CN1147261A

CN1147261A - 因子Xa抑制剂

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Publication number: CN1147261A
Application number: CN95192811A
Authority: CN
Inventors: 法赫德·阿尔-奥贝迪; 米哈尔·列布尔; 詹姆斯·A·奥斯特里姆; 佩维尔·萨法尔; 埃琳娜·斯蒂兰多娃; 彼德·斯特罗普; 阿明·沃尔泽
Original assignee: Selectide Corp
Current assignee: Selectide Corp
Priority date: 1994-04-26
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 1997-04-09
Anticipated expiration: 2015-04-25
Also published as: AU2368395A; EE03973B1; EP0758341A1; SI9520044B; PL188132B1; AU707653B2; FI964317A; DE69532754D1; LV11740B; EP0758341B1; EE9600146A; LT4218B; FI964317A0; FI120494B; KR100380124B1; IL113505A0; ZA953361B; JPH10503477A; ATE262536T1; NO318759B1

Abstract

本发明提供了能够特异性抑制因子Xa活性的化合物。该化合物由结构X1-YIR-X2组成，其中X₁为H、酰基、烷基、酰烷基、芳烷基或一种或多种氨基酸，X₂为经修饰的C-末端基团、一种或多种羧基保护基团或一个或多个氨基酸或它们的替代物，Y、I和R分别为酪氨酸、异亮氨酸和精氨酸，或是具有与Y、I和R同样功能活性的肽解模拟物或有机结构物。另外，本发明提供了一种结构为A₁-A₂-(A₃)_m-B，其中m是0或1的化合物。本发明的化合物可以是线型的或环状的，链长可以为约2-43个残基。一定程度说，本发明化合物的特征在于该化合物能够特异性地抑制因子Xa的活性，其ki≤100μM，优选≤2nM，并且基本上不会抑制凝血链中所涉及到的其它蛋白酶的活性。本发明还提供了特异性抑制因子Xa活性的方法，在体外及个体内抑制血凝的方法，以及测定因子Xa水平或活性的方法。

Description

因子Xa抑制剂

发明领域

概括地说，本发明涉及的是凝血蛋白抑制剂，更具体地说，本发明涉及的是凝血酶因子Xa的特异性抑制剂。

发明背景

形成凝血的能力对于生存来说是至关重要的。但是，当处于某些病症状态时，在循环系统内形成凝血这本身却是一种发病源。因此，有时可能会要求防止出现血块形成这一现象，然而，又不希望完全抑制凝血系统，因为这样一来会出现威胁生命的大出血现象。

为了减少血管内的凝血形成，本领域技术人员一直在试图研制出一种凝血酶原酶或因子Xa的有效抑制剂，把这种抑制剂结合到凝血酶原酶复合物上，从而在凝血过程中激活凝血酶。

一旦达到凝血酶的阈值浓度，适当浓度的因子Xa抑制剂就会提高诱发凝血所要求的形成凝血酶原酶试剂的水平，但又不会过渡延长凝血过程。尽管长期以来存在着对这种抑制剂的需求，但直到目前为止，临床应用上仍然尚无有效的特异性因子Xa抑制剂。

在许多临床应用中，十分需要抗凝血剂治疗处理。而目前使用的药物在许多特定临床应用中是不能令人满意的。例如，将近50％的整体髋骨复位患者发展为深度静脉血栓形成(DVT)。目前批准使用的治疗方法包括定剂量低分子量肝素法和变剂量肝素法。即使采用了这些药物疗法，仍有10％-20％的患者发展为DVT，5％-10％的患者发展为出血并发症。

需要有效抗凝血剂的另一类临床情形是指实施横腔(transluminal)冠状血管成形术、处于心肌梗塞形成危险或出现逐渐增强性心绞痛的情况。目前普遍接受的治疗方法是给予肝素和阿司匹林，在24小时治疗过程内6％-8％的突发性脉管闭合症与此治疗方法有关。另外，因使用肝素而需要输液治疗的出血并发症所占的比率大约为7％。此外，尽管认为延迟闭合症是有意义的，但疗程终止后继续给予肝素已价值不大，并可能是有害的。

最广泛使用的凝血抑制剂是肝素和有关的硫酸化多糖、LMWH和硫酸肝素。这些分子通过促进凝血过程中的天然调节剂、抗凝血酶III与凝血酶和因子Xa的结合而发挥着它们的抗凝血作用。肝素的抑制活性主要是针对凝血酶的，后者的失活作用比因子Xa要快100倍左右。虽然相对于肝素而言，硫酸肝素和LMWH是更有效的Xa和凝血酶抑制剂，而且作为Xa抑制剂又比凝血酶抑制剂稍有效些，但体外差别并不很大(3-30倍)，对体内的作用来说是毫无意义的。水蛭素和hirulog是目前临床试验用的另外两种凝血酶特异性抗凝血剂。但是，这些抑制凝血酶的抗凝血剂也与出血并发症有相关性。

对狒狒和狗所做的临床前期研究表明，因子Xa的特异性抑制剂能够防止凝血形成，不会产生使用直接凝血酶抑制剂所观察到的那种出血副作用。这类因子Xa抑制剂包括如2，7-双-(4-脒基亚苄基)-环庚酮和Nα-甲苯磺酰基甘氨酰-3-脒基苯丙氨酸甲酯(“TENSTOP”)，它们的有效抑制浓度(K_i)分别为约20nM和800nM。(+)-(2s)-2-(4({(3s)-1-亚氨代乙酰基-3-吡咯烷基}氧基)苯基)-3-(7-脒基-2-萘基)丙酸也代表一类因子Xa抑制剂(Katakure等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.197：965-972(1993))。但是迄今为止这些化合物尚未在临床上进行开发。

另外，因子Xa的特异性蛋白质抑制剂已经得到确认，它们包括如antistasin(“ATS”)和蜱抗凝血剂肽(“TAP”)。ATS是由水蛭(Haememterin officinalis)分离得到的，含有119个氨基酸，对因子Xa的K_i为约0.05nM。TAP是由蜱(Ornithodoros moubata)分离得到的，含有60个氨基酸，对因子Xa的K_i为约0.5nM。

业已在大量动物模型系统中研究了重组产生的ATS和TAP的效果。这两种抑制剂相对于其它抗凝血剂而言均可减少出血时间，并且在促凝血酶原激酶诱导的结扎颈静脉的深度静脉血栓形成模型中能够防止血凝现象。该模型达到的结果与当前选用的药物肝素所获得的结果是相互关联的。

还发现，皮下ATS在促凝血酶原激酶诱导的播散性血管血凝(DIC)模型中是一种有效的治疗剂。TAP能够有效地防止“高剪切”动脉血栓形成和“流速降低”，这两种现象均是由于外科手术放置聚酯(“DACRON”)移植物引起的，所说的移植物的放置剂量能够达到临床上可接受的延长激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)，即小于大约2倍的延时。相比之下，即使给予增加aPTT5倍剂量的标准肝素，仍不能防止血栓形成和移植物内的流速降低。aPTT是一种对凝血酶抑制剂特别敏感的临床凝血分析值。

ATS和TAP一直未能进行临床开发。这两种抑制剂的一个主要缺点是，需要重复剂量给药，由此产生使之失效的抗体，限制它们在临床上的有效应用。另外，TAP和ATS的大小不可能口服给药，进一步限制了能够受益于这些药剂的患者人数。

因子Xa特异性抑制剂在医药实践中具有实际应用价值。具体而言，因子Xa抑制剂在当前可选择的药物，即肝素和有关的硫酸化多糖这样的环境下是有效的，后两种是无效或仅仅勉强有效。因此，需要有一种有效的，不会引起不期望副作用的，低分子量的因子Xa特异性凝血抑制剂。本发明满足了这一需求，并带来了相应的优点。

发明概述

本发明提供了具有特异性抑制因子Xa活性的化合物。本发明的化合物具有结构X₁-Y-I-R-X₂，其中X₁为氢(H)、酰基、烷基或芳基烷基、或者一种或多种氨基酸，X₂为修饰的C-末端基团，一种或多种羧基保护基团(见下文)，一种或多种氨基酸，或其它的取代基团，Y、I和R分别为氨基酸酪氨酸、异亮氨酸和精氨酸，以及分别具有酪氨酸、异亮氨酸和精氨酸同样功能活性的肽分解模拟(peptidomimetic)结构或有机结构。另外。本发明的化合物具有如本文所定义的结构A1-A2-(A3)_m-B。

本发明的化合物可以是线型的或环状的，长度为约2-43个残基，N-末端或C-末端或两者均可被修饰。这些化合物具有因子Xa特异性抑制活性，K_i≤100μM，优选K_i≤2nM，并且基本上不会抑制包括在凝血链中的其它蛋白酶的活性。这些化合物的具体实例包括Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH₂、Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)O(CH₃)、Ac-Tyr-{ψ(CH₂NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂(其中“ψ”表示假肽键，可以是如“(CH₂NH)”所示的还原键；假肽键用括号中的“ψ”即“{ψ}”表示)、Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH₂(4-吡啶基)、Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH₂NH)}-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-Tyr-Chg-Arg(NO₂)-{ψ(CH₂NH)}-Leu-NH₂、Ac-Tyr-Ile-Arg-{ψ(COCH₂)}-Gly-Pro-NH₂、Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-C₃H₇N)-Leu-Ala-NH₂、Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH₂、Tyr-Ile-Arg-NH₂、(D)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH₂、环(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)、Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂、Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂，以及它们的可成药盐和C-末端衍生物如它们的酰胺、酯、醇和醛(参见表5)。本发明还提供了特异性抑制因子Xa活性的方法和抑制个体血凝的方法。本发明同时还提供了测定因子Xa水平或活性的方法。

附图说明

图1给出了凝血链的示意图。

图2例举了本发明化合物的结构。

图3给出了制备某些本发明化合物的合成路径。

发明详述

血凝作用是一复杂的过程，涉及一系列渐次扩大的酶激活反应，其中血浆酶原依次被一定的蛋白水解作用激活。从机上说，凝血链分为内源和外源两条路径，当因子X激活时汇聚在一起，随后进入同一条路径产生凝血酶(参见图1)。

本发明证明，内源路径在保证纤维蛋白形成和生长方面起着重要作用，而外源路径在血液凝固开始阶段是很关键的。通常认为，当组织因子/因子VIIa复合物形成时，在物理意义上血凝开始。所说的复合物一旦形成即通过激活因子IX和X快速引发血液凝固。新产生的因子Xa与因子Va和磷脂形成一对一的复合物以形成凝血酶原酶复合物，后者负责将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白。随着时间的推移，因子VIIa/组织因子复合物的活性(外源路径)受到Kunitz型蛋白酶抑制剂蛋白、TFPI的抑制，当它们复合为因子Xa时，可以直接抑制因子VIIa/组织因子的蛋白水解活性。在受抑外源系统的参与下，为了维持血凝过程，通过内源路径的凝血酶的调节活性生产额外的因子Xa。因此，凝血酶扮演着双重自动催化角色，即调节自身的产率和纤维蛋白原向纤维蛋白的转化作用。

凝血酶生成的自动催化性质对非调节性出血是重要的安全保障，它确保，一旦达到凝血酶原酶的给定阈值，血液凝固就将完成，例如有效结束出血症状。因此，特别希望研制出即能够抑制血凝作用又不会直接抑制凝血酶的药剂。

本发明提供了YIR肽，这类肽是具有抑制因子Xa活性，但基本上不会抑制包括在血凝途径中的其它蛋白酶活性的化合物。本文所用术语“化合物”或“YIR肽”是指非自然存在的Tyr-Ile-Arg(YIR)肽及其类似物和模拟物，它们能够抑制因子Xa的活性。YIR序列本身是指“YIR基元序列”，由三肽酪氨酸-异亮氨酸-精氨酸组成，或是其功能等同物，如pAph-Chg-PalMe(3)、pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂和pAph-Chg-AMP(4)(参见表1所列缩写)。本发明的化合物包括至少一个YIR基元序列或其功能等同物，并且能够特异性地抑制因子Xa的活性。为了方便起见，本文主要采用术语“化合物”和“YIR肽”来表示本发明的肽，包括功能等同物如肽类似物、肽模拟物和合成有机化合物。本发明YIR肽的功能等同物其部分特征在于具有本文所公开的结构，且其抑制因子Xa活性的K_i为≤100μM(参见实施例XXXVII)。

本发明YIR肽的类似物包括，如含有非自然存在的氨基酸或经化学修饰的氨基酸的肽，这些肽使化合物保留了因子Xa抑制活性(参见如表2)。同样，肽模拟物是模拟本发明YIR肽的结构，且保持因子Xa抑制活性的非氨基酸化学结构物。这类模拟物通常其特征在于具有类似于在相应的正常YIR肽所发现的物理特征，如尺寸、电荷或疏水性，这些特性表现在适当的空间取向作用方面。肽模拟物的一个具体实例是其中一个或多个氨基酸中的酰胺键被如碳-碳键或本领域所熟知的其它键所取代的那种化合物(如参见Sawyer，Peptide Based DrugDesign P.387-422(ACS，Washington DC 1995)，该文献引入本文以供参考)。因此，本发明还提供了具有A1-A2-(A3)_m-B结构的因子Xa抑制化合物，其中m为0或1，如本文所公开的(见下文)。本发明提供了这类肽的实例，这类肽可以是模拟化合物。

最广义地说，本文所用的术语“氨基酸”是指能够由基因编码翻译的、组成蛋白质链节的自然界存在的20种氨基酸，包括L-氨基酸和D-氨基酸，除非另有说明，同时还指经化学修饰的氨基酸如氨基酸类似物，通常不结合到蛋白质上的自然界存在的氨基酸如正亮氨酸，以及具有本领域已知的氨基酸特性的化学合成化合物。例如，能够使肽化合物的构象限制与天然苯丙氨酸或脯氨酸相同的Phe或Pro的类似物或模拟物包含在“氨基酸”的定义中，并且是本领域技术人员已知的。在本文中所说的类似物和模拟物是指氨基酸的“功能等同物”。氨基酸和氨基酸类似物的其它实例已由Roberts和Vellaccio给出(ThePeptides：Analysis，Synthesls，Biology，Eds.Gross and Meiennofer，Vol.5，p.341，Academic Press，Inc.，N.Y.1983，该文献引入本文作为参考)。表1列出了氨基酸、氨基酸类似物和模拟结构物的缩写。

表1

本说明书中使用的缩写

化合物缩写#1 缩写#2

乙酰基 Ac

丙氨酸 Ala A

3-(2-噻唑基)-L-丙氨酸 Tza

脒 AMDN

偕胺肟(C(NH₂)＝N-OH) (CNOH.NH₂)

(N-甲基吡啶鎓)甲基 AMP

(4-(N-甲基吡啶鎓))甲基 AMP(4)

1-(N-甲基吡啶鎓)

乙-1-基 AEMP

1-(4-(N-甲基吡啶鎓))

乙-1-基 AEMP(4)

精氨酸 Arg R

天冬酰胺 Asn N

天冬氨酸 Asp D

苯甲酰基 Bz

2-苯并呋喃羧基 Bzf

苄基 Bzl

苄氧羰基 Cbz

5-苯并咪唑羧基 5-Bzim

叔丁氧羰基 Boc

苯并三唑-1-基氧-

三-(二甲基氨基)-

六氟磷酸磷 Bop

β-丙氨酸 βAla

β-缬氨酸 βVal

β-(2-吡啶基)-内氨酸 Pal(2)

β-(3-吡啶基)-丙氨酸 Pal(3)

β-(4-吡啶基)-丙氨酸 Pal(4)

β-(3-N-甲基吡啶鎓)

-丙氨酸 PalMe(3)

溴代-三-吡咯烷酮基-

六氟磷酸磷 PyBroP

叔丁基 tBu，But

叔丁氧羰基 Boc

咖啡酸 Caff

羰基二咪唑 CDI

半胱氨酸 Cys C

5-氯吲哚-2-羧基 CICA

环己基 Chx

环己基丙氨酸 Cha

环己基甘氨酸 Chg

2，4-二氨基丁酸 Dab

Dab-衍生的二甲基

amidinium Dab(Nγ-C₃H₇N)

2，3-二氨基丙酸 Dap

Dap-衍生的二甲基

amidinium Dap(Nβ-C₃H₇N)

3，5-二硝基酪氨酸 Tyr(3，5-NO₂) Y(3，5-NO₂)

3，5-二碘代酪氨酸以 Tyr(3，5-I) Y(3，5-I)

3，5-二溴代酪氨酸 Tyr(3，5-Br) Y(3，5-Br)

N，N-二异丁基甲酰胺 DIBA

N，N-二异丙基甲酰胺 DIPA

4-N，N-二甲基氨基吡啶 DMAP

9-芴基甲氧羰基 Fmoc

5-氟代吲哚-2-羧基 FICA

甲酰基 For

谷氨酰胺 Gln Q

谷氨酸 Glu E

γ-羧基谷氨酸 Gla

甘氨酸 Gly G

组氨酸 His H

高精氨酸 hArg hR

5-羟基吲哚-2-羧基 5-Hic

N-羟基苯并三唑 HOBt

3-羟脯氨酸 Hyp

亚氨基二乙酸 Ida

5-氨基吲哚-2-羧基 5AM2IN

5-硝基吲哚-2-羧基 5NOINDC

DL-二氢吲哚-2-羧基 2INCA

异丁基 iBu

异亮氨酸 Ile I

异烟酸 Isn

N-甲基-异烟酸 IsnMe

异哌啶甲酸 Ina

异丙醇 iPrOH

1-异喹啉羧基 1-Iqc

3-异喹啉羧基 3-Iqc

亮氨酸 Leu L

叔亮氨酸 Tle

赖氨酸 Lys K

巯基-β，β-1，5-

亚戊基丙酸 Mpp

巯基乙酸 Mpa

巯基丙酸 Mpr

甲醇 MeOH

蛋氨酸 Met M

4-吗啉代甲酰胺 MORA

N-甲基吗啉 NMM

1-萘基丙氨酸 Nal(1)

2-萘基丙氨酸 Nal(2)

烟酸 Nic

哌啶甲酸 Npa

N-甲基烟酸 NicMe

正精氨酸 nArg nR

正亮氨酸 NLe nL

正缬氨酸 Nva nV

鸟氨酸 Orn

鸟氨酸衍生的二甲基

amidinium Orn(Nδ-C₃H₇N)

苯基 Ph

苯丙氨酸 Phe F

对胍基苯丙氨酸 Phe(Gua) F(pGua)

对氨基苯丙氨酸 Phe(NH₂) F(pNH₂)

对氯苯丙氨酸 Phe(Cl) F(pCl)

对氟苯丙氨酸 Phe(F) F(pF)

对硝基苯丙氨酸 Phe(NO₂) F(pNO₂)

对羟苯基甘氨酸 Pgl(OH)

对甲苯磺酰基 Tos

2，2，5，7，8-五甲基-苯并

二氢吡喃-6-磺酰基 Pmc

间脒基苯丙氨酸 mAph

对脒基苯丙氨酸 pAph

苯基甘氨酸 Pgl

苯基丙二酸 Pma

哌啶基 PIP

1-哌啶子基甲酰胺 PIPA

L-哌啶酸 Pip

脯氨酸 Pro P

2-吡嗪羧基 Pza

2-喹啉羧基 2-Qca

4-喹啉羧基 4-Qca

肌氨酸 Sar

S-叔丁基 SBut

结合在“TENTAGEL”上

的SCAL联结子 SCAL-TG

丝氨酸 Ser S

四氢异喹啉-3-羧基 Tic

苏氨酸 Thr T

三氟乙酰基 Tfa

色氨酸 Trp W

酪氨酸 Tyr Y

3-碘代酪氨酸 Tyr(3-I) Y(3-I)

O-甲基酪氨酸 Tyr(Me) Y(Me)

缬氨酸 Val V

*D-构型的氨基酸用前缀D-加上三个字母的代码表示(如，D-Ala、D-Cys、D-Asp、D-Trp)，或者用一个字母代码的小写字母表示(分别是a、c、d、w)。

本文所用术语“因子Xa活性”是指因子Xa本身或以称为凝血酶原酶复合物的亚单位形式催化凝血酶原转化为凝血酶的能力。相对于因子Xa活性而言，术语“抑制作用”包括对因子Xa活性的直接和间接两种抑制作用。例如，通过使本发明的YIR肽结合到因子Xa或结合到凝血酶原酶上，从而防止凝血酶原结合到凝血酶原酶复合物的活性位点上可以实现对因子Xa活性的直接抑制作用。又如通过把本发明的化合物结合到可溶性因子Xa上以防止其连接到凝血酶原酶复合物上可以实现对因子Xa活性的间接抑制作用。

在本发明中，针对因子Xa活性抑制而言的术语“特异性”是指YIR肽可以抑制因子Xa的活性，但基本上不会抑制包括血浆酶和凝血酶在内的其它特定蛋白酶的活性(采用同样的抑制剂浓度)。在血液凝固和纤维蛋白溶解链中涉及到所说的这些蛋白酶(参见表2及实施例XXVII)。

表2

选用的化合物对五种酶的抑制活性

K_i(μM)化合物 Xa 凝血酶血浆酶胰蛋白酶弹性蛋白酶Ac-Y-I-R-L-A-A-F-T 1.5 100 NT ＞200^* ＞100Ac-Y-I-R-L-P 0.5 ＞200 ＞200 ＞200 ＞100y-I-R-L-P 0.2 ＞200 ＞200 ＞200 ＞100Ac-(iBu)Y-I-R-L-P 0.04 25 ＞200 NT ＞100″TENSTOP″ 2 2 ＞200 NT ＞200^*说明当采用试验用化合物(所给出的)的最高浓度时对酶活性没有显著的抑制作用。

表2的结果证明，本发明的YIR肽作为因子Xa的抑制剂是有效的，但它基本上不能抑制其它丝氨酸蛋白酶如凝血酶或血浆酶的活性，这些蛋白酶涉及血液凝固和纤维蛋白溶解过程。

本文所用术语“取代基”是指在本文所述肽、肽类似物、模拟物或有机化合物的主链或侧链上进行取代的任何各种化学基团。取代基可以包括本领域技术人员已知的各种不同的部分(如参见Giannis and kolter，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：1244-12679(1993)，该文献引入本文作为参考)。本发明公开了大量的实施例来证明取代基的取代作用，其中包括例如pNH₂取代基取代在苯丙氨酸上获得F(pNH₂)，卤素取代在酪氨酸上获得如Y(3-I)或Y(3，5-I)。另外，取代基可以是例如杂原子如氮(N，参见如Pal)、氧(O，参见如邻-甲基酪氨酸)或硫(S，参见如Tyr(SO₃H))，它们可以被取代基取代。因此，含N-、S-或O-的部分如-SO₃H也被认为是本文所定义的“取代基”。此外，取代基还可以是氨基保护基团或羧基保护基团。

从最广义上说，本文所用术语“烷基”是指饱和或不饱和的、直链、支链或环状的约1-13个碳原子链。因此，术语“烷基”包括，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丁基、1-甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丙基、正戊基和正己基，亚烷基、环碳链如环己基和环戊基，以及直链或支链和环碳链的组合，如甲基-环己基或环丙基-亚甲基。另外，应当知道，本发明定义的烷基可以被取代基进一步取代。同样，最广义地说，术语“酰基”是指含有羧基的饱和或不饱和的、约1-13个碳原子的直链、支链或环状链。因此，术语“酰基”包括如甲酰基、乙酰基和苯甲酰基等。

术语“芳基”是指含有约5-13个碳原子，且至少一个具有共轭π电子系统的“环”基团的芳香基团。芳基的实例包括如杂环芳基、二芳基和它们的类似物及衍生物，所有的这些基团可以被一个或多个取代基取代，也可以不被取代。术语“芳烷基”是指如上所定义的被芳基取代的烷基。适宜的芳烷基包括苄基和吡啶甲基等，所有的这些基团还可以被进一步取代，或不被取代。

本文也采用术语“杂烷基”、“杂芳烷基”和“杂芳基”，是指分别被一个或多个杂原子如N、O或S原子取代的烷基、芳烷基和芳基。另外，所用术语“杂环”是指被一个或多个杂原子取代的环烷基或芳基。例如在表1和3中公开了众多杂烷基、杂芳烷基、杂芳基和杂环的实例，或者是现有技术已知的。

本发明的肽在其N-末端或C-末端可以分别用氨基保护基或羧基保护基进行修饰。本发明公开了众多这类修饰物(如参见表3)。肽或肽类似物的N-末端可以进行化学修饰，这样即使得N-末端氨基被如乙酰基、环戊基羧基、异喹啉基羧基、呋喃甲酰基、甲苯磺酰基、吡嗪羧基或其它基团取代，它们可被如上所述的取代基取代。N-末端还可以用如可逆酰胺键取代。应该知道，广义上说，术语“氨基”是指存在于肽中的任何游离氨基，包括伯、仲或叔氨基。相对而言，术语“N-末端”是指存在于按常规方式书写的肽上的第一个氨基酸中的α-氨基。

本发明肽的N-末端可以通过与氨基保护基团连接而保护起来。广义上说，术语“氨基保护基团”是指能够与自由氨基基团，包括如本发明肽N-末端上的α-氨基基团反应的化学基团。通过与之进行反应，氨基保护基团能够保护活性氨基基团使之避免如在合成过程中或由于外切肽酶对最终化合物的活性作用而发生不期望的反应。对氨基基团的修饰还可以带来其它好处，包括例如提高化合物的溶解性或活性。各种氨基保护基团如本文所述(见表3)，或者是现有技术已知的那些，它们包括例如酰基如乙酰基、吡啶甲酰基(picoloyl)、叔丁基乙酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、苯甲酰基，包括如2-芳基-2-O-苯甲醛肟(benzyloxime)(参见实施例XVI)之类的苯甲醛肟，以及氨基酰基残基，这些基团本身可以被氨基保护基团修饰。例如在The Peptides(eds.Grossand Meienhofer，Vol.3，Academic Press，Inc.，N.Y.1981)以及Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis(第二版，P309-405，John Wiley&Sons，New York 1991)中还公开了其它氨基保护基团，这些文献均引入本发明作为参考。在本发明中，本发明肽或肽类似物的N-末端氨基经修饰的任何产物均被称为“N-末端衍生物”。

同样，肽C-末端的羧基基团可以用羧基保护基团进行化学修饰。术语“羧基基团”和“C-末端”与上述“氨基基团”和“N-末端”定义方式相同。例如存在于肽C-末端上的羧基可以通过将C-末端羧基还原为醇或醛，或通过生成口服用酯，或用诸如噻唑基、环己基或其它基团之类的取代基取代羧基实现修饰。口服用酯是本领域公知的，包括例如烷氧甲基基团如甲氧甲基、乙氧甲基和异丙基甲基等；α-(C₁-C₄)烷氧乙基如甲氧乙基、乙氧乙基、丙氧乙基和异丙氧乙基等；2-氧代-1，3-二氧代(dioxolen)-4-基甲基基团如5-甲基-2-氧代-1，3-二氧代-4-基甲基和5-苯基-2-氧代-1，3-二氧代-4-基甲基等；C₁-C₃烷基硫代甲基基团如甲基硫代甲基、乙基硫代甲基和异丙基硫代甲基等；酰氧甲基如新戊酰氧甲基和α-乙酰氧甲基等；乙氧羰基-1-甲基；α-酰氧基-α-取代的甲基基团如α-乙酰氧乙基、3-苯并[c]呋喃酮基或5，6-二甲基苯并[c]呋喃酮基、1-(C₁-C₄烷氧羰基氧)乙-1-基基团如1-(乙氧羰基氧)乙-1-基；以及1-(C₁-C₄烷氨基羰基氧)乙-1-基基团如1-(甲氨基羰基氧)乙-1-基。

本发明的肽可以通过将其连接到羧基保护基团上而实现修饰。羧基保护基团是本领域公知的，通过将其连接到肽上能够保护羧基基团防止发生不期望的反应(如参见Greene and Wuts，supra，P224-276(1991)，该文献引入本文作为参考)。本领域技术人员都知道可以对肽上的N-末端氨基或C-末端羧基进行上述修饰，同样，也可以对存在于如本发明肽中的氨基酸或氨基酸类似物侧链上的活性氨基或羧基实现上述修饰。用于这种修饰的方法在本文中有说明，或者是本领域已知的。

本发明提供了特异性抑制因子Xa活性的化合物。本发明化合物具有通式结构X₁-YIR-X₂或其功能等同物，其中X₁为H、酰基、烷基、芳烷基或一个或多个氨基酸，X₂为经过修饰的C-末端基团、一个或多个羧基保护基团，或者一个或多个氨基酸或其它取代基团如氨基保护基团。本发明的化合物用作治疗各种临床病症的抗凝血剂。本发明化合物还用于各种实验室方法以防止血液样品凝固。

本发明还提供了一种具有通式A1-A2-(A3)_m-B的特异性抑制因子Xa活性的化合物，其中m为0或1，A1为R₁-R₂-R₃，A2为R₄-R₅-R₆；且A3是R₇-R₈-R₉；其中的R₁选自1-20个氨基酸；

X选自N、CH和NC(O)，R′₁和R″₁分别选自H、烷基、酰基、芳基、芳烷基和氨基保护基团，其中R₁可以被取代基取代；R₂为-CR₉₉R₁₀₀-，其中R₉₉和R₁₀₀分别选自H、烷基、芳烷基、杂芳烷基和杂芳基，并且R₉₉和R₁₀₀分别可以被取代基取代；R₃选自-C(O)-、-CH₂-、-CHR₉₉-C(O)-和-C(O)-NR₃₅-CH₂-C(O)-，其中R₃₅为桥连基团-C(O)-CR₅₅-中的CHR₅₅基团；R₄为选自-CH₂-和-NR₅₀-，其中R₅₀选自H、烷基、芳烷基和杂环；R₅为＞CR₂₀₁R₂₀₂，其中R_20l和R₂₀₂分别选自H、烷基、芳基和芳烷基，并且R₂₀₁和R₂₀₂分别可以被取代基取代；R₆选自-C(O)-、-CH₂-和-CHR₉₉-C(O)-；R₇选自-CH₂-和-NR₅₁-，其中R₅₁为H、烷基、芳烷基、杂烷基和杂芳烷基，并且这些基团部分均可被选自Q或-(CH₂)_n-Q的基团取代，其中n为0-5，Q选自氨基、脒基、咪唑基和胍基，这些基团可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基铵的可成药盐、其异酰脲或异硫酰脲；R₈为-CR₂₁₀R₂₁₁-，其中R₂₁₀和R₂₁₁分别选自H、烷基、烷芳基、杂环，并且这些基团部分均可被选自Q或-(CH₂)_n-Q的基团取代，其中n为0-5，Q选自氨基、脒基、咪唑基和胍基，这些基团可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基铵的可成药盐、其isoureide或isothioueide；R₉选自-C(O)-、-CH₂-和-CHR₉₉-C(O)-；其中，当m为1时，B选自1-20个氨基酸、-NHR₅₂、-NR₆₀R₆₁、-OR₇₀和-CHR₆₀R₆₁，其中R₅₂选自H、烷基、芳烷基、杂芳烷基和杂芳基；R₆₀和R₆₁分别选自H、烷基、芳烷基、芳基、杂芳烷基和杂芳基，R₇₀选自H、酰基、烷基、芳烷基和杂芳烷基，而当m为0时，B选自1-20个氨基酸、-OR₇₀、-NHR₅₂和-NR₆₀R₆₁，并通过酰胺键或酯键连接到R₆上；B可以被取代基取代，如果当R₃为-CH₂-或-CHR₉₉-C(O)-时，R₄则为NR₅₀；当R₄为-CH₂-时，R₃则为-C(O)-或-CHR₉₉-C(O)-；当R₆为-CH₂时，R₇为-NHR₅₁-，当R₇为CH₂时，R₆为-C(O)-或-CHR₉₉-C(O)-；当R₄为-NR₅₀-和R₁为时，R₅₀和R′₁共同构成具有式-C(O)-CHR₅₅-的桥连基团，其中CHR₅₅代表R₅₀，羰基代表R′₁，R″₁和R₅₅分别为H、C₁-C₆烷基或芳烷基；当R₃是-C(O)-NR₃₅-CH₂-C(O)-时，则R₄是-NR₅₀，R₁为

时，R₃₅和R′₁共同构成具有式-C(O)CHR₅₅-的桥连基团，其中C(O)代表R′₁，CHR₅₅代表R₃₅；R″₁和R₅₅分别为H或C₁-C₆烷基(参见图2)。

本发明的化合物可以含有由R₁、R₂和R₃，如果需要还可以有R₄形成的环状N-末端。这种化合物例如能够由如上所述的结构A1-A2-(A3)_m-B来定义，其中R₄为-NR₅₀-，R₁为 R₅₀和R′₁共同构成具有式-C(O)-CHR₅₅的桥连基团，其中R₅₅为H；R₁为H或甲基；R₉₉和R₁₀₀分别选自H、芳烷基、烷基和杂烷基或1-3个碳原子，R₉₉和R₁₀₀可以进一步连接到选自下组基团的部分上：苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基(thionaphthyl)、吲哚基或饱和烷基烷氧基、一烷基氨基、二烷基氨基、四烷基铵、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、卤代、羟基、氨基、酰氨基、脒基、胍基、三唑基和磺酰基，R₃选自-C(O)-和-C(O)-NR₃₅-CH₂-C(O)-。

另外，在化合物A1-A2-(A3)_m-B中，R′₁和R″₂部分可以被如包括烷基在内的多达6个取代基取代，还可以通过诸如-OCH₂-、-SCH₂-、＞N-CH₂-、＞NC(O)-、-CO-或-NY-CO-NZ之类的基团连接在一起，也可以不连接在一起，其中Y和Z可以是H、烷基、芳烷基或杂芳烷基。此外，R₉₉和R₁₀₀分别可以被如苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基或吲哚基，或上述相应的饱和基团之类的取代基取代，也可以被多达五个选自下述的取代基团：烷基、烷氧基、一、二、三或四烷基胺、四烷基铵、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、卤素、羟基、氨基、酰胺、脒基、胍基、三唑基或磺酰基。在R₂位上带有取代基的优选化合物为其中R₁₀₀是H，R₉₉是

的化合物。该取代化合物中的W可以是如卤素、羟基、氨基或脒基，J可以是如O、S或-NR，而R为H或烷基、芳基或芳烷基。

在A2部分上含有取代基的且具有因子Xa抑制活性的本发明化合物例如其R₅₀、R₂₀₁或R₂₀₂上可以带有一个或多个杂原子取代基如N、O或S。R₂₀₂还可以被选自如下的取代基所取代：其中X为C、N或S；R不存在，或为H或烷基，并可以被杂原子取代，n为1-5。

在A3部分上含有取代基的且具有因子Xa抑制活性的本发明化合物例如可以包括其取代基R₅₁上带有一个或多个取代基如H、烷基、芳烷基或杂环，还可以被杂原子如N、O或S所取代，也可以不被杂原子取代。R₂₁₀和R₂₁₁例如可以是取代基-(CH₂)_n-Q，其中n为约1-5，Q为氨基、脒基、脲、咪唑、胍基、一、二、三或四烷基铵的可成药盐、异酰脲或异硫酰脲。另外，R₂₁₀或R₂₁₁可以是如烷基、芳基或烷芳基。这些基团可以进一步被取代基如羟基或C₁-C₄烷氧基取代。

本发明的化合物可以含有交替排列的包括B部分在内的取代基。取代基的交替排列可以包括如R₅₂被N、O或S所取代，或者R₆₀、R₆₁或R₇₀被一个或多个杂原子或烷基所取代。

本文所公开的通式结构代表本发明的各种化合物，这些化合物保持三肽即YIR赋予的因子Xa抑制活性。本文所公开的结构物还代表含有非天然存在氨基酸、氨基酸模拟物和具有类似功能的其它有机结构及其取代物。这些功能等同物提供了适当的所需电荷群和空间力的空间分布，从而具有因子Xa有效抑制剂的功能。

本发明化合物的具体实例包括，例如，Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH₂；Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂；Ac-(iBu)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂；Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)O(CH₃)；Ac-Tyr-{ψ(CH₂NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂；Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH₂(4-吡啶基)；Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH₂NH)}-Arg-Leu-Pro-NH₂；Ac-Tyr-Chg-Arg(NO₂)-{ψ(CH₂NH)}-Leu-NH₂；Ac-Tyr-Ile-Arg-{ψ(COCH₂)}-Gly-Pro-NH₂；Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-CH₃H₇N)}-Leu-Ala-NH₂；Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH₂；Tyr-Ile-Arg-NH₂；D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂；Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH₂；环(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)；Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂；Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂；以及Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂。表3和5还给出了本发明其它的YIR肽。

本发明还提供了一种具有结构A1-A2-(A3)_m-B的化合物，其中R₁为

R′₁选自H、-CO-R_a、-SO₂-R_a、氨基保护基团、可以被取代的1-6个氨基酸，其中所说的1-6个氨基酸的N-末端被选自H、-CO-R_a、-SO₂-R_a和氨基保护基团中的取代基所取代；R_a选自烷基、芳基和杂烷基；R″₁选自H、酰基和烷基；X为N；R₂为-CHR₉₉-，其中R₉₉选自烷基、芳基、芳烷基、杂烷基和杂芳基，并且可以被选自下组中的1-6个取代基取代：氟、氯、溴、碘、氨基、硝基、脒基、酰氨基、羧基、酯、醚和羟基；R₃为-C(O)-；R₄为-NH-；R₅为-CHR₂₀₁-，其中R₂₀₁为烷基；R₆为-C(O)-；R₇为-NH-；R₈为-CHR₂₁₀-，其中R₂₁₀为带有至少一个形式正电荷的杂烷基，其中杂原子为1-6个氮原子；R₉为-C(O)-；B选自OR_b和-N-R_cR_d，其中R_b选自H、烷基和羧基保护基团，R_c选自H和烷基，R_d选自烷基、杂烷基和1-20个氨基酸，并且可以被取代基取代，其中所说化合物的C-末端可以用羧基保护基团、伯酰胺基团或与R₁上的氨基形成仲酰胺基团或叔酰胺基团的环肽部分进行修饰。这种化合物可以含有一个或多个氨基保护基团。

例如，本发明的化合物其A1选自Tyr、F(pNH₂)、mAph、pAph和Nal(2)，且含有0或1个氨基保护基团；A2选自Ile和Chg；A3选自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C₃H₇N)、Dap(Nβ-C₃H₇N)和Orn(Nδ-C₃H₇N)；B选自-H、-OH、NH₂、1-5个氨基酸或其功能等同物以及羧基保护基团。这类化合物的实例包括Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂和Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇(参见表5)。

本发明还提供了一种具有结构A1-A2-B，即其中m为0的A1-A2-(A3)_m-B的化合物。在该化合物中，B可以是杂芳烷基如(4-(N-甲基吡啶鎓))甲基；2-(3-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；1-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；(对脒基)苄基；2-(4-(N-甲基吡啶鎓))丙-2-基和2-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基。Ac-pAph-Chg-AMP(4)和Ac-pAph-Chg-AEMP(4)是这类化合物的实例。

在本发明化合物中是包括L-氨基酸还是包括D-氨基酸对此所作的选择在一定程度上取决于所需肽的性质。例如，连接有一个或多个D-氨基酸能够提高化合在体外或体内的稳定性。连接有一个或多个氨基酸还可以提高或降低化合物的药理学活性。有时可能要求化合物仅仅保留很短时间的活性。在这种情况下，化合物中结合有一个或多个L-氨基酸能够使个体内的内源肽酶消化体内化合物，由此而限制个体与活性化合物的接触。本领域技术人员在综合考虑了如个体的年龄和总体健康状况后可以确定所需要的本发明化合物的性质。

本发明的化合物可以采用如自动合成装置经化学合成得到(参见实施例I)。对反应基团如存在于氨基酸侧链上的基团或者肽的N-末端或C-末端反应性基团的选择性修饰可以赋予本发明化合物以所需的特性，如提高稳定性或增强抑制能力。

当采用固相合成法时，在使初生肽连接到树脂上的同时或肽已经从树脂中裂解出来后，可以控制化合物的化学组分，以获得例如N-末端衍生物，如N-末端乙酰化的化合物。同样，也可以对化合物的羧基，包括C-末端羧基进行修饰，例如可以使羧基酰胺化。本领域技术人员还可以采用溶液相有机化学合成本发明的YIR肽。合成后的化合物可以通过已知方法如反相高压液相色谱法(RP-HPLC；参见实施例I)或其它如基于化合物大小、电荷或疏水性的分离方法进行提纯。同样地，可以采用诸如氨基酸序列分析法或质谱法(MS)之类的已知方法来表征本发明的化合物结构(参见实施例I)。

本发明的YIR肽可以是线型的或环状的(如见下表3)。通过在两个不相邻的残基、部分或取代基之间形成桥可以实现环化，所说的残基、部分或取代基可以在YIR基元序列之内或之外。例如通过在YIR基元序列内的一个残基与YIR序列外的一个不相邻的残基、部分或取代基之间形成桥也可以实现环化。例如，通过S-S、-CH₂-S-、-CH₂-O-CH₂-、内酰胺或酯键或如前所提到的可以使肽或肽模拟物环化(参见Hruby，Life Sci.31：189-199(1982)；Toniolo，Int.J.Pept.Prot.Res.35：287-300(1990)；Kates et al.，Tetr.Lett.34：1549-1552(1993)，上述文献均引入本发明作为参考)。

本文所用术语“YIR基元序列外”是指不包括酪氨酸、异亮氨酸或精氨酸残基的YIR序列或存在于本发明YIR肽中的其等同物。反之，术语“YIR基元序列内”是指包括至少一个酪氨酸、异亮氨酸和精氨酸的YIR序列或其等同物。对于环状化合物而言，术语“桥”是指存在于本发明YIR肽中的两个不相邻氨基酸之间所形成的键。

例如，通过在X₁和X₂之间形成二硫键或内酰胺键可以实现环化。能够形成二硫键的残基包括如Cys、Pen、Mpr和Mpp以及其含2-氨基基团的等同物。能够形成内酰胺键的残基包括如Asp、Glu、Lys、Orn、α，β-二氨基丙酸、α-氨基-己二酸、α，γ-二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基苯甲酸和巯基苯甲酸。本文所公开的化合物例如可以通过内酰胺键，即可以利用一个侧链上不相邻残基连接到X₁或Y的N-末端氨基基团上形成共价键而达到环化。还可以采用另一种桥结构使本发明化合物，包括如肽和肽模拟物成环，即可以通过S-S、-CH₂-S-、-CH₂-O-CH₂-、内酰胺键、酯键或其它连接键成环(如参见Hruby，supra，1982；Toniolo，supra，1990；Kates et al.，supra，1993)。

本发明的组合物可以作为均一组合物或含有各种组合取代基的化合物的混合物形式提供。取代基选择上的灵活性在很大程度上得以控制肽化合物类似物的物化性质。对取代基的选择也影响到化合物的键亲合力(参见实施例)。

含不同取代基排列的各化合物对因子Xa的抑制活性水平不同。这些化合物是按照实施例所描述的方法合成得到的。采用实施例XXXVII和XXXVIII所述的分析法测试肽的抑制活性。使用这些方法，本领域的技术人员可以合成本发明所公开的化合物，包括其修饰物，测定化合物对因子Xa的抑制活性。

本发明提供了特异性抑制因子Xa活性的化合物。这些化合物对因子Xa活性的K_i≤100μM，优选≤2nM，并且相对于因子Xa活性而言，基本上不会抑制凝固过程中涉及到的其它蛋白酶的活性和与因子Xa的抑制有关的纤维蛋白溶解作用(见上表2)。所说的其它蛋白酶包括如凝血酶和血浆酶。本发明化合物的特异性在下述实施例XXXVII中得到证实(同时请参见上表2)。

本发明的化合物可以有益地用作抗凝血剂，可以与血样接触以防止其凝固。例如，可以使有效量的本发明化合物与新抽出的血样进行接触以防止该血样凝固。针对本发明化合物而言，术语“有效量”是指能够抑制因子Xa活性的化合物用量。本领域技术人员都知道，本发明化合物的有效量可以采用本文所公开的方法(见实施例XXXVII和XXXVIII)或现有技术已知的其它方法测得。从所公开的本发明化合物的用途看，本领域技术人员还应知道，可以用本发明的化合物代替肝素之类的制剂。相对于其它抗凝血剂来说，使用本发明的化合物例如可以节省费用。

另外，可将本发明的化合物药予个体以治疗各种临床症状，包括例如治疗心血管疾病或者如与感染或外科手术有关的并发症。心血管疾病的实例包括血管成形术后的再狭窄、成人呼吸窘迫综合症、多发性器官病变、中风和播散性血管凝血障碍。与外科手术有关的并发症的实例包括，如外科手术后可能发生的深度静脉血栓形成和近端血栓形成。因此，本发明的化合物可以用作减小或抑制个体内有害的凝血症状的药物。

由于本发明的YIR肽可以抑制因子Xa的活性，因此这种化合物可以用于减小或抑制个体内的凝血作用。本发明所用术语“个体”是指脊椎动物，包括哺乳动物，如人类，在这类个体中因子Xa包括在其凝血链中。

通过给予个体治疗有效量的本发明YIR肽可以减小或抑制个体内的凝血作用。本文所用术语“治疗有效量”是指为了抑制个体的因子Xa活性所必须给予该个体的YIR肽剂量。具体地说，治疗有效量的本发明化合物能够在凝血酶原酶复合物中或作为可溶性亚单位直接抑制因子Xa的催化活性，或者，通过抑制因子Xa组合到凝血酶原酶复合物中而间接地抑制因子Xa的催化活性。更具体而言，这些化合物能够以K_i≤100μM，优选K_i≤2nM抑制因子Xa的活性。采用例如实施例XXXVII和XXXVIII所述的方法或现有技术已知的其它方法可以确定该治疗有效量。

在实施本发明的治疗方法过程中，为了达到治疗有效量而给予个体本发明药物组合物的具体剂量将取决于各种因素的考虑，包括如疾病的性质或严重程度、给药时间和个体年龄及身体条件。采用医药领域已知的临床法可以确定适宜的剂量。因此，本发明提供了一种通过使因子Xa与具有序列X₁-YIR-X₂的化合物，或其中m为0或1的A1-A2-(A3)_m-B的化合物，或它们的功能等同物接触从而特异性抑制因子Xa活性的方法。本发明还提供了一种通过给予治疗有效量的本发明化合物而减小或抑制个体内血凝形成的方法。

本发明的化合物通常以含有该化合物和药物可接受的载体的组合物形式给予个体。术语“药物可接受的载体”是指对个体是无毒的，或是被适当的管理机构确认为具有可接受毒性的介质或组分。在本发明中术语药物可接受的载体包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水、水、乳浊液如油/水或水/油乳浊液，或各种类型的润湿剂。Martin公开了适宜的药物载体及其配方(Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th Ed.(Mack Publishing Co.，Easton 1975)，该文献引入本发明作为参考)。一般来说，组合物包括治疗有效量的本发明化合物和适当量的载体，以便对个体给药时能够提供适当的剂量。因此，本发明所要求保护的化合物可以用作抑制因子Xa的活性和个体内血液凝固的药物。

药物可接受的载体还可以包括，如其他介质、化合物或者是能够提高药理学功效的因子Xa抑制剂化合物的改性。药物可接受的介质可以包括例如酸加成盐，如由无机酸或有机酸形成的盐，所说的无机酸例如为盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸或高氯酸，所说的有机酸例如为乙酸、草酸、马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸。其他的可成药盐包括例如无机硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和对-甲苯磺酸盐等，这些盐包括但不限于以碱金属或碱土金属为基础的阳离子，如钠、锂、钾、钙或镁，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，如铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙基铵、三乙基铵和四乙基铵。

能够提高化合物药理学功效的改性实例包括，例如酯化，如形成C₁-C₆的烷基酯，最好是C₁-C₄的烷基酯，其中烷基为直链或支链。其它可接受的酯包括如C₅-C₇的环烷基酯和芳烷基酯，如苄基酯。这些酯可以通过肽化学领域已知的常规方法由本发明所述的化合物制得。

药物可接受的改性还包括例如形成肽酰胺。可以在本发明化合物上实现的酰胺改性包括，例如，由氨、其中烷基为直链或支链的伯C₁-C₆二烷基胺或具有不同取代基的芳胺衍生得到酰胺。当为仲胺时，也可以是含如氮原子的5或6元杂环。制备这些酰胺的方法是本领域熟知的。

在本发明的另一实施方案中，YIR肽可以用于分析试验中以鉴定因子Xa的存在或分离出基本上纯的因子Xa。最好用如放射性同位素标记本发明的化合物，该标记的化合物可以用测定特定标记的常规方法进行测定。另外，YIR肽的优点还在于可以用作探针以测定因子Xa的活性部位或在其体内、体外、或离体后的活性度。

应当理解，只要基本上不会影响本发明各实施方案的活性所作的任何改变都应包括在本发明公开的范围内。因此下面的实施例只是对本发明的详细说明而不是限制。

实施例I

肽的合成方法

合成用原料来自化学厂商，如Aldrich、Sigma、Fluka、Nova Biochem和Advance Chemtech。在这些化合物的合成过程中，应当用保护基团将用于这些反应的氨基酸衍生物上的官能基团保护起来以防止在偶合反应步骤中发生副反应。在Peptides，supra 1981和Vol.9，Udenfriend and Meienhofer ed.1987中描述了适用的保护基团及其用途，该文献引入本发明作为参考。

采用一般的固相肽合成法来制备本发明的化合物。例如Steward和Young(Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman and Co.，San Francisco，1969)，引入本发明作为参考)公开描述了这些方法。

除非另有说明外，肽均是在与1％二乙烯基苯交联的聚苯乙烯树脂上进行合成的。酸敏性联结子(Rink联结子)被偶合在固态载体上(Rink的Tetr.Lett.28：3787(1987)；Sieber的Tetr.Lett.28：2107(1987)，该两篇文献均引入本发明作为参考)。偶合反应是在等当量HOBt存在下，采用N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)进行的。所有的偶合反应均在室温(RT)下，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或DMF∶二氯甲烷(1∶1混合物)中进行40分钟。利用茚三酮试验监视偶合反应是否完成。

利用在DMF中的50％哌啶进行10分钟完成Fmoc基团脱保护。由脱保护后的溶液在300nm处的吸收、洗液体积和合成过程中所用树脂的重量可以确定释放的Fmoc量。当第一次偶合反应不完全时可以进行第二次(二次)偶合。每一轮偶合反应和方法如下：

步骤做法试剂和溶剂

1 1克肽树脂 10毫升DMF

2 过量2.4倍的氨基酸衍生物

3 2.4当量 DIC

4 2.4当量 HOBt

5 偶合反应40分钟

6 洗涤(3×8毫升) DMF

7 茚三酮试验

8 脱保护(10分钟) 8毫升50％

哌啶/DMF

9 洗涤(6×8毫升) DMF

10 洗涤(2×8毫升) 二氯甲烷(DCM)

11 茚三酮试验

12 从步骤2开始重复。

在完成了肽到树脂的组合后，进行最后的Fmoc脱保护反应，接着进人通常的洗涤循环过程，测定脱保护反应所释放的Fmoc基团的量。有时，通过将肽树脂与于DCM中的过量20倍的乙酸酐/吡啶(1∶1)一起摇振15分钟使Nα-未受保护的肽乙酰化。依次用DCM、DMF、和DCM洗涤肽树脂，然后进行真空干燥。

在RT下，将肽树脂悬浮于试剂K(King等人，Int.J.Pept.prot.Res.36：255-266(1990)，该文献引入本发明作为参考)鸡尾酒中(5毫升/克肽树脂)，时间为180分钟，然后在无水乙醚中过滤经裂解的混合物，离心分离出固体沉淀物，再于真空中KOH固体小丸粒上干燥。利用适当梯度的于水和乙腈(ACN)中的0.1％TFA对干燥后的肽进行HPLC提纯。收集含有所要合成产物的峰，将此肽溶液冻干，然后对所说的肽进行鉴定，包括电喷雾MS(electrospray MS)和氨基酸分析以证实合成的是正确的化合物。

为了提纯肽，将冻干肽粗品溶解于含有10-50％ACN的0.1％TFA水溶液的混合物中。肽溶液一般是通过连接在0.45微米的尼龙“ACRODISC”13(GelmanSciences；Ann Arbor MI)过滤器上的注射器来过滤的。将适当体积的经过滤的肽溶液注入半制备C18柱(Vydac Protein and Peptide C18，218TP1010；TheSeparation Group；Hesperia CA)。利用Beckman“SYSTEM GOLD”HPLC维持梯度液，即作为洗脱液的0.1％TFA缓冲剂和ACN(HPLC级)的异构裂化混合物的流速。通过在230nm处的UV测定监测对肽的洗脱过程(Beckman，System Gold，Programmable solvent Module 126，以及由“SYSTEM GOLD”软件控制的Programmable Detector Module 166)。利用MS鉴定相应合成化合物的峰后，收集该化合物，冻干，进行生物学试验。MS是用SCIEX API III+仪器做的。另外，NMR是用通用电器公司的仪器(300MHz)做的。做NMR时，一般是在六氘二甲基亚砜或氘代氯仿(CDCl₃；Aldrich)中测定样品。

采用现有技术已知的方法制备氨基酸醛。例如Fehrentz和Castro在Synthesisz中第676页(1983)、Bajusz等人在J.Med，Chem.33：1729(1990)、Kawamura等人在Chem.Pharm.Bull.17：1902(1969)，以及Someno等人在Chem.Pharm.Bull.34：1748(1986)中均已报导了氨基酸和肽醛，上述每篇文献均引入本发明作为参考。还原肽键的合成是以溶液中存在的二肽(如Tyr-{ψ-(CH₂NH)}-Ile)量为基础进行的，然后通过固相肽合成法将经适当保护的二肽与树脂上剩余的肽偶合。另外，利用Ho等人所述的方法把经保护的氨基酸醛偶合到树脂中的肽上(Pept.Res.6：10-12(1993)，该文献引入本发明参考)。

实施例II

Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH₂的合成

为了合成Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH₂，将1克Rink树脂(0.6毫摩尔NH₂/克树脂)用于上述方法中。通过MS分析所得肽。(M+H)⁺实测值为659.4，计算值(calc.)为659.9。

实施例III

Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

为了合成Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂，将1克Rink树脂(0.6毫摩尔NH₂/克树脂)用于实施例I所述方法中。所得肽的(M+H)⁺实测值为685.4，calc.为685.9。

实施例IV

Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

使用1克Rink树脂(0.6毫摩尔NH₂/克树脂)。采用上述一般固相合成法。当Tyr脱保护和肽树脂经适当的洗涤后，加入于DMF中且含2％冰醋酸的50当量异丁醛。在RT下振荡所得混合物4小时。用含2％醋酸的DMF(2×8毫升)洗涤该肽树脂后，加入于10毫升含2％醋酸的DMF中的1克NaBH₃CN。再将此肽树脂振荡30分钟，然后进行过滤，再加入新鲜的NaBH₃CN于DMF/醋酸中的混合物，继续反应30分钟。

此后，用DMF/2％醋酸(2×8毫升)和DMF(2×8毫升)洗涤上述肽树脂。再用于DMF中的乙酸酐三乙胺混合物(30当量，6小时)对所得一烷基化的肽树脂进行乙酰化。肽树脂经适当洗涤后，如实施例I所述将肽裂解及脱保护。通过MS分析经HPLC提纯的肽。(M+H)⁺实测值为758.4，calc.为758.5。

实施例V

Tfa-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

用实施例IV所述的同样方法制备(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink树脂。在二异丙基乙胺(DIEA)和N-甲基咪唑(NMI)存在下，用0.7M三氟乙酸酐(该三种物质的比为0.3∶1∶3当量)处理45分钟实现最终的三氟乙酰化。如实施例IV所述由树脂上裂解出肽，并将之分离。通过MS鉴定提纯后的肽。(M+H)⁺实测值为812.4，calc.为812.5。

实施例VI

Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)O(CH₃)的合成

按照文献记载的方法(Fehrentz and Castro，supra，1983)合成Boc-Arg(NG-Tos)-N(CH₃)O(CH₃)。在RT下，把Boc-Arg(Nγ-Tos)-N(CH₃)O(CH₃)(200毫克)与5毫升三氟乙酸(TFA)混合在一起，搅拌20分钟。通过薄层色谱(TCL)(CHCl₃∶MeOH∶CH₃COOH为90∶9∶1)以及茚三酮喷雾显色和UV照明肉眼观察监视原料是否消失。在真空中将剩余TFA蒸发，并在真空中KOH丸粒上进行干燥，得到具有适当质量的固体材料。(M+H)⁺实测值为371.2，calc.为371.4。

在一烧瓶中，把如上制备的150毫克原料溶解于1毫升的DMF中，然后加入57微升三乙胺，将此混合物冷却到0℃。在第二个烧瓶中，把171毫克的Z-Tyr-Ile-OH(Biochem Bioscience Inc.；Philadephia PA)溶解于无水四氢呋喃(THF)中，并冷却至-10℃，然后在N₂环境下加入44微升NNM和52微升氯甲酸异丁酯，搅拌该混合物15分钟。把先行制备的Arg(Tos)N(CH₃)OCH₃于DMF中的溶液加入到Z-Tyr-Ile-OH二肽混合酐中，该混合物在-10℃下搅拌30分钟，然后在RT下搅拌过夜。

如实施例I所述将反应混合物后处理后，将肽进行真空干燥，并将其中的一小部分用HPLC提纯，通过MS进行分析；该肽具有所期望的分子量(781)。把所得肽Z-Tyr-Ile-Arg(Tos)-N(CH₃)OCH₃与500微升茴香醚混合在一起，然后用常规方法进行HF脱保护。进行后处理后，分离出169毫克产物Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)O(CH₃)，并且用MS进行鉴定(实测值为493.6，calc.为494)。将残余的肽溶解于1毫升1N HCl中，并冻干。

把Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)OCH₃·2HCl(76毫克)溶解在ACN中，冷却到0℃，加入13微升吡啶，然后再加入15微升乙酸酐。将此混合物在0℃下搅拌3小时，用茚三酮试验监视反应是否完成。在RT下搅拌8小时后，将反应混合物后处理，通过MS表征产物，即Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)OCH₃(试验值为535.6，calc.为535.3)。

实施例VII

Ac-Tyr-{ψ-(CH₂NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成a.Fmoc-Tyr(But)-H的合或

按照Ho和Ngu(J.Org.Chem.58：2315(1993)，该文献引入本发明作为参考)描述的方法使4.6克(10.0毫摩尔)Fmoc-Tyr(But)-OH、2.1克(10.1毫摩尔)二环己基碳化二亚胺(DCC)、1.26克(10.1毫摩尔)苄硫醇和0.12克DMAP在DCM中发生反应。后处理后，分离出Fmoc-Tyr(But)-S-CH₂C₆H₅，在10％钯碳催化剂存在下，用三乙基硅烷在搅拌下还原硫酯，再通过闪式色谱法提纯，得到产率为81％的Fmoc-Tyr(But)-H。产物的NMR及质量在期望的范围内。b.Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH₂NH)}-Ile-(O-烯丙基)的合成

把0.73克(1.66毫摩尔)fmoc-Tyr(But)-OH和于20毫升含1％AcOH的DMF中的0.209克(3.32毫摩尔)NaBH₃CN加入到0.516克(1.82毫摩尔)TFA·Ile-(O-烯丙基)于2毫升DMF中的溶液中。2小时后对反应混合物进行后处理，利用快速色谱法(乙酸乙酯∶己烷＝35∶65)提纯最终产物，得到具有适当NMR和MS的油状产物。(M+H)实测值为599，calc.为598.7。c.Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH₂NH)}-Ile-OH的合成

向于10毫升DCM中的0.467克(0.78毫摩尔)Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH₂NH)}-Ile-O-烯丙基中加入89微升(1.56毫摩尔)HOAc、20微升三乙胺(TEA)和0.02克复合物PdCl₂(Ph₃)₂。一次性加入231微升(0.86毫摩尔(nmol))Bu₃SnH，将该混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物后处理后，用闪式色谱法(CHCl₃∶MeOH＝20∶1)提纯产物，得到产率为69％(0.319克)的预望肽。(M+H)⁺实测值为559，calc.为558。然后采用实施例I所述的一般固相法将Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH₂NH)}-Ile-OH偶合到Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink树脂上。再利用实施例I的同样方法使合成肽树脂Ac-Tyr(But)-{ψ-(CH₂NH)}-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink脱保护，并发生裂解，然后用HPLC在C18柱上提纯。

实施例VIII

Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH₂(4-吡啶基)的合成

在DIC/HOBt存在下，使肟树脂(DeGrado and Kaiser，J.Org.Chem.45：1295(1980))(0.862克，0.6毫摩尔/克)与Boc-Arg(Tos)-OH偶合过夜。先用DMF，再用DCM洗涤该树脂，然后在DCM中用乙酸酐/DIEA(1∶1当量)将树脂乙酰化。用DCM、DMF和DCM洗涤树脂后，在DCM中用25％的TFA使树脂脱保护，时间为30分钟。脱保护后的树脂用DCM、异丙醇和DCM洗涤。在DCM中，1.5当量DIEA存在下，将对称酸酐形式的Boc-Ile-OH(3当量)偶合到TFA·Arg(Tos)-OxmR上。重复上述的洗涤、乙酰化和脱保护循环。脱保护后，以与Ile同样的方式偶合Boc-Tyr(2-BrZ)-OH，然后将所得肽树脂Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR脱保护，并进行乙酰化反应，得到Ac-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR。在真空中于燥此肽树脂，总重量增加0.216克。

在6毫升DCM中，60微升冰醋酸和120微升DIEA存在下，向1/3树脂中添加100微升(800微摩尔)的4-(二甲氨基)吡啶。在RT下，振荡该树脂过夜。将DCM溶液过滤后，用3毫升DMF洗涤树脂，把洗涤液与DCM滤液合并在一起，蒸发掉溶剂后，用HF/茴香醚使残留肽脱保护，按通常方法处理得到预期的肽。进行电喷雾MS分析。(M+H)⁺实测值为582.3，Calc.为582。

实施例IX

Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH₂NH)}-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成a.Boc-Ile-H的合成

按照Fehrentz和Castro(supra，1983)所述方法由1克Boc-Ile-N(Me)OMe合成醛。按参考文献所述，通过TLC和NMR鉴定该醛。b.Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA的合成

按实施例I所述的一般固相法合成三肽树脂。c.Boc-Ile-{ψ(CH₂NH)}-Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA的合成

利用在含1％乙酸的DMF中的NaBH₃CN，通过还原胺化作用使Boc-Ile-H偶合到三肽树脂Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA上。按常规方法使Boc-基团裂解，用DIC/HOBt偶合Ac-Tyr-OH。利用HF/硫代茴香醚混合物使所得肽树脂(0.7克)脱保护，并从树脂上裂解出来。将19毫克Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH₂NH)}-Arg-Leu-Pro-NH₂粗品在C18柱上进行HPLC提纯，由此得到5毫克纯度大于90％的预期肽。(M+H)⁺实测值为688.4，Calc.为687.9。

实施例X

Ac-Tyr-Ile-Dab(N_γ-C₃H₇N)-Leu-Ala-NH₂的合成

采用实施例I所述的方法，使0.2克SCAL-TG(0.2毫摩尔NH₂/克)(Patek&Lebl，tetr.Lett.32：3891-3894(1991)，该文献引入本发明作为参考)与Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(But)-OH偶合在一起。将N-末端乙酰化，并通过TFA使所说的链脱保护后，将肽树脂洗涤、中和并用于DMF中的0.3MPyBroP/NMI处理肽树脂Ac-Tyr-Ile-Dab-Leu-Ala-SCAL-TG2小时。利用在DMF中的1M三苯膦/(CH₃)₃SiCl(3×1小时)，再用100％的TFA(1小时)把所要肽从树脂上裂解出来。通过乙醚沉淀分离出粗制肽后，用0.1％的TFA水溶液将该肽冻干。用HPLC提纯肽Ac-Tyr-Ile-Dab(N_γ-C₃H₇N)-Leu-Ala-NH₂，并通过MS表征。(M+H)⁺实测值为676.4，Calc.为676.4。

实施例XI

Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH₂的合成

采用实施例I所述的方法，把Fmoc-Pal(3)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(But)-OH偶合到1.0克Rink树脂(0.48毫摩尔NH₂/克)上。向0.25克所要肽树脂即Ac-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rink中添加500微升于DCM中的甲基碘(MeI)，振荡该肽树脂6小时。然后按实施例I所述方法将所要肽树脂Fmoc-Tyr(But)-Ile-PalMe(3)-Rink脱保护、乙酰化和进行裂解。将其中一部分粗品肽用HPLC进行提纯，并MS对成品肽进行表征。

实施例XII

Ac-环(Glu-Tyr-Ile-Arg-Leu-Lys)-NH₂的合成

采用实施例I所述的方法，使1克SCAL-TG(0.29毫摩尔NH₂/克)(参见实施例X)与Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(But)-OH和Fmoc-Glu-(OtBu)-OH偶合在一起。脱去Fmoc后，将该肽树脂乙酰化，并先用DMF，再用DCM洗涤。利用试剂K使肽树脂Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Lys(Boc)-SCAL-TG脱保护，洗涤、中和，并用于DMF中的BOP/HOBt/DIEA(5∶5∶5当量)环化作用2小时。如Kaiser所述(Kaiser等人，Anal.Biochem.34：595(1970)，该文献引入本发明作为参考)，利用茚三酮试验监视偶合反应是否完成。环化反应后，从树脂上裂解出肽，用HPLC提纯，MS表征。(M+H)⁺实测值为844.5，Calc.为844.5。

实施例XIII

环(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)的合成

在DIC/HOBt存在下，使1克肟树脂(参见实施例VIII)(0.6毫摩尔NH₂/克)与Boc-Gly-OH过夜偶合在一起。将该树脂洗涤和脱保护后，用实施例VIII所述的方法Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Ile-OH和Boc-Tyr(2-BrZ)-OH进行偶合反应。将其中三分之一的肽树脂Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-Gly-肟树脂脱保护，并通过DIC/HOBt与Boc-Gly偶合在一起。将所要肽树脂脱保护、中和，并在含有1％醋酸的DMF中并过夜环化。把所说的树脂过滤和洗涤(DMF)，合并滤液，真空蒸发除去有机溶剂。将残留的肽进行脱保护(HF/茴香醚)、冻干、HPLC提纯、M.S表征。(M+H)⁺实测值为547.8，Calc.为547.8。

实施例XIV

N-取代的甘氨酸化合物的合成：

Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH₂的合成

采用Zuckermann等人所述的方法合成N-取代的甘氨酸(J.Am.Chem.Soc.114：10646(1992)，该文献引入本发明作为参考)。在DCM/DMF中使1克SCAL-TG(0.29毫摩尔NH₂/克)(参见实施例X)与溴乙酸对称酐偶合在一起。重复该偶合反应两次。向Br-CH₂CO-SCAL-TG树脂中添加于DMSO中的Boc-NH-CH₂CH₂CH₂NH₂，振荡该树脂2小时。脱保护后，通过交替进行Br-CH₂COOH至树脂的偶合和溴乙酸树脂与适当胺的反应进行反复处理。在DMF中用乙酸酐/DIEA/NMI(1∶l∶0.25)使(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(Boc-NH-(CH₂)₃)Gly-SCAL-TG树脂乙酰化过夜。脱去保护基团Boc后，在RT，于DMF中的DIEA(1∶1)存在下，用1.8M羧基脒基吡唑·HCl(Bernatowicz等人，J.Org.Chem.57：2497-2502(1992)，该文献引入本发明作为参考)处理树脂Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-氨丙基)Gly-SCAL-TG3小时。通过kaiser试验监视鸟苷酸化反应是否完成。如实施例X所述对所得肽进行裂解和处理，并做M.S分析。(M+H)⁺实测值为502.3，Calc.为502.3。

实施例XV

二酮基哌嗪化合物的合成：

环(Ser-Ida)-Ile-Arg-Leu-Ala-NH₂的合成

通过使Fmoc连接到Rink树脂(参见实施例I)上制备起始被保护的四肽，即Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Ala-Rink。该肽树脂脱去Fmoc保护后，依次用Fmoc-Ida(OMe)-OH(3当量，DIC、HOBt)和Fmoc-Ser(tBu)-OH(7当量，对称酐)进行偶合。通过与50％哌啶/DMF接触1小时同时进行最终的脱保护和自发闭环反应。在洗涤步骤之后，利用TFA/硫代茴香醚/H₂O(95∶2.5∶2.5)使最终的肽裂解和脱保护。如上所述对所得肽进行处理，并通过HPLC(＞95％)和MS进行分析。(M+H)⁺实测值为655.4，Calc.为655.38。

实施例XVI

Ph-C(NOCH₂Ph)-CO-I-R-NH₂的合成

使0.2克Rink树脂与Fmoc-Arg(Pmc)-OH和Fmoc-Ile-OH偶合在一起，随后脱去Fmoc保护(参见实施例I)。利用上述DIC/HOBt方法把Ph-C(NOCH₂Ph)-COOH偶合到肽树脂Ile-Arg(Pmc)-Rink上。如实施例I所述进行后处理得到所要的肽树脂Ph-C(NOCH₂Ph)-CO-Ile-Arg(Pmc)-Rink，并进行MS分析。(M+H)⁺实测值为524.3，Calc.为524.6。

实施例XVII

Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

按照实施例I所述方法，用下述氨基酸衍生物在100毫克Rink树脂(0.48毫摩尔/克)上进行合成：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-pAph-(Fmoc)-OH(外消旋混合物)。如实施例I所述进行肽的裂解和分离。通过RP-HPLC分离出两种非对映肽，并通过MS进行鉴定。(M+H)⁺实测值为754.4，Calc.为754.5。

实施例XVIII

Ac-Tyr-Chg-Arg-醇的合成

利用实施例I所述方法，在0.25克Fmoc-Arg(Pmc)-Sasrin树脂(0.5毫摩尔NH₂/克树脂；Bachem Bioscience)上构成肽序列。N-末端脱去Fmoc保护基团，并乙酰化后，通过还原裂解从树脂上裂解下作为保护肽的C-末端醇(Mergler等人，Peptides P177-178(eds.Schneider and Eberle；Leiden1993)，该文献引入本发明作为参考)。将该肽树脂与在2毫升THF∶EtOH(6∶1)中的NaBH₄(4当量)溶液一起振荡24小时。在裂解反应之后，用DCM洗涤该树脂，合并裂解溶液与洗涤液，冻干。通过用TFA/水/硫代茴香醚(90∶5∶5)处理2小时使冻干的肽脱保护，再经沉淀分离。用MS分析经HPLC提纯的肽。(M+H)⁺实测值为505.3，Calc.为505.3。

实施例XIX

Ac-Tyr-Chg-Arg-醇·乙酸酯的合成

按实施例XVIII所述制备被保护的肽醇。将10毫克粗品原料溶解于DCM/ACN中，并在TEA(2.4毫摩尔)存在下，用乙酸酐(2毫摩尔)处理20分钟。将此溶液过滤、蒸发，并如上所述使肽脱去保护。用MS分析HPLC提纯后的肽。(M+H)⁺实测值为547.3，Calc.为547.3。

实施例XX

Ac-Phe(pNH₂)-Chg-Orn(C(NH)CH₃)-Leu-Pro-NH₂的合成

按实施例X所述，用SCAL联结子使1克“TENTAGEL S”NH2树脂(0.28毫摩尔NH₂/克树脂；Rapp Polymer；tubingen Germany)官能化，随后偶合氨基酸：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH和Fmoc-Chg-OH。用于DCM中的50％TFA处理肽树脂Fmoc-Chg-Orn(Boc)-Leu-Pro-SCAL-TG(一次洗涤1分钟，后一次洗涤30分钟)，用DCM洗涤3次，用于DCM中的5％DIEA(2×30秒钟)中和，然后再用DCM洗涤2次。向肽树脂中添加于4毫升吡啶：DIEA为1∶1和3毫升DMF中的1.5克盐酸乙酰亚氨酸乙酯(ethyl acetimidate)(Aldrich)的溶液，在RT下连续偶合过夜。

在DMF中用20％的哌啶使肽树脂Fmoc-Chg-Orn(C(NH)CH₃)-Leu-Pro-SCAL-TG脱保护12分钟，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，在DMF中利用DIC/HOBt将Fmoc-Phe(pNH-Boc)-Oh偶合。脱去Fmoc保护基团，再用乙酸酐∶吡啶(1∶1)乙酰化20分钟，由此得到肽树脂，即Ac-Phe(pNH-Boc)-Chg-Orn(C(NH)CH₃)-Leu-Pro-SCAL-TG。还原SCAL联结子，裂解肽，随后再通过HPLC提纯粗品，得到期望的化合物。(M+H)⁺实测值为740.2，Calc.为740.48。

实施例XXI

Ac-Phe(pNH₂)-Chg-Dap(NβC₆H₁₁N)-Leu-Pro-NH₂的合成

使0.5克SCAL-TG(0.32毫摩尔NH₂/克)与Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OH和Fmoc-Chg-OH偶合在一起。用50％的TFA除去侧链上的Boc基团，时间为20分钟，通过用10％DIEA/DCM洗涤中和该肽树脂。通过在DMF中用0.3M PyBroP/NMI处理肽树脂20分钟使侧链上的游离氨基基团转化为二甲基脒鎓(dimethylamidinium)基团。利用50％的哌啶/DMF脱去Fmoc保护基团，时间为60分钟，由此而导致二甲基脒鎓被Dap侧链上的哌啶鎓基团所交换。通过偶合Fmoc-Phe(Boc)-OH，并脱去Fmoc保护基团，完成了所需序列。如实施例X所述使肽乙酰化，并且裂解。用MS分析经HPLC提纯的肽。(M+H)⁺实测值为752.4，Calc.为752.4。

实施例XXII

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂的合成

通过乙酰氨基丙二酸酯方法(Wagner等人，DDR专利号155954，1982年7月21日授权，1988年11月9日再审查，该专利引入本发明作为参考)合成外消旋H-Phe(pCN)-OH。通过将相应的硫代亚氨酸甲酯(methylthioimidate)进行氨解转化氰基(氰基与硫化氢反应)，随后再通过MeI甲基化合成得到外消旋Ac-pAph-OH。

用1克“TENTAGEL”树脂(取代度＝0.21毫摩尔NH₂/克树脂)和Knorr联结子(Bernatowicz等人，Tetr.Lett.30：4645(1989)，该文献引入本发明作为参考)合成肽。如实施例I所述组合二肽Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG。然后在DCM中用1毫升MeI使3-吡啶基丙氨酸甲基化过夜。脱去Fmoc保护基团后，利用DIC/HOBt法偶合Ac-pAph-OH，得到如实施例I所述的肽。(M+H)⁺实测值为550.3，Calc.为550.31。

实施例XXIII

Ac-Tyr-Chg-pAph-Leu-Pro-NH₂的合成

如实施例I所述，将五肽Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG组合到0.4克的“TENTAGEL”(取代度＝0.2毫摩尔NH₂/克树脂)上。在密闭注射器中，用8毫升吡啶/三乙胺(75∶25)饱和H2S处理树脂过夜。在50℃下，用于8毫升丙酮中的0.5毫升MeI使连接有硫代酰胺的树脂甲基化，时间为30分钟，然后用丙酮和甲醇洗涤。在55℃下，使甲基硫代酰亚胺与乙酸铵在甲醇中反应3小时以获得最终的化合物，如上所述，将该最终化合物从树脂上裂解下来，并提纯。(M+H)⁺实测值为761.4，Calc.为760.43。

实施例XXIV

Ac-Phe(pCH₂NH₂)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

如实施例I所述，在1克Rink树脂(0.6毫摩尔NH₂/克树脂)上合成Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂(粗品肽)。将125毫克粗品肽溶解于50毫升MeOH中，并加入0.5毫升Raney Ni悬浮液(Aldrich)。将此肽和催化剂的混合物在RT，35psi下氢化4小时。过滤出催化剂，将溶液蒸发干燥。从含30％ACN的0.1％含水TFA中冻干残留物。通过HPLC提纯干燥的粗品，用MS进行分析。(M+H)⁺实测值为741.4，Calc.为741.7。

实施例XXV

Ac-Phe(pC(NOH)NH₂)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

将按实施例XXIV所述制备的21.1毫克粗品肽与60.3毫克的NH₂OH·HCl(Aldrich)在1.5毫升MeOH、0.7毫升吡啶和0.5毫升TEA中混合。在RT下搅拌该混合物72小时，然后在真空中蒸发溶剂和挥发性物质。利用HPLC提纯所说的肽，并用MS进行分析。(M+H)⁺实测值为770.4，Calc.为770.3。

实施例XXVI

A1-A2-B化合物的合成

按图3所示路线制备A1-A2-B化合物，即其中m为0的A1-A2-(A3)_m-B化合物。简单地说，使外消旋N-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸与L-环己基甘氨酸甲酯(H-Chg-OMe)偶合在一起，得到两种非对映二肽的混合物，通过色谱法分离该混合物。通过与L-环己基甘氨酸甲酯形成盐部分拆分外消旋N-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸。基本不溶的D，L-盐很容易被结晶，随后偶合得到基本上纯的Ac-f(pCN)-Chg-OMe。“母液”富含L，L-盐，偶合导致得到粗品Ac-F(pCN)-Chg-OMe，后者通过色谱法在硅胶上进一步被提纯。在RT下，甲醇/水中，利用氢氧化锂水解这些二肽酯至相应的酸。通过与适当的胺、RNH₂进行常规的偶合所说的两种二肽酸均转化为取代的酰胺。采用标准化学方法制备不能商购得到的那些胺。

采用标准的化学方法，即通过硫代酰胺和硫代亚氨酸甲酯或通过氢化相应的偕胺肟(实施例XXV)使氰基转化为相应的脒。所说的偕胺肟是通过腈与羟基胺反应而获得的。下述实施例详细地说明了采用所选择的方法制备标题化合物。应当知道，本发明的化合物是可以其它方法来制备的，选择所例举的方法仅仅是为了方便起见。

实施例XXVII

Ac-pAph-Chg-NHCH₂-(4-甲基吡啶翁)的合成

采用实施例XXII所述的方法，通过转化Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂-(4-吡啶基)完成Ac-pAph-Chg-NHCH₂-(4-甲基吡啶鎓)的合成。用实施例I所述的HPLC方法提纯最终的化合物。MS分析：(M+H)⁺实测值为493.3，Calc.为493.29。

如下所述制备原料：

a).将2.32克(10毫摩尔)的Ac-(D，L)-F(pCN)加温溶解于75毫升乙醇中。向其中添加L-环己基甘氨酸甲酯(1.75克，10毫摩尔)，在RT下搅拌该混合物2小时。过滤出沉淀的结晶，干燥得到1.55克D，L-盐。将滤液进行部分蒸发，并用乙醚稀释。收集分离的结晶，干燥至留下2.1克的含有D，L-盐杂质的L，L-盐。将此粗品L，L-盐与20毫升DMF、0.71克HOBt、和1.18克DCC合并。在RT下搅拌该混合物24小时。过滤掉尿素，蒸发滤液。将蒸发残留物溶解于二氯甲烷中，用1N HCl和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤上述溶液。干燥蒸发有机层。在60克硅胶上，用含20％(V/V)丙酮的二氯甲烷进行洗脱，对残留物进行色谱分离。将用二氯甲烷/乙醚/己烷得到的澄清馏份合并后进行结晶，由此得到1.6克熔点(mp)为178-180℃的无色晶体Ac-F(pCN)-Chg-OMe。

b).在RT，氮气氛下，将1.93克(5毫摩尔)Ac-F(pCN)-Chg-OMe(来自上述实施例XXVII.a.)、100毫升甲醇、10毫升水和0.75克氢氧化锂水合物的混合物搅拌24小时。然后添加2毫升乙酸，蒸发掉溶剂，使残留物在含20％异丙醇的二氯甲烷和1N的HCl之间进行分配。干燥蒸发有机层，使残留物从二氯甲烷/乙醚/己烷中结晶出来得到1.6克mp为216-218℃的无色晶体Ac-F(pCN)-Chg-OH。

c).在RT下，将150毫克(0.4毫摩尔)Ac-F(pCN)-Chg-OH(如上)、65毫克(0.6毫摩尔)4-氨基甲基吡啶、124毫克(0.6毫摩尔)DCC、60毫克(0.44毫摩尔)HOBt和5毫升DMF的混合物搅拌20小时。过滤除去尿素，蒸发滤液。用甲醇制残留物浆液，过滤收集不溶性产物，得到140毫克无色Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂(4-吡啶基)。用丙酮∶二氯甲烷∶甲醇(4∶5∶1)在硅胶上进行色谱分离获得分析用样品。该结晶固体的mp为＞250℃。

实施例XXVIII

Ac-f(4-脒基)-Chg-NHCH₂(4-甲基吡啶鎓)

使150毫克Ac-f(pCN)-Chg-NHCH₂(4-吡啶基)(见上)先与硫化氢，然后再与甲基碘和乙酸铵反应制得该化合物。通过HPLC分离出作为均一物质的产物，MS分析为：(M+H)⁺实测值为493.3，Calc.为493.29。

如下所述制备原料：

a).在RT下，将2.8克Ac-f(pCN)，(L)-环己基甘氨酸甲酯、940毫克HOBt、1.57克DCC和30毫升DMF的混合物搅拌2天。过滤除去尿素，蒸发滤液。将蒸发残留物溶解于二氯甲烷中，用1N HCl和10％的碳酸氢钠水溶液洗涤上述溶液。干燥蒸发有机层。用二氯甲烷/乙醚/己烷对残留物进行结晶，由此得到2.05克mp为181-183℃的无色Ac-f(pCN)-Chg-OMe。

b).如实施例XXVII所述对于L，L-异构体的处理，在100毫升甲醇和10毫升水中用0.75克氢氧化锂一水合物水解1.93克的Ac-f(pCN)-Chg-OMe(如上)，并从二氯甲烷/乙醚中结晶出来，得到1.65克mp为180-182℃的Ac-f(pCN)-Chg-OH。

c).在RT下，将225毫克Ac-F(pCN)-Chg-OH(如上)、100毫克4-氨甲基吡啶、90毫克HOBt、180毫克DCC和6毫升DMF的混合物搅拌1个周末。过滤除去尿素，蒸发滤液。残留物与甲醇一起搅拌，过滤除去固体物，留下190毫克mp为＞250℃的晶体Ac-f(pCN)-Chg-NHCH₂(4-吡啶基)。

实施例XXIX

Ac-pAph-Chg-NHCH₂CH₂(3-甲基吡啶鎓)

用硫化氢来饱和125毫克Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂CH₂(3-吡啶基)、2毫升DMSO、10毫升吡啶和5毫升三乙胺的混合物，同时在冰/水中进行冷却。在RT下，在一密封管形瓶中搅拌过夜后，蒸发溶剂，用丙酮/乙醚收集残留物，干燥得到125毫克硫代酰胺。将该物质与2毫升DMSO、5毫升丙酮和0.75毫升甲基碘合并，并在RT下一密封管形瓶中搅拌此混合物过夜。用甲苯稀释后，蒸发除去溶剂，把残留物和乙醚一起搅拌。滗析出乙醚，用新鲜的乙醚置换，继续搅拌直到树脂物质固化，然后过滤出剩下的乙醚，把残留物干燥。

将所得残留物溶解于20毫升甲醇中，并用0.3毫升乙酸和0.4克乙酸铵处理。把此混合物加热到55-60℃2.5小时，然后蒸发除去溶剂。将残留物溶解于水/ACN/TFA中，冻干。通过HPLC提纯此粗制产物。MS分析为：(M+H)⁺实测值为507.3，Calc.为507.31。

如下所述获得原料：在RT下，将150毫克(0.4毫摩尔)Ac-F(pCN)-Chg-OH、120毫克(0.6毫摩尔)2-(3-吡啶基)乙胺二盐酸、125毫克DCC、60毫克HOBt、0.5毫升二异丙基乙胺和10毫升DMF的混合物搅拌24小时。蒸发除去溶剂后，将残留物与甲醇一起搅拌，过滤收集不溶性产物，并用甲醇和乙醚洗涤得到110毫克无色晶体。蒸发滤液，把残留物溶解于二氯甲烷/异丙醇中。用10％碳酸氢钠水溶液洗涤此溶液，干燥，蒸发。残留物用二氯甲烷∶丙酮∶甲醇(5∶4∶1)在14克硅胶上进行色谱分离，得到40毫克mp为265-268℃的Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂CH₂(3-吡啶基)。

b).如下所述制备2-(3-吡啶基)乙胺二盐酸盐。在Parr氢化器中，35psi下，使1.3克3-吡啶基乙腈、大约3克阮内镍和含10％(体积)氨的30毫升甲醇的混合物进行氢化反应20小时。用硅藻土过滤除去催化剂，蒸发滤液。将残留物溶解于二氯甲烷中，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发。在二恶烷中利用氯化氢使产物转化为二盐酸化物。用甲醇/乙醚进行结晶得到1.4克mp为145-148℃的无色晶体。

实施例XXX

Ac-pAph-Chg-NHCH₂CH₂(4-甲基吡啶鎓)

按如上实施例所述方法，使Ac-f(pCN)-Chg-NHCH₂CH₂(4-吡啶基)先与硫化氢反应，再用甲基碘甲基化，然后再与乙酸铵反应制得该化合物。通过HPLC来提纯粗品。MS分析为：(M+H)⁺实测值为507.3，Calc.为507.31。

如上实施例XXIX所述，通过Ac-F(pCN)-Chg-OH与2-(4-吡啶基)乙胺二盐酸发生偶合反应获得原料。

按如上所述制备2-(3-吡啶基)乙胺二盐酸的方法，在氨存在下，用阮内镍氢化吡啶基-4-乙腈制得2-(4-吡啶基)乙胺二盐酸。该二盐酸化物的mp为220℃。

实施例XXXI

Ac-pAph-Chg-NHCH₂(4-脒基苯基)

按上述同样方法，用于DMSO中硫化氢、吡啶和三乙胺处理Ac-f(pCN)-Chg-NHCH₂(4-氰基苯基)。在DMSO/丙酮中用甲基碘使所获得的双硫代酰胺甲基化，然后再按如上所述使之与乙酸铵反应。通过HPLC来提纯粗品。MS分析为：(M+H)⁺实测值为520.3，Calc.为520.30。

如下所述获得原料。在RT下，将75毫克(0.2毫摩尔)Ac-F(pCN)-Chg-OH、50毫克(0.3毫摩尔)(4-氰基苯基)甲胺盐酸盐、62毫克DCC、30毫克HOBt、0.2毫升DIEA和2毫升DMF的混合物搅拌24小时。过滤后，蒸发除去溶剂，将残留物溶解于含有20％异丙醇的二氯甲烷中。用1N HCl和10％碳酸氢钠水溶液洗涤此溶液，然后干燥，蒸发。将残留物与少量的甲醇/水一起搅拌，收集分离的固体物，干燥得到80毫克Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂(4-氰基苯基)。

如下所述制备(4-氰基苯基)甲胺盐酸。将2克(10毫摩尔)α-溴代-对甲苯基氰、2克(10.8毫摩尔)邻苯二甲酰亚胺和30毫升DMF的混合物加热至回流1分钟。冷却后，用乙酸酸化该混合物，并用水稀释以结晶出产物。过滤出晶体，用水洗涤，干燥，得到2.24克mp为182-184℃的无色N-(4-氰基苯基)-甲基邻苯二甲酰亚胺。

将1.5克N-(4-氰基苯基)甲基邻苯二甲酰亚胺悬浮于50毫升沸腾的甲醇中，并用1毫升水合肼处理。5分钟后得到澄清的溶液。蒸发除去甲醇，并用2NHCl处理残留物。将悬浮液加热至沸腾，然后在冰上冷却。过滤出固体物，蒸发滤液。使残留物溶解于水中。把该溶液再次加热到沸腾，冷却，过滤。用氢氧化钠使滤液呈碱性，并用含有异丙醇的二氯甲烷萃取。干燥蒸发有机相，把残留物转化为盐酸盐，从异丙醇/乙醚中结晶出来，得到0.43克mp＞260℃的无色晶体。

使α-溴代-间甲苯基氰与邻苯二甲酰亚胺钾反应以便得到mp为147-148℃的N-(3-氰基苯基)甲基邻苯二甲酰亚胺从而制得(3-氰基苯基)甲胺。该物质与水合肼反应，转化为如上给出的mp为223-226℃的(3-氰基苯基)甲胺的盐酸盐。

实施例XXXII

Ac-pAph-Chg-NHCH₂(3-脒基苯基)

采用如上所述的方法制备该化合物。用于DMSO中硫化氢、吡啶和三乙胺处理Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂(3-氰基苯基)。在DMSO/丙酮中用甲基碘使所获得的双硫代酰胺甲基化，然后再按如上所述使之与乙酸铵反应。通过HPLC来提纯粗品。MS分析为：(M+H)⁺实测值为520.3，Calc.为520.30。

如下所述获得原料。在RT下，将300毫克(0.8毫摩尔)Ac-F(pCN)-Chg-OH、200毫克(1.2毫摩尔)(3-氰基苯基)甲胺盐酸盐、250毫克DCC、120毫克HOBt、0.8毫升DIEA和10毫升DMF的混合物搅拌24小时。过滤后，蒸发除去溶剂，将残留物溶解于大量的含有20％异丙醇的二氯甲烷中。用1N HCl和10％碳酸氢钠水溶液洗涤此溶液，然后干燥，蒸发。将残留物与异丙醇/乙醚一起搅拌，收集分离的固体物，干燥得到400毫克的Ac-F(pCN)-Chg-NHCH₂(3-氰基苯基)。

实施例XXXIII

Ac-pAph-Chg-NHCH(Me)(4-甲基吡啶鎓)

使Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-吡啶基)两种非对映体的混合物先与硫化氢，再与甲基碘和乙酸铵反应制得标题化合物的非对映体的混合物。通过HPLC来分离该非对映体。MS分析为：(M+H)⁺实测值为507.3，Calc.为507.31。

如下所述制备原料。在RT下，将150毫克(0.4毫摩尔)Ac-F(pCN)-Chg-OH、120毫克(0.6毫摩尔)外消旋1-(4-吡啶基)乙胺二盐酸盐、125毫克DCC、60毫克HOBt、0.5毫升DIEA和10毫升DMF的混合物搅拌24小时。过滤后，蒸发除去溶剂，将残留物溶解于大量的含有20％异丙醇的二氯甲烷中。用10％碳酸氢钠水溶液洗涤此溶液，然后干燥，蒸发。将残留物与异丙醇/乙醚一起搅拌，收集分离出的固体物，干燥得到125毫克的Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-吡啶基)两种非对映体的混合物。

如下所述制备外消旋1-(4-吡啶基)乙胺二盐酸。在35psi下，使1克4-乙酰基吡啶-N-氧化物、2克阮内镍和含20％(体积)氨的30毫升甲醇的混合物进行氢化反应24小时。用硅藻土过滤除去催化剂，蒸发滤液。将残留物溶解于二氯甲烷中，过滤，蒸发。将残留物溶解于异丙醇中，并在乙醚中用氯化氢处理。收集沉淀出的晶体，干燥后得到0.9克的mp为198-200℃的物质。

实施例XXXIV

DIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成a.(对氰基苄基)丙二酸(DIPA(m)Phe(pCN))-OH的N，N-二异丙基酰胺的合成

采用改进的方法(参见Pinori等人的US5061911(1991，10)，该专利引入本发明作为参考)合成2-(对氰基苄基)丙二酸。向于25毫升DMF中的3.8克2，2-二甲基-1，3-二恶烷-4，6-二酮(Meldrum酸，Aldrich)和1.12克NaCNBH₃(Aldrich)的溶液中添加2.3克对氰基苯甲醛(Aldrich)，在RT下搅拌该混合物2小时。向此反应混合物中添加400毫升的水，在冰浴中冷却该溶液，滴加浓度为20％的HCl水溶液使pH调节至3.8-4。把白色沉淀物收集于中央玻璃瓷漏斗中，用冷水洗涤。收集的沉淀物在真空中CaCl₂上干燥24小时。收集的固体在CDCl₃中所做的NMR表明该固体为化合物2，2-二甲基-5-(对氰基)苄基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(DCBD)，其mp为135-142℃，R_f为0.45(CHCl₃∶MeOH∶乙酸＝95∶4∶1)。

向于45毫升DCM中的1.5毫升的二异丙胺中添加3毫升N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)，在配备有磁搅拌器和冷凝器的反应烧瓶中回流该溶液7小时，其中所说的冷凝器上有防护CaCl₂管。当溶液冷却到室温后，加入0.8克DCBD，再回流反应混合物3小时(直到TLC表明完全转化为产物止)。将反应混合物冷却后，小心地加入5-8毫升浓度20％的HCl水溶液。分层后，用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，然后蒸发干燥，得到无需进一步提纯即可用于下一步的纯净产物。在CDCL₃中做NMR并做MS鉴定该化合物。b.DIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂的合成

用实施例I所述方法合成肽树脂DIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink。所得肽树脂用实施例XXV所述的羟基胺盐酸盐处理得到DIPA(m)Phe(pC(NOH)NH₂)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink。将肽由树脂上裂解下来，并冻干后，把此粗品(120毫克)溶解于80毫升MeOH和10毫升NH₃在MeOH中的饱和溶液中。向该反应混合物中添加0.25毫升阮内镍悬浮物(Aldrich)，该混合物在45psi下进行氢化反应24小时。过滤除去催化剂，蒸发溶剂至干燥，残留物用其中0.1％TFA水溶液与ACN为1∶1的溶液冻干。用HPLC提纯此粗品肽，MS鉴定化合物。(M+H)⁺实测值为824.2，Calc.为824.5。

实施例XXXV

经合成并发现为因子Xa有效抑制剂的带有多个取代基的化合物

No. 化合物 Calc.(Found)

1. Ac-(2-CF₃Bzl)-Y-I-R-L-P-NH₂ 860.5(860.3)

2. Ac-(CH₃CH₂CH₂CH(CH₃)CH₂)-Y- 786.5(786.5)

I-R-L-P-NH₂

3. CH₃OCO-Y-I-R-L-P-NH₂ 742.4(742.4)

4. Ac-Y-Chg-R-NH₂ 518.2(518.2)

5. Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH₂ 679.4(679.4)

6. y-Tle-R-Nle-P-NH₂ 660.4(660.4)

7. Phe(pF)-I-R-L-P-NH 662.3(662.3)

8. Ac-(D)Tic(OH)-I-R-L-P-NH₂ 714.4(714.4)

9. Ac-Phe(pCN)-I-R-L-P-NH₂ 711.4(711.4)

10.Ac-Phe(pCONH₂)-Chg-R-L-P-NH₂ 755.4(755.4)

11.y-Chg-R-NH₂ 476.2(476.2)

12.Ac-W-Chg-R-L-P-NH₂ 751.3(751.3)

13.Ac-Y-I-R-NH-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH₃ 562.3(562.3)

14.Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH₂ 722.2(722.2)

15.Ac-Y-Chg-R-Ina-NH₂ 629.4(629.4)

16.Ac-Tza-Chg-R-NH₂ 509.3(509.3)

17.Ac-Y-Chg-R-Pip-NH₂ 629.4(629.4)

18.Ac-Phe(pNH₂)-Chg-R-NH₂ 517.2(517.2)

19.Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly-

(3-胍基丙基)G-NH₂ 502.3(502.3)

20.Ac-Y-Chg-R-ol.acetate 547.3(547.3)

21.Ac-Y-Chg-R-OCH₃ 533.3(533.3)

22.Ac-Y-Chg-R-OH 519.3(519.3)

23.Bz-Y-Chg-R-NH₂ 532.2(532.2)

实施例XXXVI

单独不能提高活性的化学变化的结合作用可提高活性

测定对因子Xa活性的抑制作用。但是作为衡量本发明的肽活性来说，可以测定任何有关的生物活性，如本发明YIR肽对凝血的作用、体内有效性、体内半衰期、口服生物利用率、口服有效性或半衰期。

可以阐述许多具体变化。例如，两种变化结合起来证明，把甚至原本单一变化并不能明显提高活性的那些变化结合在一起能够进一步提高活性。相对于母体化合物Y-I-R-L-P(K_i＝5.3μM)而言，一种化学变化方式是生成Ac-Y-I-R-L-P，其K_i＝0.49μM，另一种变化方式是生成(iBu)Y-I-R-L-P，其K_i＝2.6μM。把这两种变化方式结合在一起得到AC-(iBu)Y-I-R-L-P-NH₂，其K_i＝0.04μM。因此，由这些结果证明，结合了两种化学变化的本发明肽相对于单一的相应类似变化来说能够显著提高因子Xa的抑制活性，甚至在相对于母体Y-I-R-L-P-NH₂而言，母体化合物如(iBu)Y-I-R-L-P-NH₂不能明显提高活性的情况下亦是如此。

表3例举了能够导致化合物对因子Xa的抑制作用的K_i值在100μM-1pM范围内的具体化学改性实例。

表3

具有Ki＜100μM的因子Xa抑制剂结构 MS^* AA^*(2，2-DiMe-Propyl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(2-CF₃-Bzl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(2-Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(2-Me-nPentyl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(3，3-DiMe-nBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK3-苯氧基丙酰-Y-Chg-R-NH₂ OK OK5-Bzim-CO-Chg-R-L-P-NH₂ OK OK5-Bzim-CO-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKY(3，5-Br)-I-R-L-P-NH₂ OK OKY(3，5-I)-I-R-L-P-NH₂ OK OK(Chx-CH₂)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(iBu)Y-I-R-OH OK OK(iBu)Y-I-R-L-A-NH₂ OK OK(iBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(Me)y-I-R-L-A-NH₂ OK OK(Me)Y-I-R-L-A-NH₂ OK OK(Me)y-I-R-L-P-NH₂ OK OK(Me)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK5-Hic-Chg-R-NH₂ OK OKAc-(1，2，3，6-4H-Bzl)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂OK OKAc-(1，2，3，6-4H-Bzl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2，3-DiMe-正苯基)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2，3-DiMe-正苯基)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-CF₃-Bzl)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-CF₃-Bzl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-Me-Bzl)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-Me-nBu)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-Me-正苯基)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(2-Me-正苯基)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(3，3-DiMe-nBu)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(3，3-DiMe-nBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(3，3-DiMe-正苯基)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(3，5，5-Me-3-正己基)Y-I-R-NH₂ OK OKAc-(3，5，5-Me-3-正己基)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(4-pyridyl-CH₂-)Y-I-R-NH₂ OK OKAc-(4-MeO-Bzl)Y-I-R-NH₂ OK OKAc-(Bzl)Y-I-R-NH₂ OK OKAc-(Chx-CH₂)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(环丙基-CH₂)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(环丙基-CH₂)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(Et-CH＝C(CH₃)-CH₂)Y(SO₃H)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(Et-CH＝C(CH₃)-CH₂)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(iBu)F(pNH₂)-Chg-R-NH₂ OK OKAc-(iBu)F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(iBu)Y-Chg-R-NH₂ OK OKAc-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(iBu)Y-I-Dab(Nγ-C₃H₇N)-L-P-NH₂ OK OKAc-(iBu)Y-I-Orn(Nδ-C₃H₇N)-L-P-NH₂ OK OKAc-(iBu)Y-I-R-NH₂ OK OKAc-(iBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(Me)Y-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(Me)Y-I-R-L-A-NH₂ OK OKAc-(Me)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(nBu)Y-I-R-NH₂ OK OKAc-(反式-CH₃-CH＝C(CH₃)-CH₂)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Tyr(3，5-NO₂)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-(Bzl)G-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)G-NH₂ OK OKAc-BAla-Y-I-R-G-NH₂ OK OKAc-E-Y-I-R-L-K-NH₂ ^** OK OKAc-E-Y-I-R-L-P-K-NH₂ OK OKAc-F(pCONH₂)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-F(pCONH₂)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-F(pF)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-f(pF)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-F(pCN)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-F(pNH₂)-Chg-R-NH₂ OK OKAc-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-F(pNH₂)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-F(pNH₂)-Chg-R-(Bzl)G-G-OH OK OKAc-F(pNH₂)-Chg-R-(Chx)G-G-OH OK OKAc-F(pNH₂)-Chg-R-(CH₃CH₂CH₂ OK OK

(CH₃))G-G-OHAc-G-G-Y-I-R-G-NH₂ OK OKAc-G-Y-Nle-R-L-NH₂ OK OKAc-G-y-Nle-R-L-NH₂ OK OKAc-G-Y-I-R-G-NH₂ OK OKAc-G-Y-I-R-L-NH₂ OK OKAc-Nal(1)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Nal(2)-Cha-R-D(O-烯丙基)-NH₂ OK OKAc-Nal(2)-Cha-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Nal(2)-Chg-R-NH₂ OK OKAc-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Nal(2)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Pgl(OH)-I-R-L-NH₂ OK OKAc-pAph-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-pAph-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Phe(pGua)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-S-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-W-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-W-L-R-L-A-NH₂ OK OKAc-Y(Me)-I-R-L-A-NH₂ OK OKAc-Y(Me)-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-(别-I)-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-Cha-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-Chg-R-NH₂ OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂CH₂-N(CH₃)₄ OK OKAc-Y-Chg-R-NH-Bzl-4-OMe OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂-Chx OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂CH₂-N-(CH₃)₂ OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂CH₂-O-CH₃ OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂CH₂-COOH OK OKAc-Y-Chg-R-NH-Chx OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂(2-(1-Et)吡咯烷基) OK OKAc-Y-Chg-R-NH-CH₂(2-(6-EtO)苄基噻唑基) OK OKAc-Y-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-Chg-R(NO₂)-{ψ(CH₂NH)}-L-NH₂ OK OKAc-Y-Nva-R-NH₂ OK OKAc-Y-Pen(Me)-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-Pgl-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-{ψ(CH₂N(Ac))}-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-{ψ(CH₂NH)}-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-I-R-{ψ(COCH₂)}-G-P-NH₂ OK OKAc-Y-I-Dab(Nγ-C₃H₇N)-L-A-NH₂ OK OKAc-Y-I-hR-L-A-NH₂ OK OKAc-Y-I-nR-L-A-NH₂ OK OKAc-Y-I-PalMe(3)-NH₂ OK OKAc-Y-I-PalMe(3)-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-I-{ψ(CH₂NH)}-R-L-P-NH₂ OK OKAc-y-I-R-NH₂ OK OKAc-Y-I-R-NH₂ OK OKAc-Y-I-R-N(Me)O-CH₃ OK OKAc-Y-I-R-NH-CH₂-4-吡啶基 OK OKAc-Y-I-R-NH-CH₂CH₂-N(CH₃)₂ OK OKAc-Y-I-R-NH-4-吗啉基 OK OKAc-Y-I-R-NH-OCH₃ OK OKAc-Y-I-R-Nle-Hyp OK OKAc-Y-I-R-Nle-Δ²P OK OKAc-Y-I-R-哌啶基 OK OKAc-Y-I-R-I OK OKAc-Y-I-R-I-P OK OKAc-Y-I-R-L OK OKAc-y-I-R-L-A OK OKAc-Y-I-R-L-A OK OKAc-Y-I-R-L-A-A-F-T-NH₂ OK OKAc-y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)₃)-OH OK OKAc-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)₆)-OH OK OKAc-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P)-OH OK OKAc-Y-I-R-P-NH₂ OK OKAc-Y-K-R-L-E-NH₂ OK OKAc-Y-N-R-L-NH₂ OK OKAc-Y-N-R-L-P-NH₂ OK OKAc-Y-T(Me)-R-L-P-NH₂ OK OKBAla-Y-I-R-G OK OKBAla-Y-I-R-G-NH₂ OK OKCaff-I-R-NH₂ OK OKCbz-I-R-L-NH₂ OK OKCbz-Y-I-R-NH₂ OK OKCClF₂-CO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCF₂H-CO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCF₃-CF₂CO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCH₃-CHCl-CO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCH₃-O-CO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCH₃-SO₂-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCH₃CH₂-O-CO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKCl₂CHCO-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKClCH₂CO-Y-I-R-NH₂ OK OKC-Y-I-R-L-C-NH₂ OK OKD-Tic-I-R-L-A-A-F-T-NH₂ OK OKEt(Et)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKE-Y-I-R-K-NH₂ OK OKE-Y-I-R-L-K-NH₂ OK OKE-Y-I-R-L-P-K-NH₂ OK OKF(pCl)-I-R-I-Sar-NH₂ OK OKF(pF)-I-R-L-P-NH₂ OK OKf(pF)-I-R-L-P-NH₂ OK OKF(pNH₂)-I-R-L-A-NH₂ OK OKF(pNO₂)-I-R-L-A-NH₂ OK OKf-I-R-F-P-NH₂ OK OKf-I-R-I-P-NH₂ OK OKF-I-R-L-NH₂ OK OKF-I-R-L-P-H-Y-G-NH₂ OK OKF-I-R-L-Y-V-W-N-NH₂ OK OKFor-y-I-R-L-P-NH₂ OK OKFor-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKG-G-Y-I-R-G-NH₂ OK OKG-Y-I-R-D-NH₂ OK OKG-Y-I-R-F-NH₂ OK OKG-Y-I-R-G-NH₂ OK OKG-Y-I-R-G OK OKG-Y-I-R-H-NH₂ OK OKG-Y-I-R-I-NH₂ OK OKG-Y-I-R-K-NH₂ OK OKG-Y-I-R-L-NH₂ OK OKG-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKG-Y-I-R-L-P-A-M-NH₂ OK OKG-Y-I-R-L-P-P-V-NH₂ OK OKG-Y-I-R-L-P-Q-T-NH₂ OK OKG-Y-I-R-L-P-S-Q-NH₂ OK OKG-Y-I-R-S-NH₂ OK OKG-Y-I-R-T-NH₂ OK OKG-Y-I-R-V-NH₂ OK OKG-Y-I-R-W-NH₂ OK OKG-Y-I-R-Y-NH₂ OK OK(pOH)C₆H₄-CH₂CH₂(OH)-CO-I-R-L-Sar-NH₂OK OK(pOH)C₆H₄-CH₂CH₂CO-I-R-L-A-NH₂ OK OK(pOH)C₆H₄-CH₂CH₂CO-I-R-L-P-NH₂ OK OK(pOH)C₆H₄-CH₂CHOH-CO-I-R-L-P-NH₂ OK OK(pOH)C₆H₄-OCH(CH₃)CO-I-R-L-P-NH₂ OK OK(pOH)C₆H₄-OCH₂CO-I-R-L-P-NH₂ OK OKI-H-L-W-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKI-H-L-W-y-I-R-L-P-NH₂ OK OKI-Q-L-G-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OK4-MeO-C₆H₄-CO-I-R-L-A-NH₂ OK OKN-吗啉基-CO-F-I-R-L-P-NH₂ OK OKNal(2)-Cha-R-D(O-烯丙基)-NH₂ OK OKNal(2)-Cha-R-D(O-烯丙基)-Sar-NH₂ OK OKNal(2)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKNal(2)-I-R-C(Me)-P-NH₂ OK OKN-G-Y-I-R-L-I-H-NH₂ OK OKpal-C(SBut)-R-L-P-NH₂ OK OKpal-I-R-C(SBut)-Hyp-NH₂ OK OKpal-I-R-C(SBut)-P-NH₂ OK OKPgl(OH)-I-R-L-NH₂ OK OKPh-C(NOCH₂Ph)-CO-I-R-NH₂ OK OKPh-CH＝CH-CO-I-R-L-A-NH₂ OK OKPh-CH₂CH₂CH₂-CO-I-R-L-A-NH₂ OK OKPh-CH₂CH₂CO-I-R-L-A-NH₂ OK OKPth-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKS-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-(iBu)F(pNH₂)-Chg-R-NH₂ OK OKTfa-(iBu)F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-Chg-R-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-I-Dab(N^γ-C₃H₇N)-L-P-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-I-Orn(N^δ-C₃H₇N)-L-P-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-I-PalMe(3)-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-I-R-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-I-R-OH OK OKTfa-(iBu)Y-I-R-G-NH₂ OK OKTfa-(iBu)Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-(Me)Y-I-R-L-A-NH₂ OK OKTfa-Y(Me)I-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-Y-Chg-R-NH₂ OK OKTfa-Y-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-y-I-R-L-P-NH₂ OK OKTfa-Y-I-R-L-P-NH₂ OK OKT-F-G-Y-I-R-K-A-NH₂ OK OKTos-Y-I-R-NH₂ OK OKTos-G-I-R-V-Sar-NH₂ OK OKTyr(Me)-I-R-L-A-NH₂ OK OKW-F-R-E-M-G-G-G-G-G-NH₂ OK OKW-I-R-E-K-NH₂ OK OKW-I-R-N-P-NH₂ OK OKW-I-R-T-P-NH₂ OK OKW-L-R-L-A-NH₂ OK OKW-L-R-L-A-NH₂ OK OKW-L-R-L-A-G-G-G-G-G-NH₂ OK OKW-L-R-V-A-NH₂ OK OKw-L-R-V-A-NH₂ OK OKW-L-R-V-A-G-G-G-G-G-NH₂ OK OKy(Me)-I-R-L-P-NH₂ OK OKy-Chg-R-NH₂ OK OKy-Chg-R-L-NH₂ OK OKy-Chg-R-L-P-NH₂ OK OKy-Tle-R-Nle-P-NH₂ OK OKy-Tle-R-Nle-Δ²P-NH₂ OK OKY-I-(nR)-L-A-NH₂ OK OKy-I-R(COCH₂)-G-P-NH₂ OK OKy-I-R-NH₂ OK OKY-I-R-NH₂ OK OKY-I-R-E-F-S-D-Y-NH₂ OK OKY-I-R-G-A-NH₂ OK OKY-I-R-I-NH₂ OK OKY-I-R-I-Y-NH₂ OK OKY-I-R-I-Y-E-R-E-NH₂ OK OKY-I-R-L-NH₂ OK OKy-I-R-L-A-NH₂ OK OKY-I-R-L-a-NH₂ OK OKY-I-R-L-A-NH₂ OK OKY-I-R-L-A-A-NH₂ OK OKY-I-R-L-A-A-F-NH₂ OK OKY-I-R-L-A-A-F-T-NH₂ OK OKY-I-R-L-M-E-M-T-NH₂ OK OKY-I-R-L-P-NH₂ OK OKY-I-R-L-P-NH₂ OK OKY-I-R-L-P-G-L-L-NH₂ OK OKY-I-R-L-T-K-M-W-NH₂ OK OKY-I-R-V-A-Q-L-Y-NH₂ OK OKY-I-R-V-M-N-H-R-NH₂ OK OKY-I-R-Y-R-N-P-I-NH₂ OK OKY-R-Y-P-R-D-R-N-NH₂ OK OKY-L-R-F-P-NH₂ OK OK

^*MS，质谱；AA，氨基酸分析。

^**-下划线表示肽的成环部分。

实施例XXXVII

对所选纯凝血酶和其它丝氨酸蛋白酶的体外抑制作用

通过测定抑制50％酶活性(IC₅₀)的YIR肽浓度来评价本发明化合物对因子Xa、凝血酶、血浆酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶的抑制能力。在显色分析中采用的是纯酶。为了确定抑制常数，考虑到底物竞争，用下式校正IC₅₀值：

K_i＝IC₅₀×(1/(1＋((底物浓度)/底物K_m)})(Chen and Prusoff，Biochem.Pharmacol.22：3099-3018(1973)，该文献引入本发明作为参考)。a.因子Xa分析

在分析中采用TBS-P缓冲剂(50mMTris-Cl，pH7.8，200mM NaCl，0.05％(W/V)PEG-8000，0.02％(W/V)NaN₃)。把于TBS-P中的25微升入因子Xa(EnzymeResearch Laboratories，Inc.；South Bend IN)、40微升于TBS-P中的10％(V/V)DMSO(非抑制对照)或以TBS-P中的10％(V/V)DMSO稀释的各种浓度的试验用肽以及于TBS-P中的底物S-2765(Nα-苄氧基羰基-D-Arg-Gly-L-Arg-对-硝基酰苯胺；Kabi Pharmacia，Inc.；Franklin OH)在适当的Costar半面积微量滴定板的孔中混合，由此测定IC₅₀。

把肽抑制剂加上酶预培养10分钟进行分析，加入底物使最终体积达到100微升此时开始分析。利用Bio-Tek Instruments动态平板阅读器(CeresUV900HDi)，通过在25℃下，一段线性时程内(通常在加入底物后的1-5分钟)，在405nM处的吸收变化来测定显色底物水解的初始速度。当把相对水解速度(与非抑制对照相比)与肽浓度的对数作曲线后，通过线性回归能够预测引起底物水解速度降低50％的抑制剂浓度。酶浓度为0.5nM，底物浓度为140μM。b.凝血酶分析

该分析采用TBS-P缓冲剂。与实施例XXXVII.a.一样测定IC₅₀，但底物为S-2366(L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-N-对硝基酰苯胺；Kabi)，酶为人凝血酶(Enzyme Research Laboratories，Inc.；South Bend IN)。酶浓度为1nM，底物浓度为175μM。c.血浆酶分析

该分析采用TBS-P缓冲剂。与实施例XXXVII.a.一样测定IC₅₀，但底物为S-2251((D)-Val-L-Leu-L-Lys-N-对硝基酰苯胺；Kabi)，酶为人血浆酶(Kabi)。酶浓度为5nM，底物浓度为300μM。d.胰蛋白酶分析

该分析采用含有10mMCaCl₂的TBS-P缓冲剂。与实施例XXXVII.a.一样测定IC₅₀，但底物为BAPNA(苯甲酰基-L-Arg-N-对硝基酰苯胺；Sigma ChemicalCo.；St.Louis MO)，酶为牛胰腺胰蛋白酶(XIII型，经TPCK处理；Sigma)。酶浓度为50nM，底物浓度为300μM。e.弹性蛋白酶分析

该分析采用Tris-Cl，pH7.4，300mM NaCl，2％(V/V)N-甲基-吡咯烷酮，0.01％(W/V)NaN₃缓冲剂。与实施例XXXVII.a.一样测定IC₅₀，但底物为琥珀酰-Ala-Ala-Ala-N-对硝基酰苯胺(Calbiochem-Nova Biochem Corp.；San Diego CA)，酶为人类中性白细胞弹性蛋白酶(Athens Research and Technology，Inc.；Athens GA)。酶浓度为75nM，底物浓度为600μM。

上表2给出了所选用的试验化合物与对照化合物“TENSTOP”(N-α-苯甲磺酰基-Gly-对-脒基苯丙氨酸甲酯；American Diagnostica，Inc.；GreenwichCT)相比的K_i值，其中该对照化合物为一种可逆性因子Xa抑制剂(Sturzebecher等人，Thromb.Res.54：245-252(1989)；Hauptmann等人，Thromb.Haem.63：220-223(1990)，该两篇文献均引入本发明作为参考)。结果表明，本发明的YIR肽能够抑制因子Xa的活性，但基本上不会抑制在凝血过程和纤维蛋白水解过程中所涉及到的其它各种丝氨酸蛋白酶，包括凝血酶和血浆酶的活性。

实施例XXXVIII

测定凝血抑制的方法

评价本发明化合物抑制因子Xa活性的能力。采用人类供血者的混合血浆，通过体外凝血酶原时间(PT)的测定评价不同化合物的有效性。同时还采用离体测定法，其中采集通过静脉(iv)给予大鼠和兔子化合物后，或大鼠十二指肠内给药后不同时间上的血浆，用PT测定法测定采集的血浆以确定血浆的半衰期。选用能够获得延长和高重现性凝血终点的凝血酶原稀释物来开始PT测定，下文称之为“稀释PT测定法”。另外，采用大鼠体内动静脉短路血栓形成模型确定不同化合物的有效性。a.体外稀释凝血酶原时间测定

把100微升预加热(37℃)的混合人类血小板缺乏性血浆(PPP)加入到纤维测量杯(Baxter Diagnostics.，Inc.；McGaw Park IL)中。再加入50微升于TBS-BSA中的含钙的不同浓度的试验化合物(50mM Tris-Cl，100mM NaCl，0.1％(W/V)牛血清白蛋白，20mM CaCl₂)。在对照试验中，加入含钙但不含试验化合物的TBS-BSA以测定非抑制性凝血时间。向纤维测量杯中添加150微升稀释的预热的含钙兔促凝血酶原激酶(Baxter)，此时纤维性计量仪的计时器开始计时。在测试化合物前即已获得兔促凝血酶原激酶稀释曲线，并用该曲线选择出能够使非抑制性对照的PT时间约为30秒的促凝血酶原激酶稀释度。由稀释曲线时间计算出用试验化合物(见下表4)达到50％凝血抑制作用的试验浓度(EC₅₀)(见下表4)。

另外，用“分析”模式在配备有自动凝血仪(IL；Milan，Italy)的Instrumentation Laboratories(IL)ACL3000进行稀释凝血酶原时间测定。稀释促凝血酶原激酶直到凝血时间达到30-35秒。采用该凝血时间作为100％活性。用连续二倍稀释的稀释促凝血酶原激酶试剂(IL品牌的兔脑促凝血酶原激酶)建立标准校对曲线。在测定过程中，把50微升试样(离心分离的血浆)与100微升促凝血酶原激酶试剂混合在一起，读取浊度大于169秒的读数。通过仪器计算光散射变化的最大速率，由该最大速率确定凝血时间。抑制作用百分数以相对于校对曲线而确定的活性表示。b.离体稀释凝血酶原时间分析

按照批准方法通过尾静脉(大鼠)或耳静脉(兔子)静脉给予试验用化合物。在给予试验用化合物后，每隔一段时间从插管颈动脉(大鼠)或耳动脉(兔子)取出1毫升血液样品。离心分离得到PPP后，立即将血浆储存在冰上或冷冻起来。

为了测定稀释凝血酶原时间，将血浆预热，并如上所述进行测定。由促凝血酶原激酶稀释曲线计算百分抑制率，该稀释曲线是用每一系列样品作出的，用于确定血浆中尚保留约50％初始抗凝血剂活性的时间(T1/2)。试验结果表明，本发明的YIR肽能够抑制体外血液凝固，给药后能够抑制体内血液凝固(见表4)。

表4

选用抑制剂的活性及半衰期

EC₅₀ T_1/2

人类血库大鼠兔子结构体外离体离体Ac-Y-Chg-R-NH₂ 2.5μM 5分钟 5分钟Ac-Y-Chg-R-L-P-NH 225nM 5分钟 5分钟Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂ 140nM 6分钟 5分钟Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH₂ 300nM 15分钟 10分钟

另外，采用离体稀释凝血酶原时间测定法，给大鼠快速给予不同剂量，检测各种化合物的抗凝血剂活性。表5所列化合物证明，按≤2毫克/公斤所示化合物给药后10分钟抑制率至少为30％。这些结果表明，本发明的各种有代表性的YIR肽具有明显的抗凝血活性。表5所列全部化合物的结构均经MS和AA加以证实。

表51. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx2. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT3. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx4. Ac-F(pNH₂)-Chg-Dab(Nγ-C₃NH₇)L-P-NH₂5. Bz-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂6. Tos-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂7. Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH₂8. Ac-pAph-Chg-AMP(4)9. y-Chg-R-L-NH₂10. Ac-F(pNH₂)-Chg-R-ol11. 环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂12. 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂13. Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂14. 3-Iqc-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂15. Ac-F(pNH₂)-Chg-R-噻吩基16. 2-Furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂17. 5-Me-thienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂18. Ac-Nal(2)-Chg-R-噻唑基19. 2-Bzf-f(pNH2)-Chg-R-L-P-NH₂20. Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C₃NH₇)-L-P-NH₂2l. Ac-Orn-Nal(2)-Chq-PalMe(3)-Sar-E-NH₂ ^*22. Ac-Phe(3-I，4-NH₂)-Chg-R-L-P-NH₂23. Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH₂24. Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH₂25. Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH₂COOH)-P-NH₂26. Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH₂27. Ac-F(pNH₂)-Chg-R-(Me)L-P-NH₂28. Ac-F(pNH₂)-Chg-R-OEt29. Ac-F(pNB₂)-Chg-Orn(N^δ-C₃H₇N)-L-P-NH₂30. Ac-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂31. Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂32. Ac-pAph-Chg-Dab(N^γ-C₃H₇N)33. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂34. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂35. Ac-pAph-Chg-R-NH₂36. Ac-pAph-Chg-R-OH37. Ac-Y-Chg-R-NH-Nip-NH₂38. Ac-K-Nal(2)-Chq-R-Hyp-E-NH₂39. DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NH₂40. DIPA-mF(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂41. Isn-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂42. Pza-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂43. Tfa-(iBu)F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂44. Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH₂45. Tfa-(iBu)Y-I-Orn(N^δ-C₃H₇N)-L-P-NH₂

^*下划线表示化合物的环状部分。

在某些试验中，采用十二指肠内给药法给予小鼠试验用化合物，按照批准方法，经皮下给予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物使雄性Sprague-Dawley小鼠麻醉。在右颈动脉插管取血样。做剖腹手术，在十二指肠上插入球形端针，并系在能够保证缝线触及插入点的位置。另一系头靠近插入点，以防止胃中的内容物泄漏。在每一试验结束时，通过压力试验测试缝线是否确能保证防止化合物到达插入位点。插入点离开十二指肠-胃接合处大约4厘米。化合物以1毫升标准盐水的形式给药。在试验化合物给药前以及给药后的第15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟分别抽取0.7毫升的血样。离心分离出血浆，利用稀释凝血酶原时间测定法测定凝血抑制效果。

在稀释凝血酶原时间测定中，按照≤50毫克/公斤化合物经十二指肠内给药，下述化合物具有至少30％的抑制率：Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-Aph-Chg-AMP(4)；环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-F(pNH₂)-Chg-R-醇；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇。c.大鼠动静脉短路血栓形成模型

利用小鼠体外动静脉(AV)短路评价本发明各种化合物的抗血栓形成有效性。AV短路回路是这样组成的：插入进右颈动脉内的20厘米长的聚乙烯(PE)60管，6厘米长的PE160管，该管内装有6.5厘米长的丝光棉线(5厘米暴露在血流中)，另一根PE60管(20厘米)，该管完成回路进入左颈静脉。在插入前，整个回路内填充标准盐水。

利用注射泵和蝶形导管将试验化合物连续注入尾静脉给药(注入量1.02毫升/小时)。给予所说化合物30分钟，然后打开回路，使血液流动15分钟(总的注入时间为45分钟)。到15分钟时，用夹子取出回路，小心地去掉棉线，在分析天平上称重。由仅注入盐水的对照小鼠所获得的血栓重量计算出血栓形成抑制百分率。

下述化合物以≤30微克/公斤/分钟注入后至少达到约30％的血栓形成抑制率：Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-Aph-Chg-AMP(4)；环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇和Tos-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂。

虽然已经结合所述实施方式对本发明加以了说明，但本领域技术人员都懂得对具体试验的描述仅仅是为了详细地说明本发明。应当理解，在不违背本发明精神的情况下可以有各种改进。因此，本发明仅仅受到权利要求的限定。

Claims

1.一种特异性抑制因子Xa活性的化合物，该化合物具有通式A1-A2-(A3)_m-B，其中m为0或1；

A1为R₁-R₂-R₃；A2为R₄-R₅-R₆；A3为R₇-R₈-R₉；

其中R₁选自于：

i).1-20个氨基酸；

ii).

和

iii).

其中的X选自N、CH和NC＝O，以及

R′₁和R″₁分别选自H、烷基、酰基、芳基、芳烷基和氨基保护基团，

R₁可以被取代基取代；

R₂为-CR₉₉R₁₀₀-，其中R₉₉和R₁₀₀分别选自H、烷基、芳烷基、杂芳烷基和杂芳基，并且R₉₉和R₁₀₀可分别被取代基取代；

R₃选自-C(O)-、-CH₂-、-CHR₉₉-C(O)-和-C(O)-NR₃₅-CH₂-C(O)-，其中R₃₅为桥连基团-C(O)-CR₅₅-中的CHR₅₅基团；

R₄选自-CH₂-和-NR₅₀-，其中R₅₀选自H、烷基、芳烷基和杂环；

R₅为-CR₂₀₁R₂₀₂-，其中R₂₀₁和R₂₀₂分别选自H、烷基、芳基和芳烷基，并且R₂₀₁和R₂₀₂可分别被取代基取代；

R₆选自-C(O)-、-CH₂-和-CHR₉₉-C(O)-；

R₇选自-CH₂-和-NR₅₁-，其中R₅₁为H、烷基、芳烷基、杂烷基和杂芳烷基，并且这些基团部分均可被选自Q和-(CH₂)_n-Q的基团取代，其中n为0-5，Q选自氨基、脒基、咪唑和胍基，这些基团可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基铵的可成药盐、其异酰脲或异硫酰脲；

R₈为-CR₂₁₀R₂₁₁-，其中R₂₁₀和R₂₁₁分别选自H、烷基、烷芳基、杂环，并且这些基团部分均可被选自Q或-(CH₂)_n-Q的基团取代，其中n为1-5，Q选自氨基、脒基、咪唑基和胍基，这些基团可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基铵的可成药盐、其异酰脲或异硫酰脲；

R₉选自-C(O)-、-CH₂-和-CHR₉₉-C(O)-；

其中，当m为1时，B选自1-20个氨基酸、-NHR₅₂、-NR₆₀R₆₁、-OR₇₀和-CHR₆₀R₆₁，

其中R₅₂选自H、烷基、芳烷基、杂芳烷基和杂芳基；

R₆₀和R₆₁分别选自H、烷基、芳烷基、芳基、杂芳烷基和杂芳基，和

R₇₀选自H、酰基、烷基、芳烷基和杂芳烷基，

而当m为0时，B选自1-20个氨基酸、-OR₇₀、-NHR₅₂和-NR₆₀R₆₁，并通过酰胺键或酯键连接到R₆上；

B可以被取代基取代，

条件是当R₃为-CH₂-或-CHR₉₉-C(O)-时，R₄则为NR₅₀；

当R₄为-CH₂-时，R₃则为-C(O)-或-CHR₉₉-C(O)-；

当R₆为-CH₂时，R₇为-NHR₅₁-；

当R₇为CH₂时，R₆为-C(O)-或-CHR₉₉-C(O)-；

当R₄为-NR₅₀-和R₁为时，R₅₀和R′₁共同构成具有式-C(O)-CHR₅₅-的桥连基团，

其中CHR₅₅代表R₅₀，羰基代表R′₁，R″₁和R₅₅分别为H、C₁-C₆烷基或芳烷基；以及当R₃为-C(O)-NR₃₅-CH₂-C(O)-时，则R₄为-NR₅₀-，R₁为

R₃₅和R′₁共同构成具有式-C(O)CHR₅₅-的桥连基团，

其中C(O)代表R′₁，CHR₅₅代表R₃₅；R″₁和R₅₅分别为H或C₁-C₆烷基。

2.根据权利要求1的化合物，其中

R₄为-NR₅₀-，

R₁为

R₅₀和R′₁共同构成具有式-C(O)-CHR₅₅的桥连基团，

其中R₅₅为H；

R₁为H或甲基；

R₉₉和R₁₀₀分别选自H、芳烷基、烷基和杂烷基或1-3个碳原子，

并且R₉₉和R₁₀₀可以进一步连接到选自下组基团的部分上：苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基、吲哚基或饱和烷基、烷氧基、一烷基氨基、二烷基氨基、四烷基铵、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、卤代、羟基、氨基、酰氨基、脒基、胍基、三唑基和磺酰基，

R₃选自-C(O)-和-C(O)-NR₃₅-CH₂-C(O)-。

3.根据权利要求1的化合物，其中该化合进一步包括在选自R₁₀和R₁、R₉和R₁、R₈和R₁、R₅和R₁、R₅和R₂、R₅和R₈、R₅和R₉中的两部分之间形成桥连结构，

其中所说的桥连结构是由结构-CR₄₀₀R₄₁₀(X-Y)-R₅₀₀R₅₁₀C-组成的，其中R₄₀₀、R₄₁₀、R₅₀₀和R₅₁₀选自H、烷基、环烷基、芳烷基和芳基；

X和Y分别选自碳、氮、氧、硫、-CO-NH-、-CH₂-O-CH₂，以及它们的功能等同物；

R₄₀₀、R₄₁₀、R₅₀₀、R₅₁₀可以被选自烷基和杂原子的部分所取代。

4.根据权利要求1的化合物，其中R′1和R″1分别被选自下组的取代基所取代：C₁-C₆烷基、-OCH₂-、-SCH₂-、＞N-CH₂-、＞NC(O)-、-CO-或-NY-CO-NZ，

其中Y和Z分别选自H、C₁-C₈烷基、C₅-C₁₂芳烷基和杂芳烷基。

5.根据权利要求1的化合物，其中R₂被选自下组的取代基所取代：苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基、吲哚基、烷基、烷氧基、一烷基胺、二烷基胺、四烷基铵、芳烷基氨基、氨基烷芳基和羧基。

6.根据权利要求5的化合物，其中R₂被选自下组中的1-5个取代基所取代：烷基、烷氧基、一烷基氨基、二烷基氨基、四烷基铵、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、卤素、羟基、氨基、酰胺基、脒基、胍基、三唑基或磺酰基。

7.根据权利要求1的化合物，其中R₁₀₀为H，R₉₉选自：

其中W选自H、氨基、低级烷基，并且可以被胺、酰胺、羟基、羧基和脒基进一步取代，也可以不被取代；

J选自氧、硫、NH和NR，其中R选自C₁-C₆烷基、C₅-C₁₂芳烷基、C₁-C₆烷酰基和C₅-C₁₂芳酰基。

8.根据权利要求1的化合物，其中R₅₀被选自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。

9.根据权利要求1的化合物，其中R₅₀选自H、烷基、芳烷基和杂芳烷基。

10.根据权利要求1的化合物，其中R₂₀₁和R₂₀₂进一步被选自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。

11.根据权利要求1的化合物，其中R₂₀₂为H，R₂₀₁选自

其中X为C、N或S，R选自H和烷基，该烷基可以被杂原子取代；n为1-5。

12.根据权利要求1的化合物，其中R₅₁被选自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。

13.根据权利要求1的化合物，其中R₂₁₀或R₂₁₁被选自Q和(CH₂)_n-Q的取代基所取代，n为1-5。

14.根据权利要求1的化合物，其中R₅₂被选自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。

15.根据权利要求1的化合物，其中R₆₀和R₆₁分别被烷基取代。

16.根据权利要求1的化合物，其中R₇₀被烷基取代。

17.根据权利要求1的化合物，其中：R₁为

R′₁选自H、-CO-Ra、-SO₂-Ra、氨基保护基团、可以被取代的1-6个氨基酸，其中所说的1-6个氨基酸的N-末端被选自H、-CO-Ra、-SO₂-Ra和氨基保护基团中的取代基所取代；

Ra选自烷基、芳基和杂烷基；

R″₁选自H、酰基和烷基；

X为N；

R₂为-CHR₉₉-，其中R₉₉选自烷基、芳基、芳烷基、杂烷基和杂芳基，并且可被选自下组中的1-6个取代基取代：氟、氯、溴、碘、氨基、硝基、脒基、酰氨基、羧基、酯基、醚基和羟基；

R₃为-C(O)-；

R₄为-NH-；

R₅为-CHR₂₀₁-，其中R₂₀₁为烷基；

R₆为-C(O)-；

R₇为-NH-；

R₈为-CHR₂₁₀-，其中R₂₁₀为带有至少一个形式正电荷的杂烷基，其中杂原子为氮原子；

R₉为-C(O)-；

B选自ORb和-N-RcRd，

其中Rb选自H、烷基和羧基保护基团，

Rc选自H和烷基，

Rd选自烷基、杂烷基和1-20个氨基酸，并且可以被取代基取代，

其中所说化合物的C-末端可以用羧基保护基团、伯酰胺基团或与R₁氨基形成仲酰胺基团或叔酰胺基团的环肽部分进行修饰。

18.根据权利要求17的化合物，其中A1选自Tyr、F(pNH₂)、mAph、pAph和Nal(2)。

19.根据权利要求17的化合物，其中该化合物含有氨基保护基团。

20.根据权利要求17的化合物，其中A2选自Ile和Chg。

21.根据权利要求17的化合物，其中A3选自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C₃H₇N)、Dap(Nβ-C₃H₇N)和Orn(Nδ-C₃H₇N)。

22.根据权利要求17的化合物，其中

A1选自Tyr、F(pNH₂)、mAph、pAph和Nal(2)，这些基团含有0或1个氨基保护基团；

A2选自Ile和Chg；

A3选自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C₃H₇N)、Dap(Nβ-C₃H₇N)和Orn(Nδ-C₃H₇N)；和

B选自-H、-OH、-NH₂、1-5个氨基酸或其功能等同物以及羧基保护基团。

23.根据权利要求22的化合物，其中该化合物选自Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Ac-F(pNH₂)-Chg-Dab(Nγ-C₃NH₇)-L-P-NH₂；Bz-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；Tos-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH₂；y-Chg-R-L-NH₂；Ac-F(pNH₂)-Chg-R-醇；环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；3-Iqc-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-F(pNH₂)-Chg-R-NH-2-噻唑基；2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；5-Me-2-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；Ac-Nal(2)-Chg-R-NH-2-噻唑基；2-Bzf-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C₃H₇N)-L-P-NH₂；Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH₂COOH)-P-NH₂；Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH₂；Ac-F(pNH₂)-Chg-R-(Me)L-P-NH₂；Ac-F(pNH₂)-Chg-R-OEt；Ac-F(pNH₂)-Chg-Orn(Nδ-C₃H₇N)-L-P-NH₂；

Ac-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；

Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂；

Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C₃H₇N)-NH₂；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂；

Ac-pAph-Chg-R-NH₂；

Ac-pAph-Chg-R-OH；

Ac-pAph-Chg-R-醇；

DIPA-(m)pAph-Chg-R-L-P-NH₂；

DIPA-(m)F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；

Isn-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；

Pza-F(pNH₂)-Chg-R-L-P-NH₂；

Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH₂；和

Tfa-(iBu)Y-I-Orn(NδC₃H₇N)-L-P-NH₂。

24.根据权利要求22的化合物，其中该化合物选自：

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；

Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；和

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇。

25.根据权利要求1的化合物，其中m为0。

26.根据权利要求25的化合物，其中B为杂芳烷基。

27.根据权利要求26的化合物，其中所说的杂芳烷基选自：

(4-(N-甲基吡啶鎓))甲基；

2-(3-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；

2-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；

(对脒基)苄基；

2-(4-(N-甲基吡啶鎓))丙-2-基；和

2-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基。

28.根据权利要求26的化合物，该化合物选自：

Ac-pAph-Chg-AMP(4)和

Ac-pAph-Chg-AEMP(4)。

29.一种特异性抑制因子Xa活性的非自然界存在的化合物，该化合物具有结构X₁-YIR-X₂，

其中X₁选自H、酰基、烷基、酰烷基、芳烷基和1-20个氨基酸，且

X₂选自经修饰的C-末端基团，一种或多种羧基保护基团和1-20个氨基酸，

其中所说的化合物可以被取代基取代。

30.根据权利要求29的化合物，其中X₁选自H、1个氨基酸和2个氨基酸，X₂选自经修饰的C-末端基团，一种或多种羧基保护基团和1-17个氨基酸。

31.根据权利要求29的化合物，其中所说的化合物是线型的。

32.根据权利要求29的化合物，其中所说的化合物是环状的。

33.根据权利要求32的化合物，其中通过YIR基元序列外的桥成环。

34.根据权利要求33的化合物，其中成环作用包括与存在于YIR基元序列内的Ile残基形成桥。

35.选自下组的权利要求29的化合物：

Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH₂，

Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH₃)O(CH₃)，

Ac-Tyr-{ψ(CH₂NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH₂(4-吡啶基)，

Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH₂NH)}-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-Tyr-Chg-Arg(NO₂)-{ψ(CH₂NH)}-Leu-NH₂，

Ac-Tyr-Ile-Arg-{ψ(COCH₂)}-Gly-Pro-NH₂，

Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-C₃H₇N)-Leu-Ala-NH₂，

Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH₂，

Tyr-Ile-Arg-NH₂，

D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH₂，

环(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)，

Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂。

Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH₂，

Ac-pAph-Chg-PalMe-NH₂，以及它们的可成药盐、酰胺、酯、醇和醛。

36.一种特异性抑制因子Xa活性的方法，该方法包括使因子Xa与权利要求1的化合物接触。

37.根据权利要求36的方法，其中R₁为

R′₁选自H、-CO-Ra、-SO₂-Ra、氨基保护基团、1-6个氨基酸，它们可被取代，其中所说的1-6个氨基酸的N-末端被选自H、-CO-Ra、-SO₂-Ra和氨基保护基团中的取代基所取代；

Ra选自烷基、芳基和杂烷基；

R″₁选自H、酰基和烷基；

X为N；

R₃为-C(O)-；

R₄为-NH-；

R₅为-CHR₂₀₁-，其中R₂₀₁为烷基；

R₆为-C(O)-；

R₇为-NH-；

R₈为-CHR₂₁₀-，其中R₂₁₀为带有至少一个形式正电荷的杂烷基，其中杂原子为1-6个氮原子；

R₉为-C(O)-；

B选自-ORb和-N-RcRd，

其中Rb选自H、烷基和羧基保护基团，

Rc选自H和烷基，

其中所说化合物的C-末端可以用羧基保护基团、伯酰胺基团或与R₁氨基形成仲酰胺基团或叔酰胺基团的环肽部分进行修饰，或者被还原为醇。

38.根据权利要求37的方法，其中

A2选自Ile和Chg；

39.根据权利要求38的方法，其中所说的化合物选自

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH₂-Chx；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；

Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH₂；

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

环戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；

5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂；和

Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇。

40.根据权利要求38的化合物，其中所说的化合物选自：

Ac-Y-I-R-L-A-NH₂，

Ac-Y-I-R-L-P-NH₂，

Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH₂，

Ac-Y-I-R-N(CH₃)O(CH₃)，

Ac-Y-{ψ(CH₂NH)}-I-R-L-P-NH₂，

Ac-Y-I-R-NH-CH₂(4-吡啶基)，

Ac-Y-I-{ψ(CH₂NH)}-R-L-p-NH₂，

Ac-Y-Chg-R(NO₂){ψ(CH₂NH)}-L-NH₂，

Ac-Y-I-R-{ψ(COCH₂)}-G-P-NH₂，

Ac-Y-I-Dab(Nγ-C₃H₇N)-L-A-NH₂，

Ac-Y-I-PalMe(3)-NH₂，

Y-I-R-NH₂，

D-Y-I-R-L-P-NH₂，

Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH₂，

环(G-Y-I-R-G)，

Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH₂，

Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH₂，

Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH₂，以及它们的可成药盐、酰胺、酯、醇和醛。

41.一种抑制个体内血凝的方法，该方法包括给予个体权利要求1的化合物。

42.一种诊断样品中因子Xa水平的方法，该方法包括使样品与权利要求1的化合物接触并测定结合的量。

43.一种诊断样品中活性因子Xa水平的方法，该方法包括使样品与权利要求1的化合物接触并测定因子Xa酶促催化活性的量。