KR0178575B1 - 항바이러스 활성을 갖는 펩티드 모방체 화합물 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제 억제제 화합물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 하기 일반식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 HIV 프로테아제를 억제함으로써 HIV 감염으로 발생하는 후천성 면역 결핍증의 치료 및 예방에 사용할 수 있다:

Description

항바이러스 활성을 갖는 펩티드 모방체 화합물 및 이를 포함하는 조성물

본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 펩티드 모방체 화합물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 2-이속사졸린 또는-히드록시 케토메틸렌 디펩티드 등입체성계를 이용한 펩티드 모방체로서, 특히 HIV 프로테아제를 억제함으로써 HIV 감염으로 발생하는 후천성 면역 결핍증(AIDS, 이하 에이즈로 약칭한다)의 치료 및 예방에 사용할 수 있는 화합물에 관한 것이다.

프로테아제는 특정의 펩티드 결합부위에서 단백질을 분해하는 효소이다. 생물체에서 특정한 프로테아제와 그의 상보적인 프로테아제 억제제는 광범위한 생물학적 기능을 중재 또는 조절한다. 예를 들어, 프로테아제는 폴리펩티드의 번역후과정에서 전구체를 분해하여 활성 단백질을 형성하고, 혈액응고 및 면역시스템의 보체반응과 같은 자이모겐 활성화 반응을 제공하고, 생물체 막을 통한 특정 단백질의 수송을 중개한다. 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 프로테아제는 많은 바이러스의 복제에 결정적인 역할을 한다. 바이러스 프로테아제가 감염된 세포에서 생산된 큰 전구체 폴리펩티드를 보다 작은 단백질 성분 또는 서브유니트로 분해하면 다시 이들이 모여 기능적 바이러스 구조를 형성하게 된다.

HIV는 에이즈 및 에이즈 증후군을 일으키는 레트로바이러스(retrovirus)이다. 레트로바이러스는 유전정보물질로 RNA를 갖는데, 숙주에 감염된 후 역전사효소(reverse transcriptase)에 의해 바이러스 RNA로부터 이중 나선의 DNA를 만들게 된다. 이렇게 만들어진 이중나선의 DNA는 인테그라제(integrase)에 의해 숙주의 염색체에 접목되어, 감염된 새로운 바이러스 RNA 뿐 아니라, 숙주의 효소적 기작을 이용하여 바이러스의 단백질도 만들 수 있다. 생성된 다단백질(polyprotein)은 새로운 바이러스를 형성하기 위하여 변형되어야 하는데, 이러한 변형에 관여하는 효소중에서 가장 중요한 것의 하나가 프로테아제(protease)이다.

레트로바이러스의 프로테아제 중에서는 HIV 프로테아제가 가장 집중적인 연구의 대상이 되어 왔다. HIV는 껍질 단백질 및 필요한 효소를 만들 때 이들을 mRNA로부터 각각 합성해 내는 것이 아니라, 일단 껍질 단백질과 효소 등이 다 함께 결합되어 있는 긴 형태의 다단백질인 Gag-단백질(P55) 또는 Gag-pol 단백질(P165)을 먼저 만들게 된다. 다음에 이 다단백질은 자신의 내부에 있는 프로테아제를 통하여 껍질 단백질과 역전사효소, 인테그라제 등 바이러스 형성에 필요한 효소들로 분해되게 된다. 이러한 분해과정을 담당하는 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되는데, 이러한 원리에 기초한 것이 프로테아제 억제제이다. 돌연변이 실험을 통하여, 프로테아제 기능이 없는 바이러스는 감염성이 없는 것으로 보고되었다[Kohl et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 85, 4686-4690 (1988); Peng et al., I. Virol., 63, 2550 (1989)]. 이에 따라 HIV 프로테아제의 기능을 저해하는 억제제는 HIV 감염에 의해 발생되는 질환의 치료제로서 사용할 수 있는 가능성이 제시되고 있다. HIV 프로테아제는 99개의 아미노산으로 구성되고, 두 개의 동일한 단위체가 이량체로 존재하고 있으며, 그 구조는 X-선 구조결정에 의하여 결정되었다 [Navia, et al., Nature 337, 615-620 (1989); Wlodawer, et al., Science, 245, 616-621 (1989); 및 Miller, et al., Science, 246, 1149-1152 (1989)]. 이러한 HIV 프로테아제는 반응부위에 Asp-Thr-Gly 의 배열을 갖는 전형적인 아스파르틱 프로테아제이다.

HIV 프로테아제 억제제의 개발에 있어서 기본적인 접근 방식은, 효소의 전이상태와 유사한 화합물(transition state analogue, TSA)에 의하여 효소의 활성화 부위에 결합시킴으로써 프로테아제에 의한 바이러스 폴리펩티드의 처리를 저해하는 것으로, 이러한 방식으로 개발된 여러 가지 억제제가 문헌에 개시되어 있다.

예를 들어, 파우어 등은 일련의 펩티드 클로로메틸 케튼에 의한 박테리아 프로테아제의 저해효과를 개시하고 있는데, 시험된 화합물 중 아세틸-Phe-Gly-Ala-Leu-클로로메틸 케톤이 가장 신속한 억제효과를 보였으며 관련된 화합물로는 메톡시숙시닐-Phe-Gly-Ala-Leu-클로로메틸케톤이 있다[Powers et al., Biochim. Biophys. Acta, 480: 246-261 (1977)]. 미합중국 특허 제 4,652,552 호에서는 바이러스 프로테아제의 저해제로서 테트라펩티드의 유도체를, 미합중국 특허 제 4,644,055 호에서는 바이러스 프로테아제의 저해제로서 할로메틸 유도체를, 그리고 유럽 특허출원 공개 WO 87/07836 호에서는 항바이러스제로서 L-글루탐산감마-모노하이드록사메이트를 각각 개시하고 있다. 무어 등은 HIV 프로테아제의 펩티딜 저해제를 개시하고 있으며 [Moore, Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 420 (1989)], 유럽 특허출원 공개 WO 89/10752 호에서는 HIV 프로테아제 저해제인 펩티드 유도체를 개시하고 있다.

이와 같이, 바이러스 프로테아제를 억제하면 바이러스 증식을 차단하는 효과를 주게 되고, 따라서 에이즈 등과 같은 바이러스 질환을 타제제에 비하여 부작용이 거의 없이 보다 효과적으로 치료할 수 있다. 그러나, 이러한 프로테아제 억제제로 알려진 대부분의 약물들은 생물학적 이용률이 낮아 치료제로 사용하기에 유용하지 않다는 단점이 있는데, 이렇게 활성도가 낮은 이유는 프로테아제 저해제의 분자량이 비교적 높아서 용해도 특성이 좋지 않을 뿐 아니라, 많은 펩티드 결합이 존재하므로 생체내에서 포유동물 프로테아제에 의해 분해되기 쉽기 때문이다.

본 발명에서는 이와 같은 종래의 HIV 프로테아제 억제제의 문제점을 개선하기 위하여 연구한 결과, (1) HIV 프로테아제의 전이상태 유사체로서 이속사졸린 또는 이속사졸 화합물, (2) 이속사졸린 또는 이속사졸 환을 환원성 분해시켜 얻은 히드록시 케톤, 디케톤 및 트리올의 비헤테로환 화합물, 그리고 (3) HIV 프로테아제의 구조와 유사한 C₂-대칭구조를 갖는 화합물이 HIV 프로테아제를 특이적으로 억제함으로써 바이러스 억제활성을 갖는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 보다 향상된 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 억제 활성을 갖는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 HIV 억제 활성을 갖는 신규한 화합물을 유효성분으로 포함하는, 후천성 면역결핍증 또는 HIV 감염의 예방 또는 치료에 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 하기의 일반식(I)의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물을 제공한다:

여기에서, R은 이속사졸 또는 이속사졸린환이고,

R₁은 -CO-NH-C(CH₃)₃또는 -CH₂-CH₂-Ph 이고,

R₂는 -(A)_n-P 인데,

A는 발린 또는 아스파라긴이고,

n은 0 또는 1이고,

P는 아미노 보호기를 의미하고,

R₃는 페닐 또는 시클로헥실이다.

또한 하기의 일반식 (II)의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물도 본 발명의 범위에 포함된다:

여기에서, X 및 Y는 각각 독립적으로 산소 또는 히드록시기이고,

R₁' 은 -CO-O-CH₃, -CO-NH-C(CH₃)₃, -CH₂-CH₂-Ph 또는

-C(CH₂Ph)-NH-CO-O-C(CH₃)이고,

R₂는 -(A)_n-P 인데,

A는 발린 또는 아스파라긴이고,

n은 0 또는 1이고,

P는 아미노 보호기를 의미한다.

또한 하기의 일반식 (III)의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물도 역시 본 발명의 범위에 포함된다:

여기에서, R₂는 -(A)_n-P 인데,

A는 발린 또는 아스파라긴이고,

n은 0 또는 1이고,

P는 아미노 보호기를 의미한다.

더 나아가 본 발명에서는 상기 일반식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함하는 에이즈 치료제 조성물을 제공한다. 이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 일반식 (I), (II) 또는 (III) 화합물의 대표적인 예로는 하기 표 1 내지 3에 나타낸 구조를 가지는 것들을 들 수 있다.

일반식 (I)의 화합물은-히드록시--아미노알데히드로부터-히드록시--아미노알독심을 제조한 후 니트릴 옥사이드로 부가환화(cycloaddition)하여 이속사졸린 또는 이속사졸환을 갖는 화화물을 합성하고, 이것의 카르복실 말단을 보충하기 위해 t-부틸아민과 커플링하고, 그런 다음 억제제 활성과 관련이 깊은 카르보벤질옥시-아스파라긴(Cbz-Asn) 또는 카르보벤질옥시-발린(Cbz-Val)을 N-말단쪽에 도입하여 제조할 수 있다.

일반식 (I)의 대표적인 화합물의 제조 방법은 하기 반응도 1내지 3에 나타낸 바와 같다:

상기와 같이 제조한 이속사졸 또는 이속사졸린환을 갖는 일반식 (I)의 화합물에서 이속사졸 또는 이속사졸린환을 환원 절단하여 히드록시 케톤, 디케톤 부분을 갖는 화합물을 제조하거나, 여기서 얻은 케톤기를 환원시켜 트리올을 갖는 화합물을 제조한 다음, N-말단에 Cbz-Asn 또는 Cbz-Val을 도입함으로써 일반식 (II)의 화합물을 얻을 수 있다. 커플링 반응은 EDC 또는 DEPC(diethylphosphoryl chloride)를 사용하여 수행할 수 있다.

일반식 (II)의 대표적인 화합물의 제조 방법은 하기 반응도 4 내지 6에 나타낸 바와 같다:

일반식 (III)의 화합물은 옥심 화합물로부터 유사 C₂대칭구조를 갖는 푸록산 다이머를 제조하고 이것의 N-말단을 Cbz-Asn 또는 Cbz-Val 로 치환함으로써 제조할 수 있다.

일반식 (III)의 대표적인 화합물의 제조 방법은 하기 반응도 7에 나타낸 바와 같다:

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예에서 방법 A 내지 방법 E는 다음의 과정을 나타낸다:

방법 A: 4 M HCL로 Boc기 제거

Boc-보호 펩티드 또는 아미노산 유도체를 MeOH(3-5ml/mmol)에 용해시키고 디옥산 중의 4 M HCl(10-40 당량)을 첨가하여 TLC 분석으로 반응이 종결될 때 까지 교반하였다. 용액을 감압 농축한 후 CH₂Cl₂로 용해시키고 1 M Na₂CO₃용액을 첨가하여 pH 9-10으로 조절하였다. CH₂Cl₂로 추출하고 감악농축하여 조야한 아민을 얻었다.

방법 B: 트리플루오로아세트산(TFA)으로 Boc기 제거

Boc-보호 펩티드 또는 아미노산 유도체를 1:1 CH₂Cl₂/TFA(5ml/mol)에 용해시키고 TLC 분석으로 반응이 종결될 때까지 교반하였다. 용액을 감압농축한 후 CH₂Cl₂로 추출하고 감압농축하여 조야한 아민을 얻었다.

방법 C: NaOH로 에스테르의 비누화

에스테르를 MeOH( 2 ml/mmol)에 용해시키고 1 N NaOH(1.1당량)를 첨가하여 TLC 분석으로 반응이 종결될 때까지 교반하였다. 용액에 증류수를 첨가하고 감압농축한 후 디에틸에테르로 추출하였다. 수층을 KHSO₄로 pH 2-3으로 조절하였다. 용액을 에틸아세테이트로 추출하고 감압농축하여 조야한 산을 얻었다.

방법 D: EDC/HOBt에 의한 펩티드 커플링

아민(1-3 당량), 산(1-2 당량), HOBt(1.1 당량)의 CH₂Cl₂(15ml/mmol) -15℃ 용액에 EDC(1.1 당량)와 NMM(1 당량)을 첨가하였다. 24-36 시간 상온에서 교반한 후 에틸아세테이트(20 ml)로 희석하고 용액을 10% 시트르산, 포화 NaHCO₃, 브라인으로 세척하고 감압농축하였다. 생성물을 속성 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다.

방법 E: DEPC에 의한 펩티드 커플링

아민(1-3 당량), 산(1-2 당량)의 CH₂Cl₂(10 ml/mmol) 0℃ 용액에 DIPEA(1.2 당량)과 DEPC(1.2 당량)을 첨가하였다. 15-20 시간 상온에서 교반한 후 감압농축하였다. 생성물을 속성 컬럼크로마토그래피로 분리하였다.

제조예 1: (4S, 5R)-4-벤질-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-2,2-디메틸-5-[(5'R)-5'-메톡시카르보닐-D²-이속사졸리닐]옥사졸리딘(5)의 제조

1) (4S, 5R)-3-(N-tert-부틸옥시카르보닐)-4-페닐메틸-2,2-디메틸옥사졸리딘-5-카르복스알독심 (3)의 제조

(4S, 5R)-3-(N-tert-부틸옥시카르보닐)-4-페닐메틸-2,2-디메틸옥사졸리딘-5-알데히드 (1) (28 mmol)를 MeOH 70 ml에 용해시킨 후 0℃에서 피리딘(2.2 ml, 56 mmol)과 NH₂OH·HCl(2.3 g, 30 mmol)을 첨가하여 5 시간 교반하였다. 용액을 반으로 감압농축한 후 에틸아세테이트로 수출하고 1 N HCl과 브라인으로 세척하였다. 이 용액을 감압농축하고 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트=10:1)로 분리하여 표제 화합물을 황색 오일로서 얻었다(총 수율:42%).

2)(4S, 5R)-4-벤질-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-2,2-디메틸-5-[(5'R)-5'-메톡시카르보닐-D²-이속사졸리닐]옥사졸리딘(5)의 제조

메틸 아크릴레이트(3.8 ml, 42 mmol)와 에틸 아세테이트(50ml)의 0℃ 용액에 상기 1)에서 제조한 옥심 화합물 3(2.8 g, 8.4 mmol)과 NaOCl(50 ml, 25 mmol)을 1시간동안 적가하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고 브라인으로 세척하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트=5:1)로 분리하고 에틸 아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(80% 수율).

제조예 2:(4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-시클로헥시메틸-2,2-디메틸-5-[(5'-메톡시카르보닐)이속사졸릴]옥사졸리딘) (6)의 제조

1) (4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-시클로헥실메틸-2,2-디메틸옥사졸리딘-5-카르복스알독심 (4)의 제조

tert-부틸옥시카르보닐시클로헥실알라닌 메틸에스테르를 사용하는 것을 제외하고는 제조예 1의 1)과 동일한 방법을 수행하여 표제 화합물을 얻었다(총 수율: 45%).

2) (4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-시클로헥실메틸-2,2-디메틸-5-[(5'-메톡시카르보닐)이속사졸릴]옥사졸리딘 (6)의 제조

메틸 프로피올레이트(3 ml, 34 mmol)와 에틸 아세테이트(30ml)의 0℃ 용액에 상기 1)에서 제조한 옥심 화합물(4) (2.3 g, 6.8 mmol)과 NaOCl(40 ml, 20 mmol)을 1시간동안 적가하였다. 이 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고 브라인으로 세척하고 감압농축하였다. 에틸 아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다.

[실시예 1]

3-[2(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-1(R)-히드록시-3-페닐프로필]-5(S)-(tert-부틸아미노)카르보닐-Δ²-이속사졸린 (17)의 제조

1) (4S, 5R)-4-벤질-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-2,2-디메틸-5-[5'(R)-(N-tert-부틸아미노)카르보닐-Δ²-이속사졸지닐옥사졸리딘 (7)의 제조

제조예 1에서 제조한 화합물 5(1.9 g, 4.5 mmol)를 방법 C에 따라 비누화시키고 방법 E에따라 tert-부틸아민을 커플링시켰다[tert-부틸아민(615 ml, 5.8 mmol), HOBt(670㎎,4.9 mmol), EDC(950㎎,4.9mmol), NMM(514 ml, 4.5 mmol), CH₂CH₂(67 ml), 36 h]. 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(1.96 g, 95% 수율)

2) 3-[2(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-1(R)-히드록시-3-페닐프로필]-5(S)-tert-부틸아미노)카르보닐-Δ²-이속사졸린 (17)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 7(352㎎,0.8 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 D에 따라 Cbz-Asn을 커플링시켰다[Cbz-Asn(256㎎,0.9 mmol), HOBt(140㎎,1 mmol), EDC(200㎎,1 mmol), NMM(91 ml, 0.8 mmol), CH₂Cl₂(15 ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피(EA:CH₂Cl₂:MeOH=100:10:1)로 분리하여 표제화합물을 얻었다(73㎎,16% 수율).

[실시예 2]

3-[2(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-1(R)-히드록시-3-시클로헥실프로필]-5-(tert-부틸)아미노)카르보닐-이속사졸 (18)의 제조

1) (4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-시클로헥실메틸-2,2-디메틸-5-[(5'-N-tert-부틸아미노)카르보닐]-이속사졸일]옥사졸리딘 (8)의 제조

상기 제조예 2에서 제조한 화합물 6 (680㎎,1.6 mmol)을 방법 C에 따라 비누화시키고 방법 E에 따라 tert-부틸아민을 커플링시켰다[tert-부틸아민(218 ml, 2.1 mmol), HOBt(240㎎,1.8 mmol), EDC(340㎎,1.8 mmol), NMM(182 ml, 1.6 mmol), CH₂Cl₂(25 ml), 36h)]. 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(733㎎,98% 수율).

2) 3-[2(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-1(R)-히드록시-3-시클로헥실프로필]-5-(tert-부틸)아미노)카르보닐-이속사졸 (18)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 8 (122㎎,0.3 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Asn을 커플링시켰다[Cbz-Asn(96㎎,, 0.36 mmol), DEPC(65㎎,0.4 mmol), DIPEA(75㎎,0.4 mmol), CH₂Cl₂(4 ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피(EA)로 분리하여 표제 화합물을 얻었다(84㎎,49% 수율).

[실시예 3]

(1S, 2S)-3-[2-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-3-시클로헥실-1-히드록실프로필]-5-(N-tert-부틸아미노카르보닐)이속사졸 (16)의 제조

1) (1R, 2S)-3-[2-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-3-시클로헥실-1-히드록시프로필]-5-메톡시카르보닐이속사졸 (14)의 제조

상기 제조예 2에서 제조한 화합물 6 (1.3 g, 3.1 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하였다. 이 물질을 MeOH(10 ml)에 용해시키고 Et₃N (561 ml, 3.4 mmol)과 (Boc)₂O (880㎎,3.1 mmol)을 첨가하였다. 10 시간 후 에틸 아세테이트를 첨가하고 포화 NaHCO₃용액과 브라인으로 세척하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=3:1)로 분리하여 표제 화합물을 얻었다(872㎎,74% 수율).

2) (1S, 2S)-3-[2-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-3-시클로헥실-1-벤조일옥시프로필]-5-(메톡시카르보닐)이속사졸 (15)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 14 (0.8 g, 2.1 mmol), 벤조산(513㎎,4.2 mmol) 및 PPh₃(1.1 g, 4.2 mmol)의 THF(30 ml) 0℃ 용액에 디에틸아조디카르복실레이트(661 ml, 4.2 mmol)를 천천히 적가하였다. 36시간 후 소량의 물을 첨가하고 에틸 에테르로 추출하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트=10:1)로 분리하여 표제 화합물을 얻었다(960㎎,94% 수율).

3) (1S, 2S)-3-[2-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-3-시클로헥실-1-히드록시프로필]-5-(N-tert-부틸아미노카르보닐)이속사졸 (16)의 제조

상기 2)에서 제조한 화합물 15 (0.95 g, 2 mmol)을 방법 C에 따라 비누화시키고 과정 D에 따라 tert-부틸아민을 커플링시켰다. [tert-부틸아민(630 ml, 6 mmol), HOBt(594㎎,4.4 mmol), EDC(843㎎,4.4 mmol), NMM(275 ml, 2.2 mmol), CH₂Cl₂(50ml), 36 h]. 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=4:1)로 분리하여 표제 화합물 (624㎎,74% 수율)을 얻었다.

[실시예 4]

3-[2(S)-(N-카르보벤족시-L-발리닐)아미노-1(S)-히드록시-3-시클로헥실프로필]-5-(tert-부틸)아미노)카르보닐-이속사졸 (19)의 제조

상기 실시예 3에서 제조한 화합물 16(270㎎,0.6 mmol)의 Boc기를 방법 B에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Val을 커플링시켰다[Cbz-Val(180㎎,0.7 mmol), DEPC(110 ml, 0.7 mmol), DIPEA(115 ml, 0.7 mmol), CH₂Cl₂(9ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피(Hex:EA=3:1)로 분리하고 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(260㎎,78% 수율).

[실시예 5]

5(R/S)-[2-(N-카르보벤족시-L-발릴)아미노-1(R)-히드록시-3-페닐프로필]-3-(2-페닐에틸)-Δ²-이속사졸린 (29)의 제조

1) 5(R/S)-[2-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-1(R)-히드록시-3-페닐프로필]-3-(2-페닐에틸)-D²-이속사졸린 (27)의 제조

알릴 알코올 24(500㎎,1.8 mmol)와 염화 2-페닐에틸옥심(5 mmol)의 CH₂Cl₂(30 ml) 용액에 Et₃N(1 ml, 7.5 mmol)을 30분 동안 적가하였다. 실온에서 12시간 반응시킨 후 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(Hex:EA=5:1)로 분리하고 에틸아세테이트-펜탄으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(682㎎,90% 수율).

2) 5(R/S)-[2-(N-카르보벤족시-L-발릴)아미노-1(R)-히드록시-3-페닐프로필]3-(2-페닐에틸)-Δ²-이속사졸린 (29)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 27(230㎎,0.5 mmol)의 Boc 기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Val을 커플링시켰다[Cbz-Val(150㎎,0.6 mmol), DEPC(114 ml, 0.7 mmol), DIPEA(104 ml, 0.6 mmol), CH₂Cl₂(7 ml)]. 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(215㎎,77% 수율).

[실시예 6]

메틸 6(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-2(S), 5(R)-디히드록사이-4-옥소-7-페닐헵타노에티트 (20)의 제조

1) 메틸 4-[(4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-페닐메틸-2,2-디메틸옥사졸리디닐]-2(S)-히드록시-4-옥소부타노에이트 (9)의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 화합물 5(2.3 g, 5.5 mmol)를 MeOH:H₂O(5:1) 110 ml에 용해시키고 붕산(11 mmol), 소량의 라니 니켈을 첨가하여 1 기압의 수소 가스에서 5시간 교반하였다. 셀라이트로 여과한 후 에틸아세테이트로 추출한 다음 감압농축하였다. 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(1.87 g, 81% 수율).

2) 메틸 6(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-2(S), 5(R)-디히드록사이-4-옥소-7-페닐헵타노에티트 (20)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 9(315㎎,0.7 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 D에 따라 Cbz-Asn을 커플링시켰다[Cbz-Asn(218㎎,0.8 mmol), HOBt(121㎎,0.8 mmol), EDC(171㎎,0.8 mmol), NMM(85 ml, 0.7 mmol), CH₂Cl₂(15 ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피(EA:CH₂Cl₂:MeOH=50:4:2)로 분리하여 표제화합물을 얻었다(86㎎,22% 수율).

[실시예 7]

[6(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-2 (S), 5(R)-디히드록시-4-옥소-7-페닐헵타노일]-(tert-부틸)아민 (21)의 제조

1) (4S, 5R)-4-벤질-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-2,2-디메틸-5[5'(R)-(N-tert-부틸아미노)카르보닐-Δ²-이속사졸리닐]옥사졸리딘 (7)의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 화합물 5(1.9 g, 4.5 mmol)를 방법 C에 따라 비누화시키고 방법 E에 따라 tert-부틸아민을 커플링시켰다[tert-부틸아민(615 ml, 5.8 mmol), HOBt(670㎎,4.9 mmol), EDC(950㎎,4.9 mmol), NMM(514 ml, 4.5 mmol), CH₂Cl₂(67 ml), 36 h]. 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(1.96 g, 95% 수율).

2) N-tert-부틸-4-[(4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-페닐메틸-2,2-디메틸옥사졸리디닐]-2(S)-히드록시-4-옥소부타노에이트-카르복사미드(10)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 7(1.9 g, 4.1 mmol)로부터 실시예 6의 1)과 유사한 방법으로 합성하였으며, 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(1.7 g, 90% 수율).

3) [6(S)-(N-카르보벤족시-L-아스파라질)아미노-2 (S), 5(R)-디히드록시-4-옥소-7-페닐헵타노일]-(tert-부틸)아민 (21)의 제조

상기 2)에서 제조한 화합물 10(354㎎,0.8 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 D에 따라 Cbz-Asn을 커플링시켰다[Cbz-Asn(226㎎,0.9 mmol), HOBt(123㎎,1 mmol), EDC(174㎎,1 mmol), NMM(80 ml, 0.8 mmol), CH₂Cl₂(12 ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피(EA:CH₂Cl₂:MeOH=60:6:1)로 분리하여 표제 화합물(120㎎,28% 수율)을 얻었다.

[실시예 8]

[6(S)-(N-카르보벤족시-L-발리닐)아미노-2(S), 4(R), 5(R)-트리히드록시-7-페닐헵타노일]-(tert-부틸)아민 (22)의 제조

1) N-tert-부틸-4-[(4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-페닐메틸-2,2-디메틸옥사졸리디닐]-(2S, 4R)-디히드록시부타노에이트-카르복사미드 (11)의 제조

상기 실시예 7의 2)에서 제조한 화합물 10(470㎎,1 mmol)의 MeOH(12 ml) 0℃ 용액에 NaBH₄(46㎎,1.2 mmol)을 첨가하였다. 2분후 소량의 물을 첨가하고 감압농축하였다. 에틸아세테이트로 추출한 후 포화 NaHCO₃용액, 브라인으로 세척하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=3:1)로 분리하고 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다.

2) [6(S)-(N-카르보벤족시-L-발리닐)아미노-2(S), 4(R), 5(R)-트리히드록시-7-페닐헵타노일]-(tert-부틸)아민 (22)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 11(93㎎,0.2 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Val을 커플링시켰다[Cbz-Val(64㎎,0.24 mmol), DOPC(43 ml, 0.3 mmol), DIPEA(50 ml, 0.3 mmol), CH₂Cl₂(3 ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피(Hex:EA=1:1)로 분리하여 표제 화합물을 얻었다(54㎎, 48%).

[실시예 9]

[6(S)-(N-카르보벤족시-L-발리닐)아미노-2(S), 4(S), 5(R)-트리히드록시-7-페닐헵타노일]-(tert-부틸)아민 (23)의 제조

1)N-tert-부틸-4-[(4S, 5R)-3-N-tert-부틸옥시카르보닐-4-페닐메틸-2,2-디메틸옥사졸리디닐]-(2S, 4S)-디히드록시부타노에이트-카르복사미드 (12)의 제조

상기 실시예 8의 1)에서 속성 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 표제화합물을 얻었다.

2) [6(S)-(N-카르보벤족시-L-발리닐)아미노-2(S), 4(S), 5(R)-트리히드록시-7-페닐헵타노일]-(tert-부틸)아민 (23)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 12(200㎎,0.4 mmol)의 Boc와 아세토니드기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Asn을 커플링시켰다[Cbz-Asn(127㎎,0.5 mmol), DEPC(92 ml, 0.6 mmol), DIPEA(98 ml, 0.5 mmol), CH₂Cl₂(5 ml)]. 속성 컬럼 크로마토그래피 (EA:CH₂Cl₂:MeOH=40:4:1)로 분리하여 표제 화합물을 얻었다(188㎎,82% 수율).

[실시예 10]

2(S), 7(S)-디(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-3(R), 4(R/S)-디히드록시-1,8-디페닐-6-옥소옥탄 (26)의 제조

알릴 알코올 24(827㎎,3 mmol)의 에틸아세테이트(15 ml) 0℃ 용액에 Boc-페닐알라닌알 옥심(950㎎,3.6 mmol)과 NaOCl(20 ml, 10 mmol)을 30분 동안 적가하였다. 실온에서 3 시간동안 반응시킨 후 에틸아세테이트로 추출하고 브라인으로 세척하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트=5:1)로 분리하여 화합물 25(580㎎,36% 수율)을 얻었다. 이 화합물 25(447㎎,0.8 mmol)을 라니 니켈로 가수소분해한 다음 속성 컬럼 크로마토그래피(Hex:EA=3:1)로 분리하여 표제 화합물을 얻었다(198㎎,44%).

[실시예 11]

2(S)-(N-카르보벤족시-L-발릴)아미노-3(R), 4(R/S)-디히드록시-1,8-디페닐-6-옥소옥탄(30)의 제조

1) 5(R/S)-[2-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-1(R)-히드록시-3-페닐프로필]-3-(2-페닐에틸)-D²-이속사졸린 (27)의 제조

알릴 알코올 24(500㎎,1.8 mmol)와 염화 2-페닐에틸옥심(5mmol)의 CH₂Cl₂(30 ml) 용액에 Et₃N(1 ml, 7.5 mmol)을 30분 동안 적가하였다. 실온에서 12시간 반응시킨 후 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고 감압농축하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피(Hex:EA=5:1)로 분리하고 에틸아세테이트-펜탄으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(682㎎,90% 수율).

2) 2(S)-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노-3(R), 4(R/S)-디히드록시-1,8-디페닐-6-옥소옥탄(28)의 제조

상기 1)에서 제조한 화합물 27(447㎎,0.8 mmol)을 라니 니켈로 가수소분해하여 표제화합물을 합성하였다. 속성 컬럼크로마토그래피(Hex:EA=2:1)로 분리하고 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(549㎎,92% 수율).

3) 2(S)-(N-카르보벤족시-L-발릴)아미노-3(R), 4(R/S)-디히드록시-1,8-디페닐-6-옥소옥탄(30)의 제조

상기 2)에서 제조한 화합물 28(460㎎,1.1 mmol)의 Boc기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Val을 커플링시켰다[Cbz-Val(331㎎,1.3 mmol), DEPC(233 ml, 1.4 mmol), DIPEA(230 ml, 1.3 mmol), CH₂Cl₂(16 ml)]. 속성 컬럼크로마토그래피(Hex:EA=2:1)로 분리하고 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제화합물을 흰색 고체로 얻었다(430㎎,70% 수율).

[실시예 12]

3,4-비스[(1S)-N-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노-2-페닐에틸]푸록산 (31)의 제조

Boc-페닐알라닌알옥심(1 g, 3.8 mmol)의 에틸아세테이트(20 ml) 용액에 NaOCl(22 ml)을 첨가하였다. 2시간후 에틸아세테이트로 추출하고 브라인으로 세척하였다. 에틸아세테이트-헥산으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(613㎎,65% 수율).

[실시예 13]

3,4-비스[1(S)-(N-카르보벤족시-L-발릴)아미노-2-페닐에틸]푸록산 (32)의 제조

상기 실시예 12에서 제조한 푸록산 다이머 31(563㎎,1.1 mmol)의 Boc기를 방법 A에 의해 제거하고 방법 E에 따라 Cbz-Val을 커플링시켰다[Cbz-Val(550㎎,2.4 mmol), DEPC(376 ml, 1.2 mmol), DIPEA(439 ml, 1.2 mmol), CH₂Cl₂(15 ml)]. 속성 컬럼크로마토그래피(Hex:EA=3:1)로 분리하고 에틸아세테이트-펜탄으로 재결정하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(256㎎,32% 수율).

[항바이러스 활성]

항 바이러스 효과는 신키티움 형성 조사와 역전사 효소 검정 조사를 하여 바이러스 복제를 50%로 저지하는 농도(IC₅₀)로 결정하였다.

1×10⁵세포의 H9 과 Sup T1 세포주를 24 웰 평판에 넣고 여러 농도의 본 발명의 화합물을 가하였다. 여기에 HIV-1 접종원을 200TCID₅₀(200 배의 50% 세포감염 농도, tissue culture infectious dose)을 넣고 rpmi-1640 배지를 가한 후 37 ℃에서 배양하였다. Sup T1의 경우에는 3 내지 9일후 신키티움이 형성된 개수를 조사하였다. H9의 경우 3일 간격으로 배양액의 3/4를 같은 농도의 새 배양액으로 바꾸어 주었다. 9일후 배양액 6 ml를 취해 100 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상등액 5 ml를 취해 2.5 ml의 30% PEG(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 6000 내지 약 8000)와 0.4 M NaCl을 가하고 0℃에서 하룻밤 정도 방치하여 바이러스를 침전시켰다. 2000 rpm으로 45분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 침전물을 20 ml의 역전사효소 현탁완충액을 가하여 희석시켜서 에펜도르프 관에 넣어 -70℃로 사용시까지 보관한다. 현탁완충액의 조성은 50 mM 트리스 완충액(Sigma), pH 7.5, 1 mM 디티오트레이톨, 20% 글리세롤, 0.25 M KCl과 트리톤 X-100 0.25%가 포함되어 있다. 상기 현탁액을 드라이아이스에서 2분간 얼렸다가 2분간 37℃에서 녹이는 과정을 세 번 반복한 후 4℃에서 원심분리하여 상등액을 사용하여 역전사 효소 검정한다. 역전사효소 검정 용액에는 상기 바이러스 현탁액 10 ㎕, 10 ㎕의 250 mM 트리스 완충액, pH 7.5, 37.5 mM MgCl₂, 0.25% 트리톤 X-100 용액, 1.2 ㎕의 200 mM 디티오트레이톨, 5 ㎕의 100μM 올리고(dT)-폴리(A)(베링거만하임(Boeringer Mannheim), 12-18 올리고머),³H 이 포함된 TTP(티민트리포스페이트) 1 ㎕(1μL Ci), 및 23.6 ㎕의 물을 혼합하여 사용하였다. 1시간 후 상기 용액들을 왓트만 DEB1 여과지에 부은 후 2 x SSC 완충용액에 넣는다. 2 x SSC 완충용액으로 3회 세척한 후 (1회에 10분정도 소요), 95%의 에탄올로 10초간 2회 세척한다. 여과지를 알루미늄 호일에 넣고 적외선 전구로 말린 후 액체 섬광 계수기로 정량한다. 본 발명의 화합물중 대표적인 화합물 몇가지의 HIV-1 프로테아제에 대한 억제 효과를 하기 표 4에 나타내었다.

Claims (6)

1. 하기 일반식 (I)의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물:

   여기에서, R은 이속사졸 또는 이속사졸린환이고, R₁은 -CO-NH-C(CH₃)₃또는 -CH₂-CH₂-Ph 이고, R₂는 -(A)_n-P 인데, A는 발린 또는 아스파라긴이고, n은 0 또는 1이고, P는 벤질옥시카르보닐 또는 tert-부틸옥시카르보닐이고, R₃는 페닐 또는 시클로헥실이다.
2. 하기 일반식 (II)의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물:

   여기에서, X 및 Y는 각각 독립적으로 산소 또는 히드록시기이고, R₁은 -CO-O-CH₃, -CO-NH-C(CH₃)₃, -CH₂-CH₂-Ph 또는 -C(CH₂Ph)-NH-CO-O-C(CH₃)이고, R₂는 -(A)_n-P 인데, A는 발린 또는 아스파라긴이고, n은 0 또는 1이고, P는 벤질옥시카르보닐 또는 tert-부틸옥시카르보닐이다.
3. 하기 일반식 (III)의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물:

   여기에서, R₂는 -(A)_n-P 인데, A는 발린 또는 아스파라긴이고, n은 0 또는 1이고, P는 벤질옥시카르보닐 또는 tert-부틸옥시카르보닐이다.
4. 제1항에 있어서, 하기 구조식으로 나타낸 화합물중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물:
5. 제2항에 있어서, 하기 구조식을 가지는 화합물중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물:
6. 제3항에 있어서, 하기 구조식을 가지는 화합물중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물: