KR0134497B1 - 비가역적 에이치아이브이 프로테아제 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제를 억제하는 하기 일반식(I)의 신규 화합물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서, R₁은 방향족 라디칼 또는 사이클로알킬로 치환된 저급 알킬이고, A 및 D는 각각 독립적으로

식또는

(여기에서, R₂는 비치환되거나 아릴로 치환된 저급 알킬이고, X는 O, NH 또는 N-CH₃이며, R₃은 질소원자가 포함된 방향족 복소환, 비치환되거나 아릴로 치환된 저급 알킬 또는 수소임)으로 표시되고, B는 양쪽이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산이고, C는 양쪽이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산이거나, 식(여기에서, R₄는 비치환되거나, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬이며, Y는 CH₂, O 또는 NH 임)으로 표시된다. 본 발명의 화합물은 또한 HIV 감염 및 AIDS의 치료 또는 예방에 유용하다.

Description

비가역적 에이치아이브이 프로테아제 억제제

본 발명의 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로테아제를 억제하는 신규 화합물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

HIV는 크게 보면 핵, 껍질 단백질, 지질막, 당단백질들로 구성되어 있다. 핵은 바이러스의 유전 정보를 갖고 있는 두 개의 단일 나선의 RNA, 역전사 효소등으로 구성되어 있으며 p25, p24 및 p18 등의 껍질 단백질로 둘러 싸여 있다. 이 껍질 단백질은 지질막으로 싸여 있고, 그 바깥 쪽의 당단백질은 gp41과 gp120으로 구성되어 있는데, 이 gp120이 바이러스가 T-세포를 인식하여 침투하는데 결정적인 역할을 한다.

HIV의 복제 경로는 일반적인 레트로 바이러스의 복제 경로와 유사한데, 레트로 바이러스라고 명명된 것은 그것들이 일반적인 유전 정보의 흐름과 반대되게 행동하기 때문이다. 즉, 레트로 바이러스의 유전인자는 DNA로 역전사된다는 것이다.

최근의 레트로 바이러스성 질병의 치료에는 일반적으로 바이러스성 DNA의 합성을 억제하는 화합물 즉, 역전사 효소 억제제가 많이 쓰이는데, HIV의 경우에도 보로 웰컴사(Burrows-Wellcome)의 3'-아지도-3'-데옥시 티미딘(AZT), 브리스톨-마이어스 스큅사(Bristol-Meyers-Squibb)의 2', 3'-디데옥시 이노신(DDI)등이 쓰인다.

이 외에 HIV가 숙주세포에 침입하는 것을 방지할 수 있는 폴리만노아세테이트등도 치료에 쓰이지만, 현재 이용되고 있는 AIDS 치료 방법중 어느 것도 질병을 완전히 치료하는 데에는 효과적이지 못하고 단지 일시적인 생명 연장 효과만 있을 뿐이며, 혈소판수의 감소, 신독성 및 골수 혈구 감소 등의 부작용을 야기시킨다. HIV 게놈의 바이러스 복제를 조절하는 여러 유전자들 이외에도 gag, pol 및 env라고 불리는 세개의 유전자들을 갖고 있다. gag 유전자는 55 킬로 달톤의 p55로 전이된 후 거기서부터 바이러스의 핵 구조 단백질인 MA(p17), CA(p24), NC(p7)와 p6등이 된다. po1 유전자의 5'-말단은 gag 유전자의 3'-말단과 겹쳐져 있으며, 세 개의 중요한 효소, 즉 po1 유전자의 5'-말단에 위치한 프로테아제, po1 유전자의 3'-말단에 위치한 인티그라제, 그리고 그 사이에 있는 역전사 효소를 갖는다. HIV가 위의 세가지 효소를 만들때 mRNA로부터 바로 만들어 내는 것이 아니고 껍질 단백질과 위의 효소들이 다 붙어 있는 gag 단백질(p55)과 gag-pol 단백질(p165)같은 전구 단백질 형태로 만든 후, 자체내의 프로테아제에 의해 분해하여 껍질 단백질과 프로테아제, 역전사 효소 및 인티그라제 등으로 만든다. 이러한 과정은 감염된 바이러스가 복제하는데 있어서 필수 불가결한 단계이므로, HIV 프로테아제의 억제제를 개발하는 것은 AIDS 치료에 효과적인 방법이 될 수 있다.

HIV 프로테아제는 C₂대칭성을 갖는 이량체로 존재하고 있는데, 각 단량체는 분자량이 10,793 달톤이며 99개의 아미노산으로 구성되어 있다. HIV 프로테아제는 전형적인 아스파르틱 프로테아제와 같이 반응 부위에 아스파르트산-트레오닌-글리신의 배열을 갖고 있으며, 생체외 실험에서 아스파르틱 프로테아제의 일반적인 억제제인 펩스타틴에 의해 억제되는 것으로 보아 아스파르틱 프로테아제라고 추정된다. 천연 화합물인 펩스타틴은 반응 부위에 아미드 결합 대신 히드록시기가 들어가 있는 것으로 대표될 수 있는데, 이것은 기질이 효소와 반응하여 만들어 지는 전이상태와 흡사한 구조로서 펩스타틴이 기질이나 생성물보다 효소에 강하게 결합함으로써 반응을 억제한다고 할 수 있다.

현재 개발되고 있는 대부분의 HIV 프로테아제 억제제들은 이러한 원리를 응용한 것으로써 효소에 대한 친화력이 높은 전이상태와 유사한 화합물을 개발하는 것을 목적으로 하며, 다수의 문헌에서 그 예들을 볼 수 있다[Rolerts et al., Science 248, 358(1990); Sigal et al., 유럽 특허원 제 0337714호; Handa et al., 유럽 특허원 제0346847호; Desolms et al., 유럽 특허원 제 0356223호; Dreyer et al., 유럽 특허원 제 0352000호; Sigal et al., 유럽 특허원 제 0357332호; Hanko et al., 유럽 특허원 제 0361341호; Kempf et al., 대한민국 특허 공개 제 90-18134호; Bone et al., JACS 113, 9382(1991) 및 Urban et al., FEBS Letter 298, 9(1992)]. 그러나, 상기 억제제들은 모두 가역적 억제제라는 단점을 가지고 있으며, 본 발명에서는 그러한 단점을 극복하기 위해 반응 부위에 에폭사이드를 도입함으로써 비가역적 억제제를 개발하였다. 에폭사이드를 이용하여 프로테아제를 억제하려는 시도는 천연물인 세루리닌을 이용한 방법이 보고되어 있으며(Moelling et al., FEBS Letter 261, 373(1990); Pal et al., PNAS 85, 9283(1988)), 또한 최근에 아메리칸 시아나미드 캄퍼니사(유럽 특허원 제 0492136A호)와 스미스 클라인 비참사(Bioorg. Med. Chem. Letter 2, 1441(1992))의 과학자들이 에폭사이드를 이용한 HIV 프로테아제의 비가역적 억제제를 보고하였으나, 그 억제효과가 매우 낮아 치료제로서의 가능성은 의문시되고 있다.

이에, 본 발명자들은 HIV 프로테아제 억제효과가 높은 비가역적 억제제를 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, HIV 프로테아제가 C₁대칭성을 갖고 있다는 사실을 응용하여 HIV 프로테아제의 억제제에 C₂대칭성을 도입함으로써 시스-에폭사이드를 갖는 신규한 HIV 프로테아제의 비가역적 억제제를 개발하였다.

본 발명의 목적은 HIV 감염 및 AIDS 치료제로서 유용하며 HIV 프로테아제 억제효과가 높은 HIV 프로테아제의 비가역적 억제제를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 하기 식(I)의 시스-에폭사이드를 갖는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염이 제공된다.

상기식에서, R₁은 방향족 라디칼 또는 사이클로알킬로 치환된 저급 알킬이고, A 및 D는 각각 독립적으로

식(여기에서, R₂는 비치환되거나 아릴로 치환된 저급 알킬이고, X는 O, NH 또는 N-CH₃이며, R₃은 질소원자가 포함된 방향족 복소환, 비치환되거나 아릴로 치환된 저급알킬 또는 수소임)으로 표시되고, B는 양쪽이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산이고, C는 양쪽이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산이거나, 식 (여기에서, R₄는 비치환되거나, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬이며, Y는 CH₂, O 또는 NH 임)으로 표시된다.

본 명세서에서 사용된 용어 저급 알킬은 메틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 바람직하게는 메틸을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬은 벤질, 2-페닐에틸을 포함하는 방향족 라디칼로 탄소수 1 내지 2의 직쇄 말단이 치환된 알킬, 바람직하게는 벤질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 아릴로 치환된 저급알킬은 페녹시, 나프톡시를 포함하는 방향족으로 치환된 알킬, 바람직하게는 벤질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 질소원자가 포함된 방향족 복소환은 직소원자를 포함하는 단환식 또는 이환식 방향족을 의미하고 퀴놀린, 피리딘, 벤즈이미다졸 등이 포함되며, 바람직하게는 퀴놀린이다.

본 명세서에서 사용된 아미노산은 바람직하게는 아스파라긴, 발린, 트레오닌 또는 글루탐산이다.

본 명세서에서 사용된 아미노산에 관한 약어들은 아미노산 및 펩타이드에 대한 생화학적 명명법에 관한 IUPAC-OUB 합동회의에 따른 것이다[Eur. J. Biochem. 150, 9-31(1984)].

본 발명의 일반식(I) 화합물 및 이를 위한 중간체인 일반식(II) 또는 (III)의 화합물은 하기 반응 도식 1 내지 3에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

반응도식 1 : A-B와 D-C가 같은 경우

반응도식 2 : A-B와 D-C가 다른 경우

반응도식 3 : 중간체의 제조

반응도식 1과 2는 중간체 화합물(II)와 (III)으로부터 아미드 커플링과 에폭시화 반응 과정을 거쳐 최종 화합물을 제조하는 공정을 기술하고 있다. 반응도식 1은 A-B 와 C-D가 같은 경우를 보여주고 있는데 중간체(II)를 팔라듐 촉매하에서 수소압을 가하여 보호기인 벤질옥시카르보닐을 모두 제거하므로써 (a)의 디아민을 생성시킨 후 2당량의 A-B-OH와 공지의 아미드 커플링 과정을 거쳐 최종화합물(I)을 제조하였다. A-B 와 C-D가 다른 경우는 중간체(III)과 C-D-OH를 먼저 아미드커플링시켜 (b)를 얻은 후, 트리플루오로 아세트산과 같은 산 촉매로 t-부톡시카르보닐기를 제거하고 A-B-OH와 다시한번 아미드 커플링을 시켜 (d)를 얻는다. 마지막으로 메타클로로 퍼벤조산과의 에톡시화 반응을 거쳐 최종화합물(I)을 제조하였다.

또한, 상기 커플링 반응에 사용할 수 있는 당 분야에 공지된 커플링 시약으로는 디사이클로 헥실 카보디이미디(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필 카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀사 클로라이드(BOP-Cl), 디페닐 포스포릴 아지드(DPPA)등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 아미드 커플링화에 사용되는 카르복실산들은 카르복실산의 산 할라이드 유도체 또는 활성화 에스테르 유도체로 전환시킨후 커플링 반응 시킨다.

산 할라이드 유도체에서는 산 클로라이드가 포함되고, 활성화 에스테르 유도체에는, 아민과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하도록 하기위해 카르복실산 그룹을 활성화시키는데 통상적으로 사용되는 활성화 에스테르로서, 메톡시카르보닐 클로라이드, 이소부틸옥시카르보닐 클로라이드 등을 포함하는 알콕시 카르보닐 할라이드와 커플링 시약으로부터 유도된 카르복실산의 무수물, N-하이드록시 벤조트리아졸 유도된 에스테르, N-하이드록시 프탈이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시석신이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복스아미드-유도된 에스테르 및 2,4,5-트리클로로페놀-유도된 에스테르등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

반응도식 3은 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 중간체로서 사용되는 식(II)와 식(III)의 화합물의 제조과정을 나타낸 것으로, N-(2-브로모에틸)프탈이미드를 출발물질로하여 이를 트리페닐 포스핀과 반응시킨 후, 생성된 화합물을 N-보호기가 있는 아미노산으로부터 생성된 알데히드와 비티그 반응시켜 시스-올레핀을 합성한다.

이어서, 시스-올레핀의 프탈이미드를 하이드라진으로 제거하여, P가 t-브톡시카르보닐인 경우는 반응도식 2의 출발물질인 중간체(III)을 얻고, P가 벤질옥시카르보닐인 경우는 유리된 아민에 다시 벤질옥시카르보닐을 도입한 후 에폭시화 반응을 시켜 반응도식 1의 출발물질인 중간체(II)를 제조한다.

본 발명의 화합물은 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 화합물, 부분 입체 이성체 혼합물 및 각각의 부분 이성체로서 존재할 수 있으며, 이러한 모든 이성체 형태가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 대표적인 화합물들이 표1에 나타나 있다.

본 발명의 화합물은 후천성 면역 결핍증 또는 HIV 감염의 치료 또는 예방에 유용하다.

단일용량 또는 분리 용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1kg당 0.00 1∼10mg이고, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정화합물, 환자의 체중, 연령, 성 및 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탄제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 식염 용액이 있으며, 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다.

모노-, 디글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 올레산과 같은 지방산은 주사용제제로 사용한다.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 가능하고, 특히 캅셀제와 정제가 유용하며, 정제 및 환제는 장피제로의 제조가 유용하다. 고체투여 형태는 활성화합물을 수크로오즈, 락토오즈 또는 전분과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및, 희석제외의 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제와 함께 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 항 AIDS 제, 면역 조절제등과 동시에 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물과 혼합하여 투여할 수 있는 항 AIDS제에는 지도부딘(AZT), 디데옥시이노신(DDI), 디데옥시시티신(DDC), 리바비린, 콤파운드 Ω, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 폴리만노 아세테이트, 나트륨 포스포노포메이트, HDA-23, UA001, 에플로르니틴, 아사이클로비르가 포함된다.

본 발명의 화합물과 혼합하여 투여할 수 있는 면역조절제는 브로피리민, 암프리겐, 항-인간 알파-인터페론항체 콜로니자극인자, CL246738, 임테 2-2, 디에틸디티오카바메이트, 인터루킨-2, 알파-인터페론, 이노신프라노벡스, 메티오닌 엔케팔린, 무라밀-트리펩티드, TP-5, 에리트로포이에틴, 날트레손 및 종양 치사인자가 포함된다.

HIV 감염의 치료 및 예방을 위한 본 발명의 화합물의 제제는 상술한 것으로 제한되는 것은 아니며, HIV 감염의 치료 및 예방에 유용한 본 발명 화합물의 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 제조예 및 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 하기의 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

제조예 1

단계 1 :

N-[(2-트리페닐 포스핀)에틸]프탈이미드 브로마이드

2.54g(10 밀리몰)의 N-(2-브로모에틸)프탈이미드와 2 당량의 트리페닐 포스핀을 용매 부재하에 150^oC에서 16 시간동안 교반한 후 에탄올과 에테르로 재결정하여 생성물 4.54g(수득율 88%)을 얻었다.

¹H HMR(CDC_l3) 4.32(m,2H), 4.54(m,2H), 7.51∼7.71(m, 15H), 7.81∼7.93(m,4H)

단계 2 :

4S-[(N¹-프탈로일)아미노]-[(N⁴-벤질옥시카르보닐)아미노]-5-페닐-(2,3)-펜텐

단계 1의 생성물 0.568g(1.1 밀리몰)과 N-벤질옥시카르보닐-L-페닐 알라닌알 0.283g(1 밀리몰)을 디옥산 30㎖와 디메틸 설폭사이드 10㎖에 녹인 후 70℃에서 5시간동안 교반하였다. 용액을 감압증류하여 디옥산을 제거한 후 에틸 아세테이트 80㎖를 가하여 희석하고 NaCl 포화 용액으로 세척하여 유기층을 분리하여 무수 MgSO₄로 건조한후 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 7 : 3)를 실시하여 생성물 0.374g(수득율 85%)을 시스와 트랜스 이성체(8:1)의 혼합물로 얻었다.

¹H HMR(CDCl₃) 2.78∼2.99(m,2H), 4.26(m,2H), 4.59(bs,1H), 4.85 (m,1 H), 5.10(s, 2H), 5.44∼5.58(m,2H), 7.15∼7.32(m,10H), 7.72∼7.95(m,4H)

단계 3 :

4S-[N⁴-벤질옥시카르보닐)아미노]-1-아미노-5-페닐-(2,3)-펜텐

단계2의 생성물 0.44g(1 밀리몰)과 3당량의 하이드라진을 20㎖의 에탄올로 희석시킨 후 3시간동안 환류하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 제거하고, 여액을 감압증류시켜, 유기용매를 제거한 후 에틸아세테이트 50㎖를 가하였다. 0.2N NaOH 용액으로 세척한 후 무수 MgSO₄로 건조시켜 생성물 0.298g(수득율 96%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 2.65∼3.23(m,4H), 4.64(m,1H), 5.11(s,2H), 5.15∼5.54(m,2H), 7.09∼7.43(m,10H)

단계 4 :

4S-1,4-비스[(N-벤질옥시카르보닐)아미노]-5-페닐-(2,3)-(Z)-펜텐

단계3의 생성물 0.31g(1 밀리몰)과 3당량의 트리에틸아민을 20㎖의 무수 디클로로메탄에 용해시키고 1.1 당량의 N-벤질옥시카르보닐클로라이드를 0^oC에서 천천히 가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 감압증류에 의해 유기용매를 제거한후 30㎖의 에틸 아세테이트를 가하고 1N 염산용액으로 세척한 후 무수 MgSO₄로 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸 아세테이트 = 8 : 2)를 실시하여 2,3 위치가 시스올레핀인 시스이성체 0.373g(수득율 96%) 및 트랜스 이성체 47㎎(수득율 96%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 시스올레핀 이성체

2.71(m,1H), 2.95(m,1H), 3.48∼3.79(m,2H),

4.65(m,1H), 4.80(m,2H), 5.11(s,4H), 5.33(t,1H),

5.52(m,1H), 7.13∼7.42(m,15H)

¹H NMR(CDCl₃) 트랜스 올레핀 이성체

2.81(m,2H), 3.77(m,2H), 4.45(m,1H), 4.71(bs, 2H),

5.11(d,4H), 5.55(m,2H), 7.09∼7.48(m,15H)

제조예2

4S-1,4-비스[(N-벤질옥시카르보닐)-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시페탄

상기 제조예1에서 제조된 시스 올레핀 0.46g(1 밀리몰)과 3 당량의 메타클로로퍼벤조산을 30㎖의 무수 디클로로메탄에 녹이고 16시간동안 상온에서 교반하였다. 10% Na2S₂O₃용액과 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조한 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산: 에틸 아세테이트=7:3)를 실시하여 생성물 0.40g(수득율 87%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 2.75∼3.14(m,6H), 3.71(m,1H), 4.42(bs,1H),

5.10(d, 4H), 5.15(bs,1H), 7.15∼7.41(m,15H)

실시예 1

4S-1,4-비스[N-(N'-빈질옥시카르보닐-L-발리닐)아미노]-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시펜탄

115mg(0.25 밀리몰)의 (2S,3R,4S)-1,4-비스[N-(벤질옥시카르보닐)아미노]-5-페닐-2,3-(Z)-에폭시펜탄을 무수 메탄올 10㎖에 녹인 후 20mg의 10% Pd/C를 가한 다음 수소 조건(고무 풍선)에서 3시간 동안 교반함으로써 0.25밀리몰(수득율 100%)의 1,4-(2S,3R,4S)-5-페닐-2,3-(Z)-에폭시펜탄디아민을 얻었다. 셀라이트에 Pd/C를 여과하고 감압증류에 의해 유기용매를 제거한 뒤 N-벤질옥시카르보닐-L-발런 2.5 당량, EDC(1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드·하이드로클로라이드) 3 당량, HOBT(1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트) 3 당량 및 트리에틸아민 3 당량을 가하고 무수 디메틸포름아미드 5㎖에 용해시킨 후 상온에서 16시간동안 교반하였다. 용액을 감압 증류하여 유기용매를 제거한 뒤 생성물에 에틸 아세테이트 30㎖를 가하고 NaHCO₃포화 용액으로 세척하여 유기층을 분리하여 무수 MgSO₄로 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트)를 실시하여 생성물 124mg(수득율 75%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl3) 0.82∼1.01(m,12H), 2.10(m,2H), 2.71∼3.22(m,6H),

3.62(m,1H), 3.95(m, 1H), 4.11(m,1H), 5.11(d,4H),

5.21(m,1H), 5.60(d, 1H), 5.85(m, 1H), 6.20(d,1H),

7.15∼7.44(m,15H)

FABMS 659(M+1)

실시예 2

4S-1,4-비스[N-(N'-벤질옥시카르보닐-L-글루타믹에시딜)아미노]-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시펜탄, 실시예 1에서 얻은 디아민(48mg)과 2.1 당량의 N-벤질옥시카르보닐-L-글루탐산-γ-벤질 에스테르를 실시예 1과 같은 방법으로 커플링하고 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트)하여 생성물을 얻었다. 이 생성물을 10㎖의 무수 메탄올에 용해시킨후 20mg의 10% Pd/C를 가하고 수소조건(고무 풍선)에서 16시간동안 교반한 다음 셀라이트에 Pd/C를 여과하였다. 감압증류에 의해 유기용매를 건조시킨 후 물과 디옥산 각각 20㎖를 가해 용해시키고, 2.1 당량의 벤질옥시카르보닐 클로라이드를 천천히 가한 다음 상온에서 4시간동안 교반하였다. 감압증류에 의해 디옥산을 제거한후 에테르로 세척하고, 아황산수소칼륨을 사용하여 pH를 약 3.5정도로 조정하였다. 용액을 에틸아세테이트로 추출한 다음 컬럼크로마토그래피(디클로로 메탄: 메탄올=3:1)를 실시하여 생성물 93mg(수득율 52%)를 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD) 1.88(m,2H). 2.15(m,2H), 2.41∼3.06(m,7H),

3.22(m,1H), 3.40∼3.59(m,3H), 4.11(m,1H), 4.44(m,1H),

5.10(d,4H), 7.10∼7.39(m,15H)

실시예 3

4S-1,4비스[N-[(N'-벤질 메틸 아미노)카르보닐-L-발리닐]아미노]-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시펜탄,

실시예 1에서 얻은 디아민(48mg)과 N-[(N'-벤질 메틸아미노)카르보닐]-L-발린-P-니트로 페닐 에스테르 2당량을 5㎖의 무수 디메틸 포름아미드에 용해시킨 후 상온에서 16시간동안 교반하였다. 유기 용매를 감압증류하여 제거한 뒤 에틸 아세테이트 30㎖를 가하고 NaHCO₃포화 용액으로 세척하여 유기층을 분리하여 무기 MgSO₄로 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 : 메탄올=12:1)를 실시하여 생성물 127mg(수득율 74%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 0.72∼0.98(m,12H), 2.05(m,2H), 2.80∼3.03(m,9H),

3.21(t,1H), 3.61∼3.74(m,3H), 4.05∼4.29(m,2H),

4.50(s,4H), 4.55(d,1H), 4.86(d,1H), 6.99(d,1H),

7.11∼7.35(m,15H), 7.50∼7.72(m,1H)

FABMS 685(M+1)

실시예 4

4S-1, 4-1ㅂ스[N-(N'-벤질옥시카르보닐-L-발리닐)아미노]-5-사이클로헥실-(2S, 3R)-(Z)-에폭시펜탄,

117mg(1.25 밀리몰)의 (2S,3R,4S)-1,4-비스[N-(벤질옥시카르보닐)아미노]-5-사이클로헥실-2,3-(Z)-에폭시펜탄을 무수 메탄올 10㎖에 용해시킨 후, 20mg의 10% Pd/c를 가한 다음 수소 조건(고무 풍선)에서 3시간동안 교반하였다. 셀라이트에 Pd/c를 여과하고 감압증류에 의해 유기용매를 제거한 뒤, N-벤질옥시카르보닐-L-발린 2.5당량, EDC 3 당량, HOBT 3 당량 및 트리에틸아민 3 당량을 가하고, 무수 디메틸 포름아미드 5㎖에 녹여서 상온에서 16시간동안 교반하였다. 용액을 감압증류하여 유기용매를 제거한 뒤, 생성물에 에틸 아세테이트 30㎖를 가하고, NaHCO₃포화 용액으로 세척하고 무수 MgSO₄로 유기층을 건조시킨 다음 다음 컬럼 크로마토그래피(에틸아세테이트)를 실시하여 생성물 123mg(수득율 74%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 0.82∼1.72(m,25H), 2.03∼2.29(m,2H), 2.86(m,2H),

3.31(m,2H), 3.83∼4.22(m,3H), 5.10(s,4H), 5.26(d,1H),

5.86(d,1H), 5.95(d,1H), 6.72(bs,1H), 7.26∼7.42(m,10H)

FABMS 665(M+1)

실시예 5

4S-[N1-[(N-벤질옥시카르보닐-L-아스파라기닐)아미노]]-[N4-(t-부톡시카르보닐)아미노]-5-페닐-2,3]-펜텐

552mg(1 밀리몰)의 4S-1,4-비스[(N-벤질옥시카르보닐)아미노)-5-페닐(2,3)-(Z)-펜텐과 1.2 당량의 N-벤질옥시카르보닐-L-아르파라긴을 무수 디메틸 모름 아미드 1.5㎖에 녹이고 상온에서 16시간동안 교반하였다. 용액을 감압 증류하여 유기용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트 50㎖를 가하고 NaHCO₃포화 용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄로 유기층을 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 : 메탄올 = 9:1)를 실시하여 생성물 860mg(수득율 82%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 1.39(s,9H), 2.52∼2.71(m,2H), 2.89(m,2H),

3.68(m,2H), 4.45∼4.64(m,2H), 5.12(s,2H),

5.28∼5.47(m,2H), 5.85(bs,1H), 6.19∼6.24(m,2H),

6.74(bs,2H), 7.15∼7.48(m,10H)

FABMS 525(M+1)

실시예 6

4S-[N1-[(N-벤질옥시카르보닐-L-아스파라기닐)아미노]]-[N4-(t-벤질옥시카르보닐-L-발리닐)아미노]]-5-페닐-2,3-(Z)-펜텐

실시예 5의 생성물 786mg(1.5 밀리몰)을 10㎖의 디클로로메탄과 5㎖의 트리플루오로아세트산에 용해시킨 후 상온에서 2시간동안 교반하였다. 용액을 감압증류하여 유기용매를 깨끗이 제거한후, N-벤질옥시카르보닐-L-발린 1.2 당량, EDC 1.5 당량, HOBT 1.5 당량 및 트리에틸아민 3당량을 가하고, 10㎖의 무수 디메틸 포름아미드에 녹인 다음 상온에서 16시간동안 교반하였다. 용액을 감압증류하여 유기용매를 제거한 뒤 에틸아세테이트 50㎖를 가하고 NaHCO₃포화 용액으로 세척하고 무수 MgSO₄로 유기층을 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피(디클로 메탄 : 메탄올= 15:1)을 실시하여 생성물 572mg(수득율 58%)을 얻었다.

¹H NMR(DMSO) 0.79∼1.03(m,6H), 2.03(m,1H), 2.60(m,2H),

2.97(m,2H), 3.72(m,2H), 4.28(m,1H), 4.46(m,1H),

4.91(m,1H), 5.15(s,4H), 5.45(m,2H), 6.92(bs,2H),

7.15∼7.55(m,15H), 7.92∼8.20(m,2H), 5.75(bs,2H)

FABMS 658(M+1)

실시예 7

4S-[N1-[(N-벤질옥시카르보닐-L-아스파라기닐)아미노]]-[N4-[(N-벤질옥시카르보닐-L-발리닐)아미노]]-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시펜탄

실시예 6의 생성물 526mg(0.8 밀리몰)을 20㎖의 무수디클로로메탄에 용해시키고 3당량의 메타클로로퍼벤조산을 가한 다음 상온에서 16시간동안 교반하였다. 유기층을 10% Na₂S₂O₃용액과 포화 Na₂S₂O₃용액으로 세척한 후, 무수 MgSO₄로 건조시키고 컬럼 크로마토그래피(디클로 메탄 : 메탄올 = 15 : 1)을 실시하여 생성물 339mg (수득율 63%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 0.82∼1.01(m,6H), 2.10(m,1H), 2.71∼2.97(m,3H),

3.15∼3.24(m,3H), 3.62(m,1H), 3.72(m,1H), 4.01∼

4.10(m,2H), 4.53(m,1H), 5.09(d,4H), 5.75(bs,2H),

6.52∼6.66(m,2H), 7.12∼7.43(m,15H), 7.83∼8.01(m,2H)

FABMS 674(M+1)

실시예 8

4S-[N1-[(N-부톡시카르보닐)아미노]-[N4-벤질옥시카르보닐)아미노]-5-페닐-2,3-(Z)-펜텐 310mg(1 밀리몰)의 4S-[(N4-벤질옥시카르보닐)아미노]-1-아미노-5-페닐-(2,3)-펜텐을 20㎖의 무수 디클로로메탄에 녹이고, 1.2 당량의 t-부톡시 카보닐 무수물을 가한 다음 16시간 동안 상온에서 교반하였다. 유기용매를 제거하고 컬럼 크로마토그래피(헥산: 에틸 아세테이트=8:2)를 실시하여 생성물 377m g(수득율 92%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 1.41(s,9H), 2.62(m,1H), 2.95(m,1H),

3.42∼3.71(m,3H), 4.48~4.70(m,2H), 4.89(bs,1H),

5.05(s,2H), 5.29(t,1H), 5.49(m,1H), 7.10∼7.35(m,10H)

실시예 9

4S-[N1-[(t-부톡시카르보닐)아미노]-[N4-벤질옥시카르보닐)아미노]-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시펜탄

실시예 8의 생성물 328mg(0.8 밀리몰)을 20㎖의 무수 디클로로메탄에 용해시키고 3당량의 메타클로로퍼벤조산을 가한 다음 16시간동안 상온에서 교반하였다. 10% Na₂S₂O₃용액과 NaHCO₃포화 용액으로 세척한 후, 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트=7:3)를 실시하여 생성물 306mg(수득율 92%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 1.41(s,9H), 2.67∼3.18(m,6H), 3.63(m,1H),

4.48(bs,1H), 4.85(d, 1H), 5.05(s, 2H), 7.13∼7.42(m,10H)

실시예 10

4S-[N1-[(N-부톡시카르보닐)아미노]-[N4-[(N-벤질옥시카르보닐-L발리닐)아미노]]-5-페닐-(2S,3R)-(Z)-에폭시펜탄

실시예 9의 생성물 298mg(0.7 밀리몰)을 20㎖의 무수메탄올에 용해시키고, 40mg의 10% Pd/C를 가한 다음 수소 조건(고무 풍선)에서 2시간 동안 교반하였다. 감압증류에 의해 유기용매를 제거한 뒤 셀라이트에 Pd/C를 여과하고 N-벤질옥시 카르보닐-L-발린 1.2 당량, EDC 1.5 당량, HOBT 1.5 당량 및 트리에틸아민 1.5 당량을 가한 후 디메틸 포름아미드 10㎖에 용해시키고 상온에서 16시간동안 교반하였다. 용액을 감압증류하여 유기용매를 제거한 뒤 에틸 아세테이트 50㎖를 가하고 NaHCO₃포화 용액으로 세척하고 무수 MgSO₄로 유기층을 건조시킨 다음 컬럼 크로마토그래피(에틸아세테이트)를 실시하여 생성물 250mg(수득율 68%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 0.82∼1.01(m,6H), 1.41(s,9H), 2.12(m,1H),

2.75∼3.14(m,4H), 3.84∼4.37(m,4H), 5.11(bs,2H),

5.27(d,1H), 6.12(d,1H), 6.27(d,1H), 7.20∼7.43(m,10H)

FAMBS 526(M+1)

상기 표 1에 열거한 화합물들중 실시예가 제공되지 않은 하기 표 2의 화합물은 각각 대응하는 중간체를 사용하여 상기 실시예와 동일한 방법으로 합성하였으며, NMR 및 FABMS 결과도 기록되어 있다. 단, (N-벤질옥시카르보닐)-L-사이클로 헥실 페닐알라닌알은 문헌(Boger et al., JMS 28, 1779(1985))의 방법에 의거하여 합성하였다.

HIV 프로테아제의 억제 효능 분석

본 발명의 화합물들의 억제 효능을 확인하기 위해 하기의 방법을 사용하였다.

먼저 반응기질이 없는 상태에서 HIV 프로테아제를 표1의 제1번 내지 22번 화합물 중 어느 하나를 포함하는 예비배양 용액에 가하고, 효소활성의 감소정도를 확인하기 위해 위의 반응용액의 일부를 과량의 반응기질을 포함하는 용액(분석 용액)에 가하여 남아있는 활성의 정도를 측정하였다. 즉, 50nM 소디움 아세테이트, pH 5.5, 1nM 디티오트레이톨(DTT), 1mM 에틸 디아민 테트라 아세테이트(EDTA), 0.75M 암모늄 설페이트 및 0.1% NP40을 포함하는 완충용액에 여러농도의 제1번 내지 제22번 화합물을 가하여 예비 배양 용액을 제조하고, 여기에 2.6nM의 HIV-1 프로테아제를 가함으로써 억제반응을 시작시켰다. 일정시간마다 상기 반응액 10㎕를 취하여, 위와 동일한 완충용액에 100㎕의 반응기질을 포함하는 분석 용액 80㎕에 가하여 남아있는 효소활성을 검정하였다. 이때, 반응기질로는 Ser-Ile-Ala-Glu-(p-NO2)-Phe-Leu-Val-Arg-Ala-Lys-His의 11개 아미노산으로 이루어진 올리고 펩타이드를 사용하였으며, 이 기질은 HIV 프로테아제에 의해 (P-NO2)-Phe과 Leu 사이의 아미드 결합이 끊어지게 된다. 반응속도는 (P-NO2)-Phe의 280nm에서의 강한 흡광도를 이용하여, 반응전의 기질과 반응 후의 생성물을 HPLC로 분리하여 생성물의 상대적양을 측정함으로써 결정하였다. 시간에 따른 효소활성의 감소량을 구하고 감소량의 자연로그값(ln)을 시간에 대하여 그래프로 나타냄으로써 이로부터 Kobs를 구하였다. 억제상수는 하기식에 의해 구하였다.

억제 효능이 뛰어나서 억제제의 농도를 효소의 농도보다 월등히 많은 조건(Steadystate Kinetic)으로 할 수 없는 경우에는 상기식보다는의

카니즘식으로부터 각 시간마다 활성 효소의 상대적 농도 E/(E+EI=EI')의 값을 KINSIM/FITSIM 프로그램에 입력하여 계산함으로써 억제상수 K1와 Kina 그리고 2차 속도상수(Second Order Rate Constant)인 Kina/K1를 구하였다. 상기 분석 결과는 표3에 나타내었다.

항 바이러스 활성 및 세포독성 측정

항 바이러스 활성은 신키티움 형성조사와 역전사효소검정을 통해 바이러스의 복제를 50% 저지하는 농도(IC50)를 결정함으로써 확인하였다.

1 x 105 세포의 H9와 Sup T1 세포주를 24공 평판에 넣고 여러 농도의 본 발명의 화합물을 가하였다. 여기에 HIV-1 이노큘럼을 200TCID50(200배의 50%) 세포 감염농도, Tissue culture infectious dose)로 넣고 rpmi- 1640 배지를 가한 후 37℃에서 배양하였다. Sup T1의 경우에는 3 내지 9일 후 신키티움이 형성된 갯수를 조사하였다. H9의 경우는 3일 간격으로 배양액의 3/4을 같은 농도의 새 배양액으로 바꾸어 주었다. 9일 후 6㎖를 취해 1000rpm으로 10분동안 원심분리한 후, 상층액 5㎖를 취해 2.5㎖y의 30% PEG(Poly ethylene Glycol, 분자량 6000에서 8000정도)와, 0.4NaCl을 가하고 0^oC에서 하룻밤 정도 방치하여 바이러스를 침전시켰다. 2000rpm으로 45분간 원심분리하여 상층액은 버리고, 침전물에 20㎕의 역전사효소 현탁 완충액(50mM 트리스 완충액(Sigma), pH 7.5, 1mM 디티오트레이롤, 20% 글리세롤, 0.25M KCl 및 트리톤 X-100 0.25%)을 가하여 희석시켜서 에펜도르프 튜브에 넣어 -70℃로 사용할 때까지 보관하였다. 위의 바이러스 현탁액을 드라이아이스에서 2분간 얼렸다가 2분간 37℃에서 녹이는 과정을 세 번 되풀이 한 후 4℃에서 원심분리하고 상층액을 이용하여 역전사 효소 검정을 하였다. 역전사 효소 검정 용액에는 위의 바이러스 현탄액 10㎕, 10㎕의 완충용액(250mM 트리스 버퍼, pH7.5, 37.5mM MgCl₂, 0.25% 트리톤 X-100), 1.2㎕의 200mM 디티오트레이톨, 5㎕의 100μM 올리고(dT)-폴리(A)(Boeringer Manheim, 12-18 올리고머),³H이 포함된 TTP(티민트리포스페이트) 1㎕(1μCi), 그리고 23.6㎕의 물을 넣었다. 1시간후 위의 용액들을 WHATMAN DEB1 여과지에 부은 후 2 x SSC 완충용액에 넣었다. 2 x SSC 완충용액으로 세 번 씻은 후(1번에 10분 정도 소요), 95%의 에탄올로 10초간 두 번 씻는다. 여과지를 알루미늄 호일에 넣고 적외선 전구로 말린 후 액체 신틸레이션 계수기로 정량한다.

항 AIDS제의 최대 허용치를 결정하기 위한 세포독성을 검사하기 위해, H9 세포 또는 Sup T1 세포에 0.1μM 내지 100μM범위의 화합물을 가한 후 rpmi-1640 배지에서 37^oC로 배양하고, 3일 간격으로 주면서 세포의 증식 정도를 트리판 블루 다이익스크루전 방법(Trypan blue dye exclusion technique)으로 혈구계산기(Hemacytometer)를 사용하여 두주간 관찰한 후 세포독성 CT50(세포의 50%가 죽는 값)를 결정하였다. 표4는 본 발명의 특정화합물이 갖는 항세균활성 및 세포독성의 결과이다.

Claims (4)

1. 하기 일반식(I)의 시스-에폭사이드를 갖는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염:

   상기식에서,

   R¹은 방향족 라디칼 또는 사이클로알킬로 치환된 저급 알킬이고, A 및 D는 각각 독립적으로

   식(여기에서, R₂는 비치환되거나 아릴로 치환된 저급 알킬이고, X는 O, NH 또는 N-CH₃이며, R3은 퀴놀린, 피리딘 또는 수소임)으로 표시되고, B는 양쪽이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산이고, C는 양쪽이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산이거나, 식(여기에서, R₄는 비치환되거나, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬이,며 Y는 CH₂, O 또는 NH 임)으로 표시된다.
2. 약제학적 유효량의 제 1 항의 화합물 또는 그의 염을 약제학적으로 허용되는 적당한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는, 후천성 면역 결핍증(AIDS) 또는 HIV 감염의 치료 또는 예방에 유용한 약학 조성물.
3. 가) 하기 일반식(II)의 화합물을 수소화하여 하기 일반식(a)의 디아민을 얻고; 나) 상기 단계(가)에서 생성된 디아민(a)을 아미드 커플링시킴으로 포함하는, 하기 일반식(I) 화합물의 제조방법:

   상기식에서, R¹, A, B, C 및 D는 제 1 항에 정의된 바와같고, Z는 벤질옥시카르보닐을 나타낸다.
4. 가) 하기 일반식(III)의 화합물을 아미드 커플링시켜 하기 일반식(b)의 화합물을 얻고, 나) 상기 단계 가)에서 생성된 화합물(b)의 보호기를 제거하여 하기 일반식(c)의 화합물을 얻고, 다) 상기 단계 나)에서 생성된 화합물(c)를 아미드 커플링시켜 하기 일반식(d)의 화합물을 얻고, 라) 상기 단계 다)에서 생성된 화합물(d)를 에폭시화함을 포함하는, 하기 일반식(I) 화합물의 제조방법:

   상기식에서, R¹, A, B, C 및 D는 제1항에 정의된 바와같고, P는 t-브톡시카르보닐을 나타낸다.