CZ296439B6 - Inhibitory faktoru Xa - Google Patents
Inhibitory faktoru Xa Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296439B6 CZ296439B6 CZ0314096A CZ314096A CZ296439B6 CZ 296439 B6 CZ296439 B6 CZ 296439B6 CZ 0314096 A CZ0314096 A CZ 0314096A CZ 314096 A CZ314096 A CZ 314096A CZ 296439 B6 CZ296439 B6 CZ 296439B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- okay
- peptide
- chg
- acid
- tyr
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0207—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)4-C(=0), e.g. 'isosters', replacing two amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
Peptid, specificky inhibující aktivitu faktoru Xa, obecného vzorce A.sub.1.n.-A.sub.2.n.-A.sub.3.n.-B, kde A.sub.1.n. je zbytek Tyr, F(pNH.sub.2.n.), mAph, pAph nebo Nal(2), které obsahují zádnou nebo jednu chránicí skupinu aminoskupiny, A.sub.2.n. je zbytek Ile nebo Chg, A.sub.3.n. je zbytek Arg, PalMe(3), Dab(N.sup..gama..n.-C.sub.3.n.H.sub.7.n.N), Dap(N.sup..beta..n.-C.sub.3.n.H.sub.7.n.N) nebo Orn(N.sup..delta..n.-C.sub.3.n.H.sub.7.n.N)a B je zbytek -H, -OH, -NH.sub.2.n., jeden az petaminokyselinových zbytku nebo chránicí skupina karboxylu, vcetne jeho farmaceuticky prijatelných solí. Sloucenina podle resení je charakterizována cástecne tím, ze vykazuje specifickou inhibici aktivity faktoru Xa s hodnotou K.sub.i.n. .<=. 100 .mi.M, prednostne .<=. 2 nM, a v podstate neinhibuje aktivitu jiných proteáz úcastnících se koagulacní kaskády. Dále jsou popsány farmaceutické prípravky s obsahem tohoto peptidu a pouzití peptidu pro výrobu farmaceutického prípravku pro specifickou inhibici aktivity faktoru Xa a snízení nebo inhibici srázení krve. Rovnez je zahrnuto pouzití peptidu jako antikoagulancia.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká obecně inhibice proteinů, způsobujících srážení krve, a zejména specifických inhibitorů enzymu způsobujícího srážení krve faktoru Xa.
Dosavadní stav techniky
Schopnost tvořit krevní sraženinu je nezbytná pro přežití. Při určitých chorobných stavech je však tvorba krevních sraženin v oběhovém systému sama zdrojem morbidity. V některých případech tedy může být žádoucí zamezovat tvorbě krevních sraženin. Není však žádoucí inhibovat systém srážení úplně, poněvadž by to vedlo k život ohrožujícímu krvácení.
Za účelem snížení intravaskulámí tvorby krevních sraženin se odborníci snaží vyvinout účinný inhibitor prothrombinázy nebo faktoru Xa, který je zabudován do prothrombinázového komplexu, kde aktivuje thrombin během tvorby sraženiny.
Vhodné koncentrace inhibitoru faktoru Xa by zvyšovaly hladinu protějšků vytvářejících prothrombinázu, nutných k vyvolání srážení, avšak zbytečně by neprodlužovaly proces srážení, jakmile by bylo dosaženo prahové koncentrace thrombinu. Navzdory dlouhodobě uznávané potřebě takového inhibitoru však dosud není v klinickém použití žádný účinný specifický inhibitor faktoru Xa.
V mnohých klinických aplikacích existuje značná potřeba antikoagulačního ošetření. V současnosti dostupná léčiva nejsou v mnoha konkrétních klinických aplikacích uspokojivá. Například u téměř 50 % pacientů, kteří podstupují totální náhradu kyčelního kloubu, se vyvíjí trombóza hlubokých žil (DVT). V současnosti schválené terapie zahrnují pevné dávky nízkomolekulámího heparinu (LMWH) a proměnné dávky heparinu. I při tomto léčebném režimu se u 10 až 20 % pacientů vyvine DVT a u 5 až 10 % krvácivé komplikace.
Další klinická situace, v níž jsou potřebné lepší antikoagulanty, se týká subjektů, podstupujících transluminální koronární angioplastii a jsoucích v nebezpečí infarktu myokardu nebo trpících stupňující se angínou. Současná běžně uznávaná terapie, která spočívá v podávání heparinu a aspirinu, je spojena se 6 až 8 % případů uzavření přerušené cévy do 24 h po zákroku. Podíl krvácivých komplikací, vyžadujících transfúzní terapii v důsledku podávání heparinu, je tedy přibližně 7 %. Navíc, i když je odklad uzavření významný, podávání heparinu po skončení léčebné procedury má malý význam a může být škodlixé.
Nejběžněji používanými inhibitory srážení krve jsou heparin a příbuzné sulfatované polysacharidy. LMWH a heparinsulfát. Tyto molekuly vykonávají své protisrážlivé účinky podporováním vazby přírodního regulátoru procesu srážení, antithrombinu ΙΠ, na thrombin a na faktor Xa. Inhibiční aktivita heparinu je primárně zaměřena na thrombin, který je inaktivován přibližně lOOkrát rychleji než faktor Xa. Heparinsulfát a LMWH, přestože jsou heparinu příbuzné, jsou poněkud účinnějšími inhibitory Xa než thrombinu; rozdíly in vitro jsou mírné (3 až 30násobek) a účinky in vivo mohou být bezvýznamné. Dalšími v současné době klinicky zkoušenými antikoagulanty specifickými pro thrombin jsou hirudin a hirulog. Tyto antikoagulanty, které inhibuji thrombin, jsou však rovněž spojeny s krvácivými komplikacemi.
Preklinické studie na paviánech a psech prokázaly, že specifické inhibitory faktoru Xa zabraňují tvorbě sraženiny, aniž by vyvolávaly krvácivé vedlejší účinky, pozorované u přímých inhibitorů thrombinu. Takové inhibitory faktoru Xa zahrnují například 2,7-bis-(4-amidinobenzyliden)cykloheptanon a Na-tosylglycyl-3-amidinofenylalaninmethylester („TENSTOP“), které mají účinné inhibiční koncentrace (Κ;) asi 20 nM, resp. 800 nM. Představitelem skupiny inhibitorů
-1 CZ 296439 B6 faktoru Xa je rovněž kyselina (+)-(2S)-2-(4-((3S)-l-acetimidoyl-3-pynOlidinyl)oxy)fenyl)-3(7-amidino-2-naftyl)propanová (Katakura a d., Biochem. Biophys. Res. Comm. 197:965-972 (1993)). Tyto sloučeniny však dosud nebyly vyvíjeny klinicky.
Byly rovněž identifikovány specifické bílkovinné inhibitory faktoru Xa, které zahrnují například antistasin („ATS“) a klíštěcí antikoagulační Haementerin officinalis, obsahuje 119 aminokyselin a má K; pro faktor Xa 0,05 nM. Tap, který se izoluje z klíštěte Ornithodoros moubata, obsahuje 60 aminokyselin a má K; pro faktor Xa asi 0,5 nM.
Účinnost rekombinačně získaného ATS a TAP byla zkoumána v různých systémech na zvířecích modelech. Oba inhibitory snižují dobu krvácení v porovnání s jinými antikoagulanty a zabraňují srážení v modelu thromboplastinem indukované trombózy hluboké žíly s podvázanou jugulámí žílou. Výsledky získané v tomto modelu korelují s výsledky dosahovanými s obvykle doporučovaným léčivem heparinem.
Bylo zjištěno, že subkutánní ATS představuje účinnou léčbu i v thromboplastinem indukovaném modelu roztroušené intravaskulámí koagulace (DIC). TAP účinně zabraňuje arteriální trombóze „vysokého střihu“ a „sníženému průtoku“, vyvolanému chirurgickým vložením polyesterového („DACRON“) štěpu, v míře, která způsobuje klinicky přijatelné prodloužení doby aktivovaného částečného thromboplastinu (aPTT), tj. menší než asi dvojnásobné prodloužení. Pro srovnání heparin jako standard nezabraňoval trombóze a sníženému průtoku ve štěpu ani při pětinásobném zvýšení aPTT. Zjišťování aPTT je klinická zkouška koagulace, zvlášť citlivá vůči inhibitorům thrombinu.
ATS a TAP nebyly vyvíjeny klinicky. Jednou z velkých nevýhod těchto dvou inhibitorů je, že nutné opakované dávky způsobují tvórbu neutralizujících protilátek, což limituje jejich potenciální klinické použití. Velikost TAP a ATS navíc znemožňuje jejich orální aplikaci, což dále snižuje počet pacientů, kteří by mohli mít z těchto prostředků prospěch.
Specifický inhibitor faktoru Xa by měl podstatný význam v praktické medicíně. Inhibitor faktoru Xa by byl účinný zejména za okolností, za nichž jsou v současnosti doporučovaná léčiva, tj. heparin a příbuzné sulfatované polysacharidy, neúčinné nebo účinné pouze okrajově. Existuje tedy potřeba nalézt nízkomolekulámí inhibitor srážení krve, specifický pro faktor Xa, který je účinný, ale nezpůsobuje nežádoucí vedlejší účiny. Vynález uspokojuje tuto potřebu a poskytuje rovněž související výhody.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je peptid, specificky inhibující aktivitu faktoru Xa, obecného vzorce
Ai—A2—A3—B, kde
A! je zbytek Tyr, F(pNH2), mAph, pAph nebo Nal(2), které obsahují žádnou nebo jednu chránící skupinu aminoskupiny,
A2 je zbytek Ile nebo Chg,
A3 je zbytek Arg, PalMe(3), Dab(N7-C3H7N), Dap(Np-C3H7N) nebo Om(N8-C3H7N) a
B je zbytek -Η, -OH, -NH2, jeden až pět aminokyselinových zbytků nebo chránící skupina karboxylu, přičemž Tyr je tyrosin, F(pNH2 je p-aminofenylalanin, mAph je m-amidinofenylalanin, pAph je p-amidinofenylalanin, Nal(2) je 2-naftylalanin, Ile je izoleucin, Chg je cyklohexylglycin, Arg je arginin, PalMe(3) je (3-(3-N-methylpyridinium)-alanm, DapfbT-CjHvN) je dimethyl 2,3-di
-2CZ 296439 B6 aminopropionové kyseliny, Dab(Np-C3H7N) je dimethylamidinium 2,4-diaminomáselné kyseliny a Om(N5-C3H7N) je dimethylamidinium omithinu, včetně jeho farmaceuticky přijatelných solí.
Sloučeniny podle vynálezu vykazují specifickou inhibici aktivity faktoru Xa s hodnotou Kj < 100 μΜ, přednostně Kj < 2 nM, a v podstatě neinhibují aktivitu jiných proteáz, účastnících se koagulační kaskády. Konkrétní příklady takových peptidů zahrnují Ac-Tyr-He-Arg-LeuAla-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-IleArg-N(CH3)O(CH3); Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyl); Ac-Tyr-fie-Dab(l^-C3H7N)-LeuAla-NH2; Ac-Tyr-fie-PalMe(3)-NH2; Tyr-Ile-Arg-NH2; (D)-Tyr-ne-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2; cyklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa-(iBu)TyrChg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-ProNH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; a jejich farmaceuticky přijatelné soli a C-terminální deriváty, jako jsou amidy, estery, alkoholy a aldehydy (viz rovněž tabulka 5). Vynález rovněž zahrnuje farmaceutické přípravky, obsahující peptid podle vynálezu, a jejich použití pro specifickou inhibici aktivity faktoru Xa, jakož i použití peptidu podle vynálezu jako antikoagulancia.
Koagulace krve je komplexní proces, zahrnující progresivně se zvětšující řadu reakcí aktivace enzymů, při nichž jsou plazmové zymogeny postupně aktivovány omezenou proteolýzou. Mechanisticky se koagulační kaskáda dělí na vnitřní a vnější dráhu, které se sbližují při aktivaci faktoru Xa; následná tvorba thrombinu probíhá po jedné společné dráze (viz obr. 1).
Současné důkazy naznačují, že vnitřní dráha hraje významnou roli při udržování a růstu tvorby fibrinu, zatímco vnější dráha je kritická v iniciační fázi krevní koagulace. Obecně se uznává, že koagulace krve je fyzicky iniciována při vzniku komplexu tkáňový faktor/faktor Vila. Jakmile se vytvoří tento komplex, rychle iniciuje koagulaci'aktivací faktorů IX a X. Nově vytvořený faktor Xa pak vytvoří komplex 1:1 s faktorem Va a fošfolipidy za vzniku prothrombinázového komplexu, který je odpovědný za přeměnu rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin. S postupem času je aktivita komplexu faktor VHa/tkáňový faktor (vnější dráha) potlačována inhibičním proteinem proteázy Kunutzova typu TFPI, který v komplexu s faktorem Xa může přímo inhibovat proteolytickou aktivitu faktoru Vlla/tkáňového faktoru. Za účelem zachování procesu koagulace v přítomnosti inhibovaného vnějšího systému je produkován další faktor Xa prostřednictvím aktivity vnitřní dráhy zprostředkované thrombinem. Thrombin tak hraje dvojí katalytickou roli, protože zprostředkovává svou vlastní produkci a přeměnu fibrinogenu na fibrin.
Autokatalytický charakter tvorby thrombinu je významnou pojistkou proti nekontrolovanému krvácení a zajišťuje, že je-li přítomna daná prahová hladina prothrombinázy, proběhne koagulace krve úplně, a tak dojde například ke skončení krvácení. Je tedy velmi žádoucí vyvinout prostředky, které by inhibovaly koagulaci, aniž by přímo inhibovaly thrombin.
Výhodné provedení vynálezu lze s použitím jednopísmenných symbolů aminokyselin označit jako peptidy YIR, což jsou sloučeniny, které inhibují aktivitu faktoru Xa, avšak v podstatě neinhibují aktivitu jiných proteáz účastnících se dráhy koagulace krve. Zde používaný výraz „sloučenina“ nebo „peptid YIR“ se vztahuje na peptid Tyr-Ile-Arg (YIR) nevyskytující se v přírodě a jeho analogy a mimetika, které mohou inhibovat aktivitu faktoru Xa. Sekvence YIR sama o sobě se zde označuje jako „jednotka YIR“ a je tvořena tripeptidem tyrosin-izoleucin-arginin nebo jeho funkčním ekvivalentem, jako je pAph-Chg-PalMe(3), pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 a pAphChg-AMP(4) (zkratky viz tabulka 1). Tyto sloučeniny podle vynálezu obsahují alespoň jednu jednotku YIR nebo její funkční ekvivalent a jsou schopny specificky inhibovat aktivitu faktoru Xa. Pro jednoduchost se zde obecně používají výrazy „sloučenina“ a „peptid YIR“ k označení peptidů podle vynálezu včetně funkčních ekvivalentů, jako jsou analogy peptidů, mimetika peptidů a syntetické organické sloučeniny. Funkční ekvivalent peptidu YIR podle vynálezu může být částečně charakterizován zde popsanou strukturou a hodnotou K; < 100 μΜ pro inhibici aktivity faktoru Xa (viz příklad XXXVII).
-3CZ 296439 B6
Peptidické analogy peptidu YIR podle vynálezu zahrnují například peptidy obsahující aminokyseliny nevyskytující se v přírodě nebo chemicky modifikované aminokyseliny, pokud si taková sloučenina uchovává inhibiční aktivitu pro faktor Xa (viz například tabulka 2). Podobně mimetika peptidů jsou neaminokyselinové chemické struktury, které napodobují strukturu peptidu YIR podle vynálezu a uchovávají si inhibiční aktivitu vůči faktoru Xa. Taková mimetika jsou obecně charakterizována podobnou fyzikální charakteristikou, jako je velikost, náboj nebo hydrofobicita, která je přítomna v odpovídající prostorové orientaci, jako má normální odpovídající peptid YIR. Konkrétním příkladem peptidového mimetika je sloučenina, v níž je amidická vazba mezi jednou nebo několika aminokyselinami nahrazena například vazbou uhlík-uhlík nebo jinou známou vazbou (viz například Sawyer, v Peptide Based Drug Design, str. 387-422 (ACS, Washington DC, 1995), zde zahrnuto jako odkaz).
Výraz „aminokyselina“ se zde používá v nej širším smyslu, zahrnujícím dvacet přírodních aminokyselin, které jsou překládány z genetického kódu a tvoří stavební bloky bílkovin a zahrnují, není-li konkrétně uvedeno jinak, L- a D- aminokyseliny a chemicky modifikované aminokyseliny, jako jsou analogy aminokyselin, přírodní aminokyseliny, které se obvykle nezabudovávají do bílkovin, jako je norleucin, a chemicky syntetizované sloučeniny s vlastnostmi, o nichž je známo,
| že jsou charakteristické pro aminokyselinu. V definici „aminokyseliny“ jsou například zahrnuty analogy nebo mimetika fenylalaninu nebo prolinu, které umožňují stejné konformační omezení peptidických sloučenin jako přírodní Phe nebo Pro a jsou odborníkům známé. Takovéto analogy a mimetika se zde označují jako „funkční ekvivalenty“ aminokyseliny. Další příklady aminokyselin a jejich analogů je možno nalézt v Roberts a Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, ed. Gross a Meienhofer, sv. 5, str. 341, Academie Press, lne., N.Y., 1983 (zahrnuto zde jako odkaz). Zkratky aminokyselin a jejich analogů a struktury mimetik jsou uvedeny v tabulce 1. | ||
| Tabulka 1 Zkratky používané v popisu | ||
| sloučenina | zkratka # 1 | zkratka # 2* |
| acetyl | Ac | |
| alanin | Ala | A |
| 3-(2-thiazolyl)-L-alanin | Tza | |
| allyloxykarbonyl | alloe | |
| amidin | AMDN | |
| amidoxim (C(NH2)=N-OH) | (CNOH.NH2) | |
| (N-methylpyridinium)methyl | AMP | |
| (4-(N-methylpyridinium))methyl | AMP (4) | |
| l-(N-methylpyridinium)eth-l-yl | AEMP | |
| 1 -(4-(N-methylpyridinium)eth-1 —y 1 | AEMP (4) | |
| arginin | Arg | R |
| asparagin | Asn | N |
| kyselina asparagová | Asp | D |
| benzoyl | Bz | |
| 2-benzofurankarboxy | Bzf | |
| benzyl | Bzl | |
| benzyloxykarbonyl | Cbz | |
| 5-benzimidazolkarboxy | 5-Bzim | |
| t-butyloxykarbonyl | Boc | |
| benzotriazol-l-yloxytrís-(dimethyl- | ||
| amino)-fosfoniumhexa-fluorofosfát | Bop | |
| β-alanin | βΑΝ | |
| β-valin | βνηΐ | |
| β-(2-pyridyl)-alanin | Pal (2) | |
| β-(3-ρ)τ^1)-3Νηίη | Pal (3) |
-4CZ 296439 B6 β-(4—pyridyl)-alanin p-(3-N-methylpyridinium)-alanin brom-trispyrrolidinofosfoniumhexafluorofosfát penicillamin t-butyl t-butyloxykarbonyl kyselina caffeová karbonyldiimidazol cystein 5-chlorindol-2-karboxy cyklohexyl cyklohexylalanin cyklohexylglycin kyselina 2,4-diaminomáselná dimethylamidinium od Dab kyselina 2,3-diaminopropionová dimethylamidinium od Dap
3.5- dinitrotyrosin
3.5- dijodtyrosin
3.5- dibromtyrosin N,N-diizobutylkarboxamid N,N-diizopropylkarboxamid
4- N,N-dimethylaminopyridin 9-fluorenylmethyloxykarbonyl
5- fluorindol-2-karboxy formyl glutamin kyselina glutamová kyselina γ-karboxyglutamová glycin histidin homoarginin 5-hydroxyindol-2-karboxy N-hydroxybenzotriazol 3-hydroxyprolin kyselina iminodioctová 5-aminoindol-2-karboxy 5-nitroindol-2-karboxy DL-indolin-2-karboxy izobutyl izoleucin kyselina izonikotinová kyselina N-methylizonikotinová kyselina izonipekotová izopropanol
-izochinolinkarboxy 3-izochinolinkarboxy leucin íerc-leucin lysin kyselina merkapto-P,P-cyklopentamethylenpropionová kyselina merkaptooctová
Pal (4)
PalMe (3)
| PyBroP | |
| Pen | |
| tBu. But | |
| Boc | |
| Caff | |
| CDI | |
| Cys | C |
| CICÁ | |
| Chx | |
| Cha | |
| Chg | |
| Dab | |
| Dab (X-C3H7N) | |
| Dap | |
| Dap(Np-C3H7N) | |
| Tyr(3,5-NO2) | Y(3,5-NO2) |
| Tyr (3,5-1) | Y (3,5-1) |
| Tyr (3,5-Br) | Y (3,5-Br) |
| DIBA | |
| DIPA | |
| DMAP | |
| Fmoc | |
| FICA | |
| For | |
| Gin | Q |
| Glu | E |
| Gla | |
| Gly | G |
| His | H |
| hArg | hR |
| 5-Hic | |
| HOBt | |
| Hyp | |
| Ida | |
| 5AM2IN | |
| 5NOINDC | |
| 2INCA | |
| iBu | |
| Ile | I |
| Isn | |
| IsnMe | |
| In | |
| iPrOH | |
| 1-Iqc | |
| 3-Iqc | |
| Leu | L |
| Tle | |
| Lys | K |
Mpp
Mpa
-5CZ 296439 B6
| kyselina merkaptopropionová methanol | Mpr MeOH | |
| methionin | Met | M |
| 4—morfolinokarbonylamid | MORA | |
| N-methylmorfolin | NMM | |
| 1-nafiylalanin | Nal(l) | |
| 2-nafitylalanin | Nal (2) | |
| kyselina nikotinová | Nic | |
| kyselina nipekotová | Npa | |
| kyselina N-methylnikotinová | NicMe | |
| norarginin | nArg | nR |
| norleucin | Nle | nL |
| norvalin | Nva | nV |
| omithin | Om | |
| dimethylamidinium od omithinu | Om (N8-C3H7N) | |
| fenyl | Ph | |
| fenylalanin | Phe | F |
| p-guanidinofenylalamn | Phe (Gua) | F (pGua) |
| p-aminofenylalanin | Phe (NH2) | F(pNH2) |
| p-chlorfenylalanin | Phe (Cl) | F(pCl) |
| p-fluorfenylalanin | Phe (F) | F(pF) |
| p-nitrofenylalanin | Phe (NO2) | F(pNO2) |
| p-hydroxyfenylglycin | Pgl (OH) | |
| p-toluensulfonyl | Tos | |
| 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6- | ||
| -sulfonyl | Pmc | |
| m-amidinofenylalanin | mAph | |
| p-amidinofenylalanin | pAph | |
| fenylglycin | Pgl | |
| kyselina fenylmalonová | Pma | |
| piperidinyl | PIP | |
| 1 -piperidinokarbonylamid | PÍPA | |
| kyselina L-pipekolonová | Píp | |
| prolin | Pro | P |
| 2-pyrazinkarboxy | Pza | |
| 2-chinolinkarboxy | 2-Qca | |
| 4—chinolinkarboxy | 4—Qca | |
| sarkosin | Sar | |
| S-terc.butyl | SBut | |
| linker SCAL napojený na | ||
| „TENTAGEL“ | SCAL-TG | |
| serin | Ser | S |
| tetrahydroízochinolin-3-karboxyl | Tic | |
| threonin | Thr | T |
| trifluoracetyl | Tfa | |
| tryptofan | Trp | w |
| tyrosin | Tyr | Y |
| 3-jodtyrosin | Tyr (3-1) | Y(3-I) |
| O-methyltyrosin | Tyr (Me) | Y (Me) |
| valin | Val | V |
* Aminokyseliny konfigurace D jsou označeny buď prefixem D- s použitím třípísmenného kódu (například D-Ala, D-Cys, D-Asp, D-Trp), nebo malými písmeny pomocí jednopísmenného kódu (a, c, d, w)
-6CZ 296439 B6
Výraz „aktivita faktoru Xa“ se zde vztahuje na schopnost faktoru Xa, samotného nebo v souhrnu podjednotek známých jako prothrombinázový komplex, kataiyzovat přeměnu prothrombinu na thrombin. Výraz „inhibice“ ve spojitosti s aktivitou faktoru Xa zahrnuje jak přímou, tak nepřímou inhibici aktivity faktoru Xa. Přímé inhibice aktivity faktoru Xa je možno dosáhnout například vazbou peptidu YIR podle vynálezu na faktor Xa nebo na prothrombinázu za účelem zamezení vazby prothrombinu na aktivní místo prothrombinázového komplexu. Nepřímou inhibici aktivity faktoru Xa je možno provádět například vazbou sloučeniny podle vynálezu na rozpustný faktor Xa, aby se zabránilo jeho zabudování do prothrombinázového komplexu.
Výraz „specifická“, používaný zde s odkazem na inhibici aktivity faktoru Xa, znamená, že peptid YIR může inhibovat aktivitu faktoru Xa bez podstatné inhibice aktivity jiných specifikovaných proteáz, včetně plazminu a thrombinu (s použitím stejné koncentrace inhibitoru). Tyto proteázy se účastní kaskády koagulace krve a fibrinolýzy (viz tabulka 2 a dále příklad XXVII).
Tabulka 2 Inhibiční aktivita vybraných sloučenin proti pěti enzymům
Kj(pM)
| sloučenina | Xa | thrombin | plazmin | trypsin | elastáza |
| Ac-Y-I-R-L-A-A-F-T | 1,5 | 100 | NT | >200* | >100 |
| Ac-Y-I-R-L-P | 0,5 | >200 | >200 | >200 | > 100 |
| y-I-R-L-P | 0,2 | >200 | >200 | >200 | >100 |
| Ac-(iBu)Y-I-R-L-P | 0,04 | 25 | >200 | NT | > 100 |
| „TENSTOP“ | 2 | 2 | >200 | NT | >200 |
označuje, že nedošlo k významné inhibici aktivity enzymu při nejvyšší (uvedené) testované koncentraci sloučeniny
Výsledky uvedené v tabulce 2 demonstrují, že peptidy YIR podle vynálezu jsou použitelné jako inhibitory faktoru Xa, avšak podstatně neinhibují aktivitu jiných šeřinových proteáz, jako je thrombin nebo plazmin, které se účastní procesu koagulace krve a fibrinolýzy.
Výraz „substituent“ se zde vztahuje na kteroukoli z různých chemických skupin, která je substituována na peptidický řetězec nebo na postranní řetězec peptidu, analogu peptidu, mimetika nebo organické sloučeniny podle vynálezu. Substituent může zahrnovat kteroukoli z různých jednotek, známých odborníkům (viz například Giannis a Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:12441267 (1993), zde zahrnuto jako odkaz). Jsou zde uvedeny četné příklady, demonstrující substituci různými substituenty, například substituci fenylalaninu substituentem pNH2 za vzniku F(pNH2) a substituci tyrosinu halogenem za vzniku například Y(3—I) nebo Y(3,5-I). Substituentem může být dále například heteroatom, jako je dusík (N; viz například Pal), kyslík (O; viz například Omethyltyrosin) nebo síra (S; viz například Tyr(SO3H)), který může být substituován substituentem. Za „substituent“ se tedy zde považuje i jednotka obsahující dusík, síru nebo kyslík, jako je skupina -SO3H. Substituentem může být dále chrániči skupina aminoskupiny nebo karboxyskupiny.
Konkrétními substituenty mohou být například alkylové skupiny s 1 až 13 uhlíkovými atomy. Příkladem tedy může být methyl, ethyl, n-propyl, izopropyl, sec-butyl, 1-methylbutyl, 2,2—dimethylbutyl, 2-methylpentyl, 2,2-dimethylpropyl, n-pentyl a n-hexyl. Dále je nutno vzít v úvahu, že alkyl podle vynálezu může být substituován substituentem. Podobně může být substituentem acyl, který zahrnuje nasycené nebo nenasycené lineární, rozvětvené nebo cyklické řetězce s asi 1 až 13 uhlíkovými atomy, které obsahují karboxylovou skupinu. Výraz „acyl“ tedy zahrnuje například skupiny, jako je formyl, acetyl, benzoyl apod.
Je-li substituentem aryl, vztahuje se tento výraz na aromatické skupiny s asi 5 až 13 uhlíkovými atomy a alespoň jednou „kruhovou“ skupinou s konjugovaným π-elektronovým systémem. Příklady aiylových skupin zahrnují například heterocyklické arylové skupiny, biarylové skupiny a jejich analogy a deriváty, z nichž všechny mohou být popřípadě substituovány jedním nebo něko lika substituenty. Výraz „arylalkyl“ označuje alkyl podle výše uvedené definice, substituovaný árylůVou skupinou. Vhodné arylalkylové skupiny zahrnují benzyl, pikolyl apod., z nichž všechny mohou být popřípadě substituovány.
Možnými substituenty jsou rovněž heteroalkyl, heteroarylalkyl a heteroaryl, které označují alkyl, resp. arylalkyl, resp. aryl, který je substituován jedním nebo několika heteroatomy, jako je atom dusíku, kyslíku nebo síry. Dále se používá výraz „heterocyklický“ k označení cyklické alkylové nebo arylové skupiny, která je substituována jedním nebo několika heteroatomy. Různé příklady heteroalkylů, heteroarylaikylů, heteroarylů a heterocyklů jsou uvedeny například v tabulkách 1 a 3 a jsou jinak známy.
Peptidy podle vynálezu mohou být na N-konci nebo C-konci modifikovány s použitím chránící skupiny pro aminoskupinu, resp. pro karboxyskupinu. Jsou zde uvedeny různé takovéto modifikace (viz například tabulka 3). N-konec peptidu nebo analogu peptidu může být modifikován tak, že N-terminální aminoskupina je substituována například acetylem, cyklopentylkarboxyskupinou, izochinolylkarboxyskupinou, furoylem, tosylem, pyrazinkarboxyskupinou nebo jinou takovouto skupinou, která může být, jak výše uvedeno, substituována substituentem. N-terminální aminoskupina může být rovněž substituována například obrácenou amidickou vazbou. Je nutno vzít v úvahu, že výraz „aminoskupina“ je zde používán v širokém smyslu, zahrnujícím jakoukoli volnou aminoskupinu, včetně primárních, sekundárních nebo terciárních aminoskupin, přítomnou v peptidu. Naproti tomu výraz „N-konec“ se vztahuje na α-aminoskupinu první aminokyseliny přítomné v peptidu, zapsaném konvenčním způsobem.
N-konec peptidu podle vynálezu může být chráněn navázáním amino-chránicí skupiny. Výraz „amino-chránicí skupina“ se zde používá v širokém smyslu a vztahuje se na chemickou skupinu, která může reagovat s volnou aminoskupinou včetně například a-aminoskupiny přítomné na N-konci peptidu podle vynálezu. Tím, že sní zreaguje, chrání amino-chránicí skupina jinak reaktivní aminoskupinu před nežádoucími reakcemi, ke kterým může docházet například během syntetického postupu nebo v důsledku exopeptidázové aktivity vůči konečné sloučenině. Modifikací aminoskupiny je možno rovněž dosáhnout dalších výhod, například zvýšení rozpustnosti nebo aktivity sloučeniny. Různé amino-chránicí skupiny jsou zde uvedeny (viz tabulka 3) nebo jinak známy a zahrnují například acylové skupiny, jako je acetyl, pikolyl, /erc-butylacetyl, tercbutyloxykarbonyl, benzyloxykarbonyl, benzoylové skupiny, například benzyloxim, jako je 2aryl-2-O-benzyloxim (viz příklad XVI), a rovněž aminoacylový zbytek, který sám může být modifikován amino-chránicí skupinou. Další amino-chránicí skupiny jsou popsány například v The Peptides, ed. Gross a Meienhofer, sv. 3 (Academie Press, lne., N. Y. 1981), a Greene a Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vyd., str. 309—405 (John Wiley & Sons, New York (1991), oboje zde zahrnuto jako odkaz). Produkt jakékoli takovéto modifikace N-terminální aminoskupiny peptidu nebo analogu peptidu podle vynálezu se zde označuje jako „N-terminální derivát“.
Podobně může být karboxyskupina, například karboxyskupina přítomná na C-konci peptidu, chemicky modifikována s použitím karboxy-chránicí skupiny. Výrazy „karboxyskupina“ a „Ckonec“ se zde používají způsobem konzistentním s výše uvedenými výrazy „aminoskupina“ a „N-konec“. Karboxyskupina, například přítomná na C-konci peptidu, může být modifikována redukcí C-terminální karboxyskupiny na alkohol nebo aldehyd nebo vytvořením orálního esteru nebo substitucí karboxyskupiny substituentem, jako je thiazolyl, cyklohexyl nebo jiná skupina. Orální estery jsou známy a zahrnují například alkoxymethylové skupiny, jako je methoxymethyl, ethoxymethyl, izopropoxymethyl apod., a-(Ci až C4)alkoxyethylové skupiny, jako je methoxyethyl, ethoxyethyl, propoxyethyl, izopropoxyethyl apod., 2-oxo-l,3-dioxolen-4-ylmethylové skupiny, jako je 5-methyl-2-oxo-l ,3-dioxolen—4-ylmethyl, 5-fenyl-2-oxo-l ,3-dioxolen—4—ylmethyl apod., Ci až C3 alkylthiomethylové skupiny, jako je methylthiomethyl, ethylthiomethyl, izopropylthiomethyl apod., acyloxymethylové skupiny, jako je pivaloyloxymethyl, a-acetoxymethyl apod., ethoxykarbonyl-l-methylovou skupinu, α-acyloxy-a-substituované methylové
-8CZ 296439 B6 skupiny, jako je α-acetoxyethyl, 3-ftalidylové nebo 5,6-dimethylftalidylové skupiny, 1-(C[ až C4 alkoxykarbonyloxy)eth-l-ylové skupiny, jako je l-(ethoxykarbonyloxy)eth-l-ylová skupina, a 1-(Ci až C4 alkylaminokarbonyloxy)eth-l-ylové skupiny, jako je l-(methylaminokarbonyloxy)eth-l-ylová skupina.
Peptid podle vynálezu může být modifikován navázáním karboxy-chránicí skupiny. Karboxychránicí skupiny jsou známy a tím, že jsou navázány na peptid, chrání karboxyskupinu před nežádoucími reakcemi (viz například výše citování Greene a Wuts, str. 224-276 (1991), zde zahrnuto jako odkaz). Odborníkovi je zřejmé, že výše popsané modifikace, které je možno provádět na N-terminální aminoskupině nebo na C-terminální karboxyskupině peptidu, mohou být podobně provedeny na kterékoli přítomné reaktivní aminoskupině nebo karboxyskupině, například na postranním řetězci aminokyseliny nebo analogu aminokyseliny v peptidu podle vynálezu. Metody provádění těchto modifikací jsou zde uvedeny nebojsou známy.
Chrániči skupina aminoskupiny je výhodně vybrána ze souboru zahrnujícího formyl, acetyl, pikolyl, terc-butylacetyl, fórc-butyloxykarbonyl, benzyloxykarbonyl, 2-aryl-2-0-benzyloxim, aminoacyl, benzoyl, tosyl, 3-fenoxypropionyl, 5-benzimidazolkarboxy, skupinu vzorce CC1F2co, cf2h-co, cf3-cf2co, ch3-chci-co, ch3-o-co, ch3-so2, ch3ch2-o-co, C12CHCO, C1CH2CO, (pOH)C6H4-CH2CH(OH)-CO, (pOH)C6H4-CH2CHOH-CO, (pOHjC^OCH(CH3)CO, (pOH)C6H4-OCH2CO, 4-MeO-C6H4-CO, N-morfolinyl-CO, PhC(NOCH2Ph)CO, Ph-CH=CH-CO, Ph-CH2CH2CH2-CO, Ph-CH2CH2CO, trifluoracetyl, nebo se jedná o substituci N-terminální aminoskupiny skupinou cyklopentylkarboxy, izochinolylkarboxy nebo pyrazinkarboxy.
Přednostně je chránící skupina aminoskupiny vybrána ze souboru zahrnujícího methyl, ethyl, n-propyl, izopropyl, sek-butyl, 1-methylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2-methylpentyl, 2,2-dimethylpropyl, n-pentyl, n-hexyl, cyklopentyl, cyklohexyl, methyl-cyklohexyl a cyklopropylmethylen, formyl, acetyl, benzoyl, benzyl, pikolyl.
Farmaceuticky přijatelná sůl sloučeniny podle vynálezu je s výhodou vybrána ze souboru zahrnujícího anorganický nitrát, sulfát, acetát, malát, formiát, laktát, tartrát, sukcinát, citrát a p-toluensulfonát.
Význam symbolu B je výhodně vybrán ze souboru zahrnujícího alkoxymethylové skupiny, a-(Ci-C4)alkoxyethylové skupiny, 2-oxo-l,3-dioxolen-4-ylmethylové skupiny, Ci-C3alkylthiomethylové skupiny, acyloxymethylové skupiny, α-acyloxy-a-substituované methylové skupiny, l-(Ci-C4alkyloxykarbonyloxy)eth-l-ylové skupiny a l-(Ci-C4alkylaminokarbonyloxy)eth-l-ylové skupiny.
Přednostně je význam B vybrán ze souboru zahrnujícího methoxymethyl, ethoxymethyl, izopropoxymethyl, methoxyethyl, ethoxyethyl, propoxyethyl, izopropoxyethyl, 5-methyl-2-oxo-l ,3dioxolen-4-ylmethyl, 5-fenyl-2-oxo-l,3-dioxolen-4—ylmethyl, methylthiomethyl, ethylthiomethyl, izopropylthiomethyl, pivaloyloxymethyl, α-acetoxymethyl, ethoxykarbonyl-l-methyl, a-acetoxyethyl, 3—ftalidyl, 5,6-dimethylftalidyl, l-(ethoxykarbonyloxy)eth-l-yl a l-(methylaminokarbonyloxy)eth-l-yl.
Konkrétní příklady sloučenin podle vynálezu zahrnují například Ac-Tyr-He-Arg-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-He-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(iBu)Tyr-ne-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3); Ac-Tyr-{T(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4pyridyl); Ac-Tyr-Ile-{T(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{T(CH2NH)}-Leu-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-{T(COCH2)}-Gly-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-DablN7C3H7N)-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-He-PalMe(3)-NH2; Tyr-De-Arg-NH2; D-Tyr-He-Arg-LeuPro-NH2; Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2; Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu
-9CZ 296439 B6
Pro-NH2;. Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 a Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2. Další peptidy YIR podle vynálezu jsou uvedeny například v tabulkách 3 a 5.
Příklady dalších sloučenin zahrnují Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac-pAph-ChgPalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2; AcpAph-Chg-PalMe(3)-NH2; cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 3-Iqc-pAph-ChgPalMe(3)-NH2; 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 5-Me-thienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)NH2; a Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol (viz rovněž tabulka 5).
Volba mezi přítomností L- nebo D-aminokyseliny ve sloučenině podle vynálezu může záviset zčásti na požadovaných vlastnostech peptidu. Například zabudování jedné nebo více D-aminokyselin může sloučenině dodávat zvýšenou stabilitu in vitro nebo in vivo. Zabudování jedné nebo několika D-aminokyselin může rovněž zvyšovat nebo snižovat farmakologickou účinnost této sloučeniny. V některých případech může být žádoucí umožnit sloučenině zůstat aktivní pouze po krátkou dobu. V takových případech může zabudování jedné nebo několika L-aminokyselin do sloučeniny umožnit endogenním peptidázám v organizmu strávit sloučeninu in vivo, a tak omezit vystavení organizmu působení aktivní sloučeniny. Zkušený odborník je schopen stanovit požadované vlastnosti sloučeniny podle vynálezu s ohledem například na věk a obecný zdravotní stav jedince.
Sloučeninu podle vynálezu je možno syntetizovat chemicky například s použitím automatického syntetizátoru (viz příklad I). Selektivní modifikací reaktivní skupiny, jako je skupina přítomná na postranním řetězci aminokyseliny nebo N-terminální nebo C-terminální reaktivní skupina peptidu, je možno dosáhnout požadovaných charakteristik sloučeniny podle vynálezu, jako je zvýšená rozpustnost nebo zvýšená inhibiční funkce.
Používají-li se metody syntézy v pevné fázi, může být chemické složení sloučeniny manipulováno, zatímco je vznikající peptid napojen na pryskyřici, nebo po odštěpení peptidu z pryskyřice za vzniku například N-terminálního derivátu, jako je sloučenina acetylovaná na N-konci. Podobné modifikace je možno provádět rovněž na karboxyskupině sloučeniny včetně C-terminální karboxyskupiny, která může být například'amidována. Odborník může rovněž syntetizovat peptid YIR podle vynálezu s použitím organické chemie v roztokové fázi. Syntetizovanou sloučeninu je možno čistit s použitím známých metod, jako je vysoceúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP-HPLC; viz příklad I) nebo jiné separační metody založené například na velikosti, náboji nebo hydrofobicitě sloučeniny. Podobně je možno použít známých metod, jako je sekvenční analýza aminokyselin nebo hmotová spektrometrie (MS), pro charakterizaci struktury sloučeniny podle vynálezu (viz příklad I).
Peptidy YIR podle vynálezu mohou být lineární nebo cyklické (viz například dále tabulka 3). Cyklizaci je možno provádět vytvořením můstku mezi dvěma nesousedními zbytky, jednotkami nebo substituenty, které mohou být uvnitř nebo vně jednotky YIR. Cyklizaci je možno rovněž provádět například vytvořením můstku mezi jedním ze zbytků v jednotce YIR a nesousedním zbytkem, jednotkou nebo substituentem vně sekvence YIR. Peptidy nebo peptidomimetika mohou být například cyklizovány prostřednictvím vazeb S-S, -CH2-S-, -CHr-O-CHr-, laktamových nebo esterových, jak již bylo popsáno (viz Hrubý, Life Sci. 31:189-199 (1982); Toniolo, Int. J. Pepi. Prot. Res. 35:287-300 (1990); Kates a d., Tetr. Letí. 34:1549-1552 (1993); všechny tyto publikace jsou zde zahrnuty jako odkaz).
Výraz „vně jednotky „AIR“ zde znamená nezahrnující tyrosinový, izoleucinový nebo argininový zbytek sekvence YIR nebo jeho ekvivalent přítomný v peptidu YIR podle vynálezu. Naproti tomu výraz „uvnitř jednotky „YIR“ znamená zahrnující alespoň jeden zbytek ze sekvence tyrosinu, izoleucinu a argininu YIR nebo jeho ekvivalent. Výraz „můstek“, vztahující se na cyklickou sloučeninu, znamená vazbu vytvořenou mezi dvěma nesousedními aminokyselinami přítomnými v peptidu YIR podle vynálezu.
-10CZ 296439 B6
Cyklizaci je možno provádět vytvořením například disulfidické vazby nebo laktamové vazby. Zbytky schopné vytvářet disulfídickou vazbu zahrnují například Cys, Pen, Mpr a Mpp a jejich ekvivalenty obsahující 2-amino-skupinu. Zbytky schopné tvořit laktamový můstek zahrnují například Asp, Glu, Lys, Om, kyselinu α,β-diamino-propionovou, kyselinu a-aminoadipovou, kyselinu α,γ-diamino-máselnou, kyselinu diaminooctovou, kyselinu aminobenzoovou a kyselinu merkaptobenzoovou. Sloučeniny podle vynálezu mohou být cyklizovány například přes laktamovou vazbu, která může využít skupinu postranního řetězce jednoho nesousedního zbytku k vytvoření kovalentní vazby k N-terminální aminoskupině Xj nebo Y. Alternativní můstkové struktury mohou být také použity pro cyklizaci sloučenin podle vynálezu včetně například peptidů a peptidomimetik, které mohou být cyklizovány prostřednictvím vazeb S-S, -CH2-S—CH2—O—CH2 —, laktamových, esterových nebo jiných (viz například výše Hrubý, 1982, Toniolo, 1990 a Kates a d., 1993).
Přípravek podle vynálezu může mít homogenní složení nebo může mít formu směsi sloučenin obsahujících různé kombinace substituentů. Flexibilita, kterou dovoluje výběr substituentů, umožňuje značnou kontrolu nad fyzikálně-chemickými vlastnostmi analogů peptidických sloučenin. Výběr substituentu ovlivňuje rovněž vazebnou afinitu sloučeniny (viz příklady).
Různé sloučeniny obsahující různé uspořádání substituentů vykazují různou úroveň inhibiční aktivity vůči faktoru Xa. Tyto sloučeniny byly syntetizovány postupy, popsanými v příkladech. Testování sloučenin na inhibiční aktivitu bylo prováděno pomocí testů popsaných v příkladech XXXVII a XXXVIU. S použitím těchto metod může zkušený odborník syntetizovat sloučeninu podle vynálezu včetně jejích modifikací a stanovit inhibiční aktivitu sloučeniny vůči faktoru Xa.
Vynález poskytuje sloučeniny, které specificky inhibují aktivitu faktoru Xa. Tyto sloučeniny mají pro aktivitu faktoru Xa hodnotu K, < μΜ, přednostně K; < 2 nM, a oproti inhibici faktoru Xa v podstatě neinhibují aktivitu jiných proteáz účastnících se koagulace a fibrinolýzy (viz výše tabulka 2). Mezi tyto další proteázy patří například thrombin a plazmin. Specificita sloučenin podle vynálezu je demonstrována dále v příkladu XXXVII (viz rovněž výše tabulka 2).
Sloučenina podle vynálezu může být výhodně používána jako antikoagulant, který je možno uvádět do styku s krevním vzorkem pro zamezení koagulace. Například je možno účinné množství sloučeniny podle vynálezu uvést do styku s čerstvě odebraným krevním vzorkem, aby se zabránilo jeho koagulaci. Výraz „účinné množství“ ve vztahu ke sloučenině podle vynálezu znamená množství sloučeniny, které inhibuje aktivitu faktoru Xa. Zkušenému odborníkovi je známo, že účinné množství sloučeniny podle vynálezu je možno stanovit pomocí metod zde popsaných (viz příklady XXXVII a XXXVUI) nebo jinak známých. Z hlediska popisované použitelnosti sloučeniny podle vynálezu je zkušenému odborníkovi rovněž zřejmé, že sloučeninou podle vynálezu je možno nahradit prostředek, jako je heparin. Takové použití sloučeniny podle vynálezu může například vést k úspoře nákladů ve srovnání s jinými antikoagulanty.
Sloučenina podle vynálezu může být dále podávána jedinci při ošetřování různých klinických stavů, zahrnujících například léčbu kardiovaskulární poruchy nebo komplikací spojených například s infekcí nebo chirurgickým zákrokem. Příklady kardiovaskulárních poruch jsou restenóza po angioplastii, syndrom respirační tísně u dospělých, selhání více orgánů, mrtvice a rozptýlené ucpávání cév intravaskulámí koagulací. Příklady příbuzných komplikací spojených s chirurgickým zákrokem zahrnují například trombózu hlubokých a proximálních žil, ke které může docházet po chirurgickém zákroku. Sloučenina podle vynálezu je tedy použitelná jako léčivo pro snížení nebo inhibici nežádoucí koagulace u jedince.
Jelikož peptid YIR podle vynálezu může inhibovat aktivitu faktoru Xa, může být tato sloučenina použitelná pro snižování nebo inhibici srážení krve u jedince. Výraz Jedinec“ zde zahrnuje obratlovce včetně savců, jako je člověk, u nichž se faktor Xa účastní srážecí kaskády.
-11 CZ 296439 B6
Srážení krve u jedince může být sníženo nebo inhibováno podáváním terapeuticky účinného množství peptidu YIR podle vynálezu. Výraz „terapeuticky účinné množství“ zde znamená dávku peptidu YIR, která musí být jedinci podávána, aby došlo k inhibici aktivity faktoru Xa. Konkrétněji řečeno, terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu inhibuje katalytickou aktivitu faktoru Xa buď přímo uvnitř prothrombinázového komplexu, nebo jako rozpustná podjednotka, nebo nepřímo inhibici zabudovávání faktoru Xa do prothrombinázového komplexu. Tyto sloučeniny mohou konkrétně inhibovat aktivitu faktoru Xa s hodnotou K, < 100 μΜ, přednostně Kj < 2 nM. Terapeuticky účinné množství je možno stanovit pomocí metod popsaných například v příkladech XXXVII a XXXVHI nebo jinak známých.
Při terapeutickém použití sloučenin podle vynálezu závisí konkrétní dávkování za účelem získání terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku podávaného jedinci na různých úvahách, zahrnujících například povahu a sílu onemocnění, rozvrh podávání a věk a tělesné charakteristiky jedince. Příslušné dávkování je možno stanovit pomocí známých klinických přístupů. Specifické inhíbice aktivity faktoru Xa je tedy možno podle vynálezu dosáhnout uvedením faktoru Xa do styku s léčivem obsahujícím sloučeninu podle vynálezu. Dále je možno sloučeniny podle vynálezu použít pro výrobu léčiv pro snižování nebo inhibici tvorby krevní sraženiny u jedince podáváním terapeuticky účinného množství sloučeniny podle vynálezu.
Sloučenina podle vynálezu se obecně jedinci podává jako přípravek obsahující sloučeninu a farmaceuticky přijatelný nosič. Výraz „farmaceuticky přijatelný nosič“ se vztahuje na médium nebo přípravek, který je pro jedince netoxický nebo má přijatelnou toxicitu podle stanovení pověřenou agenturou. Zde výraz farmaceuticky přijatelný nosič zahrnuje kterýkoli ze standardních farmaceutických nosičů, jako je fosfátem pufrovaný salinický roztok, voda, emulze, například olej ve vodě nebo voda v oleji, nebo kterýkoli z různých typů smáčecích prostředků. Vhodné farmaceutické nosiče a jejich formulace jsou popsány v Martin, Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 15. vyd., (Mack Publishing Co., Easton 1975), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz. Tyto přípravky obecně obsahují terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu spolu s vhodným množstvím nosiče tak, aby zahrnovaly příslušnou dávku pro podávání jedinci. Nárokované sloučeniny tedy mohou být použitelné jako léčiva pro inhibici aktivity faktoru Xa a srážení krve u jedince.
Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou rovněž zahrnovat další média, sloučeniny nebo modifikace sloučeniny inhibující faktor Xa, které zvyšují její farmakologické působení. Farmaceuticky přijatelné médium může například obsahovat adiční sůl s kyselinou, například sůl vytvořenou s anorganickou kyselinou, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná, kyselina sírová nebo kyselina chloristá, nebo s organickou kyselinou, jako je kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina maleinová, kyselina jablečná, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina jantarová nebo kyselina malonová. Další farmaceuticky přijatelné soli zahrnují například anorganický nitrát, sulfát, acetát, malát, formiát, laktát, tartrát, sukcinát, citrát, p-toluensulfonát apod., včetně, aniž by se na ně omezovaly, kationtů na bázi alkalických kovů a kovů alkalických zemin, jako je sodík, lithium, draslík, vápník nebo hořčík, a rovněž netoxické amonné, kvartemí amonné a aminové kationty, jako je amonium, methylamonium, dimethylamonium, trimethylamonium, tetramethylamonium, ethylamonium, triethylamonium a tetraethylamonium.
Příklady modifikací, které zvyšují farmakologické působení sloučeniny, zahrnují například esterifikaci, jako je tvorba Q až C6 alkylesterů, přednostně Ci až C4 alkylesterů, kde alkylová skupina má přímý nebo rozvětvený řetězec. Další přijatelné estery zahrnují například C5 až C7 cykloalkylestery a arylalkylestery, jako jsou benzylestery. Tyto estery mohou být připravovány ze sloučenin podle vynálezu běžnými metodami, známými voboru chemie peptidů.
Farmaceuticky přijatelné modifikace mohou dále zahrnovat například tvorbu amidů peptidů. Takovéto amidické modifikace, které mohou být prováděny na sloučeninách podle vynálezu, zahrnují například modifikace odvozené od amoniaku, primárních Cj až C6 dialkylaminů, kde
-12CZ 296439 B6 alkylové skupiny mají přímý nebo rozvětvený řetězec, nebo arylaminů s různými substitucemi.
V případě sekundárních aminů může mít amin rovněž formu 5- nebo óčlenného heterocyklu obsahujícího například dusíkový atom. Způsoby přípravy takovýchto amidů jsou známy.
V jiném provedení vynálezu může být peptid YIR použit při testu k identifikaci přítomnosti faktoru Xa nebo k izolaci faktoru Xa ve v podstatě čisté formě. Přednostně se sloučenina podle vynálezu značí například radioizotopem a značená sloučenina se detekuje rutinními metodami, používanými pro detekci konkrétní značky. Dále může být peptid YIR výhodně použit jakosonda k detekci umístění nebo velikosti aktivity faktoru Xaín vivo, in vitro nebo ex vivo.
Je pochopitelné, že do rozsahu vynálezu spadají modifikace, které podstatně neovlivňují aktivitu různých provedení vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález je blíže popsán v souvislosti s připojenými výkresy, které představují:
obr. 1 schematický diagram koagulační kaskády krve, obr. 2 příklad struktury sloučeniny podle vynálezu a obr. 3 schéma syntézy pro přípravu některých sloučenin podle vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je osvětlen na příkladech provedení, které jej však neomezují.
Příklad I
Postupy syntézy peptidů
Výchozí látky, použité při syntéze, byly získány od obchodníků s chemikáliemi, jako je Aldrich, Sigma, Fluka, Nova Biochem a Advance Chetech. Během syntézy těchto sloučenin byly funkční skupiny použitých derivátů aminokyselin chráněny blokujícími skupinami, aby se zabránilo vedlejším reakcím během kondenzačních stupňů. Příklady vhodných chráničích skupin a jejich použití je popsáno v The Peptides, viz výše, 1991, a ve sv. 9 Udenfried a Meienhofer, ed., 1987, zde zahrnuto jako odkaz.
K získání sloučenin podle vynálezu byla použita obecná syntéza peptidů v pevné fázi. Tyto metody jsou popsány například v Steward a Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco, 1969), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz.
Není-li uvedeno jinak, byly peptidy syntetizovány na polystyrénové pryskyřici, síťované 1 % divinylbenzenu. K pevnému nosiči byl navázán linker citlivý na kyseliny (Rink Linker; Rink, Tetr. Letí. 28:3787 (1987); Sieber, Tetr. Letí. 28:2107 (1987), přičemž tyto publikace jsou zde zahrnuty jako odkaz). Kondenzace se prováděla s použitím Ν,Ν'-diizopropylkarbodiimidu (DIC) v přítomnosti ekvivalentního množství HOBt. Všechny kondenzace se prováděly buď v N,Ndimethylformamidu (DMF), nebo ve směsi DMF - dichlormethan (1:1) po dobu 40 min při teplotě místnosti. Dokončení kondenzace bylo monitorováno ninhydrinovým testem.
Odštěpení skupiny Fmoc bylo prováděno s použitím 50% piperidinu v DMF po dobu 10 min. Množství uvolněného Fmoc bylo stanoveno z absorbance roztoku po odštěpení chránící skupiny při 300 nm, objemu promývacích roztoků a hmotnosti pryskyřice použité při syntéze. Druhá (dvojitá) kondenzace byla provedena, pokud byla kondenzace v prvním případě neúplná. Při každé kondenzaci byl použit tento cyklus:
-13CZ 296439 B6
| stupeň | působení | činidlo a rozpouštědlo |
| 1 | 1 g peptidu na pryskyřici | 10 ml DMF |
| 2 | 2,4násobný přebytek derivátu aminokyseliny | |
| 3 | 2,4 ekvivalentu | DIC |
| 4 | 2,4 ekvivalentu | HOBt |
| 5 | kondenzace po dobu 40 min | |
| 6 | promývání (3x8 ml) | DMF |
| 7 | ninhydrinový test | |
| 8 | sejmutí chránících skupin (10 min) piperidin/DMF | 8 ml 50% |
| 9 | promývání (6x8 ml) | DMF |
| 10 | promývání (2x8 ml) | dichlormethan (DCM) |
| 11 | ninhydrinový test | |
| 12 | opakování od stupně 2 |
Po dokončení syntézy peptidu na nosiči bylo provedeno konečné odštěpení Fmoc s následujícími normálními promývacími cykly a stanovením množství uvolněných skupin Fmoc. V některých případech byl N“-nechráněný peptid acetylován třepáním pryskyřice s 20násobným přebytkem směsi acetanhydridu a pyridinu (1:1) vDCM po dobu 15 min. Pryskyřice pak byla promývána postupně s DCM, DMF a DCM a pak sušena ve vakuu.
Pryskyřice s navázaným peptidem byla suspendována ve směsi činidla K (King a d., Int. J. Pept. Prot. Res. 36:255-266 (1990), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz) (5 ml/g pryskyřice s peptidem) po dobu 180 min při teplotě místnosti, pak byla směs po odštěpení přefiltrována vbezvodém diethyletheru a pevná sraženina byla izolována odstředěním a vysušena ve vakuu nad pevnými pecičkami KOH. Vysušený peptid byl podroben čištění pomocí HPLC s použitím příslušného gradientu 0,1% TFA ve vodě a acetonitrilu (ACN). Po shromáždění píku obsahujícího požadovaný syntetický produkt byl roztok peptidu lyofilizován a peptid byl podroben procesu identifikace, který zahrnovat elektrosprejovou MS a analýzu aminokyselin, za účelem potvrzení, že byla syntetizována správná sloučenina.
K čištění peptidu byl vzorek surového lyofilizovaného peptidu rozpuštěn ve směsi 0,1% vodné TFA s obsahem 10 až 50 % ACN. Roztok peptidu byl obvykle přefiltrován skrze injekční stříkačku napojenou na nylonový filtr „ACRODISC“ 13 0,45 pm (Gelman Sciences; Ann Arbor, MI). Příslušný objem přefiltrovaného roztoku peptidu byl nastříknut na semipreparativní kolonu C18 (Vydac Protein and Peptide C18, 218TP1010; The Separation Group; Hesperia, CA). Průtok gradientu nebo izokratické směsi 0,1% TFA pufru a ACN (čistota pro HPLC) jako eluentu byl udržován pomocí Beckmanova „SYSTÉM GOLD“ HPLC. Eluce peptidu byla monitorována detekcí UV při 230 nm (Beckman, Systém Gold, programovatelný modul rozpouštědla 126 a programovatelný detekční modul 166, řízený softwarem „SYSTÉM GOLD“). Po identifikaci píku odpovídajícího syntetizované sloučenině pomocí MS byla sloučenina shromážděna, lyofilizována a biologicky testována. MS byla provedena pomocí zařízení SCIEX API III+. Dále byla provedena NMR s použitím zařízení Generál Electric (300 MHz). Při NMR byly vzorky typicky měřeny v hexadeuterodimethylsulfoxidu nebo deuterochloroformu (CDC13; Aldrich).
Aldehydy aminokyselin byly připraveny pomocí známých metod. Aldehydy aminokyselin a peptidů jsou popisovány například vFehrentz a Castro, Synthesis 676 (1983);, Bajusz a d., J. Med. Chem. 33:1729 (1990); Kawamura a d., Chem. Pharm. Bull. 17:1902 (1969) a Someno a d., Chem. Pharm. Bull. 34:1748 (1986), přičemž tyto publikace jsou zde všechny zahrnuty jako odkaz. Syntéza redukovaných peptidických vazeb byla prováděna na úrovni dipeptidu v roztoku (například Tyr-{T(CH2NH)}-Ile), pak byl příslušně chráněný dipeptid kondenzován se zbytkem peptidu na pryskyřici syntézou v pevné fázi. Alternativně byl aldehyd chráněné aminokyseliny
-14CZ 296439 B6 kondenzován s peptidem na pryskyřici s použitím metod popsaných v Ho a d.,Pept. Res. 6:10-12 (1993) a v tam citovaných odkazech, které jsou zde všechny zahrnuty jako odkaz.
Příklad II
Syntéza Ac-Tyr-He-Arg-Leu-Ala-NH2
Pro syntézu Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2 výše popsaným způsobem byl použit 1 g pryskyřice Rink (0,6 mmol NH2/g pryskyřice). Výsledný peptid byl analyzován pomocí MS. (M+ H) vypočteno 659,9, nalezeno 659,4.
Příklad ΠΙ
Syntéza Ac-Tyr-He-Arg-Leu-Pro-NH2
Pro syntézu Ac-Tyr-He-Arg-Leu-Pro-NH2 způsobem popsaným v příkladu I byl použit 1 g pryskyřice Rink (0,6 mmol NH2/g pryskyřice). Výsledný peptid měl (M + H)+ vypočteno 685,9, nalezeno 685,4.
Příklad IV
Syntéza Ac-(iBu)Tyr-He-Arg-Leu-Pro-NH2
Byl použit 1 g pryskyřice Rink (0,6 mmol NH2/g pryskyřice). Byla použita výše popsaná obecná syntéza v pevné fázi. Po sejmutí chránící skupiny z Tyr a příslušném promytí pryskyřice bylo přidáno 50 ekvivalentů izobutyraldehydu v DMF s obsahem 2 % ledové kyseliny octové. Vzniklá směs byla třepána 4 h při teplotě místnosti. Po promytí pryskyřice DMF s obsahem 2 % kyseliny octové (2x8 ml) byl přidán 1 g NaBH3CN v 10 ml DMF s obsahem 2 % kyseliny octové. Pryskyřice byla 30 min třepána, pak byla přefiltrována a byla přidána čerstvá směs NaBH3CN ve směsi DMF/kyselina octová a v reakci se pokračovalo ještě 30 min.
Pryskyřice s peptidem pak byla promyta DMF/2 % kyseliny octové (2x8 ml) a DMF (2x8 ml). Vzniklý monoalkylovaný peptid na pryskyřici byl acetylován směsí acetanhydridu a triethylaminu v DMF (30 ekvivalentů, 6 h). Po řádném promytí pryskyřice byl peptid postupem podle příkladu I odštěpen a sejmuty chránící skupiny. Peptid čištěný HPLC byl analyzován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 758,5, nalezeno 758,4.
Příklad V
Syntéza Tfa-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
Stejný postup jako v příkladu IV byl použit pro přípravu piyskyřice (iBu)Tyr-He-Arg-Leu-ProRink. Konečná trifluoracetylace byla prováděna působením 0,7 M trifluoracetanhydridu v přítomnosti diizopropylethylaminu (DIEA) a N-methylimidazolu (NMI) (1:3:0,3 ekv.) po dobu 45 min. Odštěpení peptidu z pryskyřice a izolace peptidu se prováděla podle příkladu IV. Čištěný peptid byl identifikován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 812,5, nalezeno 812,4.
Příklad VI
Syntéza Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)
Syntéza Boc-Arg(NY-Tos)-N(CH3)0(CH3) byla provedena postupem popsaným v literatuře (viz výše Fehrentz a Castro, 1983). Boc-Arg(NY-Tos)-N(CH3)O(CH3) (200 mg) byl smísen při teplotě místnosti s 5 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) a míchán 20 min. Vymizení výchozí látky bylo monitorováno tenkovrstvou chromatografií (TLC) s použitím směsi CHCl3:MeOH:CH3COOH (90:9:1) a vizualizováno ninhydrinovým postřikem a osvětlením UV. Odpařením zbylé TFA ve
-15CZ 296439 B6 vakuu a vysušením ve vakuu nad pecičkami KOH byla získána pevná látka se správnou hmotou. (M + H)+ vypočteno 371,4, nalezeno 371,2.
V jedné baňce bylo 150 mg výše připravené látky rozpuštěno v 1 ml DMF, pak bylo přidáno 57 μΐ triethylaminu a směs byla ochlazena na 0 °C. Ve druhé baňce bylo 171 mg Z-Tyr-Ue-OH (Biochem Bioscience lne.; Philadelphia, PA) rozpuštěno vbezvodém tetrahydrofuranu a ochlazeno na -10 °C, pak bylo přidáno 44 μΐ NNM a 52 μΐ izobutylchlorformiátu pod N2 a směs byla míchána 15 min. Předem připravený roztok Arg(Tos)N(CH3)OCH3 v DMF byl přidán ke smíšenému anhydridu dipeptidu Z-Tyr-Ile-OH a směs byla míchána po dobu 30 min při -10 °C a pak přes noc při teplotě místnosti.
Po zpracování reakční směsi způsobem popsaným v příkladu I byl peptid sušen ve vakuu a malý podíl byl přečištěn pomocí HPLC a analyzován pomocí MS; peptid měl očekávanou molekulovou hmotnost (781). Výsledný peptid Z-Tyr-Ile-Arg(Tos)-N(CH3)OCH3 byl smísen s 500 μΐ anisolu a podroben sejmutí chránících skupin pomocí HF obvyklým způsobem. Po zpracování bylo izolováno 169 mg produktu Tyr-ne-Arg-N(CH3)O(CH3) a identifikováno pomocí MS (vypočteno 494, nalezeno 493,6). Zbylý peptid pak byl rozpuštěn v 1 ml IN HC1 a lyofilizován.
Tyr-ne-Arg-N(CH3)OCH3.2HCl (76 mg) byl rozpuštěn v ACN, ochlazen na 0 °C a bylo přidáno 13 μΐ pyridinu a pak 15 μΐ acetanhydridu. Směs byla míchána 3 h při 0 °C a dokončení reakce bylo monitorováno ninhydrinovým testem. Po 8 h míchání při teplotě místnosti byla reakční směs zpracována a produkt Ac-Tyr-ne-Arg-N(CH3)OCH3 byl charakterizován pomocí MS (vypočteno 535,3, nalezeno 535,6).
Příklad VIII
Syntéza Ac-Tyr-He-Arg-NH-CH2(4-pyridyl)
Oximová pryskyřice (DeGrado a Kaiser, J. Org. Chem. 45:1295 (1980) (0,862 g, 0,6mmol/g) byla kondenzována přes noc s Boc-Arg(Tos)-OH v přítomnosti DICZHOBt. Pryskyřice byla promyta DMF, pak DCM a acetylována směsí acetanhydrid/DIEA (1:1 ekv.) v DCM. Po promytí pryskyřice DCM, DMF a DCM byla sejmuta chránící skupina působením 25% TFA v DCM po dobu 30 min. Pryskyřice pak byla promyta DCM, izopropanolem a DCM. S TFA.Arg(Tos)OxmR byl kondenzován Boc-Ile-OH ve formě symetrického anhydridu (3 ekv.) v přítomnosti 1,5 ekv. DIEA v DCM. Byl opakován výše popsaný cyklus promývání, acetylace a snímání chránící skupiny. Po sejmutí chránící skupiny byl podobným způsobem jako Ile navázán Boc-Tyr(2BrZ)-OH, pak byla z dokončeného peptidu Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR sejmuta chránící skupina a peptid byl acetylován na Ac-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR. Peptid navázaný na pryskyřici byl sušen ve vakuu a poskytl celkový výtěžek 0,216 g.
K 1/3 pryskyřice bylo přidáno 100 μΐ (800 μιηοΐ) 4-(dimethylamino)pyridinu v přítomnosti 60 μΐ ledové kyseliny octové a 120 μΐ DIEA v 6 ml DCM. Pryskyřice byla třepána přes noc při teplotě místnosti. Po přefiltrování roztoku DCM byla pryskyřice promyta 3 ml DMF a filtráty byly spojeny s filtrátem DCM. Po odpaření rozpouštědla byl zbylý peptid zbaven chránících skupin působením HF/anisol a zpracován obvyklým způsobem na očekávaný peptid. Byla provedena elektrosprejová MS. (M + H)+ vypočteno 582, nalezeno 582,3.
Příklad X
Syntéza Ac-Tyr-Ile-Dab(N1'-C3H7N)-Leu-Ala-NH2
0,2 g SCAL-TG (0,2 mmol NH2/g) (Patek & Lebl, Tetr. Letí. 32:3891-3894 (1991), kterážto publikace je zde zahrnuta jako odkaz) bylo kondenzováno s Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH a Fmoc-Tyr-(But)-OH způsobem popsaným v příkladu I. Po acetylaci N-konce a sejmutí chránících skupin z postranních řetězců pomocí TFA byl naváza
-16CZ 296439 B6 ný peptid Ac-Tyr-Ile-Dab-Leu-Ala-SCAL-TG promyt, neutralizován a podroben působení 0,3 M PyBroP/NMI v DMF po dobu 2 h. Dokončený peptid byl odštěpen od pryskyřice s použitím 1M trifenylfosfinu/(CH3)3SiCl v DCM (3 x 1 h) a pak 100% TFA (1 h). Po izolaci surového peptidu vysrážením diethyletherem byl peptid lyofílizován z 0,1% vodného roztoku TFA. Peptid AcTyr-Ile-Dab(N'l'-C3H7N)-Leu-Ala-NH2 byl přečištěn pomocí HPLC a charakterizován pomocí MS. (M + H+) vypočteno 676,4 nalezeno 676,4.
Příklad XI
Syntéza Ac-Tyr-He-PalMe(3)-NH2
K 1,0 g pryskyřice Rink (0,48 mmol NH2/g) bylo způsobem popsaným v příkladu I navázáno Fmoc-Pal(3)-OH, Fmoc-Ile-OH a Fmoc-Tyr(But)-OH. K 0,25 g dokončeného navázaného peptidu Fmoc-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rmk bylo přidáno 500 μΐ methyljodidu (Mel) v DCM a pryskyřice s navázaným peptidem byla třepána 6 h. Z dokončeného peptidu Fmoc-Tyr(But)He-PalMe(3)-Rink byly sejmuty chránící skupiny a byla provedena acetylace a odštěpení jako v příkladu I. Část surového peptidu byla přečištěna pomocí HPLC a konečný peptid byl charakterizován pomocí MS.
Příklad XU
Syntéza Ac-cyklo(Glu-Tyr-Ile-Arg-Leu-Lys)-NH2 g SCAL-TG (0,29 mmol NH2/g) (viz příklad X) byl metodami popsanými v příkladu I kondenzován s Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, FmocTyr(But)-OH a Fmoc-Glu(OtBu)-OH. Po odštěpení Fmoc byl peptid na pryskyřici acetylován a promyt DMF a pak DCM. Z navázaného peptidu Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-LeuLys(Boc)-SCAL-TG byly s použitím činidla K sejmuty chránící skupiny, peptid byla neutralizován a cyklizován s použitím BOP/HOBt/DIEA (5:5:5 ekv.) v DMF po dobu 2 h. Dokončení kondenzace bylo monitorováno ninhydrinovým testem, jak popisuje Kaiser (Kaiser a d., Anal. Biochem. 34:595 (1970), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz). Po cyklizacibyl peptid odštěpen z pryskyřice, přečištěn pomocí HPLC a charakterizován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 844,5, nalezeno 844,5.
Příklad XIV
Syntéza N-substituovaných glycinových sloučenin: syntéza Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2
Pro syntézu N-substituovaných glycinů byl použit postup podle Zuckermanna a d., (J. Am. Chem. Soc. 114:10646 (1992), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz). 1 g SCALTG (0,29 mmol NH2/g) (viz příklad X) byl kondenzován v DCM/DMF s kyselinou bromoctovou přes symetrický anhydrid. Každá kondenzační reakce byla dvakrát opakována. K pryskyřici BrCH2CO-SCAL-TG byl přidán Boc-NH-CH2CH2CH2NH2 vDMSO a pryskyřice byla po dobu h houpána. Po sejmutí chránící skupiny byl postup opakován, přičemž byla střídána kondenzace Br-CH2COOH s pryskyřicí a reakce pryskyřice s navázanou kyselinou bromoctovou s příslušným aminem. Pryskyřice (Bzl)Gly-(Chx)Gly-(Boc-NH(CH2)3)Gly-SCAL-TG byla acetylována přes noc směsí acetanhydrid/DIEA/NMI (1:1:0,25) v DMF. Po sejmutí skupiny Boc byla pryskyřice Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-aminopropyl)Gly-SCAL-TG podrobena působení 1,8M karboxyamidinopyrazol.HCl (Bematowicz a d., J. Org. Chem. 57:2497-2502 (1992), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz) v přítomnosti DIEA (1:1) v DMF při teplotě místnosti po dobu 3 h. Dokončení guanylace bylo monitorováno Kaiserovým testem. Odštěpení a zpracování vzniklého peptidu bylo provedeno jako v příkladu X a analýza byla provedena pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 502,3, nalezeno 502,3.
-17CZ 296439 B6
Příklad XVI
Syntéza Ph-C(NOCH2Ph)-CO-I-R-NH2
0,2 g pryskyřice Rink bylo kondenzováno s Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH a byla sejmuta skupina Fmoc (viz příklad I). K navázanému peptidu He-Arg(Pmc)-Rink byla pomocí výše popsaného postupu s DIC/HOBt navázána Ph-C(NOCH2Ph)-COOH. Dokončený navázaný peptid Ph-C(NOCH2Ph)-CO-Ile-Arg(Pmc)-Rink byl zpracován jako v příkladu I a analyzován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 524,6, nalezeno 524,3.
Příklad XVII
Syntéza Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
Syntéza byla prováděna na 100 mg pryskyřice Rink (0,48 mmol/g) způsobem podle příkladu I s použitím těchto derivátů aminokyselin: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-He-OH a Fmoc-pAph(Fmoc)-OH (racemická směs). Při odštěpování a izolaci peptidu se postupovalo jako v příkladu I. Oba diastereomemí peptidy byly izolovány pomocí RP-HPLC a identifikovány pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 754,5, nalezeno 754,4.
Příklad XVIII
Syntéza Ac-Tyr-Chg-Arg-olu
Peptidická sekvence byla vybudována na 0,25 g pryskyřice Fmoc-Arg(Pmc)-Sasrin (0,5 mmol NH2/g pryskyřice; Bachem Bioscience) způsobem popsaným v příkladu I. Po sejmutí N-terminální skupiny Fmoc a acetylaci byl chráněný peptid odštěpen od pryskyřice redukčním štěpením jako C-terminální alkohol (Mergler a d., Peptides str. 177-178 (ed. Schneider a Eberle, Leiden 1993), zahrnuto zde jako odkaz). Pryskyřice s navázaným peptidem byla 24 h třepána s roztokem NaBH4 (4 ekv.) ve 2 ml THF:EtOH (6:1). Po reakci odštěpení byla pryskyřice promyta DCM a roztoky použité k odštěpení a kpromývání byly spojeny a lyofilizovány. Z lyofilizovaného peptidu byly sejmuty chránící skupiny působením TFA/voda/thioanisol (90:5:5) po dobu 2 h a peptid byl izolován vysrážením. Peptid přečištěný pomocí HPLC byl analyzován s použitím MS. (M + H)+ vypočteno 505,3, nalezeno 505,3.
Příklad XIX
Syntéza Ac-Tyr-Chg-Arg-ol.acetátu
Chráněný peptidalkohol byl připraven postupem podle příkladu XVIII. 10 mg surového materiálu bylo rozpuštěno v DCM/ACN a podrobeno působení acetanhydridu (2 mmol) v přítomnosti TEA (2,4 mmol) po dobu 20 min. Roztok byl přefiltrován, odpařen a z peptidu byly výše uvedeným způsobem sejmuty chránící skupiny. Peptid přečištěný HPLC byl analyzován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 547,3, nalezeno 547,3.
Příklad XX
Syntéza Ac-Phe(pNH2)-Chg-Om(C(NH)CH3)-Leu-Pro-NH2 g pryskyřice „TENTAGEL S“ NH2 (0,28 mmol NH2/g pryskyřice; Rapp Polymer, Tubingen, Německo) byl funkcionalizován linkerem SCAL postupem popsaným v příkladu X a byly navázány tyto aminokyseliny: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Om(Boc)-OH a Fmoc-ChgOH. Navázaný peptid Fmoc-Chg-Om(Boc)-Leu-Pro-SCAL-TG byl podroben působení 50% TFA v DCM (1 promytí po dobu 1 min, pak 1 promytí po dobu 30 min), promyt třikrát DCM, neutralizován 5% DIEA v DCM (2 x 30 s) a 2 x DCM. K navázanému peptidu byl přidán roztok 1,5 g ethylacetimidáthydrochloridu (Aldrich) ve 4 ml směsi pyridin:DIEA 1:1 a 3 ml DMF a v kondenzaci se pokračovalo přes noc při teplotě místnosti.
-18CZ 296439 B6
Z navázaného peptidu Fmoc-Chg-Om(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG byla chránící skupina odstraněna působením 20% piperidinu v DMF po dobu 12 min, byl promyt 4 x DMF, 4 x DCM a kondenzován s Fmoc-Phe(pNH-BOC)-OH pomocí DIC/HOBt v DMF. Odstraněním Fmoc a acetylací směsí acetanhydrid-pyridin (1:1) po dobu 20 min se získal navázaný peptid AcPhe(pNH-BOC)-Chg-Om(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG. Redukcí linkeru SCAL a odštěpením peptidu a následujícím přečištěním surového produktu pomocí HPLC byla získána očekávaná sloučenina. (M + H)+ vypočteno 740,48, nalezeno 740,2.
Příklad XXI
Syntéza Ac-Phe(pNH2)-Chg~Dap(N(3-C6Hi !N)-Leu-Pro-NH2
0,5 g SCAL-TG (0,32 mmol NH2/g) bylo kondenzováno s Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH a Fmoc-Chg-OH. Skupina Boc z postranního řetězce byla sejmuta působením 50% TFA po dobu 20 min a peptid navázaný na pryskyřici byl neutralizován promytím 10% DIEA/DCM. Volná aminoskupina postranního řetězce byla přeměněna působením 0,3 M PyBroP/NMI v DMF po dobu 20 min na dimethylamidiniovou skupinu. Odstraněním skupiny Fmoc působením 50% piperidinu/DMF po dobu 60 min došlo k výměně dimethylamidiniové skupiny v postranním řetězci Dap skupinou piperidiniovou. Sekvence byla dokončena kondenzací s Fmoc-Phe(Boc)-OH a sejmutím skupiny Fmoc. Peptid byl acetylován a odštěpen jako v příkladu X. Peptid přečištěný pomocí HPLC byl analyzován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 752,4, nalezeno 752,4.
Příklad XXII
Syntéza Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
Racemický H-Phe(pCN)-OH byl syntetizován acetamidomalonátovou metodou (Wagner a d., patent NDR 155954, vydaný 21. 7. 1982, podroben znovu průzkumu 9. 11. 1988, který je zde zahrnut jako odkaz). Racemický Ac-pAph-OH byl syntetizován konverzí kyanoskupiny amonolýzou odpovídajícího methylthioimidátu (vznikajícího reakcí kyanoskupiny se sirovodíkem) a následnou methylací pomocí Mel.
Pro syntézu peptidu byl použit 1 g pryskyřice „TENTAGEL“ (substituce 0,21 mmol NH2/g pryskyřice) a linker Knorr (Bematowicz a d., Tetr. Letí. 30:4645 (1989), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz). Dipeptid Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG byl sestaven jak je uvedeno v příkladu I. Pak byl 3-pyridylalanin methylován působením 1 ml Mel v DCM přes noc. Po odstranění Fmoc byl metodou DIC/HOBt navázán Ac-pAph-OH a peptid byl zpracován jako v příkladu I. (M + H)+ vypočteno 550,31, nalezeno 550,3.
Příklad ΧΧΙΠ
Syntéza Ac-Tyr-Chg-pAph-Leu-Pro-NH2
Pentapeptid Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG byl sestaven na 0,4 g „TENTAGEL“ (substituce 0,2 mmol NH2/g pryskyřice) způsobem uvedeným v příkladu I. Pryskyřice byla přes noc vystavena v uzavřené injekční stříkačce působení 8 ml směsi pyridin/triethylamin (75:25) nasycené H2S. Thioamid navázaný na pryskyřici byla methylován působením 0,5 ml Mel v 8 ml acetonu po dobu 30 min při 50 °C a pak promyt acetonem a methanolem. Methylthioimid byl podroben reakcí s octanem amonným v methanolu po dobu 3 h při 55 °C za vzniku konečné sloučeniny, která byla od pryskyřice odštěpena a přečištěna výše popsaným způsobem. (M + H)+ vypočteno 760,43, nalezeno 761,4.
Příklad XXIV
Syntéza Ac-Phe(pCH2NH2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
-19CZ 296439 B6
Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 (surový peptid) byl syntetizován na 1 g pryskyřice Rink (0,6 mmol NH2/g pryskyřice) způsobem uvedeným v příkladu I. 125 mg surového peptidu bylo rozpuštěno v 50 ml MeOH a bylo přidáno 0,5 ml suspenze Raneyova niklu (Aldrich). Směs peptidu a katalyzátoru byla hydrogenována při 35 psi po dobu 4 h při teplotě místnosti. Katalyzátor byl odfiltrován a roztok byl odpařen k suchu. Zbytek byl lyofilizován z 0,1% vodné TEA obsahující 30 % ACN. Vysušený surový produkt byl přečištěn pomocí HPLC a analyzován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 741,7, nalezeno 741,4.
Příklad XXV
Syntéza Ac-Phe(pC(NOH)NH2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
21,1 mg surového peptidu, připraveného způsobem uvedeným v příkladu XXIV, bylo smíseno s 60,3 mg NH2OH.HC1 (Aldrich) v 1,5 ml MeOH, 0,7 ml pyridinu a 0,5 ml TEA. Směs byla míchána 72 h při teplotě místnosti, pak bylo ve vakuu odpařeno rozpouštědlo a těkavý podíl. Peptid byl přečištěn pomocí HPLC a analyzován pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 770,3 nalezeno 770,4.
Příklad XXVI
Syntéza sloučenin A1-A2-B
Sloučeniny A1-A2-B, tj. sloučeniny Al-A2-(A3)m-B, kde m je 0, byly připraveny podle schématu znázorněného na obr. 3. Stručně řečeno, kondenzací racemického N-acetyl-4-kyanofenylalaninu s methylesterem L-cyklohexylglycinu (H-Chg-OMe) byla získána směs dvou diastereomerních dipeptidů, které byly rozděleny chromatografií. Racemický N-acetyl-4-kyanofenylalanin byl částečně rozštěpen vytvořením soli s L-cyklohexylglycinmethylesterem. Méně rozpustná D,L-sůl byla snadno vykrystalována a následnou kondenzací se získal Ac-f(pCN)-ChgOMe ve v podstatě čisté formě. „Matečný louh“ byl obohacen o L,L-sůl a kondenzací se získal surový Ac-F(pCN)-Chg-OMe, kteiý byl dále čištěn chromatografií na silikagelu. Tyto dipeptidestery byly hydrolyzovány na odpovídající kyseliny s použitím hydroxidu lithného ve směsi methanol/voda při teplotě místnosti. Obě dipeptidické kyseliny byly převedeny na substituované amidy konvenční kondenzací s příslušnými aminy RNH2. Aminy, které nebyly komerčně dostupné, byly připraveny standardními chemickými metodami.
Přeměna kyanoskupin na odpovídající amidiny byla provedena s použitím standardních chemických metod buď přes thioamid a methylthioimidát, nebo hydrogenací odpovídajícího amidoximu (příklad XXV). Posledně uvedená sloučenina byla získána reakcí nitrilu s hydroxylaminem. Dále uvedené příklady osvětlují přípravu titulních sloučenin těmito vybranými metodami. Je však samozřejmé, že sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny různými jinými metodami a zde vybrané postupy byly zvoleny jako vyhovující.
Příklad XXVII
Syntéza Ac-pAph-Chg-NHCH2-(4-methylpyridinium)
Syntéza Ac-pAph-Chg-NHCH2-(4—methylpyridinium) byla provedena přeměnou Ac-F(pCN)Chg-NHCH2-(4-pyridyl) metodami popsanými v příkladu XXII. Konečná sloučenina byla přečištěna pomocí HPLC způsobem popsaným v příkladu I. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 493,29, nalezeno 493,3.
Výchozí látka byla připravena takto:
a) 2,32 g (10 mmol) Ac-(D,L)-F(pCN) bylo za zahřívání rozpuštěno v 75 ml ethanolu. Byl přidán L-cyklohexylglycinmethylester (1,75 g, 10 mmol) a směs byla míchána 2 h při teplotě místnosti. Vysrážené krystaly byly odfiltrovány a vysušeny na 1,55 g D,L-soli. Filtrát byl částečně odpařen a zředěn etherem. Vypadlé krystaly byly shromážděny a vysušeny a bylo získáno
-20CZ 296439 B6
2,1 g L,L-soli kontaminované D,L-solí. Surová L,L-sůl byla spojena s 20 ml DMF, 0,71 g HOBt a 1,18 g DCC. Směs byla míchána 24 h při teplotě místnosti. Močovina byla odfiltrována a filtrát byl odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu a roztok byl promyt 1N HC1 a nasyceným vodným roztokem bikarbonátu sodného. Organická vrstva byla vysušena a odpařena. Zbytek byl chromatografován na 60 g silikagelu s elucí 20% acetonem (v/v) v methylenchloridu. Krystalizací spojených čistých frakcí ze směsi methylenchlorid/ether/hexan bylo získáno 1,6 g AcF(pCN)-Chg-OMe jako bezbarvé krystaly s teplotou tání 178 až 180 °C.
b) Směs 1,93 g (5 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OMe (z výše uvedeného příkladu XXVII.a), 100 ml methanolu, 10 ml vody a 0,75 g hydrátu hydroxidu lithného byla míchána 24 h při teplotě místnosti pod dusíkem. Po přídavku 2 ml kyseliny octové byla odpařena rozpouštědla a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid s obsahem 20 % izopropanolu a 1N HC1. Organická vrstva byla vysušena a odpařena a zbytek byl překrystalován ze směsi methylenchlorid/ether/hexan, čímž poskytl 1,6 g Ac-F(pCN)-Chg-OH jako bezbarvé krystaly s teplotou tání 216 až 218 °C.
c) Směs 150 mg (0,4 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH (viz výše), 65 mg (0,6 mmol) 4-aminomethylpyridinu, 124 mg (0,6 mmol) DCC, 60 mg (0,44 mmol) HOBt a 5 ml DMF byla míchána 20 h při teplotě místnosti. Močovina byla odfiltrována a filtrát byl odpařen. Zbytek byl suspendován v methanolu a nerozpustný produkt byl odfiltrován a poskytl 140 mg bezbarvého AcF(pCN)-Chg-NHCH2(4-pyridyl). Analytický vzorek byl získán chromatografií na silikagelu s použitím směsi aceton/methylenchlorid//methanol (4:5:1). Krystalická pevná látka měla teplotu tání nad 250 °C.
Příklad XXVIII
Ac-f(4—amidmo)-Chg-NHCH2(4—methylpyridinium)
Tato sloučenina byla připravena reakcí 150 mg Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2(4-pyridyl) (viz výše) se sirovodíkem, pak s methyljodidem a octanem amonným. Produkt byl izolován pomocí HPLC jako homogenní látka. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 493,29, nalezeno 493,3.
Výchozí látka byla připravena takto:
a) Směs 2,8 g Ac-f(pCN), (L)-cyklohexylglycinmethylesteru, 940 mg HOBt, 1,57 g DCC a 30 ml DMF byla míchána 2 dny při teplotě místnosti. Močovina byla odstraněna filtrací a filtrát byl odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu a roztok byl promyt 1N HC1 a 10% vodným roztokem uhličitanu sodného. Organická fáze byla vysušena a odpařena. Krystalizací zbytku ze směsi methylenchlorid/ether/hexan se získalo 2,05 g bezbarvého Ac-f(pCN)-Chg-OMe s teplotou tání 181 až 183 °C.
b) Hydrolýza 1,93 g Ac-f(pCN)-Chg-OMe (viz výše) s 0,75 g monohydrátu hydroxidu lithného ve 100 ml methanolu a 10 ml vody byla provedena způsobem popsaným pro L,L-izomer výše v příkladu XXVII a krystalizací ze směsi methylenchlorid/ether bylo získáno 1,65 g Ac-f(pCN)-Chg-OH s teplotou tání 180 až 182 °C.
c) Směs 225 mg Ac-f(pCN)-Chg-OH (viz výše), 100 mg 4—aminomethylpyridmu, 90 mg HOBt, 180 mg DCC a 6 ml DMF byla míchána přes víkend při teplotě místnosti. Močovina byla odfiltrována a filtrát byl odpařen. Zbytek byl míchán smethanolem a pevný podíl byl odfiltrován, čímž se získalo 190 mg krystalického Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2(4-pyridyl) s teplotou tání nad 250 °C.
Příklad XXIX
Ac-pAph-Chg-NHCH2CH2(3-methylpyridinium)
-21 CZ 296439 B6
Směs 125 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2(3-pyridyl), 2 ml DMSO, 10 ml pyridinu a 5 ml triethylaminu byla za chlazení směsí led/voda sycena sirovodíkem. Poté, co byla přes noc míchána při teplotě místnosti v uzavřené lahvičce, byla odpařena rozpouštědla a zbytek byl získán pomocí směsi aceton/ether a vysušením se získalo 125 mg thioamidu. Tato látka byla spojena s 2 ml DMSO, 5 ml acetonu a 0,75 methyljodidu a směs byla míchána v uzavřené lahvičce přes noc při teplotě místnosti. Po zředění toluenem byla odpařena rozpouštědla a zbytek byl rozmíchán s etherem. Ether byl dekantován, nahrazen čerstvým etherem a v míchání se pokračovalo do ztuhnutí pryskyřičnatého materiálu, načež byl zbylý ether odfiltrován a zbytek vysušen.
Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 20 ml methanolu a bylo přidáno 0,3 ml kyseliny octové a 0,4 g octanu amonného. Směs byla zahřívána 2,5 h na 55 až 60 °C a pak byla odpařena rozpouštědla. Zbytek byl rozpuštěn ve směsi voda/ACN/TFA a lyofilizován. Surový produkt byl přečištěn pomocí HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 507,31, nalezeno 507,3.
Výchozí látka byla získána takto: Směs 150 mg (0,4 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 120 mg (0,6 mmol) 2-(3-pyridyl)ethylamindihydrochloridu, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0,5 ml diizopropylethylaminu a 10 ml DMF byla míchána 24 h při teplotě místnosti. Po odpaření rozpouštědla byl zbytek rozmíchán s methanolem a nerozpustný produkt byl shromážděn filtrací a promyt methanolem a etherem, čímž se získalo 110 mg bezbarvých krystalů. Filtrát byl odpařen a zbytek byl rozpuštěn ve směsi methylenchlorid/izopropanol. Tento roztok byl promyt 10% vodným roztokem uhličitanu sodného, vysušen a odpařen. Zbytek byl chromatografován na 14 g silikagelu s použitím směsi methylenchlorid/aceton/methanol (5:4:1) a bylo získáno 40 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2(3-pyridyl) s teplotou tání 265 až 268 °C.
b) 2-(3-Pyridyl)ethylamindihydrochlorid byl připraven tímto způsobem: Směs 1,3 g 3-pyridylacetonitrilu, přibližně 3 g Raneyova niklu a 30 ml methanolu s obsahem 10 % objemových amoniaku byla hydrogenována při 35 psi po dobu 20 h s použitím Parrova hydrogenátoru. Katalyzátor byl odfiltrován přes celit a filtrát byl odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu, roztok vysušen pomocí síranu hořečnatého, přefiltrován a odpařen. Produkt byl převeden na dihydrochlorid s použitím chlorovodíku v dioxanu. Krystalizací ze směsi methanol/ether se získalo 1,4 g bezbarvých krystalů s teplotou tání 145 až 148 °C.
Příklad XXX
Ac-pAph-Chg-NHCH2CH2(4-methylpyridinium)
Tato sloučenina byla připravena výše popsanými metodami reakcí Ac-F(pCN)-ChgNHCH2CH2(4-pyridyl) se sirovodíkem s následnou methylací methyljodidem a reakcí s octanem amonným. Surový produkt byl přečištěn pomocí HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 507,31, nalezeno 507,3.
Výchozí látka byla získána kondenzací Ac-F(pCN)-Chg-OH s 2-(4-pyridyl)ethylamindihydrochloridem způsobem uvedeným výše v příkladu XXIX.
2-(4-pyridyl)ethylamindihydrochlorid byl připraven způsobem popsaným výše pro 2-(3-pyridyl)ethylamindihydrochlorid hydrogenací pyridyl-4-acetonitrilu na Raneyově niklu v přítomnosti amoniaku. Dihydrochlorid měl teplotu tání 220 °C.
Příklad XXXI
Ac-pAph-Chg-NHCH2(4-amidinofenyl)
Tato sloučenina byla připravena podobnými metodami jako výše působením sirovodíku v DMSO, pyridinu a triethylaminu na Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(4-kyanofenyl). Získaný bis-thioamid byl methylován methyljodidem vDMSO/aceton a pak podroben reakci s octanem
-22CZ 296439 B6 amonným, jak uvedeno výše. Surový produkt byl přečištěn pomocí HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 520,30, nalezeno 520,3.
Výchozí látka byla získána tímto způsobem: Směs 75 mg (0,2 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 50 mg (0,3 mmol) (4-kyanofenyl)methylaminhydrochloridu, 62 mg DCC, 30 mg HOBt, 0,2 ml DIEA a 2 ml DMF byla míchána 24 h při teplotě místnosti. Po přefiltrování bylo odpařeno rozpouštědlo a zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu s obsahem 20 % izopropanolu. Roztok byl promyt IN HC1 a 10% vodným roztokem uhličitanu sodného, pak vysušen a odpařen. Zbytek byl rozmíchán s malým množstvím směsi methanol/voda a shromážděním a vysušením vypadlého pevného podílu bylo získáno 80 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(4-kyanofenyl).
(4~Kyanofenyl)methylaminhydrochlorid byl připraven tímto způsobem: Směs 2 g (10 mmol) a-brom-p-tolunitrílu, 2 g (10,8 mmol) ftalimidu draselného a 30 ml DMF byla zahřívána 1 min k refluxu. Po ochlazení byla směs okyselena kyselinou octovou a zředěna vodou pro vykrystalování produktu. Krystaly byly odfiltrovány, promyty vodou a vysušením se získalo 2,24 g bezbarvého N-(4-kyanofenyl)methylftalimidu s teplotou tání 182 až 184 °C.
1,5 g N-(4-kyanofenyl)methylftalimidu bylo suspendováno v 50 ml vroucího methanolu a podrobeno působení 1 ml hydrazinhydrátu. Po 5 min vznikl čirý roztok. Methanol byl odpařen a ke zbytku byla přidána 2N HC1. Suspenze byla zahřáta k varu a pak ochlazena na ledu. Pevný podíl byl odfiltrován a filtrát odpařen. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě. Roztok byl znovu zahřát kvaru, ochlazen a přefiltrován. Filtrát byl zalkalizován hydroxidem sodným a extrahován methylenchloridem s obsahem izopropanolu. Organická fáze byla vysušena a odpařena a zbytek byl převeden na hydrochlorid, vykrystalován ze směsi izopropanol/ether a poskytl 0,43 g bezbarvých krystalů s teplotou tání nad 260 °C.
(3-Kyanofenyl)methylaminhydrochlorid byl připraven reakcí a-brom-m-tolunitrilu s ftalimidem draselným za vzniku N-(3-kyanofenyl)methylftalimidu s teplotou tání 147 až 148 °C. Reakcí této látky s hydrazinhydrátem a převedením na hydrochlorid výše uvedeným způsobem byl získán (3-kyanofenyl)methylamin o teplotě tání 223 až 226 °C.
Příklad XXXII
Ac-pAph-Chg-NHCH2(3-amidinofenyl)
Tato sloučenina byla připravena výše popsanými metodami. K Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3-kyanofenyl) byl přidán sirovodík v DMSO, pyridin a triethylamin. Získaný bis-thioamid byl methylován methyljodidem v DMSO/acetonu a pak podroben výše popsaným způsobem reakci s octanem amonným. Surový produkt byl přečištěn pomocí HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 520,30, nalezeno 520,3.
Výchozí látka byla získána tímto způsobem: Směs 300 mg (0,8 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 200 mg (1,2 mmol) (3-kyanofenyl)methylaminhydrochloridu, 250 mg DCC, 120 mg HOBt, 0,8 ml DIEA a 10 ml DMF byla míchána 24 h při teplotě místnosti. Po přefiltrováni bylo odpařeno rozpouštědlo a zbytek byl rozpuštěn ve velkém objemu methylenchloridu s obsahem 20% izopropanolu. Roztok byl promyt IN HC1 a 10% vodným roztokem uhličitanu sodného, vysušen a odpařen. Zbytek byl rozmíchán se směsí izopropanol/ether a shromážděním a vysušením vypadlého pevného podílu bylo získáno 400 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3kyanofenyl).
Příklad XXXIII
Ac-pAph-Chg-NHCH(Me)(4-methylpyridinium)
Směs diastereomerů titulní sloučeniny byla připravena reakcí směsi dvou diastereomemích Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4—pyridyl) se sirovodíkem, pak s Mel a octanem amonným.
-23CZ 296439 B6
Diastereomery byly rozděleny pomocí HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočteno 507,31, nalezeno 507,3.
Výchozí látka byla připravena tímto způsobem: Směs 150 mg (0,4 mmol) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 120 mg (0,6 mmol) racemického l-(4~pyridyl)ethylamindihydrochloridu, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0,5 ml DIEA a 10 ml DMF byla míchána 24 h při teplotě místnosti. Po přefiltrování bylo odpařeno rozpouštědlo a zbytek byl rozpuštěn ve velkém objemu methylenchloridu s obsahem 20 % izopropanolu. Roztok byl promyt 10% vodným roztokem uhličitanu sodného, vysušen a odpařen. Zbytek byl rozmíchán se směsí izopropanol/ether a vypadlý pevný podíl byl shromážděn a vysušen, čímž se získalo 125 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-pyridyl) jako směs dvou diastereomerů.
Racemický 1-(4-pyridyl)ethylamindihydrochlorid byl připraven tímto způsobem: Směs 1 g 4-acetylpyridin-N-oxidu, 2 g Raneyova niklu a 30 ml methanolu s obsahem 20 % amoniaku (v/v) byla hydrogenována 24 h při 30 psi. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes celit a filtrát byl odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu, roztok přefiltrován a odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v izopropanolu a podroben působení chlorovodíku v etheru. Vysrážené krystaly byly shromážděny a vysušeny, čímž se získalo 0,9 g látky steplotou tání 198 až 200 °C.
Příklad XXXIV
Syntéza DlPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
a) Syntéza Ν,Ν-diizopropylamidu (p-kyanobenzyl)malonové kyseliny (DIPA(m)Phe(pCN))OH
Syntéza 2-(p-kyanobenzyl)malonové kyseliny byla provedena modifikovaným postupem (viz Pinori a d., patent US 5 061 911 (říjen 1991), který je zde zahrnut jako odkaz). Kroztoku 3,8 g 2,2-dimethyl-l ,3-dioxan—4,6-dionu (Meldrumova kyselina; Aldrich) a 1,12 g NaCNBH3 (Aldrich) ve 25 ml DMF bylo přidáno 2,3 g p-kyanobenzylaldehydu (Aldrich) a směs byla míchána 2 h při teplotě místnosti. K reakční směsi bylo přidáno 400 ml vody a roztok byl chlazen na vodní lázni a jeho pH upravováno na 3,8 až 4 přikapáváním 20% vodného roztoku HC1. Bílá sraženina byla oddělena na Bůchnerově nálevce ze sintrovaného skla a promyta chladnou vodou. Shromážděná sraženina byla 24 h sušena ve vakuu nad CaCl2. NMR shromážděné pevné látky vCDC13 ukázalo na sloučeninu 2,2-dimethyl-5-(p-kyano)benzyl-l,3-dioxan-4,6-dion (DCBD), která má teplotu tání 135 až 142 °C a Rf 0,45 (CHCl3-MeOH-kyselina octová 95:4:1).
K 1,5 ml diizopropylaminu ve 45 ml DCM byly přidány 3 ml N,O-bis(trimethylsilyl)acetamidu (BSA) a roztok byl refluxován 7 h v reakční baňce opatřené magnetickým míchadlem a chladičem chráněným trubičkou CaCl2. Po ochlazení roztoku na teplotu místnosti bylo přidáno 0,8 g DCBD a reakční směs byla refluxována 3 h (do dokončení konverze produktu podle TLC). Po ochlazení reakční směsi bylo opatrně přidáno 5 až 8 ml 20% vodného roztoku HC1. P oddělení vrstev byla organická vrstva promyta vodou, vysušena (MgSO4) a odpařena k suchu na čistý produkt, který byl použit bez dalšího čištění v dalším stupni. Identifikace sloučenin byla provedena s použitím NMR v CDC13 a MS.
b) Syntéza DIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
Peptid na pryskyřici DIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink byl syntetizován způsobem popsaným v příkladu I. Vzniklý navázaný peptid byl podroben působení hydroxylaminhydrochloridu způsobem popsaným v příkladu XXV a byl získán DIPA(m)Phe(pC(NOH)NH2)Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink. Po odštěpení peptidu z pryskyřice a lyofilizaci byl surový produkt (120 mg) rozpuštěn v 80 ml MeOH a 10 ml nasyceného roztoku NH3 v MeOH. K reakční směsi bylo přidáno 0,25 ml suspenze Raneyova niklu (Aldrich) a směs byla hydrogenována 24 h při 45 psi. Byl odfiltrován katalyzátor, rozpouštědlo odpařeno do sucha a zbytek byl lyofilizován
-24CZ 296439 B6 z roztoku 1:1 0,1% vodného roztoku TFA a ACN. Surový peptid byl přečištěn pomocí HPLC a sloučenina byla identifikována pomocí MS. (M + H)+ vypočteno 824,5, nalezeno 824,2.
Příklad XXXV
Sloučeniny s několika substitucemi, které byly syntetizovány a účinně inhibovaly faktor Xa
| č. | sloučenina | vypočt. | (nal.) |
| 1. | Ac-(2-CF3Bzl)-Y-I-R-L-P-NH2 | 860,5 | (860,3) |
| 2. | Ac-(CH3CH2CH2CH(CH3)CH2)-Y-I-R-L-P-NH2 | 786,5 | (786,5) |
| 3. | ch3oco-y-i-r-l-p-nh2 | 742,4 | (742,4) |
| 4. | Ac-Y-Chg-R-NH2 | 518,2 | (518,2) |
| 5. | Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH2 | 679,4 | (679,4) |
| 6. | y-Tle-R-Nle-P-NH2 | 660,4 | (660,4) |
| 7. | Phe(pF)-I-R-L-P-NH | 662,3 | (662,3) |
| 8. | Ac-(D)Tic(OH)-I-R-L-P-NH2 | 714,4 | (714,4) |
| 9. | Ac-Phe(pCN)-I-R-L-P-NH2 | 711,4 | (711,4) |
| 10. | Ac-Phe(pCONH2)-Chg-R-L-P-NH2 | 755,4 | (755,4) |
| 11. | y-Chg-R-NH2 | 476,2 | (476,2) |
| 12. | Ac-W-Chg-R-L-P-NH2 | 751,3 | (751,3) |
| 13. | Ac-Y-I-R-NH-CH(CH3)-(CH2)2-CH3 | 562,3 | (562,3) |
| 14. | Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH2 | 722,2 | (722,2) |
| 15. | Ac-Y-Chg-R-Ina-NH2 | 629,4 | (629,4) |
| 16. | Ac-Tza-Chg-R-NH2 | 509,3 | (509,3) |
| 17. | Ac-Y-Chg-R-Pip-NH2 | 629,4 | (629,4) |
| 18. | Ac-Phe(pNH2)-Chg-R-NH2 | 517,2 | (517,2) |
| 19. | Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly-(3-guanidinopropyl)G-NH2 | 502,3 | (502,3) |
| 20. | Ac-Y-Chg-R-ol.acetát | 547,3 | (547,3) |
| 21. | Ac-Y-Chg-R-OCH3 | 533,3 | (533,3) |
| 22. | Ac-Y-Chg-R-OH | 519,3 | (519,3) |
| 23. | Bz-Y-Chg-R-NH2 | 532,2 | (532,2) |
Příklad XXXVI
Kombinace chemických změn, které jednotlivě nemusejí mít zlepšenou aktivitu, mohou zlepšovat aktivitu
Byla měřena inhibice aktivity faktoru Xa. Jako míru aktivity peptidu podle vynálezu je však 15 možno stanovit jakoukoli relevantní míru biologické aktivity, jako je vliv peptidu YIR podle vynálezu na koagulaci, účinnost in vivo, poločas in vivo, orální biodostupnost, orální účinnost nebo poločas.
Jsou zobrazeny různé specifické změny. Jako příklad byly kombinovány dvě změny za účelem prokázání, že dalšího zlepšení aktivity bylo dosaženo kombinací změn i tehdy, když původní jednotlivé změny nezlepšovaly významně aktivitu. Jednotlivými chemickými změnami byl získán Ac-Y-I-R-L-P, který měl hodnotu K; = 0,49 μΜ, a (iBu)Y-I-R-L-P s hodnotou Kj = 2,6 μΜ, přičemž původní sloučenina Y-I-R-L-P má hodnotu Ki = 5,3 μΜ. Kombinací těchto dvou změn vznikl Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2, který měl hodnotu K;= 0,04 μΜ. Tyto výsledky tedy demonstrují, že peptid podle vynálezu s kombinací dvou chemických změn může mít podstatně zvýšenou inhibiční aktivitu vůči faktoru Xa v porovnání s odpovídajícími analogy s jedinou změnou i v případě, kdy jedna původní sloučenina, jako je (iBu)Y-I-R-L-P-NH2, neměla významně zvýšenou aktivitu vůči původnímu Y-I-R-L-P-NH2.
-25CZ 296439 B6
V tabulce 3 jsou uvedeny příklady specifických chemických modifikací, které vedly ke sloučeninám s hodnotami inhibice faktoru Xa K; mezi 100 μΜ a 1 pM.
Tabulka 3 Inhibitory faktoru Xa s hodnotou K; < 100 μΜ
| struktura | MS* | AA* |
| (2,2-diMe-propyl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (2-CF3-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (2-Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (2-Me-n-pentyl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (3,3-diMe-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| 3-fenoxypropionyl-Y-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| 5-Bzim-CO-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| 5-Bzim-CO-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Y(3,5-Br)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Y(3,5-I)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (Chx-CH2)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (iBu)Y-I-R-OH | OK | OK |
| (iBu)Y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| (iBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (Me)Y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| (Me)Y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| (Me)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (Me)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| 5-Hic-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(l,2,3,6-4H-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(l,2,3,6-4H-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2,3-diMe-n-pentyl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2,3-diMe-n-pentyl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-CF3-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-CF3-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-Me-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-Me-nBu)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-Me-n-pentyl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(2-Me-n-pentyl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(3,3-diMe-nBu) Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(3,3-diMe-nBu)Y~I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(3,3-diMe-n-pentyl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(3,3,5-Me-3-n-hexyl)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(3,3,5-Me-3-n-hexyl)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(4-pyridyl-CH2-)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(4-MeO-Bzl)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Bzl)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Chx-CH2)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(cyklopropyl-CH2)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(cyklopropyl-CH2)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Et-CH=C(CH3)-CH2)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Et-CH=C(CH3)-CH2)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
-26CZ 296439 B6
| Ac-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)Y-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)Y-I-Dab(NY-C3H7N)-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)Y-I-Om(N8-C3H7N)-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(iBu)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(íBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Me)Y-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Me)Y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Me)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(nBu)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-(trans-CH3-CH=C(CH3)-CH2)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Tyr(3,5-NO2)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-(Bzl)-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)G-NH2 | OK | OK |
| Ac-pAla-Y-I-R-G-NH2 | OK | OK |
| Ac-E-Y-I-R-L-K-NH,” | OK | OK |
| Ac-E-Y-I-R-L-P-K-NH, | OK | OK |
| Ac-F(pCONH2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pCONH2)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pF)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-f(pF)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pCN>-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pNH2)-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pNH2)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-F(pNH2)-Chg-R-(Bzl)G-G-OH | OK | OK |
| Ac-F(pNH2)-Chg-R-(Chx)G-G-OH | OK | OK |
| Ac-F(pNH2)-Chg-R-(CH3CH2CH2(CH3))G-G-OH | OK | OK |
| Ac-G-G-Y-I-R-G-NH2 | OK | OK |
| Ac-G-Y-Nle-R-L-NH2 | OK | OK |
| Ac-G-y-Nle-R-L-NH2 | OK | OK |
| Ac-G-Y-I-R-G-NH2 | OK | OK |
| Ac-G-Y-I-R-L-NH2 | OK | OK |
| Ac-Nal(l)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH2 | OK | OK |
| Ac-Nal(2)-Cha-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Nal(2)-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Nal(2)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Pgl(OH)-I-R-L-NH2 | OK | OK |
| Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-pAph-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Phe(pGua)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-S-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-W-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-W-L-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-(Me)-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y(Me)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-(allo-I)-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Cha-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-N(CH3)4 | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-Bzl-4-0Me | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2~Chx | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-N-(CH3)2 | OK | OK |
-27CZ 296439 B6
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-O-CH3 | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-COOH | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-Chx | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2(2-( 1 -Et)pyrrolidinyl) | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-NH-CH2(2-(6-EtO)benzylthiazolyl) | OK | OK |
| Ac-Y-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Nva-R(NO2)-{T(CH2NH)}-L-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Nva-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Pen(Me)-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-{T(CH2N(Ac)}-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-{T(CH2NH)}-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-{T(COCH2))-G-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-Dab(NT-C3H7N)-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-hR-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-nR-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-PalMe(3)-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-PalMe(3)-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-{T(CH2NH)}-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ac-y-I-R-N(Me)O-CH3 | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-NH-CH2--4—Pyridyl | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-NH-4—morfolinyl | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-NH-OCH3 | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-Nle-Hyp | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-Nle-A2P | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-piperidyl | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-I | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-I-P | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-A | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-A | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-A-A-F-T-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)3)-OH | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)6)-OH | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P)-OH | OK | OK |
| Ac-Y-I-R-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-K-R-L-E-NH? | OK | OK |
| Ac-Y-N-R-L-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-N-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Ac-Y-T(Me)-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| BAla-Y-I-R-G | OK | OK |
| pAla-Y-I-R-G-NH2 | OK | OK |
| Caff-I-R-NH2 | OK | OK |
| Cbz-I-R-L-NH2 | OK | OK |
| Cbz-Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| CClFr-CO-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| CF2H-CO-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| cf3-cf2co-y-i-r-l-p-nh2 | OK | OK |
| ch3-chci-co-y-i-r-l-p-nh2 | OK | OK |
| CH3-O-CO-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
-28CZ 296439 B6
| CH3CH2-O-CO-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| ci2chco-y-i-r-l-p_nh2 | OK | OK |
| C1CH2CO-Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| C-Y-I-R-L-C-NHo | OK | OK |
| D-Tic-I-R-L-A-A-F-T-NH2 | OK | OK |
| Et(Et)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| E-Y-I-R-K-NH, | OK | OK |
| E-Y-I-R-L-K-NH, | OK | OK |
| E-Y-I-R-L-P-K-NHt | OK | OK |
| F(pCl)-I-R-I-Sar-NH2 | OK | OK |
| F(pF)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| f(pF)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| F(pNH2)-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| F(pNO2)-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| f-I-R-F-P-NH2 | OK | OK |
| f-I-R-I-P-NH2 | OK | OK |
| f-i-r-l-nh2 | OK | OK |
| f-i-r-l-p-h-y-g-nh2 | OK | OK |
| f-i-r-l-y-v-w-n-nh2 | OK | OK |
| For-y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| For-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| G-G-Y-I-R-G-NH2 | OK | OK |
| g-y-i-r-d-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-f-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-g-nh2 | OK | OK |
| G-Y-I-R-G | OK | OK |
| G-Y-I-R-H-NH2 | OK | OK |
| g-y-i-r-i-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-k-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-l-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-l-p-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-l-p-a-m-nh2 | OK | OK |
| G-Y-I-R-L-P-P-V-NH2 | OK | OK |
| G-Y-I-R-L-P-Q-T-NH2 | OK | OK |
| G-Y-I-R-L-O-S-Q-NH2 | OK | OK |
| g-y-i-r-s-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-t-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-v-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-w-nh2 | OK | OK |
| g-y-i-r-y-nh2 | OK | OK |
| (pOH)C6H4-CH2CH2(OH)-CO-I-R-L-Sar-NH2 | OK | OK |
| (pOH)C6H4-CH2CH2CO-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| (pOH)C6H4-CH2CH2CO-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (pOH)C6H4-CH2CHOH-CO-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (pOH)C6H4-OCH(CH3)CO-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| (pOHjCsIL-OCHzCO-I-R-L-P-NHz | OK | OK |
| I-H-L-W-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| I-H-L-W-y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| I-Q-L-G-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| 4-MeO-C6H4-CO-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| N-morfolinyl-CO-F-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH2 | OK | OK |
| Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-Sar-NH2 | OK | OK |
| Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Nal(2)-I-R-C(Me)-P-NH2 | OK | OK |
-29CZ 296439 B6
| N-G-Y-I-R-L-I-H-NH2 | OK | OK |
| pal-C(SBut)-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| pal-I-R-C(SBut)-Hyp-NH2 | OK | OK |
| pal-I-R-C(SBut)-P-NH2 | OK | OK |
| Pgl(OH)-I-R-L-NH2 | OK | OK |
| Ph-C(NOCH2Ph)-CO-I-R-NH2 | OK | OK |
| Ph-CH=CH-CO-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ph-CH2CH2CH2-CO-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Ph-CH2CH2CO-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Pth-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| s-y-i-r-l-p-nh2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-Dab(Ny-C3H7N)-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-Om(N5-C3H7N)-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-PalMe(3)-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-R-OH | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-R-G-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-(Me)Y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| Tfa-Y(Me)I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-Y-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| Tfa-Y-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Tfa-Y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| T-F-G-Y-I-R-K-A-NH2 | OK | OK |
| Tos-Y-I-R-NH2 | OK | OK |
| Tos-G-I-R-V-Sar-NH2 | OK | OK |
| Tyr(Me)-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| W-F-R-E-M-G-G-G-G-NH2 | OK | OK |
| w-i-r-e-k-nh2 | OK | OK |
| w-i-r-n-p-nh2 | OK | OK |
| w-i-r-t-p-nh2 | OK | OK |
| w-L-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| w-l-r-l-a-nh2 | OK | OK |
| w-l-r-l-a-g-g-g-g-g-nh2 | OK | OK |
| w-l-r-v-a-nh2 | OK | OK |
| w-l-r-v-a-nh2 | OK | OK |
| W-L-R-V-A-G-G-G-G-G-NH2 | OK | OK |
| y(Me)-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| y-Chg-R-NH2 | OK | OK |
| y-Chg-R-L-NH2 | OK | OK |
| y-Chg-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| y-Tle-R-Nle-P-NH2 | OK | OK |
| y-Tle-R-Nle-A2P-NH2 | OK | OK |
| y-I-(nR)-L-A-NH2 | OK | OK |
| y-I-R(COCH2)-G-P-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-E-F-S-D-Y-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-G-A-NH2 | OK | OK |
-30CZ 296439 B6
| y-I-R-I-NH2 | OK | OK |
| Y-I-R-I-Y-NH2 | OK | OK |
| y-i-r-i-y-e-r-e-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-l-nh2 | OK | OK |
| y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-L-a-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-L-A-NH2 | OK | OK |
| y-i-r-l-a-a-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-l-a-a-f-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-l-a-a-f-t-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-l-m-e-m-t-nh2 | OK | OK |
| y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| y-I-R-L-P-NH2 | OK | OK |
| Y-I-R-L-P-G-L-L-NH2 | OK | OK |
| y-i-r-l-t-k-m-w-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-v-a-q-l-y-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-v-m-n-h-r-nh2 | OK | OK |
| y-i-r-y-r-n-p-i-nh2 | OK | OK |
| y-r-y-p-r-d-r-n-nh2 | OK | OK |
| y-l-r-f-p-nh2 | OK | OK |
Ms - hmotová spektrometrie, AA - analýza aminokyselin
- podtržení označuje cyklizovanou část peptidu
Příklad XXXVII
Inhibice vybraných čištěných koagulačních enzymů a jiných serinových proteázzw vitro
Schopnost sloučeniny podle vynálezu inhibovat faktor Xa, thrombin, elastázu a tiypsin byla zjišťována stanovením koncentrace peptidu YIR, která inhibuje aktivitu enzymu o 50 % (IC50). Čištěné enzymy byly použity při testech chromogenity. Pro stanovení inhibiční konstanty byla hodnota IC50 korigována na kompetici se substrátem s použitím vzorce
K; = IC50 x (l/{ 1 + ((koncentrace substrátu)/Km substrátu)}) (Chen a Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3018 (1973), přičemž tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz).
a) Test faktoru Xa
Pro tento test byl použit pufr TBS-P (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,05 % (w/v) PEG-8000, 0,2 % (w/v) NaN3). Hodnota IC50 byla stanovena tak, že v příslušných jamkách mikrotitrační plotny Costar s poloviční plochou bylo kombinováno 25 μΐ lidského faktoru Xa (Enzyme Research Laboratories, lne., South Bend, IN) v TBS-P, 40 μΐ 10% (v/v) DMSO v TBS-P (neinhibovaná kontrola) nebo různých koncentrací testovaného peptidu, zředěného v 10% (v/v) DMSO v TBS-P, a substrátu S-2765 (Na-benzyloxykarbonyl-D-Arg-Gly-L-Argp-nitroanilid; Kabi Pharmacia, lne., Franklin, OH) v TBS-P.
Testy byly prováděny preinkubací peptidického inhibitoru plus enzymu po dobu 10 min; pak byl zahájen test přídavkem substrátu do získání konečného objemu 100 μΐ. Počáteční rychlost hydrolýzy chromogenního substrátu byla měřena změnou absorbance při 405 nM s použitím kinetického deskového čítače Bio-tek Instruments (Ceres UV900HDÍ) při 25 °C během lineární části časového průběhu (obvykle 1 až 5 min po přídavku substrátu). Koncentrace inhibitoru, která způsobila 50% pokles rychlosti hydrolýzy substrátu, byla odhadnuta z lineární regrese po vynesení
-31 CZ 296439 B6 relativních rychlostí hydrolýzy (v porovnání s neinhibovanou kontrolou) proti logaritmu koncentrace peptidu. Koncentrace peptidu byla 0,5 nM a koncentrace substrátu byla 140 μΜ.
b) Test thrombinu
Pro tento test byl použit pufr TBS-P. Hodnota IC50 byla stanovena způsobem popsaným v příkladu XXXVII.a) s tou výjimkou, že jako substrát byl použit S-2366 (L-PyroGlu-L-Pro-LArg-p-nitroanilid; Kabi) a enzymem byl lidský thrombin (Enzyme Research Laboratories, lne.; South Bend, IN). Koncentrace enzymu byla 1 nM a koncentrace substrátu 175 μΜ.
c) Test plazminu
Pro tento test byl použit pufr TBS-P. Hodnota IC50 byla stanovena způsobem popsaným v příkladu XXXVH.a) s tou výjimkou, že jako substrát byl použit S-2251 ((D-Val-L-Leu-L-Lys-pnitroanilid; Kabi) a enzymem byl lidský plazmin (Kabi). Koncentrace enzymu byla 5 nm a koncentrace substrátu 300 μΜ.
d) Test trypsinu
Pro tento test byl použit pufr TBS-P s obsahem 10 mM CaCl2. Hodnota IC50 byla stanovena způsobem popsaným v příkladu XXXVII.a) s tou výjimkou, že jako substrát byl použit ΒΑΡΝΑ (benzoyl-L-Arg-p-nitroanilid; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) a enzymem byl hovězí pankreatický trypsin (typ XIII, ošetřený TPCK; Sigma). Koncentrace enzymu byla 50 nM a koncentrace substrátu 300 μΜ.
e) Test elastázy
Pro tento test byl použit pufr Tris-Cl, pH 7,4, 300 mM NaCl, 2 % (v/v) N-methylpyrrolidonu, 0,01 % (v/v) NaN3. Hodnota IC50 byla stanovena způsobem popsaným v příkladu XXXVII.a) s tou výjimkou, že jako substrát byl použit sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (CalbiochemNova Biochem Corp.; San Diego, CA) a enzymem byla lidská neutrofilová elastáza (Athens Research and Technology, lne.; Athens, GA) Koncentrace enzymu byla 75 nM a koncentrace substrátu 600 μΜ.
Hodnoty K; pro vybrané testované sloučeniny v porovnání s kontrolní sloučeninou „TENSTOP“ (Ν-α-tosyl-Gly-p-amidinofenylalaninmethylester; Američan Diagnostica, lne.; Greenwich, CT), což je reverzibilní inhibitor faktoru Xa (Sturzebecher a d., Thromb. Res. 54:245-252 (1989); Hauptmann a d., Thromb. Haem. 63:220-223 (1990), přičemž tyto publikace jsou zde zahrnuty jako odkaz) jsou uvedeny výše v tabulce 2. Výsledky demonstrují, že peptidy YIR podle vynálezu mohou inhibovat aktivitu faktoru Xa, avšak v podstatě neinhibují aktivitu různých jiných serinových proteáz včetně thrombinu a plazminu, které se účastní procesu koagulace krve a fibrinolýzy.
Příklad XXXVIII
Testy pro stanovení inhibice koagulace
Sloučeniny podle vynálezu byly testovány na schopnost inhibovat aktivitu faktoru Xa. Účinnost různých sloučenin byla hodnocena pomocí testu prothrombinové doby (PT) in vitro s použitím spojené plazmy od lidského dárce. Byl rovněž použit test ex vivo, při němž byla plazma shromažďována v různých časových intervalech po intravenózní (iv) aplikaci sloučeniny krysám a králíkům nebo intraduodenální aplikaci krysám a analyzována pomocí testu PT pro stanovení poločasu plazmy. Test PT byl zahájen ředěním thromboplastinu, zvoleným tak, aby bylo možno získat prodloužený a vysoce reprodukovatelný konečný bod koagulace, a označovaným jako dále
-32CZ 296439 B6 popsaný „test doby zředěného prothrombinu“. Účinnost různých sloučenin byla stanovena rovněž pomocí krysího modelu trombózy s použitím krysího arteriovenózního zkratu in vivo.
a) Test doby zředěného prothrombinu in vitro
100 μΐ předehřáté (37 °C) spojené lidské plazmy chudé na destičky (PPP) bylo přidáno do pohárku fíbrometru (Baxter Diagnostics, lne.; McGraw Park, IL). Bylo přidáno 50 μΐ různých koncentrací testovaných sloučenin vTBS-BSA s vápníkem (50 mM Tris-Cl, lOOmM NaCl, 0,1 % (w/v) bovinního sérového albuminu, 20 mM CaCl2). V kontrolních experimentech byl pro měření doby neinhibované koagulace přidáván TBS-BSA s vápníkem, avšak bez testované sloučeniny. Do pohárku fíbrometru bylo přidáno 150 μΐ zředěného předehřátého králičího thromboplastinu (Baxter) s vápníkem a byl zapnut časovač fíbrometru. Před testováním sloučeniny byla získána zřeďovací křivka králičího thromboplastinu, která se používá k výběru takového zředění thromboplastinu, které poskytuje dobu PT u neinhibované kontroly alespoň 30 s. Pokusná koncentrace poskytující 50% inhibici koagulace (EC50) s testovanou sloučeninou (viz dále tabulka 4) byla vypočtena z dob zřeďovací křivky.
Alternativně byl test doby zředěného prothrombinu proveden s použitím „výzkumné“ varianty na automatizovaném koagulačním zařízení Instrumentation Laboratories (IL) ACL3000-plus (IL, Milán, Itálie). Thromboplastin byl ředěn do dosažení doby srážení 30 až 35 s. Tato doba srážení byla vzata jako aktivita 100 %. Standardní křivka pro kalibraci byla stanovena postupným dvojnásobným ředěním zředěného thromboplastinového činidla (králičí mozkový thromboplastin IL). Během testu byl vzorek 50 μΐ (plazma oddělená centrifiigováním) smísen se 100 μΐ thromboplastinového činidla a každých 169 s byly odečítány nefelometrické hodnoty. Doba koagulace byla stanovena z maximální rychlosti změny rozptylu světla vypočtené zařízením. Inhibice se vyjadřuje jako procento aktivity stanovené porovnáním s kalibrační křivkou.
b) Test doby zředěného prothrombinu ex vivo
Testovaná sloučenina byla podávána iv schváleným postupem buď od ocasní žíly (krysa), nebo do ušní žíly (králík). V časových intervalech po aplikaci testované sloučeniny byly odebírány vzorky po 1 ml krve z kanylované karotidy (krysa) nebo ušní tepny (králík). Po odstředění k získání PPP byla plazma okamžitě uložena na led nebo zmrazená.
Ke stanovení doby zředěného prothrombinu byla plazma předehřátá a testována výše popsaným způsobem. Procento inhibice bylo vypočteno ze zřeďovací křivky thromboplastinu, která byla provedena u každé série vzorků a použita ke stanovení doby, v níž zůstane v plazmě přibližně 50% počáteční antikoagulační aktivity (Ti/2). Výsledky tohoto experimentu demonstrují, že peptidy YIR podle vynálezu mohou inhibovat koagulaci krve in vitro a po aplikaci in vivo (viz tabulka 4).
Tabulka 4 Aktivity a poločasy vybraných inhibitorů
| ec50 | |||
| spojená lidská | krysí | králičí | |
| struktura | in vitro | ex vivo | ex vivo |
| Ac-Y-Chg-R-NH2 | 2,5 μΜ | 5 min | 5 min |
| Ac-Y-Chg-R-L-P-NH2 | 225 nM | 5 min | 5 min |
| Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 | 140 nM | 6 min | 5 min |
| Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2 | 300 nM | 15 min | 10 min |
Různé sloučeniny byly rovněž testovány na antikoagulační aktivitu s použitím testu doby zředěného prothrombinu ex vivo po aplikaci bolusu iv v různých dávkách u krys. Sloučeniny uvedené v tabulce 5 vykázaly alespoň 30% inhibici po 10 min od podání < 2 mg/kg uvedené sloučeniny. Tyto výsledky demonstrují, že různé reprezentativní peptidy YIR podle vynálezu mají podstatnou
-33CZ 296439 B6 aňtikóagulační aktivitu. Struktura všech sloučenin uvedených v tabulce 5 byla potvrzena pomocí MSaAA.
Tabulka 5
1. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx
2. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT
3. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx
4. Ac-FÍpNHzy-Chg-Dab^-CaNHTÍL-P'-^
5. Bz-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
6. Tos-F(pNH2>-Chg-R-L-P-NH2
7. Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH2
8. Ac-pAph-Chg-AMP(4)
9. y-Chg-R-L-NH2
10. Ac-F(pNH2)-Chg-R-ol
11. Cyclopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
12. 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
13. Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
14. 3-Iqc-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
15. Ac-F (pNH2)-Chg-R-Thiazolyl
16. 2-Furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
17. 5-Me-ťhienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
18. Ac-Nal(2)-Chg-R-Thiazolyl
19. 2-Bzf-f(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
20. Ac-pAph-Chg-Dab(NY-C3NH7)-L-P-NH2
21. Ac-Om-Nal(2)-Chg-PalMe(3)-Sar-E-NH/
22. Ac-Phe(3-I,4—NH2)-Chg-R-L-P-NH2
23. Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH2
24. Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH2
25. Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH2COOH)-P-NH2
26. Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2
27. AC-F(pNH2)-Chg-R-(Me)L-P-NH2
28. Ac-F(pNH2)-Chg-R-OEt
29. Ac-F(pNH2)-Chg-Om(N* 5 *-C3H7N)-L-P-NH2
30. Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
31. Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2
32. Ac-pAph-Chg-Dab(N7-C3H7N)
33. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
34. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2
35. Ac-pAph-Chg-R-NH2
36. Ac-pAph-Chg-R-OH
37. Ac-Y-Chg-R-NH-Nip-NH2
38. Ac-K-Nal(2)-Chg-R-Hvp-E-NH2
39. DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NH2
40. DIPA-mF(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
41. Isn-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
42. Pza-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
43. Tfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
44. Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2
45. Tfa-(iBu)Y-I-Om(Ns-C3H7N)-L-P-NH2 * — podtržení označuje cyklickou část sloučeniny
V některých experimentech byly testované sloučeniny aplikovány krysám intraduodenálně.
Samci krys Sprague-Dawley o hmotnosti přibližně 300 g byli anestetizováni schváleným postu-34CZ 296439 B6 pem subkutánně kombinací ketamin/xylazin. Pravá karotida byla kanylována pro odběr vzorků. Byla provedena laparotomie a duodenum bylo kanylováno jehlou s kulatým hrotem a podvázáno tak, aby šev byl vzdálen od místa vpichu. Další smyčka byla umístěna v blízkosti místa vpichu k zamezení úniku žaludečního obsahu. Účinnost švu při zabraňování sloučenině v dosažení místa vpichu byla testována v závěru každého experimentu tlakovou zkouškou. Bod vpichu byl přibližně 4 cm od spojení duodena se žaludkem. Sloučeniny byly podávány v 1 ml normálního salinického roztoku. Před podáním testované sloučeniny a po 15, 30, 60, 90 a 120 min po jejím podání byl odebrán vzorek 0,7 ml krve. Plazma byla oddělena centrifugováním a testována na inhibici koagulace s použitím testu doby zředěného prothrombinu.
Po intraduodenální aplikaci < 50 mg/kg sloučeniny vykázaly alespoň 30% inhibici při testu doby zředěného prothrombinu tyto sloučeniny: Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx, Ac-pAphChg-PalMe(3)-NH-Chx, Bzf-pAph-Chg-PalMe^j-NIfy, Ac-F(NH2)-Chg-R-L-P-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-pAph-Chg-AMP(4), cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 2-furoylpAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 5-Me-thienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-Y(3-I)-Chg-RL-P-NH2, Ac-F(pNH2)-Chg-R-ol a Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol.
c) Model trombózy krysím arterizovenózním zkratem
Antithrombotická účinnost různých sloučenin podle vynálezu byla testována s použitím krysího mimotělního arteriovenózního (AV) zkratu. Obvod AV zkratu byl tvořen 20 cm trubičky z polyethylenu (PE) 60, zavedené do pravé karotidy, 6 cm PE trubičky 160 obsahující mercerované bavlněné vlákno o délce 6,5 cm (5 cm vystaveno průtoku krve) a druhým úsekem trubičky PE 60 (20 cm), uzavírajícím obvod do levé jugulámí žíly. Celý obvod byl před zavedením vyplněn normálním salinickým roztokem.
Testované sloučeniny byly podávány kontinuální infuzi do ocasní žíly pomocí injekční pumpy a křídlatého katetru (infuzní objem 1,02 ml/h). Sloučenina byla podávána po dobu 30 min, pak byl zkrat otevřen a po dobu 15 min byla ponechána protékat krev (celkem 45 min infuze). Po uplynutí těchto 15 min byl zkrat zaškrcen, vlákno bylo opatrně vyjmuto a zváženo na analytických vahách. Procento inhibice tvorby trombů bylo vypočteno pomocí hmotnosti trombu získané u kontrolních krys, které dostávaly infuzi salinického roztoku.
Růst trombu inhibovaly po infuzi < 33 pg/kg/min o alespoň 30 % tyto sloučeniny: Ac-pAphChg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx, Bzf-pAph-Chg-PalMe(3}_ NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-pAph-ChgAMP(4), cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 5-Me-thienyI-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, AcpAph-Chg-PalMe(3)-ol a Tos-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2.
Přestože je vynález popsán s odkazem na uvedená provedení, je odborníkovi zřejmé, že konkrétní příklady slouží pouze kjeho objasnění a že je možno bez překročení myšlenky vynálezu provádět různé modifikace. Vynález je tedy omezen pouze následující patentovými nároky.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (17)
1. Peptid, specificky inhibující aktivitu faktoru Xa, obecného vzorce
A1-A2-A3-B kde
-35CZ 296439 B6
Ai je zbytek Tyr, F(pNH2), mAph, pAph nebo Nal(2), které obsahují žádnou nebo jednu chránící skupinu aminoskupiny,
A2 je zbytek Ile nebo Chg,
A3 je zbytek Arg, PalMe(3), Dab(N7-C3H7N), Dap(Np-C3H7N) nebo Om(N5-C3H7N) a
B je zbytek -H, -OH, -NH2, jeden až pět aminokyselinových zbytků nebo chránící skupina karboxylu, přičemž Tyr je tyrosin, F(pNH2) je p-aminofenylalanin, mAph je m-amidinofenylalanin, pAph je p-amidinofenylalanin, Nal(2) je 2-naftylalanin, Ile je izoleucin, Chg je cyklohexylglycin, Arg je arginin, PalMe(3) je p-(3-N-methylpyridinium)-alanin, Dap(N7-C3H7N) je dimethylamidinium 2,3-diaminopropionové kyseliny, Dab(Np-C3H7N) je dimethylamidinium 2,4-diaminomáselné kyseliny a Om(N5-C3H7N) je dimethylamidinium omithinu, včetně jeho farmaceuticky přijatelných solí.
2. Peptid podle nároku 1, kde chránící skupina aminoskupiny je vybrána ze souboru zahrnujícího formyl, acetyl, pikolyl, Zerc-butylacetyl, terc-butyloxykarbonyl, benzyloxykarbonyl, 2-aryl2-O-benzyloxim, aminoacyl, benzoyl, tosyl, 3-fenoxypropionyl, 5-benzimidazolkarboxy, skupinu vzorce CC1F2-CO, CF2H-CO, CF3-CF2CO, CH3-CHC1-CO, CH3-O-CO, CH3-SO2, CH3CH2-O-CO, C12CHCO, C1CH2CO, (pOH)C6H4-CH2CH(OH)-CO, (pOHJC^-^HzCHOHCO, (pOH)C6H4-OCH(CH3)CO, (pOHjC^-OCH.CO, 4-MeO-C6H4-CO, N-morfolinyl-CO, PhC(NOCH2Ph)-CO, Ph-CH=CH-CO, Ph-CH2CH2CH2-CO, Ph-CH2CH2CO, trifluoracetyl, nebo se jedná o substituci N-terminální aminoskupiny skupinou cyklopentylkarboxy, izochinolylkarboxy nebo pyrazinkarboxy.
3. Peptid podle nároku 1 nebo 2, kde farmaceuticky přijatelnou solí je adiČní sůl s kyselinou.
4. Peptid podle nároku 3, kde adiční sůl s kyselinou je sůl vytvořená s anorganickou kyselinou vybranou ze souboru zahrnujícího kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovou kyselinu fosforečnou, kyselinu sírovou nebo kyselinu chloristou nebo sůl vytvořená s organickou kyselinou vybranou ze souboru zahrnujícího kyselinu octovou, kyselinu šťavelovou, kyselinu maleinovou, kyselinu jablečnou, kyselinu vinnou, kyselinu citrónovou, kyselinu jantarovou nebo kyselinu malonovou.
5. Peptid podle nároku 1 nebo 2, kde farmaceuticky přijatelná sůl je vybrána ze souboru zahrnujícího anorganický nitrát, sulfát, acetát, malát, formiát, laktát, tartrát, sukcinát, citrát a p-toluensulfonát.
6. Peptid podle nároku 5, kde farmaceuticky přijatelnou solí je p-toluensulfonát.
7. Peptid podle nároků 1 a 3 až 6, kde chránící skupina aminoskupiny je vybrána ze souboru zahrnujícího methyl, ethyl, n-propyl, izopropyl, seAr-butyl, 1-methylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2-methylpentyl, 2,2-dimethylpropyl, n-pentyl, n-hexyl, cyklopentyl, cyklohexyl, methyl-cyklohexyl a cyklopropyl-methylen, formyl, acetyl, benzoyl, benzyl, pikolyl.
8. Peptid podle nároků 1 až 6, kde význam B je vybrán ze souboru zahrnujícího alkoxymethylové skupiny, a-(Ci-C4)alkoxyethylové skupiny, 2-oxo-l,3-dioxolen-4-ylmethylové skupiny, Ci-C3alkylthiomethylové skupiny, acyloxymethylové skupiny, a-acyloxy-a-substituované methylové skupiny, l-(Ci~C4alkyloxykarbonyloxy)eth-l-ylové skupiny a l-(Ci-C4alkylaminokarbonyloxy)eth-l-ylové skupiny.
-36CZ 296439 B6
9. Peptid podle nároku 8, kde význam B je vybrán ze souboru zahrnujícího methoxymethyl, ethoxymethyl, izopropoxymethyl, methoxyethyl, ethoxyethyl, propoxyethyl, izopropoxyethyl, 5-methyl-2-oxo-l ,3-dioxolen-4-ylmethyl, 5-fenyl-2-oxo-l ,3-dioxolen-4-ylmethyl, methyl-
5 thiomethyl, ethylthiomethyl, izopropylthiomethyl, pivaloyloxymethyl, a-acetoxymethyl·, ethoxykarbonyl-l-methyl, α-acetoxyethyl, 3-ftalidyl, 5,6-dimethylftalidyl, l-(ethoxykarbonyloxy)eth-l-yl a l-(methylaminokarbonyloxy)eth-l-yl.
10. Peptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vybraný ze skupiny zahrnující io acetyl-p-amidinofenylalanyl-He-Arg-Leu-Pro-NH2, m-N,N-diizopropylkarboxamido-p-aminofenylalanyl-cyklohexylglycyl-Arg-Leu-Pro-NH2, acetyl-p-amidinofenylalanyl-cyklohexylglycyl-p-(3-N-methylpyridinium)-alanyl-NH2, acetyl-Tyr-cyklohexylglycyl-Arg-OH,
15 acetyl-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2, acetyl-Tyr-He-Arg-Leu-Pro-NH2, acetyl-Tyr-He-Arg-N(CH3)O(CH3), acetyl-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyl), acetyl-Tyr-Ile-2,4-<iiaminobutyroyldimethylamidinium-Leu-Ala-NH2 a
20 acetyl-Tyr-He-3-(3-N-methylpyridinium)-alanyl-NH2.
11. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje peptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 10.
25
12. Farmaceutický přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič.
13. Použití peptidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 pro přípravu farmaceutického přípravku pro specifickou inhibici aktivity faktoru Xa.
14. Použití podle nároku 13, kde farmaceutický přípravek je pro léčení kardiovaskulární poruchy vybrané ze skupiny zahrnující restenózu po angioplastice, syndrom respirační tísně dospělých, multiorgánové selhání, mrtvici a poruchu srážlivosti s roztroušeným intravaskulámím srážením.
15. Použití podle nároku 13, kde farmaceutický přípravek je pro léčení komplikací spojených s chirurgickým zákrokem, vybraných ze skupiny zahrnující trombózu hlubokých a proximálních žil.
40
16. Použití podle nároku 13, kde farmaceutický přípravek je pro snížení nebo inhibici krevní srážlivosti.
17. Použití peptidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 jako antikoagulancia pro prevenci srážení krevního vzorku.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23305494A | 1994-04-26 | 1994-04-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ314096A3 CZ314096A3 (en) | 1997-05-14 |
| CZ296439B6 true CZ296439B6 (cs) | 2006-03-15 |
Family
ID=22875692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0314096A CZ296439B6 (cs) | 1994-04-26 | 1995-04-25 | Inhibitory faktoru Xa |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0758341B1 (cs) |
| JP (1) | JP3655632B2 (cs) |
| KR (1) | KR100380124B1 (cs) |
| CN (1) | CN1181091C (cs) |
| AT (1) | ATE262536T1 (cs) |
| AU (1) | AU707653B2 (cs) |
| CA (1) | CA2186497C (cs) |
| CZ (1) | CZ296439B6 (cs) |
| DE (1) | DE69532754T2 (cs) |
| DK (1) | DK0758341T3 (cs) |
| EE (1) | EE03973B1 (cs) |
| ES (1) | ES2214500T3 (cs) |
| FI (1) | FI120494B (cs) |
| HU (1) | HUT76346A (cs) |
| IL (1) | IL113505A (cs) |
| LT (1) | LT4218B (cs) |
| LV (1) | LV11740B (cs) |
| NO (1) | NO318759B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ284977A (cs) |
| PL (1) | PL188132B1 (cs) |
| PT (1) | PT758341E (cs) |
| RU (1) | RU2152954C1 (cs) |
| SI (1) | SI9520044B (cs) |
| SK (1) | SK286094B6 (cs) |
| TW (1) | TW409129B (cs) |
| WO (1) | WO1995029189A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA953361B (cs) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA199700186A1 (ru) * | 1995-02-17 | 1998-02-26 | Басф Акциенгезельшафт | Новые дипептидные амидины, используемые в качестве ингибиторов тромбина |
| US5747458A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-05 | Chiron Corporation | Urokinase receptor ligands |
| US6069130A (en) * | 1995-06-07 | 2000-05-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Ketoheterocyclic inhibitors of factor Xa |
| DK0868526T3 (da) * | 1995-12-20 | 2002-12-02 | Aventis Pharma Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af N-acetyl(L)-4-cyanophenylalanin Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH og N-acetyl-(L)-p-amidinophenylalanincyclohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alanin Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 |
| US5766932A (en) * | 1995-12-20 | 1998-06-16 | Hoechst Marion Roussel, Inc. | Process for preparing N-acetyl(L)-4-cyanophenylalanine from a mixture of the corresponding D,L ethyl esters using subtilisin |
| US6194435B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-02-27 | Cor Therapeutics, Inc. | Lactams as selective factor Xa inhibitors |
| US6262047B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-07-17 | Cor Therapeutics, Inc. | Selective factor Xa inhibitors |
| US6369080B2 (en) | 1996-10-11 | 2002-04-09 | Cor Therapeutics, Inc. | Selective factor Xa inhibitors |
| US6063794A (en) | 1996-10-11 | 2000-05-16 | Cor Therapeutics Inc. | Selective factor Xa inhibitors |
| US6369063B1 (en) | 1997-04-14 | 2002-04-09 | Cor Therapeutics, Inc. | Selective factor Xa inhibitors |
| WO1998046626A1 (en) | 1997-04-14 | 1998-10-22 | Cor Therapeutics, Inc. | SELECTIVE FACTOR Xa INHIBITORS |
| CA2285705A1 (en) * | 1997-04-14 | 1998-10-22 | Cor Therapeutics, Inc. | Selective factor xa inhibitors |
| US7109326B2 (en) | 1997-04-15 | 2006-09-19 | Genentech, Inc. | Halo-alkoxycarbonyl prodrugs |
| US6218382B1 (en) | 1997-08-11 | 2001-04-17 | Cor Therapeutics, Inc | Selective factor Xa inhibitors |
| US6333321B1 (en) | 1997-08-11 | 2001-12-25 | Cor Therapeutics, Inc. | Selective factor Xa inhibitors |
| US6228854B1 (en) | 1997-08-11 | 2001-05-08 | Cor Therapeutics, Inc. | Selective factor Xa inhibitors |
| GB9727123D0 (en) * | 1997-12-22 | 1998-02-25 | Int Centre Genetic Eng & Bio | Synthesis of diamines |
| DE69829879T2 (de) | 1997-12-24 | 2006-03-02 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Indolderivate als faktor xa inhibitoren |
| EP0987274A1 (en) * | 1998-09-15 | 2000-03-22 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Factor VIIa Inhibitors |
| EP1016663A1 (en) * | 1999-01-02 | 2000-07-05 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor Xa activity) |
| EP1022268A1 (en) * | 1999-01-02 | 2000-07-26 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Arylalkanoyl derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them |
| WO2000040571A1 (en) | 1999-01-02 | 2000-07-13 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor xa activity) |
| IL144095A0 (en) | 1999-01-02 | 2002-05-23 | Aventis Pharma Gmbh | Arylalkanoyl derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them |
| EP1059302A1 (en) * | 1999-06-08 | 2000-12-13 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Factor VIIa inhibitors |
| EP1095933A1 (en) | 1999-10-30 | 2001-05-02 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them |
| JP5088598B2 (ja) * | 1999-12-14 | 2012-12-05 | 昭和電工株式会社 | シアノベンジルアミン類の塩の製造方法 |
| EP1151989A4 (en) * | 1999-12-14 | 2009-01-21 | Showa Denko Kk | PROCESS FOR PRODUCING A CYANOBENZYLAMINE SALT OR ONE OF ITS DERIVATIVES |
| HUP0301986A2 (hu) | 2000-01-28 | 2003-09-29 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh. | Eljárás acetil-amidinofenilalanil-ciklohexilglicil-piridinioalanin-amidok elżállítására, valamint kiindulási anyagok és köztitermékek |
| EP1127884A1 (en) | 2000-02-26 | 2001-08-29 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use as inhibitor of factor XA activity and pharmaceutical compositions containing them |
| DE10029015A1 (de) | 2000-06-15 | 2001-12-20 | Curacyte Ag | Hemmstoffe für den Gerinnungsfaktor Xa |
| EE200300192A (et) * | 2000-12-06 | 2003-08-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Guanidiini ja amidiini derivaadid, nende valmistamismeetod ja kasutamine, farmatseutiline preparaatning eelravim |
| EP1314733A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Indole-2-carboxamides as factor Xa inhibitors |
| US7838560B2 (en) | 2002-03-11 | 2010-11-23 | The Medicines Company (Leipzig) Gmbh | Urokinase inhibitors, production and use thereof |
| WO2004050637A2 (en) | 2002-12-03 | 2004-06-17 | Axys Pharmaceuticals, Inc. | 2-(2-hydroxybiphenyl-3-yl)-1h-benzoimidazole-5-carboxamidine derivatives as factor viia inhibitors |
| US7358268B2 (en) | 2002-12-04 | 2008-04-15 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Imidazole derivatives as factor Xa inhibitors |
| US7429581B2 (en) | 2002-12-23 | 2008-09-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pyrazole-derivatives as factor Xa inhibitors |
| DE10301300B4 (de) | 2003-01-15 | 2009-07-16 | Curacyte Chemistry Gmbh | Verwendung von acylierten 4-Amidino- und 4-Guanidinobenzylaminen zur Inhibierung von Plasmakallikrein |
| US7223780B2 (en) | 2003-05-19 | 2007-05-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Triazole-derivatives as blood clotting enzyme factor Xa inhibitors |
| US7741341B2 (en) | 2003-05-19 | 2010-06-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Benzimidazole-derivatives as factor Xa inhibitors |
| EP1479680A1 (en) | 2003-05-19 | 2004-11-24 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Azaindole derivatives as Factor Xa inhibitors |
| US7317027B2 (en) | 2003-05-19 | 2008-01-08 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Azaindole-derivatives as factor Xa inhibitors |
| EP1479677A1 (en) | 2003-05-19 | 2004-11-24 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | New indole derivatives as factor xa inhibitors |
| EP1479675A1 (en) | 2003-05-19 | 2004-11-24 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Indazole-derivatives as factor Xa inhibitors |
| DE10342108A1 (de) | 2003-09-11 | 2005-04-14 | Curacyte Chemistry Gmbh | Basisch-substituierte Benzylaminanaloga als Inhibitoren des Gerinnungsfaktors Xa, ihre Herstellung und Verwendung |
| EP1568698A1 (en) | 2004-02-27 | 2005-08-31 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Pyrrole-derivatives as factor Xa inhibitors |
| AU2005299693B2 (en) | 2004-10-26 | 2012-07-05 | Janssen Pharmaceutica, N.V. | Factor Xa compounds |
| EP1724269A1 (en) | 2005-05-20 | 2006-11-22 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Heteroaryl-carboxylic acid (sulfamoyl alkyl) amide - derivatives as factor Xa inhibitors |
| DE102005044319A1 (de) | 2005-09-16 | 2007-03-22 | Curacyte Chemistry Gmbh | 2-(Aminomethyl)-5-Chlor-Benzylamid-Derivate und ihre Verwendung als Hemmstoffe des Gerinnungsfaktors Xa |
| DE102006050672A1 (de) | 2006-10-24 | 2008-04-30 | Curacyte Discovery Gmbh | Hemmstoffe des Plasmins und des Plasmakallikreins |
| EP1918718A1 (de) * | 2006-10-31 | 2008-05-07 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Vorrichtungen zur elektrochemischen Bestimmung von Faktor Xa-Inhibitoren in Blutproben |
| AU2008239659B2 (en) | 2007-04-13 | 2013-09-05 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Combination anticoagulant therapy with a compound that acts as a factor Xa inhibitor |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| CA1161431A (en) * | 1979-05-11 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives |
| US4469679A (en) * | 1983-02-16 | 1984-09-04 | Smithkline Beckman Corporation | Octapeptide vasopressin antagonists |
| HU191961B (en) * | 1984-08-02 | 1987-04-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing 1,5 and 8 substituted peptides of angiotenzin-ii antagonistic activity |
| EP0627929B1 (en) * | 1992-02-14 | 1998-09-30 | Corvas International, Inc. | Inhibitors of thrombosis |
-
1995
- 1995-04-25 AU AU23683/95A patent/AU707653B2/en not_active Ceased
- 1995-04-25 SI SI9520044A patent/SI9520044B/sl not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 DK DK95917736T patent/DK0758341T3/da active
- 1995-04-25 JP JP52785395A patent/JP3655632B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-25 ZA ZA953361A patent/ZA953361B/xx unknown
- 1995-04-25 EP EP95917736A patent/EP0758341B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-25 CN CNB951928112A patent/CN1181091C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-25 AT AT95917736T patent/ATE262536T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 DE DE69532754T patent/DE69532754T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-25 ES ES95917736T patent/ES2214500T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-25 RU RU96122647/04A patent/RU2152954C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 CA CA002186497A patent/CA2186497C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-25 SK SK1366-96A patent/SK286094B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 CZ CZ0314096A patent/CZ296439B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 NZ NZ284977A patent/NZ284977A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 KR KR1019960706004A patent/KR100380124B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 WO PCT/US1995/005268 patent/WO1995029189A1/en active IP Right Grant
- 1995-04-25 PT PT95917736T patent/PT758341E/pt unknown
- 1995-04-25 EE EE9600146A patent/EE03973B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 EP EP03021617A patent/EP1384725A3/en not_active Withdrawn
- 1995-04-25 HU HU9602954A patent/HUT76346A/hu not_active Application Discontinuation
- 1995-04-26 IL IL11350595A patent/IL113505A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-05-11 TW TW084104681A patent/TW409129B/zh active
-
1996
- 1996-09-25 PL PL95317067A patent/PL188132B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-10-25 FI FI964317A patent/FI120494B/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-10-25 NO NO19964553A patent/NO318759B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-10-25 LT LT96-151A patent/LT4218B/lt not_active IP Right Cessation
- 1996-11-15 LV LVP-96-410A patent/LV11740B/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2186497C (en) | Factor xa inhibitors | |
| AU760580B2 (en) | Factor VIIa inhibitors | |
| JP2000505437A (ja) | セリンプロテアーゼ阻害剤 | |
| US7879792B2 (en) | Synthetic peptide inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4 | |
| US5849510A (en) | Factor Xa inhibitors | |
| CA2026376C (en) | Anticoagulant peptides | |
| US5192747A (en) | Anticoagulant peptides | |
| US6759384B1 (en) | Factor Xa inhibitors | |
| KR100330465B1 (ko) | 삼관능성항트롬빈및항혈소판펩티드 | |
| JP2899415B2 (ja) | 血液凝固のカスケードにおいて治療上活性である新規ペプチド誘導体、その製造方法、及びそれらを含有する医薬組成物 | |
| Odake et al. | Inhibition of thrombin by arginine-containing peptide chloromethyl ketones and bis chloromethyl ketone-albumin conjugates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110425 |