NO318759B1 - Forbindelse som spesifikt inhiberer faktor Xa-aktivitet, farmasoytisk preparat som inneholder forbindelsen, anvendelse av forbindelsen for fremstilling av et farmasoytisk preparat og anvendelse av forbindelsen som antikoagulant. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår generelt inhibering av blodkoagulasjonsproteiner, nærmere bestemt forbindelser som spesifikt inhiberer faktor Xa-aktivitet. Den angår også farmasøytiske preparater som inneholder forbindelsene, anvendelse av forbindelsene til fremstilling av farmasøytiske preparater og anvendelse av forbindelsene som antikoagulant for å forhindre koagulasjon av en blodprøve.

Bakgrunnsinformasj on

Evnen til å danne blodkoagler er nødvendig for over-levelse. I visse sykdomstilstander er imidlertid dannelse av blodkoagler i sirkulasjonssystemet i seg selv en kilde til sykelighet. Således kan det noen ganger være ønskelig å forhindre blodkoageldannelse. Det er imidlertid ikke ønskelig å fullstendig inhibere koagulasjonssysternet, siden dette ville føre til livstruende blødninger.

For å redusere intravaskulær dannelse av blodkoagler har fagfolk prøvd å utvikle en effektiv inhibitor av protrombinase eller av faktor Xa, som inkorporeres i protrombinasekomplekset og aktiverer trombin under koageldannelse.

Passende konsentrasjoner av en faktor Xa-inhibitor ville øke nivået av protrombinasedannende midler som kreves for å initiere koagulasjon, men ville ikke på uønsket måte forlenge koagulasjonsprosessen når først en terskelkonsentrasjon av trombin er oppnådd. Trass i lang tids erkjennelse av ønskeligheten av en slik inhibitor foreligger imidlertid til dags 'dato ingen effektiv spesifikk faktor Xa-inhibitor for klinisk anvendelse.

I mange kliniske anvendelser er det et stort behov for antikoagulasjonsbehandling. De for tiden tilgjengelige medikamenter er ikke tilfredsstillende i mange spesifikke kliniske anvendelser. For eksempel vil nær 50 % av pasienter som gjennomgår fullstendig hofteutskifting, utvikle dyp venetrombose (DVT). De for tiden anerkjente behandlingsmåter omfatter en fast dose med heparin med lav molekylvekt (LMWH) og en variabel dose med heparin. Selv ved slik medikamentbehandling vil 10 % til 20 % av pasientene utvikle DVT, og 5 % til 10 % vil vise blødningskomplikasjoner.

En annen klinisk situasjon hvor bedre antikoagula-sjonsmidler trengs, omfatter pasienter som gjennomgår translum-inal kransåreangioplastikk med fare for myokardinfarkt, eller som lider av crescendo angina. Den foreliggende, vanlig aksepterte behandlingsmåte, som består av tilførsel av heparin og aspirin, er forbundet med 6 % til 8 % forekomst av abrupt karlukning i løpet av 24 timer etter behandlingen. Forekomsten av blødningskomplikasjoner som krever transfusjonsterapi grunnet bruk av heparin, er også tilnærmet 7 %. Videre vil, selv om det foreligger betydelige forekomster av forsinket karlukning, tilførsel av heparin etter avsluttet behandling være av liten verdi, og kan virke mot sin hensikt.

De vanligst anvendte blodkoagulasjonsinhibitorer er heparin og de beslektede sulfaterte polysakkarider LMWH og heparinsulfat. Disse molekyler utøver sine antikoagulasjons-virkninger ved å fremme binding av en naturlig regulator av koagulasjonsprosessen, antitrombin III, til trombin og til faktor Xa. Den inhibitoriske virkning av heparin er først og fremst rettet mot trombin, som inaktiveres tilnærmet 100 ganger raskere enn faktor Xa. Selv om heparinsulfat og LMWH sammenlignet med heparin er noe mer kraftige inhibitorer av Xa enn av trombin, er forskjellene in vi tro beskjedne {3-30 ganger), og virkningen in vivo kan være uten betydning. Hirudin og hirulog er ytterligere to trombinspesifikke antikoagulanter som for tiden benyttes i kliniske forsøk. Disse antikoagulanter, som inhiberer trombin, er imidlertid også forbundet med blødningskomplikasjoner.

Prekliniske undersøkelser hos bavianer og hunder har vist at spesifikke inhibitorer av faktor Xa hindrer koageldannelse uten å gi de samme blødningsbivirkninger som observeres med direkte trombininhibitorer. Slike faktor Xa-inhibitorer omfatter f.eks. 2,7-bis-(4-amidinobenzyliden)-sykloheptanon og Na-tosylglysyl-3-amidinofenylalaninmetylester ("TENSTOP"), hvis effektive inhibitoriske konsentrasjoner (Ki-verdier) ligger på tilnærmet 20 nM henholdsvis 800 nM. ( + )-(2S)-2-(4{{ (3S)-1-acetimidoyl-3-pyrrolidinyl}oksy)fenyl)-3-(7-amidino-2-naftyl)propansyre representerer også en klasse av faktor Xa-inhibitorer (Katakura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 137:965-972 (1993)). Hittil har imidlertid disse forbindelser ikke blitt utviklet klinisk.

Videre omtales teknikkens stilling i følgende publikasjoner: WO 80/00351 beskriver en forbindelse GL-Phe-Val-Arg-MNA som virker som et substrat på faktor Xa og som inneholder en sekvens med et tripeptidmotiv av aromatisk-alifatisk-basisk aminosyrer.

A.G. Maule et al., Regulatory Peptides, vol. 50 no. 1, 1994, s. 37-47 og B. Ponsati et al., Analytical Biochemistry, vol. 181, no. 2, 1989, s. 389-395 gjør kjent YIR-peptidsekvenser. Det samme gjør E.C. Jorgensen et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol. 14, no. 10, 1971, s. 899-903.

H.L. Messmore et al., Thromb. Haem., vol. 42, no. 1, 1979, s.952 rapporterer om bruk av derivater av syntetiske lavmolekylære peptidanaloger til inhibering av serinproteaser. Det ble funnet at faktor-Xa ble inhibert av H-D-Phe-Phe-Arg-NH2 og derivater av dette peptidet. Resultatene av forsøkene som er gjort viser at molekylær manipulering med lavmolekylære peptidanaloger av serinproteaser kan vise seg å gi opphav til potente inhibitorer av faktor Xa.

G. Claeson et al., Annals N.Y. Academy of Science, vol. 370, 1981, s. 798-811 gjør kjent at enkle estere og amider av aminosyrer lenge har vært brukt som syntetiske substrater for serinproteaser i forbindelse med koagulering og fibrinolyse. Publikasjonen gjør i likhet med E. Shaw , Folia Haematology, vol. 109, no. 1, 1982, s. 33-42 kjent peptidsekvensen for faktor-Xa-substraters aktive sete.

EP 019589 gjør kjent tripeptidderivater med formel H-D-X-Y-Z-R der X kan være Tyr og Y kan være Ile og Z kan være Arg.

EP 171270 beskriver peptider med den partielle sekvensen - Tyr-Cpg (Chg) -His..

WO 9315756 er relatert til peptidaldehydanaloger som inhiberer trombin eller faktor-Xa. Forbindelsene kan anvendes til å forhindre eller behandle tilstander karakterisert ved unormal trombose.

Spesifikke proteininhibitorer av faktor Xa er også identifisert, og omfatter f.eks. antistasin ("ATS") og anti-koagulasjonspeptid fra midd ("TAP"). ATS, som isoleres fra iglen Haementeria officinalis, inneholder 119 aminosyrer og har en Ki for faktor Xa på 0,05 nM. TAP, som isoleres fra midden Ornithodoros moubata, inneholder 60 aminosyrer og har en Ki for faktor Xa på tilnærmet 0,5 nM.

Effektiviteten av rekombinant fremstilt ATS og TPA er undersøkt i en rekke dyremodellsystemer. Begge inhibitorer reduserer blødningstiden sammenlignet med andre antikoagulanter, og forhindrer koagulasjon i en tromboplastinindusert, avsnørt halsvenemodell for dyp venetrombose. De oppnådde resultater i denne modell samsvarer med resultater oppnådd ved å benytte det for tiden foretrukne medikament heparin.

Subkutan ATS ble også funnet å være en effektiv behandling i en tromboplastinindusert modell for disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC). TAP forhindrer effektivt "high-shear" arteriell trombose og "redusert gjennomstrømning" forå-rsaket av kirurgisk innsetting av et polyester("DACRON")-tran-splantat ved nivåer som gav en klinisk aksepterbar forlengelse av den aktiverte partielle tromboplastintid (aPTT), dvs. mindre enn tilnærmet to gangers forlengelse. Til sammenligning forhindret ikke standard heparin trombose og redusert gjennomstrømning i transplantatet, selv ikke ved doser som gav fem gangers økning av aPTT. aPTT er en klinisk koagulasjonsanalyse som er spesielt følsom for trombininhibitorer.

ATS og TAP er ikke utviklet klinisk. Én vesentlig ulempe ved disse to inhibitorer er at tilførsel av de påkrevde gjentatte doser fører til dannelse av nøytraliserende anti-stoffer, noe som begrenser deres mulige kliniske anvendelse. Videre gjør størrelsen av TAP og ATS oral tilførsel umulig, noe som ytterligere begrenser antallet pasienter som kan dra nytte av disse midlerr.

En spesifikk inhibitor av faktor Xa ville ha vesentlig praktisk anvendelse innen medisinen. Særlig vil en faktor Xa-inhibitor være effektiv under betingelser hvor de medikamenter som foretrekkes i dag, heparin og beslektede sulfaterte polysakkarider, kun har begrenset eller ingen virkning. Således foreligger et behov for en faktor Xa-spesifikk blodkoagulasjons-inhibitor med lav molekylvekt som er effektiv, men som ikke gir uønskede bivirkninger. Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller dette behov og tilveiebringer i tillegg beslektede fordeler.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som spesifikt inhiberer faktor Xa-aktivitet, kjennetegnet ved at den har den generelle formel

hvor

Al er Tyr, F{pNH2), mAph, pAph eller Nal (2), som inneholder 0

eller 1 aminobeskyttende gruppe,

A2 er Ile eller Chg,

A3 er Arg, PalMe(3), Dab(N<Y->C3H7N) , Dap (NP-C3H7N) eller Orn(N5-C3H7N) ;

og

B er -H, -0H, -NH2r én til fem aminosyrer eller en karboksybeskyttende gruppe, omfattende farmasøytisk akseptable salter derav.

Foreliggende oppfinnelse angår også et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det inneholder forbindelsene.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av forbindelsene til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en kardiovaskulær forstyrrelse valgt blant gruppen bestående av restenose etterfølgende angioplastikk, "adult respiratory distress syndrome", multi-organsvikt, slag og disseminert intravaskulær koagulasjonsforstyrrelse.

Foreliggende oppfinnelse angår i tillegg anvendelse av forbindelsene som antikoagulant for å forhindre koagulasjon av en blodprøve.

Slike forbindelser viser en spesifikk inhibering av faktor Xa-aktivitet med Ki < 100 uM, fortrinnsvis Kj < 2 nM, og inhiberer ikke i vesentlig grad aktiviteten av andre proteaser som deltar i koagulasj onskaskaden.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er et skjematisk diagram over blodkoagulasjonskaskaden. Figur 2 gir et eksempel på en struktur for en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Figur 3 viser en syntesevei for fremstilling av noen forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Blodkoagulasjonen er en komplisert prosess som omfatter en gradvis forsterket serie av enzymaktiveringsreaksjoner hvor plasmazymogener fortløpende aktiveres ved begrenset proteolyse. Mekanistisk kan blodkoagulasjonskaskaden inndeles i den intrinsiske og den ekstrinsiske vei, som møtes ved aktiveringen av faktor X, og hvor den påfølgende dannelse av trombin skjer via en enkelt, felles vei (se figur 1).

Foreliggende bevismateriale antyder at den intrinsiske vei spiller en viktig rolle i bibeholdelse og vekst av fibrindannelse, mens den ekstrinsiske vei er kritisk i initieringsfasen av blodkoagulasjonen. Det er generelt akseptert at blodkoagulasjonen initieres fysisk ved dannelse av et vevsfaktor-/faktor Vlla-kompleks. Når dette kompleks først er dannet, vil det hurtig initiere koagulasjon ved å aktivere faktorene IX og X. Den nydannede faktor Xa danner så et én-til-én-kompleks med faktor Va og fosfolipider, slik at et protrombinasekompleks dannes, som så er ansvarlig for overføring av løselig fibrinogen til uløselig fibrin. Med tiden vil aktiviteten av faktor Vlla-/vevsfaktorkomplekset (den ekstrinsiske vei) undertrykkes av et proteaseinhibitorprotein av Kunitz-type, TFPI, som ved kompleks-binding til faktor Xa direkte kan inhibere den proteolytiske aktivitet av VIIa-/vevsfaktor. For å opprettholde koagulasjonsprosessen i nærvær av et inhibert ekstrinsisk system fremstilles ytterligere faktor Xa via den trombinmedierte aktivitet av den intrinsiske vei. Således spiller trombin en autokatalytisk dobbeltrolle ved at det fremmer sin egen dannelse og overføringen av fibrinogen til fibrin.

Trombindannelsens autokatalytiske natur er en viktig beskyttelse mot ukontrollert blødning, og sikrer at når først et gitt terskelnivå av protrombinase foreligger, vil blodkoagulasjonen forløpe fullstendig, slik at f.eks. blødningen opphører. Følgelig er det mest ønskelig å utvikle midler som inhiberer koagulasjonen uten direkte å inhibere trombin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer YIR-peptider, som er forbindelser som inhiberer faktor Xa-aktivitet uten i vesentlig grad å inhibere aktiviteten av andre proteaser som deltar i blodkoagulasjonsveien. Som benyttet heri, viser begrepet "forbindelse" eller "YIR-peptid" til et ikke naturlig forekommende Tyr-Ile-Arg(YIR)-peptid og etterlignere av dette, som kan inhibere faktor Xa-aktivitet. YIR-sekvensen selv vises heri til som "YIR-motivét", og består av tripeptidet tyrosin-isoleucin-arginin eller en funksjonell ekvivalent av dette, som f.eks. pAph-Chg-PalMe{3), pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 og pAph-Chg-AMP(4) (se tabell 1 for forkortelser). Slike forbindelser ifølge oppfinnelsen inneholder minst ett YIR-motiv eller en funksjonell ekvivalent av dette, og kan spesifikt inhibere aktiviteten av faktor Xa. For enkelthets skyld benyttes begrepene "forbindelse" og "YIR-peptid" heri i bred forstand for å vise til peptidene ifølge oppfinnelsen, heriblant funksjonelle ekvivalenter som peptidanaloger, peptidetterlignere og syntetiske organiske forbindelser. En funksjonell ekvivalent av et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen kan delvis karakteriseres ved at det har en struktur som beskrevet heri, og at det har en Ki < 100 uM for inhibering av faktor Xa-aktivitet (se eksempel XXXVII).

Peptidanaloger av et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen omfatter f.eks. peptider som inneholder ikke naturlig forekommende aminosyrer eller kjemisk modifiserte aminosyrer, forutsatt at forbindelsen fortsatt har faktor Xa-inhiberende aktivitet (se f.eks. tabell 2). På tilsvarende måte er peptidetterlignere kjemiske strukturer som ikke er aminosyrer, men som etterligner strukturen av et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen og som bibeholder faktor Xa-inhibitoraktivitet. Slike etterlignere kan generelt karakteriseres ved at de viser lignende fysiske egenskaper som størrelse, ladning eller hydrofobisitet, presentert i tilsvarende romlig orientering som den som finnes i det tilsvarende normale YIR-peptid.- Et spesifikt eksempel på en peptidetterligner er en forbindelse hvor amidbindingen mellom én eller flere av aminosyrene er erstattet med f.eks. en karbon-karbonbinding eller andre bindinger, noe som er velkjent innen faget (se f.eks. Sawyer i Peptide Based Drug Design, s. 387-422, ACS, Washington DC, 1995) , som inkorporeres heri ved referanse. Således tilveiebringer oppfinnelsen videre faktor Xa-inhiberende forbindelser med strukturen A1-A2-(A3)m-B, hvor m er 0 eller 1, som beskrevet heri (se nedenfor). Eksempler på slike peptider, som kan være etterlignende forbindelser, blir gitt heri.

Som benyttet heri, betegner begrepet "aminosyre" i sin bredeste forstand for å vise til de 20 naturlig forekommende aminosyrer, som translateres fra den genetiske kode og utgjør byggesteinene i proteiner, heriblant, med mindre annet spesielt er angitt, L-aminosyrer og D-aminosyrer så vel som kjemisk modifiserte aminosyrer, som aminosyreanaloger, naturlig forekommende aminosyrer som ikke vanligvis inkorporeres i proteiner, f.eks. norleucin, og kjemisk syntetiserte forbindelser med egenskaper kjent innen faget for å være karakteristiske for en aminosyre. For eksempel omfattes analoger eller etterlignere av fenylalanin eller prolin, som gir den samme konformasjonelle begrensning i peptidforbindelsene som naturlig Phe eller Pro, innen definisjonen av "aminosyrer", og vil være kjent blant fagfolk. Slike analoger eller etterlignere vises heri til som 11 funksjonelle ekvivalenter" av en aminosyre. Andre eksempler på aminosyrer og aminosyreanaloger er oppstilt av Roberts og Vellaccio (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, red.: Gross og Meienhofer, bind 5, s. 341, Academic Press, Inc., N.Y., 1983), som inkorporeres heri ved referanse). Forkortelser for aminosyrer, aminosyreanaloger og etterlignende strukturer er opplistet i tabell 1.

Som benyttet heri, viser begrepet "faktor Xa-aktivitet" til evnen til faktor Xa, enten alene eller i komplekset av subenheter -betegnet protrombinasekomplekset, til å katalysere overføringen av protrombin til trombin. Når det benyttes med henvisning til faktor Xa-aktivitet, omfatter begrepet "inhibering" både direkte og indirekte inhibering av faktor Xa-aktivitet. Direkte inhibering av faktor Xa-aktivitet kan f.eks. oppnås ved binding av et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen til faktor Xa eller til protrombinase, slik at binding av protrombin til protrombinasekompleksets aktive sete forhindres. Indirekte inhibering av faktor Xa-aktivitet kan f.eks. oppnås ved binding av en forbindelse ifølge oppfinnelsen til løselig faktor Xa, slik at faktorens innføring i protrombinasekomplekset forhindres.

Som benyttet heri, betyr begrepet "spesifikt", når det viser til inhibering av faktor Xa-aktivitet, at et YIR-peptid kan inhibere faktor Xa-aktivitet uten i vesentlig grad å inhibere aktiviteten av andre angitte proteaser, heriblant plasmin og trombin (ved å benytte samme konsentrasjon av inhibitoren). Slike proteaser deltar i blodkoagulasjonen og fibrinolysekaskaden (se tabell 2, se også eksempel XXVII).

Resultatene i tabell 2 viser at YIR-peptidene som er anvendbare som inhibitorer av faktor Xa, uten at de i vesentlig grad inhiberer aktiviteten av andre serinproteaser som trombin eller plasmin, som deltar i blodkoagulasjon og fibrinolyse.

Som benyttet heri, viser begrepet "substituent" til enhver av forskjellige kjemiske grupper som kan substitueres til peptidryggraden eller sidekjeden i et peptid, en peptidanalog, en etterlignende eller organisk forbindelse som beskrevet heri. En substituent kan omfatte enhver av en rekke forskjellige molekylrester kjent blant fagfolk (se f.eks. Giannis og Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:1244-1267 (1993), som inkorporeres heri ved referanse. Flere eksempler som viser substitusjon av en substituent, er beskrevet heri, heriblant f .eks. substitusjon av en pNH2-substituent til fenylalanin, slik at F(pNH2) erholdes, og substitusjon av et halogen til tyrosin, slik at f.eks. Y(3-I) eller Y(3,5-I) erholdes. I tillegg kan en substituent f.eks. være et heteroatom som nitrogen (N, se f.eks. Pal), oksygen (0, se f.eks. 0-metyltyrosin) eller svovel (S, se f.eks. Tyr(S03H)), som kan substitueres med en substituent. Således betraktes en N-, S- eller 0-holdig rest som -S03H som en "substituent", som definert heri. Videre kan en substituent være en aminobeskyttende gruppe eller en karboksybeskyttende gruppe.

Som benyttet heri, brukes begrepet "alkyl" i sin bredeste forstand for å omfatte mettede eller umettede, lineære, forgrenede eller sykliske kjeder med tilnærmet 1-13 karbonatomer. Således omfatter begrepet "alkyl" f.eks. metyl-, etyl-, n-propyl-, isopropyl-, sek.-butyl-, 1-metylbutyl-, 2,2-dimetylbutyl-, 2-metylpentyl-, 2,2-dimetylpropyl-, n-pentyl- og n-heksylgrupper, alkylengrupper, sykliske kjeder av karbonatomer som sykloheksyl-og syklopentylgrupper, så vel som kombinasjoner av lineære eller forgrenede kjeder og sykliske karbonatomkjeder som f.eks. metyl-sykloheksyl- eller syklopropyl-metylengruppen. I tillegg bør det forstås at et alkyl som definert heri, kan være substituert med en substituent. På tilsvarende måte benyttes begrepet "acyl" i sin bredeste forstand for å omfatte mettede eller umettede, lineære, forgrenede eller sykliske kjeder med tilnærmet 1-13 karbonatomer, som inneholder en karboksylgruppe. Således omfatter begrepet "acyl" f.eks. grupper som formyl, acetyl, benzoyl og 1ignende.

Begrepet "aryl" viser til aromatiske grupper med tilnærmet 5-13 karbonatomer og minst én "ring" med et konjugert pi-elektronsystem. Eksempler på aryler omfatter f.eks. heterosykliske arylgrupper, biarylgrupper og analoger og derivater av disse, som alle om ønskelig kan substitueres med én eller flere substituenter. Begrepet "arylalkyl" viser til et alkyl som definert ovenfor, substituert med en arylgruppe. Egnede arylalkylgrupper omfatter benzyl, pikolyl og tilsvarende, som alle om ønskelig kan substitueres.

Begrepene "heteroalkyl", "heteroarylalkyl" og "heteroaryl" benyttes også heri, og viser til et alkyl, et arylalkyl henholdsvis et aryl som er substituert med ett eller flere heteroatomer som f.eks. et N-, 0- eller S-atom. I tillegg benyttes begrepet "heterosyklisk" for å vise til en syklisk alkyl- eller arylgruppe som er substituert med ett eller flere heteroatomer. Flere eksempler på heteroalkyler, heteroarylalk-yler, heteroaryler og heterosykliske forbindelser er f.eks. gitt i tabellene 1 og 3, og er ellers velkjent innen faget.

Peptidene kan modifiseres i N-terminal eller C-terminal ende ved å benytte en aminobeskyttende gruppe henholdsvis en karboksybeskyttende gruppe. Flere slike modifikasjoner er beskrevet heri {se f.eks. tabell 3). Den N-terminale ende i et peptid eller en peptidanalog kan modifiseres kjemisk, slik at den N-terminale aminogruppe er substituert, f.eks. med en acetyl-, syklopentylkarboksy-, isokinolinylkarboksy-, furoyl-, tosyl-, pyrazinkarboksy- eller annen tilsvarende gruppe, som kan være substituert med en substituent som beskrevet ovenfor. Den N-terminale aminogruppe kan også f.eks. være substituert med en reversert amidbinding. Det bør forstås at begrepet "aminogruppe" benyttes bredt heri for å vise til enhver fri aminogruppe, heriblant en primær, sekundær eller tertiær aminogruppe, som foreligger i et peptid. Til sammenligning viser begrepet "N-terminal ende" til a-aminogruppen i den første aminosyre som foreligger i et peptid opptegnet på konvensjonell måte.

Den N-terminale ende i et peptid kan beskyttes ved tilkobling av en aminobeskyttende gruppe. Begrepet "aminobeskyttende gruppe" benyttes bredt heri for å vise til en kjemisk gruppe som kan reagere med en fri aminogruppe, heriblant f.eks. a-aminogruppen som foreligger i den N-terminale ende av et peptid ifølge oppf-innelsen. Ved at den reagerer med denne, vil en aminobeskyttende gruppe beskytte den ellers reaktive aminogruppen mot uønskede reaksjoner som f.eks. kan forekomme under en syntesefremgangsmåte, eller grunnet eksopeptidaseaktivitet i et sluttprodukt. Modifikasjon av en aminogruppe kan også gi ytterligere fordeler, heriblant f.eks. økt løselighet eller aktivitet av forbindelsen. Forskjellige aminobeskyttende grupper beskrives heri (se tabell 3) og er ellers velkjent innen faget, og omfatter f.eks. acylgrupper som acetyl-, pikoloyl-, tert.-butylacetyl-, tert.-butyloksykarbonyl-, benzyloksykarbonyl- og benzoylgrupper, heriblant f.eks. et benzyloksim som 2-aryl-2-0-benzyloksim (se eksempel XVI), så vel som en aminosyrerest, som selv kan være modifisert med en aminobeskyttende gruppe. Andre aminobeskyttende grupper er f.eks. beskrevet i The Peptides, red. Gross og Meienhofer, bind 3 (Academic Press, Inc., N.Y., 1981); og av Greene og Wuts i Protective Groups in Organic Synthesis, 2. utg., s. 309-405, John Wiley & Sons, New York (1991), som begge inkorporeres heri ved referanse. Produktet av en slik modifisering av den N-terminale aminogruppe i et peptid eller en peptidanalog ifølge oppfinnelsen betegnes heri som et "N-terminalt derivat".

Tilsvarende kan en karboksygruppe, som f.eks. karboksygruppen som foreligger i et peptids C-terminale ende, modifiseres kjemisk ved å benytte en karboksybeskyttende gruppe. Begrepene "karboksygruppe" og "C-terminal ende" benyttes på en måte som er i samsvar med begrepene "aminogruppe" og "N-terminal ende", som definert ovenfor. En karboksygruppe, f.eks. den som foreligger i et peptids C-terminale ende, kan modifiseres ved reduksjon av den C-terminale karboksygruppe til en alkohol eller et aldehyd, eller ved dannelse av en oral ester eller ved substitusjon av karboksygruppen med en substituent som f.eks. en tiazolyl-, en sykloheksyl- eller en annen gruppe. Orale estere er velkjent innen faget og omfatter f.eks. alkoksymetylgrupper som metoksymetyl, etoksymetyl, isopropoksymetyl og lignende; a-(Ci-C4)alkoksyetylgruppene som metoksyetyl-, etoksyetyl-, propoksyetyl-, isopropoksyetyl- og lignende; 2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetylgruppene som 5-metyl-2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetyl-, 5-fenyl-2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetyl- og lignende; Ci-C3-alkyltiometylgruppene som metyltiometyl-, etyltiometyl-, isopropyltiometyl- og lignende; acyloksymetylgruppene som pivaloyloksymetyl-, a-acetoksymetyl- og lignende; etoksykarbonyl-1-metylgruppen; a-acyloksy-a-substituerte metylgrupper som a-acetoksyetyl-, 3-ftalidyl- eller 5,6-dimetylftalidylgruppen, 1-(Ci-C4-alkyloksykarbonyloksy)et-l-ylgruppene som 1-(etoksykarbonyloksy) et-l-ylgruppen; og 1-(Ci-C4-alkylamino-karbonyloksy)et-l-ylgruppen som 1-(metylaminokarbonyloksy)et-l-ylgruppen .

Et peptid ifølge oppfinnelsen kan modifiseres ved tilkobling av en karboksybeskyttende gruppe. Karboksybeskyttende grupper er velkjent innen faget, og vil ved at de bindes til peptidet beskytte en karboksygruppe mot uønskede reaksjoner (se f.eks. Greene og Wuts, supra, s. 224-276 (1991), som inkorporeres heri ved referanse). Den dyktige fagmann vil innse at slike modifikasjoner som er beskrevet ovenfor, som kan utføres på et peptids N-terminale aminogruppe eller C-terminale karboksygruppe, på tilsvarende måte kan utføres på enhver reaktiv aminogruppe eller karboksygruppe som f.eks. foreligger i sidekjeden til en aminosyre eller aminosyreanalog i et peptid ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåter for utførelse av slike modifikasjoner beskrives heri, og er ellers velkjent innen faget.

Forbindelser som spesifikt inhiberer aktiviteten av faktor Xa, og som har den generelle formel A1-A2-(A3)m-B, hvor m er 0 eller 1, og Al er Ri-R2-R3/ A2 er R4-R5-R6, og A3 er R7-RB-R9; hvor Rx er valgt fra gruppen som består av 1-20 aminosyrer;

gruppen som består av N, CH og NC(0) , og R'i og R"i er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen som består av H, alkyl, acyl, aryl, arylalkyl og en aminobeskyttende gruppe, og hvor Ri kan substitueres med en substituent; R2 er -CR99Ri0o-, hvor R99 og R100 uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen som består av H, alkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl og heteroaryl, og hvor R99 og R10o uavhengig av hverandre kan substitueres med en substituent;

R3 er valgt fra gruppen som består av -C(0)-, -CH2-, -CHR99-C (0)-og -C(0)-NR3s-CH2-C (0)-, hvor R35 er CHR5S-gruppen i brogruppen - C(0)-CR5S-; R4 er valgt fra gruppen som består av -CH2- og -NR50-, hvor R50 er'valgt fra gruppen som består av H, alkyl, arylalkyl og heterosyklisk; R5 er >R20iR202 » hvor R20i og R202 uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen som består av H, alkyl, aryl og arylalkyl, og hvor R2oi og R202 uavhengig av hverandre kan substitueres med en substituent; R6 er valgt fra gruppen som består av -C(0)-, -CH2- og -CHR99-C(0) -R7 er valgt fra gruppen som består av -CH2- og -NR5i-, hvor R51 er H, alkyl, arylalkyl, heteroalkyl og heteroarylalkyl, og enhver av disse rester substituert med en substituent valgt fra gruppen som består av Q og -(CH2)n-Q, hvor n er 1-5, og hvor Q er valgt fra gruppen som består av en amino-, amidino-, imidazol- og guanidinogruppe, som kan være substituert med en substituent, og et mono-, di-, tri-eller tetraalkylammonium av et farmasøytisk aksepterbart salt, isoureid eller isotioureid av disse; RB er -CR210R211-/ hvor R210 og R2n uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen som består av H, alkyl, alkylaryl og heterosyklisk, og enhver av disse rester substituert med en substituent valgt fra gruppen som består av Q og -(CH2)n-Q, hvor n er 1-5, og hvor Q er valgt fra gruppen som består av en amino-, amidino-, imidazol- og guanidinogruppe, som kan være substituert med en substituent, og et mono-, di-, tri-eller tetraalkylammonium av et farmasøytisk aksepterbart salt, isoureid eller isotioureid av disse; R9 er valgt fra gruppen som består av -C(0)-, -CH2- og -CHR99-C (0) -; og hvor, når m er 1, B er valgt fra gruppen som består av 1-20 aminosyrer, -NHR52, -NR60R6i, -OR70 og -CHR60R6i, hvor R52 er valgt fra gruppen som består av H, alkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl og heteroaryl, hvor R6o og R6i uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen som består av H, alkyl, arylalkyl, aryl, heteroarylalkyl og heteroaryl, og hvor R70 er valgt fra gruppen som består av H, acyl, alkyl, arylalkyl og heteroarylalkyl, og hvor, når m er 0, B er valgt fra gruppen som består av 1-20 aminosyrer, -OR70, -NHR52 og -NR60R6ir som er koblet til R6 ved en amidbinding eller en esterbinding, hvor B kan være substituert med en substituent, forutsatt at når R3 er -CH2- eller -CHRS9-C(0)-, er R4 NR50; når R4 er -CH2-, er R3 -C(O)- eller - CHR99-C(0)-; når R4 er -CH2-, er R3 -C(O)- eller -CHR99-C (0) -; når R6 er -CH2-, er R7 -NHR51-; når R7 er CH2, er R6 -C(0)- eller - CHR99-C(0)-; når R4 ér -NRS0- og Ri er er R50 og R'i slått sammen, slik at en bro- gruppe dannes med formelen -C(O)-CHR55-, hvor CHRS5 representerer R50, og karbonylgruppen representerer R'i, og R<1> '1 og R55 uavhengig av hverandre er H, Ci-Cs-alkyl eller arylalkyl; og når R3 er - C(O)-NR35-CH2-C(0)-, så er R4 -NR50-, Ri er R35 og R'i slås sammen, slik at en bro- gruppe dannes med formelen -C(0)-CHR5S-, hvor C(0) representerer R'i, og CHR55 representerer R3S; R' '1 og R55 er uavhengig av hverandre H eller Ci-Ce-alkyl (se f.eks. figur 2). En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan inneholde en syklisk N-terminal ende dannet av Rlf R2, R3 og, om ønskelig, R4. En slik forbindelse er f.eks. definert ved strukturen A1-A2-(A3)m-B, som beskrevet ovenfor, hvor R* er -NR50-, Ri er Rso og R'i slås sammen, slik at en bro- gruppe dannes med formelen -C(0)-CHR55, hvor RS5 er H; Ri er H eller metyl; R99 og Ri00 er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen som består av H, arylalkyl, alkyl og heteroalkyl eller 1-3 karbonatomer, og hvor R99 og R100 videre kan kobles til en rest valgt fra gruppen som består av fenyl, tienyl, tiazolyl, pyridyl, naftyl, tionaftyl, indolyl eller mettet alkyl, alkoksy, monoalkylamino, dialkylamino, tetraalkylammonium, arylalkylamino, aminoalkylaryl, karboksy, halogen, hydroksy, amino, amido, amidino, guanidino, triazolyl og sulfonyl, og R3 er valgt fra gruppen som består av -(CO)- og -C(0)-NR35-CH2-C(0)-. Videre kan i forbindelsen A1-A2-(A3)m-B R'l- og R''l-restene substitueres med opptil seks substituenter, heriblant f.eks. et alkyl, og om ønskelig kobles til en gruppe som -0CH2-, -SCH2-, >N-CH2-, >NC(0)-( -CO- eller -NY-CO-NZ, hvor Y og Z kan være H, alkyl, arylalkyl eller heteroaralkyl. Videre kan R99 og R100 uavhengig av hverandre substitueres med en substituent som f.eks. en fenyl-, tienyl-, tiazolyl-, pyridyl-, naftyl-, tionaftyl- eller indolylgruppe, eller en mettet gruppe som tilsvarer disse, om ønskelig substituert med opptil fem grupper valgt fra alkyl, alkoksy, mono-, di- eller trialkylamin, tetraalkylammonium, arylalkylamino, aminoalkylaryl, karboksy, 'halogener, hydroksy, amino, amid, amidino, guanidino, triazolyl eller sulfonyl. En foretrukket forbindelse med substitusjoner i R2-posisjonen er når R100 er en H og R99 er enten hvor W i den substituerte forbindelse f.eks. kan være en halogen-hydroksyl-, amino- eller amidinogruppe, og J f.eks. kan være 0, S eller -NR, hvor R er en H eller et alkyl, aryl eller arylalkyl. Forbindelser som inneholder en substituent substituert på A2-resten, og som viser faktor Xa-inhiberende aktivitet, kan f .eks. ha substitusjon av R50/ R201 eller R202 med én eller flere heteroatomsubstituenter som N, 0 eller S. R202 kan også være substituert med en substituent valgt blant

hvor X er C, N eller S; R er fraværende, H eller alkyl, som kan være substituert med et heteroatom, og n er 1-5.

Forbindelser som inneholder en substituent substituert på A3-resten, og som viser faktor Xa-inhiberende aktivitet, kan f.eks. omfatte substitusjon av R51 med én eller flere substituenter som f.eks. en H, alkyl, arylalkyl eller heterosyklisk, om ønskelig substituert med et heteroatom som N, 0 eller S. R2i0 og R2n kan f.eks. være substituenten -(CH2)n-Q, hvor n er tilnærmet 1-5, og hvor Q er amino, amidino, urea, imidazol, guanidino, mono-, di-, tri- eller tetraalkylammonium av et farmasøytisk aksepterbart salt, isoureid eller isotioureid. Alternativt kan R2i0 eller R2n f .eks. være alkyl, aryl eller alkylaryl. Disse grupper kan videre substitueres med en substituert som f.eks. en hydroksy- eller Ci-C4-alkoksygruppe.

Forbindelsene kan inneholde et alternativt arrangement av substituenter som omfatter B-resten. Et slikt alternativt arrangement av substituenter kan f.eks. omfatte substitusjon av R52 med et N, 0 eller S, eller substitusjon av R6o, R6i eller R70 med ett ell-er flere heteroatomer eller én eller flere alkylgrupper.

De generelle strukturer som beskrives heri, representerer de forskjellige forbindelsene, som bibeholder faktor Xa-inhiberende virkning tilsvarende den gitt av tripeptidet YIR. Også representert blant strukturene som beskrives heri, er forbindelser som inneholder ikke naturlig forekommende aminosyrer, aminosyreetterlignere og andre organiske strukturer og substituenter som viser lignende funksjon. Slike funksjonelle ekvivalenter gir passende romlig gruppering av de ønskede ladninger og krefter som gir en effektiv faktor Xa-inhiberende funksjon.

Spesifikke eksempler på forbindelsene omfatter f.eks. Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)0(CH3) ; Ac-Tyr-{¥(CH2NH) }-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2 (4-pyridyl) ; Ac-Tyr-Ile-{v(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Chg-Arg(N02) -

{V(CH2NH) }-Leu-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-{¥{COH2) }-Gly-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Dab(NY-C3H7N) -Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)NH2; Tyr-Ile-Arg-NH2; (D)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2; syklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 og Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2. Ytterligere YIR-peptider er f.eks. vist i tabellene 3 og 5.

Det tilveiebringes også en forbindelse med strukturen A1-A2-(A3)m-B, hvor Ri er

R'i er valgt fra gruppen som består av H, -CO-Ra, -S02-Raf en aminobeskyttende gruppe, 1-6 aminosyrer som kan være substituert, hvor den N-terminale ende av disse 1-6 aminosyrer er substituert med en substituent valgt fra gruppen som består av H, -CO-Ra, -S02-Ra og en aminobeskyttende gruppe; og hvor Ra er valgt fra gruppen som består av alkyl, aryl og heteroalkyl; R''i er valgt fra gruppen som består av H, acyl og alkyl; X er N; R2 er -CHR99-, hvor R99 er valgt fra gruppen som består av alkyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl og heteroaryl, som kan være substituert med en substituent valgt fra gruppen som består av 1-6 fluor-, klor-, brom-, jod-, amino-, nitro-, amidino-, amido-, karboksy-, -ester-, eter- og hydroksygrupper; R3 er -C(0)-; R4 er - NH-; R5 er -CHR20i-, hvor R20i er et alkyl; Rs er -C(0)-; R7 er -NH-; Re er -CHR2io-i hvor R2i0 er et heteroalkyl med minst én formell positiv ladning, hvor heteroatomet er 1-6 nitrogenatomer; R9 er - C(0)-; og B er valgt fra gruppen som består av -0Rb og -N-RcRd, hvor Rb er valgt fra gruppen som består av H, alkyl og en karboksybeskyttende gruppe, Rc er valgt fra gruppen som består av H og alkyl, og Rd er valgt fra gruppen som består av alkyl, heteroalkyl og 1-20 aminosyrer, som kan være substituert med en substituent, hvor den C-terminale ende av forbindelsen kan være modifisert med en karboksybeskyttende gruppe, en primær amidgruppe eller en del av et syklisk peptid som den sekundære eller tertiære amidgruppe dannet med aminogruppen i Rx. En slik forbindelse kan inneholde én eller flere aminobeskyttende grupper.

For eksempel har forbindelsen Al valgt fra gruppen som består av Tyr, F(pNH2), mAph, pAph og Nal(2), som inneholder 0 eller 1 aminobeskyttende gruppe; A2 er valgt fra gruppen som består av Ile og Chg; A3 er valgt fra gruppen som består av Arg, PalMe(3), Dab (NY-C3H7N) , Dap (NP-C3H7N) og Orn (N°-C3H7N) ; og B er valgt fra gruppen som består av -H, -0H, -NH2, 1-5 aminosyrer eller funksjonelle ekvivalenter av disse og en karboksybeskyttende gruppe. Eksempler på slike forbindelser omfatter Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2-; Ac-pAph-Chg-PalMe{3)-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; syklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 3-Igc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 og Ac-pAph-Chg-PalMe{3)-ol (se også tabell 5) .

Tilveiebringes kan videre en forbindelse med strukturen A1-A2-B, dvs. A1-A2-(A3)m-B, hvor m er 0. I en slik forbindelse kan B være et heteroarylalkyl, som f.eks. (4-(N-metylpyridinium))metyl; 2-(3-(N-metylpyridinium))et-l-yl; l-(4-(N-metylpyridinium))et-l-yl; (p-amidino)benzyl; 2-(4-(N-metylpyridinium) )prop-2-yl og 2-(4-(N-metylpyridinium))et-l-yl. Ac-pAph-Chg-AMP(4) og Ac-pAph-Chg-AEMP(4) er eksempler på slike forbindelser.

Valget av hvorvidt en L- eller en D-aminosyre skal innføres i en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, kan delvis avhenge av peptidets ønskede egenskaper. For eksempel kan innføring av én eller flere D-aminosyrer gi økt stabilitet av forbindelsen in vitro eller in vivo. Innføring av én eller flere D-aminosyrer kan også øke eller redusere forbindelsens farmakologiske aktivitet. I noen tilfeller kan det være ønskelig å la forbindelsen forbli aktiv kun i et kort tidsrom. I slike tilfeller kan innføring av én eller flere L-aminosyrer i forbindelsen tillate endogene peptidaser i et individ å kløyve forbindelsen in vivo, hvorved individets eksponering overfor den aktive forbindelse begrenses. Den erfarne fagmann kan fastslå de ønskede egenskaper som kreves av en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved f.eks. å ta i betraktning individets alder og generelle helsetilstand.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres kjemisk ved bruk av f.eks. en automatisk syntesemaskin {se eksempel I). Selektiv modifisering av en reaktiv gruppe, f.eks. en gruppe som foreligger i en aminosyresidekjede eller en N-terminal eller C-terminal reaktiv gruppe i et peptid, kan gi en forbindelse ifølge oppfinnelsen ønskelige egenskaper som f.eks. økt løselighet eller forhøyet inhibitorisk virkning.

Når fastfasesyntesefremgangsmåter benyttes, kan en forbindelses kjemiske sammensetning manipuleres mens det voksende peptid er festet til resinet, eller etter at peptidet er kløyvet fra resinet, slik at f.eks. et N-terminalt derivat, som en N-terminalt acetylert forbindelse, erholdes. Lignende modif-iseringer kan også gjøres med en karboksygruppe i en forbindelse, heriblant en C-terminal karboksygruppe, som f.eks. kan amideres. En fagmann kan også syntetisere et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen ved å bruke væskefase-organisk kjemi. En syntetisert forbindelse kan renses ved å benytte velkjente fremgangsmåter som reversfase-høyytelsesvæskekromatografi (RP-HPLC, se eksempel I) eller andre separasjonsmetoder basert f.eks. på forbindelsens størrelse, ladning eller hydrofobisitet. På tilsvarende måte kan velkjente fremgangsmåter som aminosyresekvensanalyse eller massespektro-metri (MS) benyttes for å karakterisere strukturen av en forbindelse ifølge oppfinnelsen (se eksempel I).

YIR-peptidene kan være lineære eller sykliske (se f.eks. tabell 3 nedenfor). Syklisering kan oppnås ved å danne en bro mellom to rester, grupper eller substituenter som ikke er naboer, og som kan ligge inne i eller utenfor YIR-motivet. Syklisering kan også f.eks. oppnås ved å danne en bro mellom en åv restene innen YIR-motivet og en rest, gruppe eller substituent som ikke ligger i naboposisjon, og som ligger utenfor YIR-sekvensen. For eksempel kan peptider eller peptidetterlignere sykliseres via S-S-, -CH2- S-, -CH2-0-CH2-, laktam- eller esterbindinger, eller som tidligere rapportert (se Hruby, Life Sei., 31:189-199 (1982); Toniolo, Int. J. Pept. Prot. Res., 35:287-300 (1990); Kates et al., Tetr. Lett., 34:1549-1552

(1993), som alle inkorporeres heri ved referanse).

Som benyttet heri, betyr uttrykket "utenfor YIR-motivet" at en tyrosin-, isoleucin- eller argininrest i YIR-sekvensen, eller dens ekvivalent, som foreligger i et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen, ikke omfattes. I motsetning til dette betyr uttrykket "innen YIR-motivet" at minst én av tyrosin-, isoleucin-og argininrestene i YIR-sekvensen eller dens ekvivalent omfattes. Begrepet "bro" i forbindelse med en syklisk forbindelse betyr en binding dannet mellom to aminosyrer som ikke ligger i nabo-stilling, og som foreligger i et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen.

Syklisering kan f.eks. oppnås ved dannelse av en disulfidbinding eller en laktambinding mellom Xi og X2. Rester som kan danne en disulfidbinding, omfatter f.eks. Cys, Pen og Mpr, og Mpp og dennes 2-aminogruppeholdige ekvivalenter. Rester som kan danne en laktambinding, omfatter f.eks. Asp, Gl*u<,> Lys, Orn, a,p-diaminopropionsyre, a-aminoadipinsyre, a,y-diaminosmørsyre, diaminoeddiksyre, aminobenzosyre og merkaptobenzosyre. Forbindelsene som beskrives heri, kan f.eks. sykliseres via en laktambinding som kan benytte en sidekjedegruppe i en ikke-naborest, slik at en kovalent kobling til den N-terminale aminogruppe i Xi eller i Y dannes. Alternative brostrukturer kan også benyttes for syklisering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, heriblant f.eks. peptider og peptidetterlignere, som kan sykliseres via S-S-, -CH2-S-, -CH2-0-CH2-, laktam-, ester-eller andre bindinger (se f.eks. Hruby, supra, 1982; Toniolo, supra, 1990; Kates et al., supra, 1993).

Et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringes som et homogent preparat eller som en blanding av forbindelser som inneholder forskjellige kombinasjoner av substituenter. Fleksibiliteten som tillates av valg av substituenter, gir en stor grad av kontroll over de fysiokjemiske egenskaper til-peptidforbindelsesanalogene. Valg av substituent påvirker også forbindelsens bindingsaffinitet (se eksemplene).

Forskjellige forbindelser som inneholder forskjellige arrangementer av substituentene, viser forskjellige nivåer for inhibitorisk aktivitet av faktor Xa. Disse forbindelser ble syntetisert ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene. Analyse av peptidene for inhibitorisk aktivitet ble oppnådd ved bruk av analysemetodene beskrevet i eksemplene XXXVII og XXXVIII. Ved bruk av slike fremgangsmåter kan en fagmann syntetisere en forbindelse som beskrevet heri, heriblant en modifikasjon av denne, og fastslå forbindelsens faktor Xa-inhiberende aktivitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer forbindelser som spesifikt inhiberer faktor Xa-aktivitet. Slike forbindelser har en Ki < 100 uM, fortrinnsvis < 2 nM, for faktor Xa-aktivitet, og inhiberer ikke i vesentlig grad aktiviteten av andre proteaser som deltar i koagulasjon og fibrinolyse sammenlignet med inhiberingen av faktor Xa (se tabell 2 ovenfor). Slike andre proteaser omfatter f.eks. trombin og plasmin. Spesifisiteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen demonstreres i eksempel XXXVII nedenfor (se også tabell 2 ovenfor).

En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan med fordel benyttes som en antikoagulant, som kan tilføres en blodprøve for å hindre koagulasjon. For eksempel kan en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen tilføres i en nytappet blodprøve for å forhindre koagulasjon av blodprøven. Som benyttet heri, betyr begrepet "effektiv mengde" når det viser til en forbindelse ifølge oppfinnelsen, en mengde av en forbindelse som inhiberer faktor Xa-aktivitet. Den erfarne fagmann vil innse at en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan fastslås ved å benytte fremgangsmåtene beskrevet heri (se eksemplene XXXVII og XXXVIII), eller som ellers er velkjent innen faget. I lys av den beskrevne anvendelighet av en forbindelse ifølge oppfinnelsen vil den erfarne fagmann også innse at et middel som f.eks. heparin kan erstattes med en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Slik anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan f.eks. føre til kostnadsreduksjoner sammenlignet med andre antikoagulanter.

I tillegg kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen til-føres til et individ for behandling av en rekke kliniske tilstander, heriblant f.eks. behandling av en kardiovaskulær forstyrrelse eller en komplikasjon forbundet med f.eks. infeksjon eller kirurgi. Eksempler på kardiovaskulære forstyrrelser omfatter restenose etter angiopiastikk, "adult respiratory distress syndrome", flerorgansvikt, slag og tilstanden disseminert intravaskulær koagulasjon. Eksempler på beslektede komplikasjoner forbundet med kirurgi omfatter f.eks. dyp venetrombose og proksimal venetrombose, som kan forekomme etter kirurgi. Således er en forbindelse ifølge oppfinnelsen anvendbar som et medikament for å redusere eller inhibere uønsket koagulasjon i et individ.

Siden et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen kan inhibere faktor Xa-aktivitet, kan en slik forbindelse være anvendbar for å redusere eller inhibere blodkoagulasjon i et individ. Som benyttet heri, betyr begrepet "individ" et virveldyr, heriblant et pattedyr som f.eks. et menneske, i hvilket faktor Xa deltar i koagulasj onskaskaden.

Blodkoagulasjon i et individ kan reduseres eller inhiberes ved tilførsel til individet av en terapeutisk effektiv mengde av et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen. Som benyttet heri, betyr begrepet "terapeutisk effektiv mengde" dosen av et YIR-peptid som må tilføres til et individ for å inhibere faktor Xa-aktivitet i individet. Nærmere bestemt inhiberer en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen den katalytiske aktivitet av faktor Xa, enten direkte innen protrombinasekomplekset eller som en løselig subenhet, eller indirekte ved å inhibere innføringen av faktor Xa inn i protrombinasekomplekset. Nærmere bestemt kan slike forbindelser inhibere faktor Xa-aktivitet med en Ki < 100 uM, og fortrinnsvis med en Ki < 2 nM. En terapeutisk effektiv mengde kan bestemmes ved å benytte fremgangsmåtene som f.eks. er beskrevet i eksemplene XXXVII og XXXVIII, eller som ellers er kjent innen faget.

Ved utførelse av en terapeutisk fremgangsmåte vil dosen som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat som skal tilføres til individet, avhenge av en rekke betraktninger, heriblant f.eks. sykdommens natur eller styrke, tilføringsplanen og individets alder og fysiske egenskaper. En passende dose kan fastslås ved å benytte kliniske metoder velkjent innen medisinen. Således tilveiebringes en fremgangsmåte for spesifikk inhibering av faktor Xa-aktivitet ved å sette faktor Xa i kontakt med en forbindelse med sekvensen Xi-YIR-X2 eller A1-A2-(A3)m-B, hvor m er 0 eller 1, eller en funksjonell ekvivalent av disse. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en anvendelse for redusering eller inhibering av dannelsen av et blodkoagel i et individ ved tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen vil generelt til-føres et individ som et preparat som inneholder forbindelsen og et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff. Begrepet "farmasøytisk aksepterbart bærerstoff" viser til et medium eller et preparat som ikke er giftig for individet, eller har aksepterbar giftighet ifølge den gjeldende regulatoriske instans. Som benyttet heri, omfatter begrepet farmasøytisk aksepterbart bærerstoff alle de vanlige farmasøytiske bærerstoffer som fosfatbufret saltvann, vann, en emulsjon, som en olje-/vann- eller vann-/oljeemulsjon, eller enhver av forskjellige typer fuktemidler. Egnede farmasøytiske bærerstoffer og deres sammensetning er beskrevet av Martin (i Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. utg. (Mack Publishing Co., Easton 1975), som inkorporeres heri ved referanse). Slike preparater vil generelt inneholde en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, sammen med en passende mengde bærerstoff, slik at preparatet inneholder en passende dose for tilførsel til et individ. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan således være anvendbare som medikamenter for inhibering av faktor Xa-aktivitet og blodkoagulasjon i et individ.

Farmasøytisk aksepterbare bærerstoffer kan også f.eks. omfatte andre medier, forbindelser eller modifikasjoner av en faktor Xa-inhiberende forbindelse som øker dets farmakologiske virkning. Et farmasøytisk aksepterbart medium kan f.eks. omfatte et syreaddisjonssalt, f.eks. et salt dannet med en uorganisk syre som saltsyre, hydrogenbromid, fosforsyre, svovelsyre eller perklorsyre, eller med en organisk syre som eddiksyre, oksalsyre, maleinsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, ravsyre eller malonsyre. Andre farmasøytisk aksepterbare salter omfatter f.eks. uorganisk nitrat, sulfat, acetat, malat, formiat, laktat, tartrat, succinat, sitrat, p-toluensulfat og lignende, heriblant, men ikke begrenset til, kationer basert på alkalimetaller og alkaliske jordmetaller som natrium, litium, kalium, kalsium eller magnesium, så vel som ikke-toksiske ammonium-, kvaternære ammonium- og aminkationer som ammonium, metylammonium, dimetyl-ammonium, trimetylammonium, tetrametylammonium, etylammonium, trietylammonium og tetraetylammonium.

Eksempler på modifikasjoner som øker forbindelsens farmakologiske virkning omfatter f.eks. esterifisering, f.eks. dannelse av Ci-C6-alkylestere, fortrinnsvis C1-C4-alkylestere, hvor alkylgruppen er en uforgrenet eller forgrenet kjede. Andre aksepterbare estere omfatter f.eks. Cs-C7-sykloalkylestere og arylalkylestere som benzylestere. Slike estere kan fremstilles fra forbindelsene beskrevet heri ved bruk av gjengse fremgangsmåter velkjent innen faget peptidkjemi.

Farmasøytisk aksepterbare modifikasjoner kan også f.eks. omfatte dannelse av peptidamider. Slike amidmodifikasjoner som kan utføres på forbindelsene ifølge oppfinnelsen, omfatter f.eks. dem avledet fra ammoniakk, primære Ci-C6-dialkylaminer, hvor alkylgruppene er uforgrenede eller forgrenede kjeder, eller arylaminer med forskjellige substitusjoner. Når det gjelder sekundære aminer, kan aminet også foreligge som en heterosyklisk forbindelse med fem eller seks medlemmer, som f.eks. inneholder et nitrogenatom. Fremgangsmåter for fremstilling av slike amider er velkjent innen faget.

I en annen utførelse av oppfinnelsen kan et YIR-peptid benyttes i en analyse for å påvise nærvær av faktor Xa eller for å isolere faktor Xa i en i det vesentlige ren tilstand. Fortrinnsvis merkes forbindelsen ifølge oppfinnelsen med f.eks. en radioaktiv isotop, og den merkede forbindelse påvises ved bruk av en rutinemessig fremgangsmåte anvendbar for påvisning av den benyttede merking. I tillegg kan et YIR-peptid med fordel benyttes som en probe for å fastslå lokalisering eller mengde av faktor Xa-aktivitet in vivo, in vitro eller ex vivo.

Eksempel I

Fremgangsmåter for peptidsyntese

Utgangsmaterialer benyttet i syntesen ble erholdt fra kjemikalieleverandører som Aldrich, Sigma, Fluka, Nova Biochem og Advance Chemtech. Under syntesen av disse forbindelser ble de funksjonelle grupper i aminosyrederivatene benyttet i fremgangsmåtene beskyttet med blokkeringsgrupper for å forhindre sidereaksjoner under koblingstrinnene. Eksempler på egnede beskyttende grupper og deres anvendelse er beskrevet i The Peptides, supra, 1981, og i bind 9, Udenfriend og Meienhofer, red., 1987, som inkorporeres heri ved referanse.

Generell fastfasepeptidsyntese ble benyttet for fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Slike fremgangsmåter er f.eks. beskrevet av Steward og Young (Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco, 1969), som inkorporeres heri ved referanse).

Dersom ikke annet er angitt, ble peptider syntetisert på polystyrenresin kryssbundet med 1 % divinylbenzen. En syre-sensitiv linker (Rink Linker) ble koblet til det faste støtte-middel {Rink, Tetr. Lett., 28:3787 (1987); Sieber, Tetr. Lett., 28:2107 (1987), som begge inkorporeres heri ved referanse). Kobling ble utført med N,N'-diisopropylkarbodiimid (DIC) i nærvær av en ekvivalent mengde HOBt. Alle koblinger ble utført i enten N,N-dimetylformamid (DMF) eller DMF:diklormetan (1:1-blanding) ved romtemperatur (RT) i 40 minutter. Koblingseffektiviteten ble målt ved ninhydrinanalyse.

Deproteksjon av Fmoc-gruppen ble oppnådd med 50 % piperidin i DMF i 10 minutter. Mengden frigjort Fmoc ble bestemt ut fra absorbansen ved 300 nm av løsningen etter deproteksjon, vaskevolumet og vekten av resinet benyttet i syntesen. En andre (dobbel) kobling ble utført dersom koblingen i første omgang var ufullstendig. Syklusen av koblinger og fremgangsmåter var som følger:

Etter fullført peptidoppbygging på resinet ble den avsluttende Fmoc-deproteksjon utført, fulgt av normale vaske-sykluser og bestemmelse av mengden Fmoc-gruppe frigjort ved deproteksjonen. I noen tilfeller ble det Na<->ubeskyttede peptid acetylert ved å riste peptidresinet med 20 gangers overskudd av eddiksyreanhydrid/pyridin (1:1) i DCM i 15 minutter. Peptidresinet ble vasket med DCM, fulgt av DMF og deretter DCM, og så tørket under vakuum.

Peptidresin ble suspendert i reagens K-cocktail (King et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 36:255-266 (1990), som inkorporeres heri ved referanse) (5 ml/g peptidresin) i 180 minutter ved RT, hvoretter kløyvingsblåndingen ble filtrert i vannfri dietyleter, og den faste utfelling ble isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum over biter med fast KOH. Det tørkede peptid ble renset ved HPLC ved bruk av en passende gradient av 0,1 % TFA i vann og acetonitril (ACN). Etter oppsamling av toppen som inneholdt det ønskede synteseprodukt, ble peptidløsningen frysetørket, og peptidet ble utsatt for en identifiseringsprosess som omfattet elektrospray-MS og aminosyreanalyse for å fastslå at den korrekte forbindelse var syntetisert.

For peptidrensing ble en prøve med frysetørket råpeptid løst i en blanding av 0,1 % vandig TFA tilsatt 10 % til 50 % ACN. Peptidløsningen ble vanligvis filtrert gjennom en sprøyte koblet til et 0,45 um nylonfilter, "ACRODISC" 13 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Et passende volum av filtrert peptidløsning ble injisert i en semipreparativ C18-kolonne (Vydac Protein and Peptide C18, 218TP1010, The Separation Group, Hesperia, CA). Gjennomstrømningshastigheten av en gradient eller isokratisk blanding av 0,1 % TFA-buffer og ACN (HPLC-grad) som elueringsmiddel ble opprettholdt ved bruk av en Beckman "SYSTEM GOLD" HPLC. Eluering av peptidet ble fulgt ved UV-deteksjon ved 230 nm (Beckman, System Gold, Programmable Solvent Module 126 og Programmabl-e Detector Module 166, kontrollert med "SYSTEM GOLD" programvare). Etter identifisering av toppen som tilsvarte forbindelsen som ble syntetisert ved bruk av MS, ble forbindelsen oppsamlet, frysetørket og analysert biologisk. MS ble utført med et SCIEX API III+-instrument. I tillegg ble NMR utført med et General Electric-instrument (300 MHz). For NMR ble prøver typisk målt i heksadeuteriodimetylsulfoksid eller deuteriokloroform (CDCI3, Aldrich).

Aminosyrealdehyder ble fremstilt ved bruk av fremgangsmåter velkjent innen faget. Aminosyre- og peptidaldehyder er f.eks. beskrevet av Fehrentz og Castro, Synthesis, 676 (1983); Bajusz et al., J. Med. Chem., 33:1729 (1990); Kawamura et al., Chera. Pharm. Bull., 17:1902 (1969), og Someno et al., Chem. Pharm. Bull., 34:1748 (1986), som alle inkorporeres heri ved referanse. Syntese av reduserte peptidbindinger ble utført på dipeptidnivå i løsning (f.eks. Tyr-{¥ (CH2NH) }-Ile) , hvoretter dipeptidet beskyttet på passende vis ble koblet til resten av peptidet på resin ved bruk av fastfasepeptidsyntese. Alternativt ble det beskyttede aminosyrealdehyd koblet til peptidet på resin ved bruk av fremgangsmåter beskrevet av Ho et al. (Pept. Res., 6:10-12 (1993), og referanser sitert i denne, som alle

inkorporeres heri ved referanse).

■

Eksempel II

Syntese av Ac- Tyr- Ile- Arg- Leu- Ala- NH2

For syntese av Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2 ble 1 g Rink-resin (0,6 mmol NH2/g resin) benyttet i fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Det resulterende peptid ble analysert ved MS. (M + H)<+ >observert: 659,4, beregnet: 659,9.

Eksempel III

Syntese av Ac- Tyr- Ile- Arg- Leu- Pro- NH2

For syntese av Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2 ble 1 g Rink-resin (0,6 mmol NH2/g resin) benyttet i fremgangsmåten beskrevet i eksempel I. Det resulterende peptid hadde (M + H)<+> observert: 685,4, beregnet: 685,9.

Eksempel IV

Syntese av Ac-( iBu) Tyr- Ile- Arg- Leu- Pro- NH2

I-g Rink-resin (0,6 mmol NH2/g resin) ble benyttet. Den generelle fastfasesyntesefremgangsmåte beskrevet ovenfor ble benyttet. Etter deproteksjon av Tyr og passende vask av peptidresinet ble 50 ekvivalenter isobutyraldehyd i DMF med 2 % iseddik tilsatt. Den resulterende blanding ble ristet i 4 timer ved RT. Etter vask av peptidresinet med DMF tilsatt 2 % eddiksyre (2 x 8 ml) ble 1 g NaBH3CN i 10 ml DMF tilsatt 2 % eddiksyre tilsatt. Peptidresinet ble ristet i 30 minutter, hvoretter peptidresinet ble frafiltrert, og en nylaget blanding av NaBH3CN i DMF/eddiksyre ble tilsatt, og reaksjonen fikk fortsette i ytterligere 30 minutter.

Peptidresinet ble så vasket md DMF/2 % eddiksyre (2x8 ml) og DMF (2x8 ml). Det resulterende monoalkylerte peptidresin ble acetylert med eddiksyreanhydrid-trietylaminblanding i DMF (30 ekvivalenter, 6 timer). Etter passende vask av peptidresinet ble peptidet avkløyvet og deprotektert som beskrevet i eksempel I. HPLC-renset peptid ble analysert med MS. (M + H)<+> observert: 758,4, beregnet: 758,5.

Eksempel V

Syntese av Tfa-( iBu) Tyr- Ile- Arg- Leu- Pro- NH2

Samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel IV ble benyttet til fremstilling av (iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink-resin. Avsluttende trifluoracetylering ble utført ved å behandle peptidresinet med 0,7 M trifluoreddiksyreanhydrid i nærvær av diisopropyletylamin (DIEA) og N-metylimidazol (NMI) (1:3:0,3 ekvivalenter) i 45 minutter. Kløyving av peptidet fra resinet og isolering av peptidet ble utført som beskrevet i eksempel IV. Det rensede peptid ble identifisert ved MS. (M + H)<+> observert: 812,4, beregnet: 812,5.

Eksempel VI

Syntese av Ac- Tyr- Ile- Arg- N( CH3) 0 ( CH3)

Syntese av Boc-Arg (N^Tos) -N (CH3) O (CH3) ble oppnådd ifølge fremgangsmåten i litteraturen (Fehrentz og Castro, supra, 1983). Boc-Arg(N<Y->Tos)-N(CH3)0(CH3) (200 mg) ble blandet med 5 ml trifluoreddiksyre (TFA) ved RT og omrørt i 20 minutter. Reduksjon av mengde utgangsmateriale ble fulgt ved tynnsjiktskromatografi (TLC) med CHCl3:MeOH:CH3COOH (90:9:1) og synliggjort med hinhydrinspray og UV-belysning. Inndamping av gjenværende TFA under vakuum og tørking under vakuum over fast KOH førte til et fast stoff med korrekt masse. (M + H)<+> observert: 371,2, beregnet: 371,4.

I én kolbe ble 150 mg av materialet fremstilt ovenfor løst i 1 ml DMF, hvoretter 57 ul trietylamin ble tilsatt og blandingen avkjølt til 0 °C. I en annen kolbe ble 171 mg Z-Tyr-Ile-OH (Biochem Bioscience, Inc., Philadelphia, PA) løst i vannfritt tetrahydrofuran (THF) og avkjølt til -10 °C, hvoretter 44 ul NNM og 52 ul isobutylklorformiat ble tilsatt under N2, og blandingen ble omrørt i 15 minutter. En tidligere fremstilt løsning av Arg (Tos) N(CH3) OCH3 i DMF ble tilsatt det blandede anhydrid av Z-Tyr-Ile-OH-dipeptid, og blandingen ble omrørt ved - 10 °C i 30 minutter og deretter over natten ved RT.

Etter opparbeiding av reaksjonsblandingen som beskrevet i eksempel I, ble peptidet tørket under vakuum, og en liten porsjon ble renset ved HPLC og analysert ved MS; peptidet hadde den forventede molekylvekt (781). Det resulterende peptid Z-Tyr-Ile-Arg (Tos)-N(CH3)OCH3 ble blandet med 500 ul anisol og utsatt for HF-deproteksjon ved den vanlige fremgangsmåten. Etter opparbeiding ble 169 mg av produktet Tyr-Ile-Arg-N(CH3) 0 (CH3) isolert og identifisert ved MS (observert: 493,6, beregnet: 494). Resten av peptidet ble så løst i 1 ml 1 N HC1 og frysetørket.

Tyr-Ile-Arg-N(CH3)OCH3.2 HCl (76 mg) ble løst i ACN, avkjølt til 0 °C og tilsatt 13 ul pyridin, fulgt av 15 ul eddiksyreanhydrid. Blandingen ble omrørt ved 0 °C i 3 timer og reaksjonsforløpet fulgt ved ninhydrinanalyse. Etter omrøring ved RT i 8 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet, og produktet Ac-Tyr-Ile-Arg-N (CH3) 0CH3 ble karakterisert ved MS (observert: 535,6, beregnet: 535,3).

Eksempel VII

Syntese av Ac- Tyr- f¥( CH2NH) )- Ile- Arg- Leu- Pro- NH2

a. Syntese av Fmoc- Tyr( But)- H

4,6 g (10,0 mmol) Fmoc-Tyr(But)-OH, 2,1 g (10,1 mmol) disykloheksylkarbodiimid (DCC), 1,26 g (10,1 mmol) benzyl-merkaptan og 0,12 g DMAP fikk reagere i DCM som beskrevet av Ho og Ngu (J. Org. Chem., 58:2315 (1993), som inkorporeres heri ved referanse). Etter opparbeiding ble Fmoc-Tyr(But)-S-CH2C6H5 isolert og gav, etter reduksjon av tioesteren ved omrøring med trietylsilan i nærvær av 10 % Pd på karbon og rensing ved flashkromatografi, 81 % utbytte av Fmoc-Tyr(But)-H. NMR og produktets masse var i samsvar med det forventede området.

b. Syntese av Fmoc- Tyr ( But) - fy ( CH2NH))- Ile-( O- allyl)

0,73 g (1,66 mmol) Fmoc-Tyr(But)-OH og 0,209 g

(3,32 mmol) NaBH3CN i 20 ml 1 % AcOH i DMF ble tilsatt en blanding av 0,516 g (1,82 mmol) TFA.Ile-(O-allyl) i 2 ml DMF. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet og slutt-

produktet renset ved flashkromatografi (etylacetat:heksan, 35:65) for erholdelse av et oljeaktig produkt med korrekt NMR og MS. (M + H) observert: 599, beregnet: 598,7.

c. Syntese av Fmoc- Tyr ( But)-{ ¥ ( CH2NH) )- Ile- OH

Til 0,467 g (0,78 mmol) Fmoc-Tyr(But)-{W(CH2NH) }-Ile-Oallyl i 10 ml DCM ble 89 ul (1,56 mmol) HOAc, 20 ul trietylamin (TEA) og 0,02 g av komplekset PdCl2(Ph3)2 tilsatt. 231 ul (0,86 nmol) Bu3SnH ble tilsatt i én porsjon, og blandingen ble omrørt i 1 time ved RT. Etter passende opparbeiding av reaksjonsblandingen ble produktet renset ved f lashkromatograf i (CHCl3:MeOH, 20:1) og gav 69 % utbytte (0,319 g) av det forventede peptid. (M + H)<+ >observert: 559, beregnet: 558. Fmoc-Tyr (But )-{¥ (CH2NH) }-Ile-OH ble så koblet til Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink-resin ved bruk av generell fastfasemetodologi som beskrevet i eksempel I. Det endelige peptidresin Ac-Tyr (But) - {¥ (CH2NH) }-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink ble deprotektert og kløyvet på vanlig måte som beskrevet i eksempel I og renset ved HPLC på en C18-kolonne.

Eksempel VIII

Syntese av Ac- Tyr- Ile- Arg- NH- CH2 ( 4- pyridyl)

Oksimresin (DeGrado og Kaiser, J. Org. Chem., 45:1295

(1980) (0,862 g med 0,6 mmol/g) ble koblet over natten med Boc-Arg(Tos)-0H i nærvær av DIC/HOBt. Resinet ble vasket med DMF, fulgt av DCM, og acetylert med eddiksyreanhydrid/DlEA (1:1 ekvivalenter) i DCM. Etter vask av resinet med DCM, DMF og DCM ble det deprotektert med 25 % TFA i DCM i 30 minutter. Det deprotekterte resin ble vasket med DCM, isopropanol og DCM. Til TFA.Arg(Tos)-OxmR ble det koblet Boc-Ile-OH i symmetrisk anhyd-ridform (3 ekvivalenter) i nærvær av 1,5 ekvivalenter DIEA i DCM. Syklusen med vask, acetylering og deproteksjon som beskrevet ovenfor ble gjentatt. Etter deproteksjon ble Boc-Tyr(2-Brz)-OH koblet på tilsvarende måte som Ile, hvoretter det endelige peptidresin Boc-Tyr(2-Brz)-Ile-Arg(Tos)-OxmR ble deprotektert og acetylert for erholdelse av Ac-Tyr(2-Brz)-Ile-Arg(Tos)-OxmR. Peptidresinet ble tørket under vakuum for erholdelse av et totalutbytte på 0,216 g. Til 1/3 av resinet ble det tilsatt 100 ul (800 umol) 4-(dimetylamino)pyridin i nærvær av 60 ul iseddik og 120 ul DIEA i 6 ml DCM. Resinet ble ristet over natten ved RT. Etter filtrering av DCM-løsningen ble resinet vasket med 3 ml DMF, og vaskeløsningen ble slått sammen med DCM-filtratet. Etter inndamping av løsemidlet ble gjenværende peptid deprotektert med HF/anisol og prosessert på vanlig måte for erholdelse av det forventede peptid. Elektrospray-MS ble utført. (M + H)<+> observert: 582,3, beregnet: 582.

Eksempel IX

Syntese av Ac- Tyr- Ile-{ ¥( CH2NH) )- Arg- Leu- Pro- NH2

a. Syntese av Boc- Ile- H

Aldehyd ble syntetisert fra 1 g Boc-Ile-N(Me)OMe som beskrevet av Fehrentz og Castro ( supra, 1983). Aldehydet ble identifisert ved TLC og NMR som beskrevet i referansen.

b. Syntese av Arg( Tos)- Leu- Pro- MBHA

Syntese av tripeptidresinet ble utført ved generell fastfasetilnærming som beskrevet i eksempel I.

c. Syntese av Boc- Ile-( V( CH2NH) }- Arg( Tos)- Leu- Pro- MBHA

Boc-Ile-H ble koblet til tripeptidresinet Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA ved reduktiv aminering med NaBH3CN i DMF tilsatt 1 % eddiksyre. Boc-gruppen ble kløyvet som vanlig, og Ac-Tyr-OH ble

koblet ved bruk av DIC/HOBt. Det endelige peptidresin (0,7 g) ble deprotektert og kløyvet fra resinet med HF-/tioanisolblanding. 19 mg av råproduktet Ac-Tyr-Ile-{V(CH2NH) }-Arg-Leu-Pro-NH2 ble HPLC-renset på en C18-kolonne for erholdelse av tilnærmet 5 mg > 90 % rent forventet peptid. (M + H)<+> observert: 688,4, beregnet: 687,9.

Eksempel X

Syntese av Ac- Tyr- Ile- Dab( NY- C3H7N)- Leu- Ala- NH2

0,2 g SCAL-TG (0,2 mmol NH2/g) (Patek & Lebl, Tetr. Lett-, 32:3891-3894 (1991), som inkorporeres heri ved referanse) ble koblet med Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dab(Boe)-OH, Fmoc-Ile-OH og Fmoc-Tyr(But)-OH ved bruk av fremgangsmåter beskrevet i eksempel I. Etter acetylering av den N-terminale ende og sidekjededeproteksjon med TFA ble peptidresinet Ac-Tyr-Ile-Dab-

Leu-Ala-SCAL-TG vasket, nøytralisert og behandlet med 0,3 M PyBroP/NMI i DMF i 2 timer. Det endelige peptid ble kløyvet fra resinet med 1 M trif enylfosf in/(CH3) 3SiCl i DCM (3x1 time), fulgt av 100 % TFA (1 time). Etter isolering av råpeptidet ved utfelling med dietyleter ble peptidet frysetørket fra en 0,1 % vandig TFA-løsning. Peptidet Ac-Tyr-Ile-Dab(N<Y->C3H7N)-Leu-Ala-NH2 ble renset ved HPLC og karakterisert ved MS. (M + H)<+> observert: 676,4, beregnet: 676,4.

Eksempel XI

Syntese av Ac- Tyr- Ile- PalMe( 3)- NH2

Til 1,0 g Rink-resin (0,48 mmol NH2/g) ble det koblet Fmoc-Pal(3)-OH, Fmoc-Ile-OH og Fmoc-Tyr(But)-OH ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet i eksempel I. Til 0,25 g av det endelige peptidresin Fmoc-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rink ble 500 ul metyljodid (Mel) i DCM tilsatt, og peptidresinet ble ristet i 6 timer. Det endelige peptidresin Fmoc-Tyr(But)-Ile-PalMe(3)-Rink ble deprotektert, acetylert og kløyvet som beskrevet i eksempel I. En porsjon av råpeptidet ble renset ved HPLC, og det endelige peptid ble karakterisert ved MS.

Eksempel XII

Syntese av Ac- syklo( Glu- Tyr- Ile- Arg- Leu- Lys)- NH2

1 g SCAL-TG (0,29 mmol NH2/g) (se eksempel X) ble koblet med Fmoc-Lys(Boe)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH og Fmoc-Glu(OtBu)-OH ved bruk av fremgangsmåter beskrevet i eksempel I. Etter fjerning av Fmoc ble peptidresinet acetylert og vasket med DMF og deretter med DCM. Peptidresinet Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Lys-(Boe)-SCAL-TG ble deprotektert med reagens K, vasket, nøytralisert og syklisert ved bruk av BOP/HOBt/DIEA (5:5:5 ekvivalenter) i DMF i 2 timer. Forløpet av koblingen ble fulgt ved ninhydrinanalyse som beskrevet av Kaiser et al., Anal. Biochem., 34:595 (1970), som inkorporeres heri ved referanse. Etter syklisering ble peptidet kløyvet fra resinet, renset ved HPLC og karakterisert ved MS. (M + H)<+> observert: 844,5, beregnet: 844,5.

Eksempel XIII

Syntese av syklo( Gly- Tyr- Ile- Arg- Gly)

1 g oksimresin (se eksempel VIII) (0,6 mmol NH2/g) ble koblet over natten med Boc-Gly-OH i nærvær av DIC/HOBt. Etter vask og deproteksjon av resinet ble Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ile-OH og Boc-Tyr(2-BrZ)-OH koblet ved bruk av fremgangsmåter beskrevet i eksempel VIII. En tredjedel av peptidresinet Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-Gly-oksimresin ble deprotektert og koblet med Boc-Gly ved DIC/HOBt. Det endelige peptidresin ble deprotektert, nøytralisert og syklisert over natten i DMF tilsatt 1 % eddiksyre. Resinet ble filtrert og vasket (DMF), filtratene ble slått sammen, og det organiske løsemiddel fjernet ved inndamping i vakuum. Restpeptidet ble deprotektert (HF/anisol), frysetørket, HPLC-renset og karakterisert ved MS. (M + H)<+> observert: 547,8, beregnet: 54 7,8.

Eksempel XIV

Syntese av N- substituerte glysinforbindelser

Syntese av Ac-( Bzl) Gly-( Chx) Gly-( 3- guanidopropyl) Gly- NH2

For syntese av N-substituerte glysiner ble fremgangsmåten til Zuckermann et al. (J. Am. Chem. Soc, 114:10646 (1992), som inkorporeres heri ved referanse) benyttet. 1 g SCAL-TG (0,29 mmol NH2/g) (se eksempel X) ble koblet med bromeddiksyre via symmetrisk anhydrid i DCM/DMF. Hver koblingsreaksjon ble gjentatt to ganger. Til Br-CH2CO-SCAL-TG-resin ble det tilsatt Boc-NH-CH2CH2CH2NH2 i DMSO, og resinet ble ristet i 2 timer. Etter deproteksjon ble prosessen gjentatt ved alternerende kobling av Br-CH2COOH 'til resinet og reaksjon av bromeddiksyreresin med det passende amin. (Bzl) Gly-(Chx) Gly-(Boc-NH-(CH2) 3) Gly-SCAL-TG-resinet ble acetylert med eddiksyreanhydrid/DIEA/NMI (1:1:0,25) i DMF over natten. Etter deproteksjon av Boc-gruppen ble resinet Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-aminopropyl)Gly-SCAL-TG behandlet med 1,8 M karboksyamidinopyrazolyHCl (Bernatowicz et al., J. Org. Chem., 57:2497-2502 (1992), som inkorporeres heri ved referanse) i nærvær av DIEA (1:1) i DMF i 3 timer ved RT. Forløpet av guanyleringen ble fulgt ved Kaiser-analyse. Kløyving og prosessering av det resulterende peptid ble utført som beskrevet i eksempel X og analysert ved MS. (M + H)<+> observert: 502,3, beregnet: 502,3.

Eksempel XV

Syntese av diketopiperazinforbindelser

Syntese av syklo( Ser- Ida)- Ile- Arg- Leu- Ala- NH2

Det beskyttede utgangstetrapeptid Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Ala-Rink ble fremstilt ved Fmoc-strategi på Rink-resin (se eksempel I). Etter Fmoc-deproteksjon av peptidresinet ble først Fmoc-Ida(OMe)-OH (3 ekvivalenter, DIC, HOBt) og deretter Fmoc-Ser(tBu)-OH (7 ekvivalenter, symmetrisk anhydrid) tilkoblet. Avsluttende deproteksjon og spontan ringdannelse ble utført samtidig ved 1 times behandling med 50 % piperidin/DMF. Etter vasketrinnene ble sluttpeptidet avkløyvet og deprotektert med TFA/tioanisol/H20 (95:2,5:2,5). Det resulterende peptid ble prosessert som beskrevet ovenfor og analysert ved HPLC (> 95 %) og ved MS. (M + H)<+> observert: 655,4, beregnet: 655,38.

Eksempel XVI

Syntese av Ph- C ( NOCH2Ph)- CO- I- NH2

0,2 g Rink-resin ble koblet med Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, fulgt av fjerning av Fmoc-beskyttelsen (se eksempel I). Til peptidresinet Ile-Arg (Pmc)-Rink ble Ph-C (N0CH2Ph)-COOH koblet ved bruk av DIC/HOBt-protokollen beskrevet ovenfor. Det endelige peptidresin Ph-C (N0CH2Ph)-CO-Ile-Arg (Pmc)-Rink ble opparbeidet som beskrevet i eksempel I og analysert ved MS. (M + H)<+> observert: 524,3, beregnet: 524,6.

Eksempel XVII

Syntese av • Ac- pAph- Ile- Arg- Leu- Pro- NH2

Syntesen ble utført på 100 mg Rink-resin (0,45 mmol/g) ifølge fremgangsmåten i eksempel I, ved bruk av følgende aminosyrederivater: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH og Fmoc-pAph(Fmoc)-OH (racemisk blanding). Kløyving og isolering av peptidet ble utført som beskrevet i eksempel I. Begge diastereomere peptider ble isolert ved RP-HPLC og identifisert ved MS. (M + H)<+> observert: 754,4, beregnet: 754,5.

Eksempel XVIII

Syntese av Ac- Tyr- Chg- Arg- ol

Peptidsekvensen ble oppbygd på 0,25 g Fmoc-Arg(Pmc)-Sasrin-resin (0,5 mmol NH2/g resin, Bachem Bioscience) ved bruk av fremgangsmåten beskrevet i eksempel I. Etter Fmoc-deproteksjon og acetylering av den N-terminale ende ble det beskyttede peptid kløyvet fra resinet ved reduktiv kløyving som en C-terminal alkohol (Mergler et al., Peptides, s. 177-178 (Schneider og Eberle, red., Leiden, 1993), som inkorporeres heri ved referanse) . Peptidresinet ble ristet med en blanding av NaBH4 (4 ekvivalenter) i 2 ml THF:EtOH (6:1) i 24 timer. Etter kløyvingsreaksjonen ble resinet vasket med DCM, hvoretter kløyvingsløsningen og vaskeløsningene ble slått sammen og frysetørket. Det frysetørkede peptid ble deprotektert ved behandling med TFA/vann/tioanisol (90:5:5) i 2 timer og isolert ved utfelling. HPLC-renset peptid ble analysert ved MS. (M + H)<+> observert: 505,3, beregnet: 505,3.

Eksempel XIX

Syntese av Ac- Tyr- Chg- Arg- ol. acetat

Den beskyttede peptidalkohol ble fremstilt som beskrevet i eksempel XVIII. 10 mg råmateriale ble løst i DCM/ACN og behandlet med eddiksyreanhydrid (2 mmol) i nærvær av TEA (2,4 mmol) i 20 minutter. Løsningen ble filtrert, inndampet og peptidet deprotektert som beskrevet ovenfor. HPLC-renset peptid ble analysert ved MS. (M + H)<+> observert: 547,3, beregnet: 547,3.

Eksempel XX

Syntese av Ac- Phe ( pNH2) - Chg- Orn( C ( NH) CH3) - Leu- Pro- NH2

1 g "TENTAGEL S"-NH2-resin (0,28 mmol NH2/g resin, Rapp Polymer, Tubingen, Tyskland) ble funksjonalisert med SCAL-linker som beskrevet i eksempel X, og følgende aminosyrer ble tilkoblet: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn(Boe)-OH og Fmoc-Chg-OH. Peptidresinet Fmoc-Chg-Orn(Boe)-Leu-Pro-SCAL-TG ble behandlet med 50 % TFA i DCM (én vask i 1 minutt, deretter én vask i 30 minutter), vasket 3 x med DCM, nøytralisert med 5 % DIEA i DCM (2 x 30 sekunder) og 2 x med DCM. Til peptidresinet ble det tilsatt en løsning av 1,5 g etylacetimidat-hydroklorid (Aldrich) i 4 ml 1:1 pyridin:DIEA og 3 ml DMF, og koblingen ble fortsatt over natten ved RT.

Peptidresinet Fmoc-Chg-Orn (C (NH) CH3) -Leu-Pro-SCAL-TG ble deprotektert med 20 % piperidin i DMF i 12 minutter, vasket 4 x med DMF, 4 x med DCM, hvoretter Fmoc-Phe(pNH-BOC)-OH ble tilkoblet ved bruk av DIC/HOBt-kobling i DMF. Deproteksjon av Fmoc og acetylering med eddiksyreanhydrid:pyridin (1:1) i 20 minutter gav peptidresinet Ac-Phe(pNH-BOC)-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG. Reduksjon av SCAL-linkeren og kløyving av peptidet, fulgt av HPLC-rensing av råproduktet, gav den forventede forbindelse. (M + H)<+> observert: 740,2, beregnet: 740,48.

Eksempel XXI

Syntese av Ac- Phe ( pNH2) - Chg- Dap ( NP^ HuN) - Leu- Pro- NH2

0,5 g SCAL-TG (0,32 mmol NH2/g) ble koblet med Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dap(Boe)-OH og Fmoc-Chg-OH. Boc-gruppen fra sidekjeden ble fjernet med 50 % TFA i 20 minutter, og peptidresinet ble nøytralisert ved vask med 10 % DIEA/DCM. Den frie aminogruppe i sidekjeden ble overført til dimetylami-diniumgruppen ved behandling av peptidresinet med 0,3 M PyBroP/NMI i DMF i 20 minutter. Fmoc-gruppedeproteksjon med 50 % piperidin/DMF i 60 minutter førte til utbytting av dimetyla-midiniumgruppen med piperidiniumgruppen i sidekjeden til Dap. Sekvensen ble fullført ved tilkobling av Fmoc-Phe(Boe)-OH og deproteksjon av Fmoc-gruppen. Peptidet ble acetylert og kløyvet som beskrevet i eksempel X. HPLC-renset peptid ble analysert ved MS. (M + H)<+> observert: 752,4, beregnet: 752,4.

Eksempel XXII

Syntese av Ac- pAph- Chg- PalMe( 3)- NH2

Racemisk H-Phe(pCN)-OH ble syntetisert ved acetamido-malonatfremgangsmåten (Wagner et al., DDR patentskrift nr.

155 954, tildelt 21. juli 1982; revurdert 9. november 1988, som inkorporeres heri ved referanse). Racemisk Ac-pAph-OH ble syntetisert ved overføring av cyangruppen ved ammonolyse av det tilsvarende metyltioimidat (dannet ved å reagere cyangruppen med hydrogensulfid) og påfølgende metylering med Mel.

1 g "TENTAGEL"-resin (substitusjon = 0,21 mmol NH2/g resin) og Knorr-linker (Bernatowicz et al., Tetr. Lett., 30:4645

(1989), som inkorporeres heri ved referanse) ble benyttet for syntese av peptidet. Dipeptidet Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG ble oppbygd som beskrevet i eksempel I. Deretter ble 3-pyridylalanin metylert med 1 ml Mel i DCM over natten. Etter Fmoc-deproteksjon ble Ac-pAph-OH tilkoblet ved DIC/HOBt-fremgangsmåten, og peptidet ble opparbeidet som beskrevet i eksempel I. (M + H)<+> observert: 550,3, beregnet: 550,31.

Eksempel XXIII

Syntese av Ac- Tyr- Chg- pAph- Leu- Pro- NH2

Pentapeptidet Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG ble oppbygd på 0,4 g "TENTAGEL" (substitusjon =0,2 mmol NH2/g resin) som beskrevet i eksempel I. Resinet ble behandlet over natten i en lukket sprøyte med 8 ml pyridin/trietylamin (75:25) mettet med H2S. Det resinbundne tioamid ble metylert med 0,5 ml Mel i 8 ml aceton i 30 minutter ved 50 °C, og så vasket med aceton og metanol. Metyltioimidet fikk reagere med ammoniumacetat i metanol i 3 timer ved 55 °C for erholdelse av sluttfor-bindelsen, som ble kløyvet fra resinet og renset som beskrevet ovenfor. (M + H)<+> observert: 761,4, beregnet: 760,43.

Eksempel XXIV

Syntese av Ac- Phe ( pCH2NH2) - Chg- Arg- Leu- Pro- NH2

Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 (råpeptid) ble syntetisert på 1 g Rink-resin (0,6 mmol NH2/g resin) som beskrevet i eksempel I. 125 mg råpeptid ble løst i 50 ml MeOH, og 0,5 ml Raney-nikkelsuspensjon (Aldrich) ble tilsatt. Blandingen av peptid og katalysator ble hydrogenert ved 35 psi i 4 timer ved RT. Katalysatoren ble frafiltrert og løsningen inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble frysetørket fra 0,1 % vandig TFA tilsatt 30 % ACN. Det tørkede råprodukt ble renset ved HPLC og analysert ved MS. (M + H)<+> observert: 741,4, beregnet: 741,7.

Eksempel XXV

Syntese av Ac- Phe ( pC ( N0H) NH2)- Chg- Arg- Leu- Pro- NH2

21,1 mg råpeptid fremstilt som beskrevet i eksempel XXIV ble blandet med 60,3 mg NH2OH.HCl (Aldrich) i 1,5 ml MeOH, 0,7 ml pyridin og 0,5 ml TEA. Blandingen ble omrørt i 72 timer ved RT, hvoretter løsemiddel og flyktige materialer ble inndampet

under vakuum. Peptidet ble renset ved HPLC og analysert ved MS.

(M + H)<+> observert: 770,4, beregnet: 770,3.

Eksempel XXVI

Syntese av A1- A2- B- forbindelser

Al-A2-B-forbindelser, dvs. Al-A2- (A3)m-B-forbindelser hvor m er 0, ble fremstilt som vist i figur 3. Kort beskrevet gav kobling av racemisk N-acetyl-4-cyanfenylalanin med L-sykloheksylglysinmetylester (H-Chg-OMe) en blanding av to diastereomere dipeptider som ble separert ved kromatografi. Racemisk N-acetyl-4-cyanfenylalanin ble delvis fraksjonert ved å danne saltet med L-sykloheksylglysinmetylester. Det mindre løselige D,L-salt utkrystalliserte lett, og påfølgende kobling gav Ac-f(pCN)-Chg-Ome i i det vesentlige ren tilstand. Gjenværende væske var anriket på L,L-saltet, og kobling førte til råforbindelsen Ac-F(pCN)-Chg-Ome, som ble ytterligere renset ved kromatografi på kiselgel. Disse dipeptidestere ble hydrolysert til de tilsvarende syrer ved bruk av litiumhydroksid i metanol/vann ved RT. Begge dipeptidsyrer ble overført til de substituerte amider ved konvensjonell kobling med de passende aminer, RNH2. Aminene som ikke var kommersielt tilgjengelige, ble fremstilt ved bruk av gjengse kjemiske fremgangsmåter.

Overføring av cyangrupper til de tilsvarende amidiner ble utført ved gjengse kjemiske fremgangsmåter, enten via tioamidet og metyltioimidatet eller ved hydrogenering av det tilsvarende amidoksim (eksempel XXV). Dette ble erholdt ved å la nitrilet reagere med hydroksylamin. Eksemplene beskrevet nedenfor illustrerer fremstilling av de ønskede forbindelser ved disse utvalgte fremgangsmåter. Det vil innses at forbindelser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å benytte forskjellige andre fremgangsmåter, og at fremgangsmåtene benyttet i eksemplene her ble valgt av bekvemmelighetsgrunner.

Eksempel XXVII

Syntese av Ac- pAph- Chg- NHCH2-( 4- metylpyridinium)

Syntese av Ac-pAph-Chg-NHCH2- (4-metylpyridinium) ble oppnådd ved omdannelse av Ac-F(pCN) -Chg-NHCH2- (4-pyridyl) ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet i eksempel XXII. Sluttforbin-deisen ble renset ved HPLC som beskrevet i eksempel I. MS-analyse: (M + H)<+> observert: 493,3, beregnet: 493,29.

Utgangsmaterialet ble fremstilt som følger:

a) Ac-(D,L)-F(pCN), 2,32 g (10 mmol) ble løst i 75 ml etanol ved oppvarming. L-sykloheksylglysinmetylester (1,75 g, 10

mmol) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 2 timer ved RT. De utfelte krystaller ble frafiltrert og tørket for erholdelse av 1,55 g D,L-salt. Filtratet ble delvis inndampet og fortynnet med eter. De utskilte krystaller ble oppsamlet og tørket, det gjenværende materialet inneholdt 2,1 g L,L-salt forurenset med D,L-salt. Det urensede L,L-salt ble slått sammen med 20 ml DMF, 0,71 g HOBt og 1,18 g DCC. Blandingen ble omrørt i 24 timer ved RT. Urea ble frafiltrert, og filtratet ble inndampet. Restmaterialet ble løst i metylenklorid, og blandingen ble vasket med 1 N HCl og mettet, vandig natriumbikarbonat. Det organiske lag ble tørket og inndampet. Restmaterialet ble kromatografert over 60 g kiselgel med 20 % (v/v) aceton i metylenklorid som elueringsmiddel. Krystallisering av de sammenslåtte rene fraksjoner fra metylenklorid/ eter/heksan gav 1,6 g Ac-F(pCN)-Chg-OMe som fargeløse krystaller med smeltepunkt (smp.) 178-

180 °C.

b) En blanding av 1,93 g (5 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OMe (fra eksempel XXVII.a., ovenfor), 100 ml metanol, 10 ml vann og

0,75 g litiumhydroksidhydrat ble omrørt under nitrogen i 24 timer ved RT. Etter tilsetning av 2 ml eddiksyre ble løsemidlene inndampet, og restmaterialet ble fordelt mellom metylenklorid tilsatt 20 % isopropanol og 1 N HCl. Det organiske lag ble tørket og inndampet, og restmaterialet ble krystallisert fra fnetylenklorid/eter/heksan for erholdelse av 1,6 g Ac-F (pCN)-Chg-OH som fargeløse krystaller med smp. 216-218 °C.

c) En blanding av 150 mg (0,4 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH (se ovenfor), 65 mg (0,6 mmol) 4-aminometylpyridin, 124 mg

(0,6 mmol) DCC, 60 mg (0,44 mmol) HOBt og 5 ml DMF ble omrørt i 20 timer ved RT. Urea ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble inndampet. Restmaterialet ble suspendert i metanol, og det uløselige produkt ble oppsamlet ved filtrering for erholdelse av 140 mg fargeløst Ac-F (pCN)-Chg-NHCH2 (4-pyridyl) . En analytisk prøve ble erholdt ved kromatografi over kiselgel med ace-

ton:metylenklorid:metanol (4:5:1). Det krystallinske, faste stoff hadde smp. > 250 °C.

Eksempel XXVIII

Ac- f ( 4- amidino) - Chg- NHCH2 ( 4- metylpyridinium)

Denne forbindelse ble fremstilt ved å la 150 mg Ac-f (pCN) -Chg-NHCH2 (4-pyridyl) (se ovenfor) reagere med hydrogensulfid og deretter med metyljodid og ammoniumacetat. Produktet ble isolert ved HPLC som et homogent materiale. MS-analyse: (M + H)<+> observert: 493,3, beregnet: 493,29.

Utgangsmaterialet ble fremstilt som følger:

a) En blanding av 2,8 g Ac-f(pCN), (L)-sykloheksylglysinmetylester, 940 mg HOBt, 1,57 g DCC og 30 ml DMF ble omrørt 1 2 dager ved RT. Urea ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble inndampet. Restmaterialet ble løst i metylenklorid, og løsningen ble vasket med 1 N HCl og 10 % vandig natriumkarbonat. Den organiske fase ble tørket og inndampet. Krystallisering av restmaterialet fra metylenklorid/eter/ heksan gav 2,05 g fargeløst Ac-f(pCN)-Chg-OMe med smp. 181-183 °C.

b) Hydrolyse av 1,93 g Ac-f(pCN)-Chg-OMe (se ovenfor) med 0,75 g litiumhydroksidmonohydrat i 100 ml metanol og 10 ml

vann ble behandlet som beskrevet for L,L-isomeren i eksempel XXVII, krystallisert fra metylenklorid/eter, for erholdelse av 1,65 g Ac-f(pCN)-Chg-OMe med smp. 180-182 °C.

c) En blanding av 225 mg Ac-f(pCN)-Chg-OMe (se ovenfor) , 100 mg 4-aminometylpyridin, 90 mg HOBt, 180 mg DCC og 6 ml

DMF ble omrørt over helgen ved RT. Urea ble frafiltrert og filtratet inndampet. Restmaterialet ble omrørt med metanol, og fast materiale fjernet ved filtrering, etterlatende 190 mg krystal-linsk Ac-f (pCN)-Chg-NHCH2 (4-pyridyl) med smp. > 250 °C.

Eksempel XXIX

Ac- pAph- Chg- NHCH2CH2 ( 3- metylpyridinium)

En blanding av 125 mg Ac-F (pCN)-Chg-NHCH2CH2 (3-pyridyl) , 2 ml DMSO, 10 ml pyridin og 5 ml trietylamin ble mettet med hydrogensulfid under avkjøling i is/vann. Etter omrøring i en forseglet ampulle over natten ved RT ble løsemidlene inndampet, og restmaterialet ble oppsamlet med aceton/eter og tørket for erholdelse av 125 mg av tioamidet. Dette materialet ble blandet med 2 ml DMSO, 5 ml aceton og 0,75 ml metyljodid, og blandingen ble omrørt i en forseglet ampulle over natten ved RT. Etter fortynning med toluen ble løsemidlene inndampet, og restmaterialet ble omrørt med eter. Eteren ble helt av og erstattet med ny eter, og omrøringen fikk fortsette til det harpikslignende materialet størknet, hvoretter gjenværende eter ble frafiltrert og restmaterialet tørket.

Det resulterende restmaterialet ble løst i 20 ml metanol og behandlet med 0,3 ml eddiksyre og 0,4 g ammoniumacetat. Blandingen ble oppvarmet til 55-60 °C i 2,5 timer, hvoretter løsemidlene ble inndampet. Restmaterialet ble løst i vann/ACN/TFA og frysetørket. Råproduktet ble renset ved HPLC som beskrevet i eksempel I. MS-analyse: {M + H)<*> observert: 507,3, beregnet: 507,31.

Utgangsmaterialet ble erholdt som følger: En blanding av 150 mg {0,4 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 120 mg {0,6 mmol) 2-(3-pyridyl)etylamin-dihydroklorid, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0,5 ml diisopropyletylamin og 10 ml DMF ble omrørt i 24 timer ved RT. Etter inndamping av løsemidlet ble restmaterialet omrørt med metanol, og det uløselige produkt ble oppsamlet ved filtrering og vasket med metanol og eter for erholdelse av 110 mg fargeløse krystaller. Filtratet ble inndampet, og restmaterialet ble løst i metylenklorid/isopropanol. Denne løsning ble vasket med 10 % vandig natriumkarbonat, tørket og inndampet. Restmaterialet ble kromatografert over 14 g kiselgel med metylenklorid: aceton: metanol (5:4:1) for erholdelse av 40 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2 (3-pyridyl) med smp. 265-268 °C. b) 2-(3-pyridyl)etylamin-dihydroklorid ble fremstilt som følger: En blanding av 1,3 g 3-pyridylacetonitril, tilnærmet 3 g Raney-nikkel og 30 ml metanol tilsatt 10 % (vol/vol) ammoniakk ble hydrogenert ved 35 psi i 20 timer med en Parr-hydrogenator. Katalysatoren ble frafiltrert over celitt, og filtratet ble inndampet. Restmaterialet ble løst i metylenklorid, tørket med magnesiumsulfat, filtrert og inndampet. Produktet ble overført til dihydrokloridet med hydrogenklorid i dioksan. Krystallisering fra metanol/eter gav 1,4 g fargeløse krystaller med smp. 145-148 °C.

Eksempel XXX

Ac - pAph- Chg- NHCH2CH2 ( 4 - metylpyr idinium)

Denne forbindelsen ble fremstilt ved å benytte fremgangsmåter beskrevet ovenfor, ved å la Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(4-pyridyl) reagere med hydrogensulfid, fulgt av metylering med metyljodid og reaksjon med ammoniumacetat. Råproduktet ble renset ved HPLC. MS-analyse: (M + H)<+> observert: 507,3, beregnet: 507,31.

Utgangsmaterialet ble erholdt ved kobling av Ac-F(pCN)-Chg-OH med 2-(4-pyridyl)etylamin-dihydroklorid som beskrevet i eksempel XXIX ovenfor.

2-(4-pyridyl)etylamin-dihydroklorid ble fremstilt som beskrevet for 2-(3-pyridyl)etylamin-dihydroklorid (se ovenfor) ved hydrogenering av pyridyl-4-acetonitril over Raney-nikkel i nærvær av ammoniakk. Dihydrokloridet hadde smp. 220 °C.

Eksempel XXXI

Ac- pAph- Chg- NHCH2 ( 4 - amidinof enyl)

Denne forbindelsen ble fremstilt ved å benytte tilsvarende metoder som beskrevet ovenfor, ved behandling av Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2 (4-cyanf enyl) med hydrogensulfid i DMSO, pyridin og trietylamin. Det erholdte bis-tioamid ble metylert med metyljodid i DMSO/aceton og fikk deretter reagere med ammoniumacetat som beskrevet ovenfor. Råproduktet ble renset ved HPLC. MS-analyse: (M + H)<+> observert: 520,3, beregnet: 520,30.

Utgangsmaterialet ble erholdt som følger: En blanding av 75 mg (0,2 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 50 mg (0,3 mmol) (4-cyan-fenyljmetylamin-hydroklorid, 62 mg DCC, 30 mg HOBt, 0,2 ml DIEA og 2 ml DMF ble omrørt i 24 timer ved RT. Etter filtrering ble løsemidlet inndampet og restmaterialet løst i metylenklorid tilsatt 20 % isopropanol. Løsningen ble vasket med 1 N HCl og 10 % vandig natriumkarbonat, tørket og inndampet. Restmaterialet ble omrørt med en liten mengde metanol/vann, og utskilte faste stoffer ble oppsamlet og tørket for erholdelse av 80 mg Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2 (4-cyanf enyl) .

(4-cyanfenyl)metylamin-hydroklorid ble fremstilt som følger: En blanding av 2 g (10 mmol) a-brom-p-tolunitril, 2 g (10,8 mmol) kaliumftalimid og 30 ml DMF ble oppvarmet til refluks i 1 minutt. Etter avkjøling ble blandingen surgjort med eddiksyre

og fortynnet med vann for utkrystallisering av produktet. Krystallene ble frafiltrert, vasket med vann og tørket for erholdelse av 2,24 g fargeløst N-(4-cyanfenyl)metylftalimid med smp. 182-184 °C.

1,5 g N-(4-cyanfenyl)metylftalimid ble suspendert i 50 ml kokende metanol og behandlet med 1 ml hydrazinhydrat. En klar løsning var resultatet etter 5 minutter. Metanolen ble inndampet og restmaterialet behandlet med 2 N HCl. Suspensjonen ble oppvarmet til koking og deretter avkjølt på is. Fast stoff ble frafiltrert og filtratet inndampet. Restmaterialet ble løst i vann. Løsningen ble igjen oppvarmet til koking, avkjølt og filtrert. Filtratet ble gjort alkalisk med natriumhydroksid og ekstrahert med metylenklorid tilsatt isopropanol. Den organiske fase ble tørket og inndampet, og restmaterialet ble overført til hydrokloridsaltet, krystallisert fra isopropanol/eter og gav 0,43 g fargeløse krystaller med smp. > 260 °C.

(3-cyanfenyl)metylamin-hydroklorid ble fremstilt ved å la a-brom-m-tolunitril reagere med kaliumftalimid for dannelse av N-(3-cyanfenyl)metylftalimid med smp. 147-148 °C. Reaksjon av dette materialet med hydrazinhydrat og overføring til hydrokloridet som ovenfor gav (3-cyanfenyl)metylamin med smp. 223-226 °C.

Eksempel XXXII

Ac - pAph- Chg - Chg-NHCH2 ( 3 - amidino f enyl)

Denne forbindelsen ble fremstilt ved å benytte fremgangsmåter som beskrevet ovenfor. Ac-F (pCN)-Chg-NHCH2 (3-cyan-fenyl) ble'behandlet med hydrogensulfid i DMSO, pyridin og trietylamin. Det erholdte bis-tioamid ble metylert med metyljodid i DMSO/aceton og fikk så reagere med ammoniumacetat som beskrevet ovenfor. Råproduktet ble renset ved HPLC. MS-analyse: (M + H)<* >observert: 52 0,3, beregnet: 520,30.

Utgangsmaterialet ble erholdt som følger: En blanding av 300 mg (0,8 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 200 mg (1,2 mmol) (3-cyanfenyl)metylamin-hydroklorid, 250 mg DCC, 120 mg HOBt, 0,8 ml DIEA og 10 ml DMF ble omrørt i 24 timer ved RT. Etter filtrering ble løsemidlet inndampet og restmaterialet løst i et stort volum metylenklorid tilsatt 20 % isopropanol. Løsningen ble vasket med 1 N HCl og 10 % vandig natriumkarbonat, tørket og inndampet. Restmaterialet ble omrørt med isopropanol/eter, og de utskilte faste stoffer ble oppsamlet og tørket for erholdelse av 4 00 mg Ac-F(pCN) -Chg-NHCH2 (3-cyanf enyl) .

Eksempel XXXIII

Ac- pAph- Chg- NHCH( Me)( 4- metylpyridinium)

En blanding av diastereomerer av den ønskede forbindelse ble fremstilt ved å la en blanding av to diastereomere Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-pyridyl) reagere med hydrogensulfid og deretter med Mel og ammoniumacetat. Diastereomerene ble separert ved HPLC. MS-analyse: (M + H)<+> observert: 507,3, beregnet: 507,31.

Utgangsmaterialet ble fremstilt som følger: En blanding av 150 mg (0,4 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 120 mg (0,6 mmol) racemisk 1-(4-pyridyl)etylamin-dihydroklorid, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0,5 ml DIEA og 10 ml DMF ble omrørt i 24 timer ved RT. Etter filtrering ble løsemidlet inndampet og restmaterialet løst i et stort volum metylenklorid tilsatt 20 % isopropanol. Løsningen ble vasket med 10 % vandig natriumkarbonat, tørket og inndampet. Restmaterialet ble omrørt med isopropanol/eter, og de utskilte faste stoffer ble oppsamlet og tørket for erholdelse av 125 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-pyridyl) som en blanding av to diastereomerer.

Racemisk 1-(4-pyridyl)etylamin-dihydroklorid ble fremstilt som følger: En blanding av 1 g 4-acetylpyridin-N-oksid, 2 g Raney-nikkel og 30 ml metanol tilsatt 20 % ammoniakk (vol/vol) ble hydrogenert i 24 timer ved 30 psi. Katalysatoren ble fjernet- ved filtrering over celitt og filtratet inndampet. Restmaterialet ble løst i metylenklorid, filtrert og inndampet. Restmaterialet ble løst i isopropanol og behandlet med hydrogenklorid i eter. De utfelte krystaller ble oppsamlet og tørket for erholdelse av 0,9 g stoff med smp. 198-200 °C.

Eksempel XXXIV

Syntese av DIPA( m) pAph- Chg- Arg- Leu- Pro- NH3

a. Syntese av N, N- diisopropylamidet av ( p- cyanbenzyl)-malonsyre( PIPA( m) Phe( pCN))- OH

Syntese av 2-(p-cyanbenzyl)malonsyre ble oppnådd ved en modifisert fremgangsmåte (se Pinori et al., US patentskrift nr. 5 061 911 (oktober 1991), som inkorporeres heri ved referanse). Til en løsning av 3,8 g 2,2-dimetyl-l,3-dioksan-4,6-dion (Meldrums syre, Aldrich) og 1,12 g NaCNBH3 (Aldrich) i 25 ml DMF ble det tilsatt 2,3 g p-cyanbenzaldehyd (Aldrich), og blandingen ble omrørt i 2 timer ved RT. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt 400 ml vann, og løsningen ble avkjølt i et isbad og pH justert til 3,8-4 ved dråpevis tilsetning av 20 % vandig HCl. Den hvite utfelling ble oppsamlet i en Buchner-trakt med sintret glass og vasket med kaldt vann. Sammenslått utfelt materiale ble tørket i vakuum over CaCl2 i 24 timer. NMR av det samlede faste stoff i CDC13 identifiserte forbindelsen 2,2-dimetyl-5-(p-cyan)benzyl-1,3-dioksan-4,6-dion (DCBD), som har smp. 135-142 °C og Rf 0,45 (CHCI3:MeOH:eddiksyre, 95:4:1).

Til 1,5 ml diisopropylamin i 45 ml DCM ble det tilsatt

3 ml N,O-bis(trimetylsilyl)acetamid (BSA), og løsningen ble refluksert i en reaksjonskolbe utstyrt med magnetrører og en kondensator beskyttet med et CaCl2-rør i 7 timer. Etter avkjøling av løsningen til RT ble 0,8 g DCBD tilsatt og reaksjonsblandingen refluksert i 3 timer (inntil fullstendig overføring til produktet, som vist ved TLC). Etter avkjøling av reaksjonsblandingen ble 5-8 ml 20 % vandig HCl forsiktig tilsatt. Etter separering av lagene ble det organiske lag vasket md vann, tørket (MgS04) og inndampet til tørrhet for erholdelse av et rent produkt som ble benyttet i neste trinn uten ytterligere rensing. Identifisering av forbindelsene ble gjort ved NMR i CDC13 og MS.

b. Syntese av PIPA( m) pAph- Chg- Arg- Leu- Pro- NHg

Peptidresin PIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink ble syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel I. Det resulterende peptidresin ble behandlet med hydroksylamin-hydroklorid som beskrevet i eksempel XXV for erholdelse av DIPA(m)-Phe(pC(NOH)NH2)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink. Etter kløyving av peptidet fra resinet og frysetørking ble råproduktet (120 mg) løst i 80 ml MeOH og 10 ml mettet løsning av NH3 i MeOH. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt 0,25 ml Raney-nikkelsuspensjon (Aldrich), og blandingen ble hydrogenert ved 45 psi i 24 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og løsemidlet inndampet til tørrhet, og restmaterialet ble frysetørket fra l:l-løsning av 0,1 % TFA i vann og ACN. Råpeptidet ble renset ved HPLC og forbindelsen identifisert ved MS. (M + H)<+> observert: 824,2, beregnet: 824,5.

Eksempel XXXV

Forbindelser med flere substitusjoner som ble syntetisert og funnet å være potente inhibitorer av faktor Xa

Eksempel XXXVI

Kombinasjoner av kjemiske endringer som hver for seg ikke for-bedrer aktiviteten, kan forbedre aktiviteten

Inhibering av faktor Xa-aktivitet ble målt. Imidlertid kan ethvert relevant mål av biologisk aktivitet, f.eks. virkningen av et YIR-peptid ifølge oppfinnelsen på koagulasjon, in vivo-aktivitet, in vivo-halveringstid, oral biotilgjengelig-het, oral aktivitet eller halveringstid, bestemmes som et mål på aktiviteten av et peptid ifølge oppfinnelsen.

Mange spesifikke endringer er beskrevet. For eksempel ble to endringer kombinert for å demonstrere at ytterligere bed-ring av aktiviteten kunne oppnås ved å kombinere endringer, selv når de opprinnelige enkelte endringer ikke signifikant forbedret aktiviteten. Enkle kjemiske endringer gav Ac-Y-I-R-L-P, som hadde Ki = 0,49 uM, og (iBu)Y-I-R-L-P, som hadde Ki = 2,6 uM, sammenlignet med utgangs forbinde Isen Y-I-R-L-P (Ki = 5,3 uM) . Ved å kombinere disse to endringer ble Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2 fremstilt, som hadde Ki = 0,04 uM. Disse resultater viser således at et peptid ifølge oppfinnelsen med en kombinasjon av to kjemiske endringer kan ha vesentlig forhøyet faktor Xa-inhiberende aktivitet sammenlignet med de tilsvarende analoger med enkle endringer, selv når en utgangsforbindeIse som (iBu)Y-I-R-L-P-NH2 ikke hadde signifikant bedre aktivitet enn utgangsforbindelsen Y-I-R-L-P-NH2.

Tabell 3 gir eksempler på spesifikke kjemiske modifikasjoner som førte til forbindelser med Ki-verdier mellom 100 uM og 1 pM for faktor Xa-inhibering..

Eksempel XXXVII

In vi tro - inhibering av utvalgte rensede koagulasjonsenzymer og andre serinproteaser

Evnen til en forbindelse ifølge oppfinnelsen til å inhibere faktor Xa, trombin, plasmin, elastase og trypsin ble anslått ved å bestemme konsentrasjonen av YIR-peptid som inhiberer enzymaktiviteten med 50 % (IC50) . Rensede enzymer ble benyttet i kromogene analyser. For å bestemme inhiberings-konstanten ble IC50-verdien korrigert for konkurranse med substrat ved å benytte formelen:

Ki = IC50 x (l/{l + ( (substratkonsentras jon) /substrat Km)})

{Chen og Prusoff, Biochem. Pharmacol., 22:3099-3018 (1973), som inkorporeres heri ved referanse).

a. Faktor Xa- analyse

TBS-P-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,05 % (vekt/vol) PEG-8000, 0,02 % (vekt/vol) NaN3) ble benyttet i denne analysen. IC50-verdien ble bestemt ved å sammenblande i

1

passende brønner i en Costar halvareals mikrotiterplate 25 ul human faktor Xa (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN) i TBS-P, 40 ul 10 % (vol/vol) DMSO i TBS-P (ikke-inhibert

kontroll) eller forskjellige konsentrasjoner av et analysepeptid fortynnet i 10 % (vol/vol) DMSO i TBS-P, og substrat S-2765 (Na-benzyloksykarbonyl-D-Arg-Gly-L-Arg-p-nitroanilid, Kabi Pharmacia, Inc., Franklin, OH) i TBS-P.

Analysene ble utført ved å preinkubere peptidinhibi-toren sammen med enzymet i 10 minutter, hvoretter analysen ble startet ved tilsetning av substrat til et sluttvolum på 100 ul. Initialhastigheten for hydrolyse av det kromogene substrat ble målt ved endring i absorbans ved 405 nm med et Bio-tek Instru-ments kinetic plate reader (Ceres UV900HDi) ved 25 °C, ved å benytte den lineære del av tidsforløpet (vanligvis 1-5 minutter etter tilsetning av substrat). Konsentrasjonen av inhibitor som gav 50 % reduksjon i substrathydrolysehastigheten, ble bestemt ved lineær regresjon etter å plotte relativ hydrolysehastighet (sammenlignet med den ikke-inhiberte kontroll) mot logaritmen av peptidkonsentrasjonen. Enzymkonsentrasjonen var 0,5 nM og substratkonsentrasjonen 140 uM.

b. Trombinanalyse

TBS-P-buffer ble benyttet i denne analysen. IC50 ble bestemt som beskrevet i eksempel XXXVII.a., bortsett fra at substratet var S2366 (L-pyroGlu-L-Pro-L-Arg-p-nitroanilid, Kabi), og enzymet var humant trombin (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). Enzymkonsentrasjonen var 1 nM og substratkonsentrasjonen 175 uM.

c. Plasminanalyse

TBS-P-buffer ble benyttet i denne analysen. ICS0 ble bestemt som beskrevet i eksempel XXXVII.a., bortsett fra at substratet var S2251 ((D)-Val-L-Leu-L-Lys-p-nitroanilid, Kabi), og enzymet var humant plasmin (Kabi). Enzymkonsentrasjonen var 5 nM og substratkonsentrasjonen 300 uM.

d. Trypsinanalyse

TBS-P-buffer tilsatt 10 mM CaCl2 ble benyttet i denne analysen. ICS0 ble bestemt som beskrevet i eksempel XXXVII.a., bortsett fra at substratet var BAPNA (benzoyl-L-Arg-p-nitroanilid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), og enzymet var pan-kreatisk trypsin fra storfe (type XIII, TPCK-behandlet, Sigma). Enzymkonsentrasjonen var 50 nM og substratkonsentrasjonen 300 uM.

e. Elastaseanalyse

Tris-HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl, 2 % (vol/vol) N-metyl-pyrrolidon, 0,01 % (vekt/vol) NaN3-buffer ble benyttet i denne analysen. ICSo ble bestemt som beskrevet i eksempel XXXVII.a., bortsett fra at substratet var succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (Calbiochem-Nova Biochem Corp., San Diego, CA)( og enzymet var human nøytrofil elastase (Athens Research and Technology, Inc., Athens, GA). Enzymkonsentrasjonen var 75 nM og substratkonsentrasjonen 600 uM,

Ki-verdiene for utvalgte analyseforbindelser sammenlignet med kontrollforbindelsen "TENSTOP" (N-alfa-tosyl-Gly-p-amidinof enylalaninmetylester, American Diagnostica, Inc., Greenwich, -CT), som er en reversibel faktor Xa-inhibitor (Sturzebecher et al., Thromb. Res., 54:245-252 (1989); Hauptman et al., Thromb. Haem., 63:220-223 (1990), som begge inkorporeres heri ved referanse), er vist i tabell 2 ovenfor. Resultatene viser at YIR-peptidene ifølge oppfinnelsen kan inhibere faktor Xa-aktivitet uten i vesentlig grad å inhibere aktiviteten av forskjellige andre serinproteaser, heriblant trombin og plasmin, som deltar i blodkoagulasjon og fibrinolyse.

Eksempel XXXVIII

Analyser for å bestemme inhibering av koagulasjon

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble analysert for deres evne til å inhibere faktor Xa-aktivitet. Effektiviteten av forskjellige forbindelser ble anslått ved in vitro-protrombintid(PT)-analysen med sammenslått plasma fra humane donore-r. En ex vivo-analyse ble også benyttet, hvor plasma ble oppsamlet ved forskjellige tidsrom etter intravenøs (i.v.) tilførsel av en forbindelse til rotter og til kaniner, eller intraduodenal tilførsel til rotter, og analysert med PT-analysen for å bestemme halveringstid i plasma. PT-analysen ble startet med en tromboplastinfortynning valgt for å oppnå et forlenget og svært reproduserbart sluttpunkt for koagulasjonen, betegnet som "fortynnet PT-analyse", som beskrevet nedenfor. Effektiviteten av forskjellige forbindelser ble også bestemt med en in vivo arteriovenøs shunt-modell for trombose i rotte.

a. Fortynnet protrombintid- analyse in vitro

100 ul forvarmet (37 °C) , sammenslått blodplatefattig plasma (PPP) fra menneske ble overført til en fibrometerkopp (Baxter Diagnostics, Inc., McGaw Park, IL). 50 ul av forskjellige konsentrasjoner av en analyseforbindelse i TBS-BSA med kalsium (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,1 % (vekt/vol) bovint serumalbumin, 20 mM CaCl2) ble tilsatt. I kontrolleksperimenter ble PBS-BSA med kalsium, men uten analyseforbindelse, tilsatt for måling av ikke-inhibert koagulasjonstid. 150 ul fortynnet, forvarmet kanintromboplastin (Baxter) med kalsium ble tilsatt fibrometerkoppen, og fibrometerets tidsmåler ble startet. En kanintromboplastinfortynningskurve ble erholdt før analyse av forbindelsen, og benyttes for valg av en tromboplastinfortynning som gir tilnærmet 30 sekunders PT-tid for ikke-inhiberte kontroller. Den eksperimentelle konsentrasjon som gav 50 % inhibering av koagulasjonen (EC50) med analyseforbindelse (se tabell 4 nedenfor), ble beregnet fra tidspunktene på fortynningskurven.

Alternativt ble den fortynnede protrombintid-analyse utført ved å benytte "research"-modus på et' ACL3000-plus auto-matisert koagulasjonsinstrument fra Instrumentation Laboratories (IL) (IL, Milano, Italia). Tromboplastin ble fortynnet inntil en koagulasjonstid på 30-35 sekunder ble oppnådd. Denne koagulasjonstid ble definert som 100 % aktivitet. En standard-kurve for kalibrering ble satt opp ved to gangers seriefortynning av det fortynnede tromboplastinreagens (tromboplastin fra kaninhjerne fremstilt av IL). Under analysen ble en 50 ul prøve (plasma separert ved sentrifugering) blandet med 100 ul tromboplastinreagens, og nefelometriske målinger ble foretatt over 169 sekunder. Koagulasjonstiden ble bestemt fra maksimal-hastigheten for endring av lysspredning, beregnet av instru-mentet. Inhiberingen uttrykkes som prosent aktivitet, bestemt ved sammenligning med kalibreringskurven.

b. Fortynnet protrombintid- analyse ex vivo

Analyseforbindelse ble tilført i.v. enten via halevenen (rotte) eller ørevenen (kanin) ifølge en godkjent protokoll. Blodprøver på 1 ml ble uttatt ved faste tidsrom etter tilførsel av en analyseforbindelse fra en drenert halsarterie (rotte) eller ørearterie (kanin). Etter sentrifugering for erholdelse av PPP ble plasmaet umiddelbart lagret på is eller nedfrosset.

For bestemmelse av fortynnet protrombintid ble plasmaet forvarmet og analysert som beskrevet ovenfor. Prosent inhibering ble beregnet fra en tromboplastinfortynningskurve som ble analysert sammen med hver prøveserie, og benyttet for å bestemme tiden ved hvilken tilnærmet 50 % av den opprinnelige antikoagulantaktivitet foreligger i plasmaet (Tl/2). Resultatene av dette forsøk viser at YIR-peptidene ifølge oppfinnelsen kan inhibere blodkoagulasjon in vitro og etter tilførsel in vivo (se tabell 4).'

Forskjellige forbindelser ble også undersøkt for antikoagulasjonsaktivitet med ex vivo fortynnet protrombintid-analysen etter intravenøs bolustilførsel av forskjellige doser i rotter. Forbindelsene angitt i tabell 5 viste minst 30 % inhibering 10 minutter etter tilførsel av < 2 mg/kg av den angitte forbindelse. Disse resultater viser at forskjellige representative YIR-peptider ifølge oppfinnelsen har en vesentlig antikoagulasjonsaktivitet. Strukturen av alle forbindelsene angitt i tabell 5 ble bekreftet ved MS og AA.

I noen eksperimenter ble analyseforbindelsene tilført rotter ved å benytte en intraduodenal doseringsprotokoll. Sprague-Dawley hannrotter på tilnærmet 300 g ble bedøvd med en kombinasjon av ketamin/xylazin subkutant, ifølge en godkjent protokoll. Høyre halsarterie ble drenert for uttak av blodprøver. En laparotomi ble utført, og duodenum ble drenert med en kanyle med kulespiss og bundet på plass for å sikre at suturen lå distalt for insersjonspunktet. Nok en overbinding ble plassert proksimalt for insersjonspunktet for å hindre lekkasje av mageinnhold. Effektiviteten av suturen i å hindre en forbindelse fra å nå insersjonsstedet ble analysert ved trykkanalyse ved avslutningen av hvert eksperiment. Insersjonspunktet var tilnærmet 4 cm fra duodenum-magesekkovergangen. Forbindelser ble tilført i 1 ml normalt saltvann. En 0,7 ml blodprøve ble tappet før tilførsel av analyseforbindelsen 15, 30, 60, 90 og 120 minutter etter tilførsel. Plasma ble separert ved sentrifugering og analysert for inhibering av koagulasjon ved å benytte fortynnet protrombintid-analyse.

Følgende forbindelser viste minst 30 % inhibering i den fortynnede protrombintid-analyse etter intraduodenal tilførsel av ^ 50 mg/kg forbindelse: Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph-Chg-AMP{4); syklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 3-Igc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; Ac-Y (3-1)-Chg-R-L-P-NH2; Ac-F (pNH2)-Chg-R-ol og Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol.

c. Rottearteriovenøs shunt- modell for trombose

Den antitrombotiske virkning av forskjellige forbindelser ifølge oppfinnelsen ble anslått ved å benytte ekstra-korporeal arteriovenøs(AV)-shunt hos rotte. AV-shuntkretsen bes-tod av 20 cm polyetylen (PE) 60-rør innsatt i høyre halsarterie, 6 cm PE 160-rør med en innlagt 6,5 cm lang mercerisert bomullstråd (5 cm eksponert for blodstrømmen), og nok et stykke PE-60-rør (20 cm) som fullførte kretsen inn i ytre venstre halsvene. Hele kretsen ble fylt med normalt saltvann før innsetting.

Testforbindelser ble tilført ved kontinuerlig infusjon

i halevenen med en sprøytepumpe og et "sommerfugl"-kateter (infusjonsvolum 1,02 ml/time). En forbindelse ble tilført i 30 minutter, hvoretter shunten ble åpnet og blod fikk strømme gjennom i 15 minutter (totalt 45 minutters infusjon). Etter de 15 minutter ble shunten lukket, og tråden ble forsiktig fjernet og veid med en analysevekt. Prosent inhibering av trombedannelse ble beregnet ved å benytte trombevekten erholdt fra kontrollrotter som ble infusert med saltvann.

Følgende forbindelser inhiberte trombevekst med minst tilnærmet 30 % etter infusjon med < 33 ug/kg/minutt: Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PalMe(3) -NH2; Ac-F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3}-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph-Chg-AMP-(4); syklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH3; 3-Igc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3)-ol og Tos-F (pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 .

Claims (15)

1. Forbindelse som spesifikt inhiberer faktor Xa-aktivitet, karakterisert ved at den har den generelle formel A1-A2-A3-B hvor Al er Tyr, F(pNH2), mAph, pAph eller Nal (2), som inneholder 0 eller 1 aminobeskyttende gruppe, A2 er Ile eller Chg, A3 er Arg, PalMe(3)( Dab (NY<->C3H7N) , Dap (NP-C3H7N) eller Orn (N5- C3H7N) ; og B er -H, -OH, -NH2, én til fem aminosyrer eller en karboksybeskyttende gruppe, omfattende farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den aminobeskyttende gruppen er valgt blant: formyl, acetyl, picoloyl, tert.-butylacetyl, tert.-butyloksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, 2-aryl-2-0-benzyloksim, aminoacyl, benzoyl, tosyl, 3-fenoksyproprion-syre, 5-benzimidazolkarboksy, CC1F2-C0, CF2H-CO, CF3-CF2CO, CH3-CHC1-C0, CH3-0-CO, CH3-S02, CH3CH2-0-CO, Cl2CHCO, ClCH2CO, (pOH)C6H4-CH2CH(OH) -CO, (pOH) C6H4-CH2CHOH-CO, <pOH) C6H4-OCH (CH3) CO, "(pOH) C6H4-OCH2CO, 4-MeO-C6H4-CO, N-morf olinyl-CO, Ph-C (NOCH2Ph)-CO, Ph-CH=CH-CO, Ph-CH2CH2CH2-CO, Ph-CH2CH2CO og trifluoracetyl, eller den N-terminale aminogruppen er erstattet med en syklopentylkarboksy-, isokinolylkarboksy- eller pyrazinkarboksygruppe.

3. Forbindelse ifølge kravene l til 2, karakterisert ved at det farmasøytisk akseptable saltet er et syreaddisjonssalt.

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at syreaddisjonssaltet er et salt dannet med en uorganisk syre valgt blant saltsyre, hydro-bromsyre, fosforsyre, svovelsyre og perklorsyre, eller er et salt dannet av en organisk syre valgt blant eddiksyre, oksalsyre, maleinsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, ravsyre og malonsyre.

5. Forbindelse ifølge kravene 1 til 2, karakterisert ved at det farmasøytisk akseptable saltet er valgt blant gruppen bestående av uorganisk nitrat, sulfat, acetat, maleat, formiat, laktat, tartrat, suksinat, citrat og p-toluensulfonat.

6. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved at det farmasøytisk akseptable saltet er p-toluensulfonat.

7. Forbindelse ifølge kravene 2 til 6, karakterisert ved at B er valgt blant gruppen bestående av alkoksymetylgrupper, a-(Ci til Cjal-koksyetylgrupper, 2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetylgrupper, Ci til C3 alkyltiometylgrupper, acyloksymetylgrupper, a-acyloksy-a-substituerte metylgrupper, 1-(Ci til C4alkyloksykarbonyloksy)et-l-yl-grupper og 1-(Ci til C4alkylaminokarbonyloksy)et-1-yl-grupper.

8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at B er valgt blant gruppen bestående av metoksymetyl, etoksymetyl, isopropoksymetyl, metoksyetyl', etoksyetyl, propoksyetyl, isopropoksyetyl, 5-metyl-2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetyl, 5-fenyl-2-okso-1,3-dioksolen-4-ylmetyl, metyltiometyl, etyltiometyl, isopropyltiometyl, pivaloyloksymetyl, a-acetoksymetyl, etoksykarbonyl-1-metyl, a-acetoksyetyl, 3-ftalidyl, 5,6-dimetylftalidyl, 1-(etoksykarbonyl-oksy)et-l-yl og 1-(metylaminokarbonyloksy)et-l-yl.

9. Forbindelse ifølge kravene 1 til 8, karakterisert ved at den er valgt blant gruppen bestående av:

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder en forbindelse ifølge kravene 1 til 9.

11. Farmasøytisk preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at det videre omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.

12. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 9 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en kardiovaskulær forstyrrelse valgt blant gruppen bestående av restenose etterfølgende angioplastikk, "adult respiratory distress syndrome", multi-organsvikt, slag og disseminert intravaskulær koagulasjonsforstyrrelse.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor det farmasøytiske preparatet er for behandling av komplikasjoner forbundet med kirurgi valgt blant gruppen bestående av dyp vene- og proksimal venetrombose.

14. Anvendelse ifølge krav 12, hvor det farmasøytiske preparatet er til reduksjon eller inhibering av blodkoagulasjon.

15. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene l til 9 som antikoagulant for å forhindre koagulasjon av en blodprøve.