羟基苯并三唑可加到反应中，溶剂优选用二甲基甲酰胺。

分离出的物质是甲酯时经皂化使α-位羧基游离出。

然后这些前体按已述的方法在氰基苯丙氨酸的氨基发生偶联反应，并进入下一步反应，即制备脒基。

为了制备本发明的化合物中基团C是N-糖苷连接的醛糖酸，首先将N-α和C-α保护的酸性氨基酸与相应的经保护的碳水化合物部分相连。该制备按文献已知的方法进行，例如A.Klemer等;J.Carbohydrate Chemistry，7（4），785-797（1988）或T.Takeda等;Carbohydrate Research，207，71-79（1990），或R.Walczyna等;Car-bohydrate Research，180，147-151（1988），或L.Urge等;Tetrahydron Letters，32（9）3445-3448（1991）。裂解掉氨基酸的氮保护基后，磺酰氯如上述方法进行连接，并将C-α羧基的保护基裂解掉。然后C-端的氨基发生偶连，C端优选用脒基苯丙酰胺，尤以D-4-脒基苯丙氨酸-哌啶酰胺为优选。醛糖酸去保护后，用常规方法将物质进行纯化，如用凝胶渗透色谱或离子交换色谱法。

为了制备脒基，将氰基苯丙氨酸化合物溶解于吡啶和三乙胺中用硫化氢饱和。2-3天后该溶液与盐酸水溶液搅拌，分离出沉淀。用甲基化试剂（优选为碘甲烷）甲基化后，并与铵盐（优选为乙酸铵）在醇（优选为甲酸铵）中反应，可得到含有脒基的肽衍生物。用三氟乙酸或Hcl在乙酸中进行酸解处理后，得到所希望的终产物。然后在^RSephadex LH-20上于甲醇中进行凝胶渗透色谱，得到纯净物。目的化合物用核磁和质谱加以确证，用HPLC和薄层层析法检查纯度。为转变成所希望的盐，优选用离子交换色谱法。为此将相应的化合物结合于羧甲基化的离子交换树脂（例如CM-^RFractogel）上，用所希望的酸洗脱，最终产物经低压升华干燥法得到结晶，其它的希望得到的盐可由乙酸盐得到。

为评价本发明抑制剂的活性，可按不同的标准进行试验，优选的方法是测定Ki值，IC₅₀值和在体内和离体的部位促凝血酶原激酶时间（PTT）。特异性试验用对各种丝氨酸蛋白酶的IC₅₀值加以确定，特别是对凝血酶和胰蛋白酶的IC₅₀。本发明化合物的稳定性的测定法是，将待试物与纯酶（优选为胰蛋白酶，糜蛋白酶或木瓜蛋白酶）或与肝或肠匀浆保温，在一定的时间间隔由溶液中采样，最好用HPLC测定。试验表明本发明权利要求的化合物从技术的立场看是稳定的，分解较慢。至于权利要求的化合物作为具有显著的抗血栓能力的特异和强效的凝血酶抑制剂，超过了迄今已知的低分子抑制剂，并且部分地具有可经胃肠给药的特点，如同化合物Mtr-L-Asp-D-Aph-Pip所示的那样。

本发明的内容还涉及含有式Ⅰ化合物的诊断药或治疗药。

此外，本发明的内容还涉及式Ⅰ化合物应用于制备具有抗血栓作用的诊断药或治疗药的方法。

缩写字：

Aph 脒基苯丙氨酸

NAPAP β-萘磺酰-甘氨酰-D，L-P-脒基苯丙氨酰-哌啶

Asp 天冬氨酸

Asn 天冬酰胺

Glu 谷氨酸

Cys（SO₃H）半胱氨酸磺酸

β-Dmn 6，7-二甲氧基萘基

β-Mns 5-甲氧基萘基

Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃

Thn 5，6，7，8-四氢萘

Tmn 5，6，7，8-四甲基萘基

Phl 苯基

Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基

Tos 4-甲基苯基

Pme 2，3，4，5，6-五甲基苯基

Mte 4-甲氧基-2，3，5，6-四甲基苯基

Htr 4-羟基-2，3，6-三甲基苯基

Cph 4-羧苯基

Z（Cbo）苄氧羰基

Boc 叔丁氧羰基

Bpoc 二苯基异丙氧羰基

Ddz 二甲氧基二甲基苄氧羰基

Fmoc 芴甲氧羰基

Pip 哌啶

OtBu 叔丁基酯

OMe 甲酯

OEt 乙酯

OiBu 异丁酯（仲丁酯）

OiPr 异丙酯

OnPe 新戊酯

DC 薄层色谱

DcCI 二环己基碳二亚胺

DMF 二甲基甲酰胺

FAB-MS 快原子轰击质谱

DIPEA 二异丙基乙胺

HOBt 羟基苯并三唑

以下的实施例对本发明作进一步说明

β-萘磺酰基-L-天冬氨酸-D-p-脒基苯丙氨酰哌啶

1.Boc-D-P-氰基苯丙氨酰哌啶

50g（255mmol）对-氰基溴苄，55g（255mmol）乙酰氨基丙二酸二乙酯与2g碘化钾在250ml无水二噁烷中加热沸腾;然后在3小时内将新鲜制备的6g（260mmol）钠与乙醇的溶液滴到上述溶液中。再加热回流3小时，冷却到80℃，于3小时内加入170ml 3N氢氧化钠溶液，于95℃加热4小时。冷却后用6N Hcl调整PH＝1，蒸除二噁烷，滤集析出的沉淀。加入氢氧化钠使PH＝9，用2倍量乙酸乙酯萃取，水相再用盐酸调整PH＝1，结晶出N-乙酰氰基苯丙氨酸，滤集结晶，水洗数次，高真空干燥。收得量47g（79.2%），

纯度试验：TLC Rf＝0.5（氯仿50/甲醇10/冰乙酸2.5∥体积比。

24g产物溶解3N苛性钠于3升水中，调整PH＝6-6.5，向其中加入500mg酰基转移酶，于37℃保温4天。溶液经超滤除去酰基转移酶，然后将滤液体积浓缩成1升。调整PH＝1后用乙酸乙酯萃取多次，有机相用少量浓食盐溶液洗涤，硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得到8.2gN-乙酰基-D-氰基苯丙氨酸（68%）。将22ml冰乙酸和4.3ml浓盐酸与40ml水加到8g上述化合物中，加热煮沸24小时。水解溶液经蒸发，并用甲醇蒸带残留的酸后，用甲醇-乙醚沉出，收得量6.6g（85%）。

5gD-氰代苯丙氨酸盐酸盐于14ml水中，加入7.5ml二异丙基乙胺使溶解。向其中加入6g叔丁氧羰基氧化亚胺基-2-苯乙腈于17ml二噁烷的溶液，搅拌过夜。加入40ml水和50ml乙酸乙酯。分出水相，有机相用1M碳酸氢钾萃取数次。合并水相，用10ml乙醚洗涤数次，然后用盐酸调整至PH＝3。用乙酸乙酯萃取3次，氯化钠溶液洗涤，有机相用硫酸钠干燥，蒸除溶剂后得5.6g（78%）Boc-D-氰基苯丙氨酸。3.26g（10mmol）Boc-D-氰基苯丙氨酸，1.49g（11mmol）HOBt和2.42g（12mmol）DCCI溶解于50ml DMF中，搅拌1小时。加入1ml哌啶，搅拌过夜。滤除析出的二环己基脲，蒸除DMF，剩余物溶于乙酸乙酯，用碳酸氢钾、1M硫酸氢钾和饱和食盐水溶液各洗涤3次。硫酸钠干燥后，蒸除溶剂，得到3.16g（80%）Boc-D-氰基苯丙氨酰哌啶，

纯度控制：TLC Rf＝0.27（氯仿）

2.D-氰基苯丙氨酰哌啶盐酸盐

3gBoc保护的化合物溶解于50ml 1.2NHcl的冰水乙酸溶液，室温下搅拌30分钟。真空蒸除裂解剂，用甲苯蒸带，剩余物用少量乙醚研磨，滤集结晶，真空干燥，收得量2.2g（90%）。

3.Ddz-Asp（tBu）-D-氰基苯丙氨酰哌啶

2.88g（7mmol）Ddz-Asp（tBu），1.04gHOBt，1.73gDCCI和2.06g（7mmol）氰代苯丙氨酰哌啶盐酸盐溶解于50mlDMF中，加入2.4ml（14mmol）二异丙基乙胺后，室温下于暗处搅拌1天，真空蒸除溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯中，用1M硫酸氢钾溶液洗涤3次，碳酸氢钾溶液洗涤3次和浓食盐溶液洗涤2次。有机相经硫酸钠干燥后，蒸除溶剂，剩余物用二异丙醚研磨。滤集结晶并干燥，得到3.86g（85%）Ddz-Asp（tBu）-D-氰代-苯丙氨酰哌啶。

4.β-萘磺酰基-Asp-（t-Bu）-D-氰代苯丙氨酰哌啶

3.25g（5mmol）Ddz-Asp（tBu）-D-氰代苯丙氨酰哌啶溶解于200ml 5%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌30分钟。反应液倾入到2M碳酸氢钠水溶液中，有机层用2M碳酸氢钠溶液洗涤2次，浓食盐溶液洗涤1次。硫酸钠干燥后，蒸除溶剂，油状剩余物用二异丙醚萃取3次。加入1.71ml（10mmol）DIPEA的二氯甲烷溶液，使油状物溶解，搅拌下向其中加入1.13g（5mmol）β-萘磺酰氯。室温下搅拌反应物过夜夜然后将有机相分别用NaHCO₃溶液，硫酸氢钾溶液和氯化钠溶液各洗涤3次，硫酸钠干燥有机相，蒸除溶剂，得到的物质不需纯化用于下一步反应。

5.β-萘磺酰-AsP（tBu）-D-脒基-苯丙氨酰哌啶

4中得到的化合物溶解于30ml干燥吡啶，加入1ml三乙胺后通入硫化氢气3小时。室温放置3天后，倾入到由100g冰和50ml浓盐酸的混合物中。吸滤析出的沉淀，水洗。硫代酰胺经干燥后溶解于50ml丙酮中，与1.5ml碘甲烷混合。加热回流30分钟。冷却后用乙醚沉淀。沉淀溶解于二氯甲烷中，用水洗2次。有机相经硫酸钠干燥，蒸除溶剂，剩余物溶解于30ml干燥甲醇中，加入200mg乙酸铵。于60℃加热3小时，真空蒸除溶剂。产物于Sephadex LH-20层析纯化，用甲醇洗脱，收得量630mg。

纯度控制：TLC Rf＝0.55（氯仿50/甲醇10/冰乙酸2.5∥体积）。

FAB-MS：M+H 636

6.β-萘磺酰-Asp-D-脒基-苯丙氨酰哌啶

5中分离得到的化合物500mg溶解于5ml 1.2N Hcl于冰乙酸的溶液中，室温搅拌1小时。蒸除溶剂后，剩余物用乙醚研磨。滤集固体，产品在五氧化二磷上高真空干燥。粗品溶解于水中，结合在CM-分步凝胶离子交换树脂上。用5%乙酸洗脱，冷冻干燥后得到290mg乙酸盐。经¹³C-NMR谱证明了其正确的结构。

MAB-MS：M+H 580

6，7-二甲氧基-β-萘磺酰-L-Asp-D-p-脒基苯丙氨酰哌啶

制备方法类似于上述实施例，只是用6，7-二甲氧基-β-萘磺酰氯代替了β-萘磺酰氯。

MAB-MS：M+H 640

5，6，7，8-四氢-β-萘磺酰-L-Asp-D-p-脒基苯丙氨酰哌啶

用5，6，7，8-四氢-β-萘磺酰氯和上述的方法，制备5，6，7，8-四氢-β-萘磺酰-L-Asp-D-p-脒基苯丙氨酰哌啶。

FAB-MS：M+H 584

4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-Asp-D-P-脒基苯丙氨酰哌啶

用4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰氯和上述的方法，制备4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-Asp-D-p-脒基苯丙氨酰哌啶。

FAB-MS：M+H 602

4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-Cys（SO₃H）-D-P-脒基苯丙氨酰哌啶

用4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰氯和上述的方法，制备4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-Cys

（SO₃H）-D-p-脒基苯丙氨酰哌啶

FAB-MS：M+H 638

4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-门冬氨酰-N-〔β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸〕-D-P-脒基苯丙氨酰哌啶（Mtr-L-Asp（β-D-氨基葡糖醛酸）_D_Aph-Pip）

1.（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖胺）醛糖酸甲酯

2g（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖叠氮）-醛糖酸甲酯溶解于200ml乙酸乙酯/甲醇（2∶1，v/v）中，加入2g钯-碳，用三乙胺调整至PH＝7.5，氢气处理1小时。过滤反应混合物，蒸除溶剂，收得量1.9g

纯度控制：TLC Rf＝0.35（二氯甲烷∶丙酮/2∶1）

2.2-N-（Z）-4-N〔（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸甲酯〕-L-天冬酰氨-叔丁酰酯

1.26g Z-天冬氨酸-α-叔丁酯，0.9g HOBt和1.4g二环己基碳二亚胺溶解于100ml THF中，于0℃下与1.4g第1步的产物混合。室温搅拌过夜，真空蒸除溶剂。剩余物溶于氯仿，水洗，硫酸钠干燥，蒸除溶剂。剩余物用硅胶纯化，氯仿/丙酮（6∶1/v∶v）洗脱。收得量1.7g

纯度控制：TLC R_f＝0.72（氯仿∶丙酮/6∶1）

3.4-N-〔（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸甲酯〕-L-天冬酰胺叔丁酯

0.9g第二步制得的化合物溶解于20ml甲醇，与少量钯-碳混合，氢化5小时，滤除催化剂，蒸除溶剂，剩余物（0.75g）不需进一步纯化可进入下一步反应。

4.2-N-（4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基）-4-N-〔（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基）-醛糖酸甲酯〕-L-天冬酰胺-叔丁酯

1.73g上述物质，1.2ml二异丙基乙胺和0.8g Mtr-氯化物溶解于80ml DMF中，室温搅拌过夜，真空蒸除溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯，水洗三次，硫酸钠干燥有机相后，真空蒸除溶剂。再用硅胶柱层析纯化，二氯甲烷-丙酮（3∶1/v/v）洗脱。收得量1.57g。

纯度控制：TLC Rf＝0.87（二氯甲烷∶甲醇/10∶1）

5.2-N-（4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基）-4-N-〔（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸甲酯〕-L-天冬酰胺

2.2g第4步的物质溶于50ml三氟乙酸/二氯甲烷（1∶1/v∶v）的混合液中，室温搅1小时。真空蒸发酸混合物，再用甲苯真空蒸带存在的痕量酸，得到的产物不需进一步纯化可用于下一步反应。收得量1.2g。

纯度控制：TLC Rf＝0.7（氯仿∶甲醇/3∶1）

6.2-N-（4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基）-4-N-〔（2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸甲酯〕-L-天冬氨酰-D-4-脒基苯丙氨酰哌啶

1.0g上述物质、0.23g HOBt和0.37g DCCI溶于50ml DMF中，于4℃下搅拌30分钟，然后加入0.4g D-4-脒基苯丙氨酰哌啶和0.5g N-甲基吗啉。反应物室温下搅拌过夜。过滤后真空蒸除溶剂。粗品用硅胶层析，氯仿/甲醇5∶1洗脱，收得量1.2g。

纯度控制：TLC Rf＝0.7（氯仿∶甲醇/3∶1）

7.2-N-（4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基）-4-N-〔（β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸甲酯〕-L-天冬氨酰-D-4-脒基苯丙氨酰哌啶

1.1g上一步物质溶于50ml甲醇，用1N氢氧化钠调整至PH＝9.2小时后于PH＝8.5-9下用甲醇性Hcl中和，真空蒸除溶剂。剩余物于甲醇中用^RSephadex LH-20层析纯化。收得量0.9g。

纯度控制：TLC Rf＝0.34（氯仿∶甲醇∶水/40∶20∶1）。

8.2-N-（4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基）-4-N-（β-D-吡喃葡萄糖基）醛糖酸-L-天冬氨酰-D-脒基苯丙氨酰哌啶

0.9g上一步物质溶于100ml氯仿∶甲醇∶水（40∶20∶1/v∶v∶v），与0.2g氢氧化钡混合，混合物于室温下搅拌3小时，用甲醇性Hcl调整至PH＝3.5，蒸除溶剂。剩余物于甲醇中用Sephades^RLH-20层析纯化。收得量0.72g。

纯度控制：TLC Rf＝0.32（氯仿∶甲醇∶水/8∶6∶1）

FAB-MS：777

4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-天冬氨酸-（γ-氨基丁酸）-D-Aph-哌啶

1.4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-天冬氨酸-（γ-氨基丁酸叔丁酯）-D-氰代苯丙氨酰哌啶

1gMtr-Asp-D-氰代苯丙氨酰哌啶溶于30ml DMF，再与0.39ml二异丙基乙胺、0.39gHOBt，0.42gγ-氨基丁酸叔丁酯和0.66g二环己基碳二亚胺混合。先于冰浴中搅拌1小时，再于室温下搅拌过夜。滤除析出的二环己基脲，真空蒸发溶剂。油状剩余物溶于乙酸乙酯，分别用水、1M碳酸氢钾溶液，1M硫酸氢钾溶液和饱和氯化钠溶液各洗涤2次。硫酸钠干燥后蒸除溶剂，收得量：1.1g。

纯度控制：TLC Rf＝0.89（氯仿∶甲醇/9∶1）

2.4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-天冬氨酸-（γ-氨基丁酸叔丁酯）-D-Aph-哌啶

按照实施例1的第5步方法将氰基转变成脒基，收得量：500mg。

纯度控制：TLC Rf＝0.4（氯仿∶甲醇∶乙酸/50∶10∶2.5）

3.4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-天冬氨酸-（γ-氨基丁酸）_D-Aph-哌啶

400mg上制的物质溶解于15ml 1.2NHcl/乙酸中，室温下搅拌90分钟。蒸除酸混合液，两次用甲苯混合并蒸掉甲苯。粗产物溶解于3ml甲醇中，滴入到50ml乙醚中使之结晶。收集沉淀，真空干燥，收得量：320mg。

纯度控制：TLC Rf＝0.25（氯仿∶甲醇∶乙酸/50∶10∶2.5）。

FAB-MS：686

在步骤1用酰基转移酶进行消旋物拆分，将相应的消旋的D，L-氰代苯丙氨酰哌啶转变成本发明的化合物，它也是非常强效的凝血酶抑制剂。

表1 本发明化合物总表

β-萘磺酰基-L-Glu-D-Aph-Pip

-L-Asp-D-Aph-Pip

-D-Asp-D，L-Aph-Pip

-L-Asp-D，L-Aph-Pip

-L-Asp-D，L-Aph-3-羟甲基哌啶

-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

-L-Asp（OMe）-D-Aph-Pip

-L-Asp（OEt）-D-Aph-Pip

-L-Asp（OiBu）-D-Aph-Pip

Mtr-D-Asp-D，L-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（OMe）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（OEt）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（OiBu）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（OiPr）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp-D-Aph-Pip

Mte-L-Asp-D-Aph-Pip

Mte-L-Asp（OiBu）-D，L-Aph-Pip

Htr-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

Htr-L-Asp-D-Aph-Pip

Mtr-L-Glu-D，L-Aph-Pip

Mtr-L-Asn-D-Aph-Pip

Mtr-D-Asn-D，L-Aph-Pip

Thn-L-Asn-D-Aph-Pip

Pme-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

Pme-L-Asp-D-Aph-Pip

Pme-L-Asp（OtBu）-D，L-Aph-Pip

Phl-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

Phl-L-Asp-D-Aph-Pip

B-Dmn-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

表1（续）

B-Dmn-L-Asp-D-Aph-Pip

Tos-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

Tos-L-Asp-D-Aph-Pip

Pmc-L-Asp（OtBu）-D-Aph-Pip

Pmc-L-Asp-D-Aph-Pip

B-Mns-L-Asp（OnPe）-D-Aph-Pip

B-Mns-L-Asp-D-Aph-Pip

Cph-L-Asp（OtBu）-D，L-Aph-Pip

Cph-L-Asp-D，L-Aph-Pip

Phl-L-Cys（SO₃H）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Cys（SO₃H）-D，L-Aph-Pip

Mtr-L-Cys（SO₃H）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（r-氨基丁酸）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（L-苏氨酸）-D-Aph-Pip

Mtr-L-Asp（L-苯丙氨酸）-Aph-Pip

Mtr-L-Asn[（B-D-吡喃葡萄糖基）-醛糖酸〕-D-Aph-Pip

＊脒基盐未列出。

对凝血酶抑制常数的测定

物质的抑制常数（Ki）用酶学的已知动力学方法测定。所用的人凝血酶借助“活性部位滴定”法测定纯度为87%。Ki-测定是由缓冲液（50mM Tris-Hcl，75mMNaCl pH 7.8，37℃），100pM凝血酶，0.1mM底物S2238（Kabi）和抑制剂所构成，抑制剂的浓度范围在0-0.2μM之间。抑制剂与酶预保温10分钟，加入生色的底物S2238使反应开始。为估计动力学，采用“紧密结合”的数学算法，借助非线性回归求出Ki值（表Ⅱ）和抑制类型。所有抑制剂的抑制类型证明是大于90%的竞争性抑制。

抑制剂特异性的测定

抑制剂的特异性用对凝血酶和胰蛋白酶来测定。特异性是用对胰蛋白酶和凝血酶的Ki值比值来定义（表Ⅱ）。对酶活性产生50%抑制时的抑制剂浓度定为IC₅₀（100%相当于无抑制的酶反应）。对胰蛋白酶的IC₅₀值用如下方法算出：由牛胰脏制成的胰蛋白酶与提高浓度的抑制剂于25mM Tris-Hcl，10mM Cacl₂，pH＝7.8下37℃预保温10分钟。加入底物Chromozym TRY（7.1×10^-5M）使酶反应开始。1小时后在405nm处测定释放出的pNA。用同样的方法测定对凝血酶的IC₅₀，只是用人的凝血酶，缓冲液为50mM Tris-Hcl，50mMNacl，PH＝7.8，和5×10^-5M的底物S2238。由凝血酶和胰蛋白酶的IC₅₀可以计算Ki值（Ki＝IC₅₀/S+Km）。胰蛋白酶与凝血酶的Ki比值就是特异性，结果列于表Ⅱ。

表 2 选择的一些化合物的作用

化合物	特异性凝血酶/胰蛋白酶	凝血酶抑制作用K I（纳摩尔/升）
			1.Napap2.Nas-Asp-D-Aph-pip3.Dmn-Asp-D-Aph-pip4.Mtr-Asp-D-Aph-pip5.Mtr-Asp(tBu)-Aph-pip6.Mtr-Asp(iPr)-Aph-pip7.Nas-Asn-Aph-pip8.Mtr-Asn［(β-吡喃葡萄糖基）醛糖酸］D-Aph-pip9.Mtr-L-Cys(so₃H)-D-Aph-pip10.Mtr-l-Asp(r-氨基丁酸）D-Aph-pip	2472301252973784841061501810	111061.50.90.660.0850.60.8

Claims

1、制备式Ⅰ化合物的方法

其中

R′是连接于α-位或β-位的萘环，环上可任选地被多至3个碳原子的烷基和/或含多至3个碳原子的烷氧基取代；或者是连接于α-或β-位的四氢萘环或茚环，环上可任选地含有多至3个碳原子的烷基，和/或有多至3个碳原子的烷氧基；或者是苯环，环上任选地含有多至4个碳原子的烷基，和/或具有多至三个结构为O-X的基团，O为氧，X为氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基或叔丁基，和/或具有结构为-COOY的基团，Y为氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基，叔丁基，异丁基，异戊基或新戊基；或者是苯并二氢吡喃环，环上可有多至5个烷基，每个烷基最多可有3个碳原子；

R1是结构为A-B的基团，A=-(CH₂)n-，n=1-4，B为酸基，可以是羧酸基，可任选地被酯化或成为酰胺，酯醇最多可含17个碳原子；可以是磺酸基，磷酸基，硼酸基或四唑基；R1或者是结构为A-B-C的基团，A的含义同上，B是羰基或磺酰基，C是N-连接的α，β，γ或δ-氨基酸或经N-糖苷键连接的醛糖酸基团；

R2和R3可相同或不同，为多至4个碳原子的烷基，或R2与R3共同形成多至8元环的杂环，环上可以有羟基取代或碳原子数可多至3个的羟烷基取代，羟基可任选地被酯化，相应的羧酸可含多至17个碳原子，＊代表R或S构型的碳原子，以R构型为优选，

该制备方法的特征是，被保护的酸性氨基酸经α-位的羧基连接到对一氰代苯丙氨酸衍生物的α-氨基上，除去-α-保护基，磺酰氯连接到含氮基团上，氰基转变成脒基，并可任选地在酸性氨基酸上第三个功能基存在的保护基裂解掉。

2、权利要求1的一种方法，其特征是，制备＊为R构型的碳原子的化合物。

3、权利要求1的一种方法，其特征是，制备R′为β-萘基，R1为X是氢的-CH₂COOX基，R2与R3共同形成哌啶的化合物。

4、权利要求1的方法，其特征是，制备R′为β-6，7-二甲氧基萘基，R1为-CH₂COOX（X＝H）、R2和R3共同形成哌啶的化合物。

5、权利要求1的方法，其特征是，制备R′为β-四氢萘，R1为-CH₂COOX（X＝H）、R2和R3共同形成哌啶的化合物。

6、权利要求1的方法，其特征是，制备R′为4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基，R1为-CH₂COOX（X＝H）、R2和R3共同形成哌啶的化合物。

7、权利要求1的方法，其特征是，制备R′为4-羧苯基，R1为-CH₂COOX（X＝H），R2和R3共同形成哌啶的化合物。

8、权利要求1的方法，其特征是，制备R′为4-羟基-2，3，6-三甲苯基，R1为-CH₂COOX（X＝H），R2和R3共同形成哌啶环的化合物。

9、权利要求1的方法，其特征是，制备R′为2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃，R1为-CH₂COOX（X＝H）和R2与R3共同形成哌啶的化合物。

10、权利要求1-8之一的方法，其特征是，制备X为醇基、醇基可多至17个碳的化合物。

11、权利要求1-8之一的方法，其特征是，制备R1为-（CH₂）n-SO₃H（n＝1-4）的化合物。

12、权利要求1-8之一的方法，其特征是，制备R1为-（CH₂）n-PO（OH）₂（n＝1-4）的化合物。

13、权利要求1-10之一的方法，其特征是，制备R2和R3共同形成3-羟甲基哌啶的化合物。

14、权利要求13的方法，其特征是，制备羟基被羧酸酯化的化合物，羧酸可含多至17个碳原子。