FI120494B - Tekijän Xa inhibiittoreita - Google Patents

Tekijän Xa inhibiittoreita Download PDF

Info

Publication number
FI120494B
FI120494B FI964317A FI964317A FI120494B FI 120494 B FI120494 B FI 120494B FI 964317 A FI964317 A FI 964317A FI 964317 A FI964317 A FI 964317A FI 120494 B FI120494 B FI 120494B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
chg
arg
paph
leu
pro
Prior art date
Application number
FI964317A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI964317A (fi
FI964317A0 (fi
Inventor
Fahad Al-Obeidi
Armin Walser
Pavel Safar
Michal Lebl
James A Ostrem
Alena Stierandova
Peter Strop
Original Assignee
Selectide Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Selectide Corp filed Critical Selectide Corp
Publication of FI964317A publication Critical patent/FI964317A/fi
Publication of FI964317A0 publication Critical patent/FI964317A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120494B publication Critical patent/FI120494B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0207—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)4-C(=0), e.g. 'isosters', replacing two amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

Tekijän Xa inhibiittoreita
Keksinnön tausta Keksinnön alue 5 Tämä keksintö koskee yleisesti veren hyydyttävien proteiinien inhibitiota ja tarkemmin määriteltynä spesifisiä entsyymihyytymistekijän Xa inhibiittoreita. Taustatietoja
Kyky muodostaa verihyytymiä on ehdottoman välttämä-10 töntä hengissä pysymisen kannalta. Eräissä tautitiloissa verihyytymien muodostuminen verenkiertojärjestelmän sisällä on kuitenkin itsessään sairauden lähde. Joskus voi siis olla toivottavaa estää verihyytymien muodostuminen. Ei ole kuitenkaan toivottavaa tukahduttaa hyytymisjärjestelmää täy-15 dellisesti, koska seurauksena olisi hengenvaarallinen hemor-ragia.
Verihyytymien muodostumisen suonten sisällä vähentämiseksi ammattimiehet ovat pyrkineet kehittämään protrom-binaasin tai tekijän Xa tehokkaan inhibiittorin, joka teki-20 jä on liittyneenä protrombinaasikompleksiin, jossa se aktivoi trombiinin hyytymän muodostumisen aikana.
• · • *.. Tekijän Xa inhibiittorin sopivat pitoisuudet kohot- ·;··: taisivat protrombinaasia muodostavien aineiden tasoa, joita ·*·’. hyytymisen käynnistyminen edellyttää, mutta eivät pitkit- • · 25 täisi hyytymisprosessia kohtuuttomasti, kun trombiinin kyn- • · · · , .·. nyspitoisuus on saavutettu. Huolimatta pitkään tiedostetus- • · · X! ta sellaisen inhibiittorin tarpeesta, ei kliinisessä käy- • · ♦ * tössä tällä hetkellä kuitenkaan ole tehokasta ja spesifistä tekijän Xa inhibiittoria.
• · · ^ 9 9 · *·* * 30 Monissa kliinisissä käyttötilanteissa on olemassa «·· suuri antikoagulanttihoidon tarve. Monissa spesifisissä klii- « .*j·. nisissä käytöissä nykyisin tarjolla olevat lääkkeet eivät .···, ole tyydyttäviä. Esimerkiksi lähes 50 %:lle potilaista, • joille laitetaan täydellinen lonkkaproteesi, kehittyy syvä- • · · *.*.· 35 laskimon tukos (DVT) . Nykyisin hyväksyttyihin hoitoihin kuu- ··· ·...· luvat pienimoolimassaisen hepariinin (LMWH) anto kiinteää 2 annostusta käyttäen ja hepariinin anto muuttuvaa annostusta käyttäen. Jopa näitä lääkehoito-ohjelmia käytettäessä 10 - 20 %:lle potilaista kehittyy DVT ja 5 - 10 %:lle kehittyy verenvuotokomplikaatiota.
5 Toinen kliininen tilanne, johon kaivataan parempia antikoagulantteja, liittyy potilaisiin, joille tehdään trans-luminaalinen sepelvaltimonmuovausleikkaus ja joilla on sydäninfarktin vaara tai jotka sairastavat asteittain voimistuvaa angina pectorista. Nykyisin yleisesti hyväksyttyyn 10 hoitoon, joka käsittää hepariinin ja aspiriinin antamisen, liittyy se, että äkillisten suonen tukkeutumien esiintymistiheys 24 tunnin kuluessa toimenpiteestä on 6 - 8 %. Veren-siirtohoitoa vaativien verenvuotokomplikaatioiden esiintymistiheys, joihin on syynä hepariinin käyttö, on myös noin 15 7 %. Sitä paitsi, vaikka viivästyneet tukkeutumat ovat oleellisia, hepariinin annolla toimenpiteiden päätyttyä on vain vähän merkitystä ja se voi olla haitallista.
Yleisimmin käytettyjä veren hyytymistä estäviä aineita ovat hepariini ja sitä lähellä olevat sulfatoidut po-20 lysakkaridit, LMWH ja hepariinisulfaatti. Näiden molekyylien veren hyytymistä estävä vaikutus perustuu siihen, että ne edistävät hyytymisprosessin luonnollisen säätelijän, an-·;··· titrombiini III: n, sitoutumista trombiiniin ja tekijään Xa.
Hepariinin inhibitorinen vaikutus kohdistuu pääasiallisesti • · 25 trombiiniin, joka inaktivoituu noin 100 kertaa nopeammin kuin tekijä Xa. Vaikka hepariinisulfaatti ja LMWH ovat he- • · · XI pariiniin verrattuina jonkin verran voimakkaampia Xa:n in- • · · • hibiittoreita kuin trombiinin inhibiittoreita, erot in vitro ovat vaatimattomia (3 - 30 kertaisia) ja vaikutukset in ··· • · · *.* * 30 vivo voivat olla merkityksettömiä. Hirudiini ja hirulogi • · · ovat kaksi muuta trombiinispesifistä antikoagulanttia, joi-ta tällä hetkellä tutkitaan kliinisesti. Näihinkin antiko- • · · .···. agulantteihin, jotka inhiboivat trombiinia, liittyy veren- • · *·* vuotokomplikaatioita.
• · » 35 Esikliiniset tutkimukset paviaaneilla ja koirilla • · · ·...· ovat osoittaneet, että spesifiset tekijän Xa inhibiittorit 3 estävät hyytymien muodostumista aiheuttamatta veren-vuotosivuvaikutuksia, joita havaitaan trombiinia suoraan inhiboivien aineiden yhteydessä. Sellaisiin tekijän Xa in-hibiittoreihin kuuluvat esimerkiksi 2,7-bis(4-amidinobentsy-5 lideeni)sykloheptanoni ja Na-tosyyliglysyyli-3-amidonofe-nyylialaniinin metyyliesteri (Tenstop), joilla vaikuttavat inhibitoriset pitoisuudet (Ki:t) ovat vastaavasti noin 20 nmol/1 ja 800 nmol/1. (+)-(2S)-2-{4-[ ( (3S)-1-asetimido-yyli-3-pyrrolidinyyli)oksi)fenyyli}-3-(7-amidino-2-naftyy-10 li)propaanihappokin on tyypillinen esimerkki eräästä tekijän Xa inhibiittoreiden ryhmästä [Katakura et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 197 (1993) 965 - 972], Tähän mennessä näitä yhdisteitä ei kuitenkaan ole otettu kliiniseen käyttöön.
15 On myös tunnistettu spesifisiä tekijän Xa proteii- ni-inhibiittoreita ja niihin kuuluvat esimerkiksi antista-siini (ATS) ja punkin hyytymistä estävä peptidi (TAP). ATS, joka eristetään juotikkaasta (Haementerin officinalis), sisältää 119 aminohappoa ja sen Ki tekijän Xa:n suhteen on 20 0,05 nmol/1. TAP, joka eristetään punkista (Ornithodoros moubata), sisältää 60 aminohappoa ja sen Ki tekijän Xa:n • · ·’·· suhteen on 0,5 nmol/1.
*:*·: Yhdistelraä-DNA-tekniikalla tuotetun ATS:n ja TAP:n tehokkuutta on tutkittu monilla eläinmallimetodeilla. Mo- • · 25 lemmat inhibiittorit lyhentävät verenvuotoa!kaa muihin an- • · · · . .·. tikoagulantteihin verrattuina ja estävät hyytymistä vaikean • · · ’··· laskimotukoksen sidottu kaulalaskimo -mallissa, jossa tukos t · · ^ • m · indusoidaan tromboplastiinilla. Tässä mallissa saavutetut tulokset korreloivat tulosten kanssa, jotka saavutetaan käyt- • · · * 30 tämällä parasta nykyistä käytettävissä olevaa lääkettä, he- pariinia.
Ihon alle annetun ATS:n havaittiin myös olevan te- .···. hokas hoito disseminoitunut suonensisäinen koagulaatio (DIC) -mallissa, jossa hyytyminen indusoidaan tromboplas- • · · *·*·* 35 tiinilla. TAP ehkäisi tehokkaasti "suurten leikkausvoimien" • · · *...* yhteydessä esiintyvää valtimotukosta ja kirurgisesti suori- 4 tetun polyesterisiirteen (Dacron-siirteen) paikalleenase-tuksesta aiheutuvaa "pienentynyttä virtausta" niin, että se tuotti tulokseksi aktiivisen osittaisen tromboplastiiniajän (aPTT) kliinisesti hyväksyttävän pitenemisen, ts. pitenemi-5 sen vähemmän kuin noin kaksinkertaiseksi. Vertailun vuoksi todettakoon, että edes annoksina, jotka aiheuttivat aPTT:n pitenemisen viisinkertaiseksi, tavanomainen hepariini ei estänyt tukosta ja pienensi virtausta siirteen sisällä. aPTT:n määritys on koagulaation kliininen testi, joka on 10 erityisen herkkä trombiinin inhibiittoreiden suhteen.
ATS.1ää ja TAP:tä ei ole otettu kliiniseen käyttöön. Yksi näiden kahden inhibiittorin suurimmista puutteista on se, että vaadittavien annosten antaminen toistuvasti aiheuttaa vaikutuksen kumoavien vasta-aineiden kehittymistä, mi-15 kä rajoittaa niiden potentiaalista kliinistä käyttöä. Lisäksi TAP: n ja ATS:n koko tekee suun kautta antamisen mahdottomaksi, mikä rajoittaa niiden potilaiden määrää, jotka voisivat hyötyä näistä aineista.
Spesifisellä tekijän Xa inhibiittorilla olisi huo-20 mättävän suuri merkitys käytännön lääketieteessä. Tekijän Xa inhibiittori olisi nimenomaan tehokas tilanteissa, jois- • · i 1·· sa nykyiset parhaat lääkkeet hepariini ja sitä lähellä ole- ”2· vat sulfatoidut polysakkaridit ovat tehottomia tai niillä :3 4 5: on vain vähäinen vaikutus. On siten olemassa sellaisen pie- • · ··· 25 nimoolimassaisen, tekijä Xa -spesifisen, veren hyytymistä ···· . estävän aineen tarve, joka on tehokas mutta ei aiheuta epä- ·»· .···. toivottavia sivuvaikutuksia. Tämä keksintö tyydyttää tämän • · · tarpeen ja tarjoaa myös siihen liittyviä etuja.
... Keksinnön yhteenveto • · · ·.. 30 Keksintö koskee yhdistettä, joka inhiboi spesifi- • · *···1 sesti tekijän Xa aktiivisuutta, jolla on yleinen kaava ··· « · · • « · :3: Xi-ri-R2-R3-x2 ··· · 2 • · · 3 *·]·1 35 jolloin 4 • · 5
Xl on H, asyyli-, alkyyli- tai arylalkyyliryhmä; 5
Rl on Tyr; R2 on Ile; R3 on Arg; ja X2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat muunnettu C-pää-5 teryhmä, yksi tai useampi karboksyyliryhmän suojaava ryhmä, yksi tai useampi aminohappo tai muu substituentti, jolloin muunnettu C-pääteryhmä on muunnettu pelkistämällä C-päätteen karboksyyliryhmä alkoholiksi tai aldehydiksi tai muodostamalla oraalinen esteri tai substituoimalla karbok-10 syyliryhmä substituentilla; mukaan lukien yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.
Keksintö koskee myös yhdistettä, joka inhiboi spesifisesti tekijän Xa aktiivisuutta, jolla on yleinen kaava
15 A1-A2-A3-B
j olioin AI on Tyr, F(pNH2), mAph, pAph, tai Nai (2), joka sisältää 0 tai 1 aminoryhmän suojaava ryhmä; 20 A2 on Ile tai Chg; A3 on Arg, PalMe(3), Dab (Νγ-03Η7Ν) , Dap (Νβ-03Η7Ν) tai ·*’·· Orn (N5C3H7N) ; ja *:··: B on -H, -OH, -NH2, 1-5 aminohappoa tai karboksyyliryh- ·*·’: män suojaava ryhmä, mukaan lukien yhdisteen farmaseutti- • · ··. 25 sesti hyväksyttävät suolat.
• · · · . .·. Keksinnön mukainen yhdiste voi olla lineaarinen tai • · · syklinen, pituudeltaan noin 2-43 happoryhmää ja N-pääs- • · · tään tai C-päästään tai molemmista päistään muunnettu. Ky- ... seisillä yhdisteillä on sellainen tekijän Xa aktiivisuutta • · · 30 spesifisesti inhiboiva vaikutus, että Ki on 100 pmol/l tai • · ’···' sitä pienempi, edullisesti 2 nmol/1 tai sitä pienempi, ei- :*·*: vätkä ne inhiboi oleellisesti muiden hyytymiskaskadiin osal- :***; listuvien proteaasien aktiivisuutta. Yksittäisiä esimerkke- • · · jä kyseisistä yhdisteistä ovat Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2, • · · 35 Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, *···’ Ac-Tyr-Ile-Arg-N (CH3) O (CH3) , Ac-Tyr-{Ψ (CH2NH) }-Ile-Arg- 6
Leu-Pro-NH2 (jossa Ψ on merkkinä pseudopeptidisidoksesta, joka voi olla esimerkiksi pelkistetty sidos, kuten (CH2NH) osoittaa; pseudopeptidisidokset osoitetaan aaltosulkujen ympäröimällä kirjaimella Ψ, {Ψ}), Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2 (4-py-5 ridyyli), Ac-Tyr-Il·e-{Ψ(CH2NH) }-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Tyr-Chg-
Arg (N02) -{Ψ(CH2NH) }-Leu-NH2/ Ac-Tyr-Ile-Arg-{Ψ(COCH2) }-Gly-Pro-NH2, Ac-Tyr-Ile-Dab(NY-C3H7N)-Leu-Ala-NH2, Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2, Tyr-Ile-Arg-NH2, {D)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidinopropyyli)Gly-NH2, syklo-10 (Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly), Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2,
Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja C-terminaaliset johdokset, kuten amidit, esterit, alkoholit ja aldehydit (ks. myös taulukko 5). Kek-15 sintö koskee myös menetelmiä tekijän Xa aktiivisuuden inhi-boimiseksi spesifisesti. Niin ikään keksintö koskee menetelmiä tekijän Xa tason ja aktiivisuuden toteamiseksi.
Lyhyt selostus piirroksista
Kuvio 1 on kaaviokuva verenhyytymiskaskadista.
20 Kuviossa 2 on annettu esimerkki keksinnön mukaisen yhdisteen rakenteesta.
• · • *·· Kuviossa 3 on esitetty synteesikaavio eräiden kek- ·:·*: sinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi.
·*·*; Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · 25 Veren hyytyminen on monimutkainen prosessi, joka • · t · . .·. sisältää progressiivisesti voimistuvan sarjan entsyyminak- • · · t*J*# tivointireaktioita, joissa plasman tsymogeenit aktivoituvat • · · ketjussa rajoitetun proteolyysin johdosta. Mekanismin mu- ... kaan verenhyytymiskaskadi on jaettu sisäiseen ja ulkoiseen • · * *·^* 30 reaktiotiehen, jotka yhtyvät tekijän X aktivoinnissa; myö- '···* hempi trombiinin tuotanto tapahtuu yhtä yhteistä tietä (ks.
kuvio 1) .
• ;**’j Nykyinen todistusaineisto viittaa siihen, että si- • · · .·. säisellä tiellä on tärkeä osa fibriinin muodostumisen yllä- • « » *·|·* 35 pidossa ja lisäämisessä, kun taas ulkoinen tie on ratkaise- • · *···* va veren hyytymisen käynnistymisvaiheessa. Yleisesti ollaan 7 sitä mieltä, että veren hyytyminen käynnistyy fysikaalisesti kudostekijä - tekijä Vlla-kompleksin muodostuessa. Muo-dostuttuaan tämä kompleksi käynnistää nopeasti hyytymisen aktivoimalla tekijät IX ja X. Vastamuodostunut tekijä Xa 5 muodostaa sitten 1:1 -kompleksin tekijän Va ja fosfolipidi-en kanssa, jolloin muodostuu protrombinaasikompleksi, joka vastaa liukoisen fibrinogeenin muuntamisesta liukenemattomaksi fibriiniksi. Ajan mittaan tekijä Vila — kudostekijä-kompleksin aktiivisuutta (ulkoinen tie) heikentää Kunitz-10 tyyppiä oleva proteaasia inhiboiva proteiini TFPA, joka muodostettuaan kompleksin tekijän Xa kanssa kykenee suoraan inhiboimaan tekijä Vila — kudostekijä-kompleksin aktiivisuutta. Hyytymisprosessin ylläpitämiseksi, kun ulkoinen järjestelmä on inhiboitu, muodostuu lisätekijää Xa sisäisen 15 reaktiotien trombiinivälitteisen aktiivisuuden kautta. Trom-biinilla on siten kahdenlainen autokatalysointitehtävä, toimia välittäjänä itsensä tuotannossa ja fibrinogeenin muuntamisessa fibriiniksi.
Trombiinin tuotannon autokatalyyttinen luonne on 20 tärkeä suoja hallitsematonta verenvuotoa vastaan ja takaa sen, että kun läsnä on määrätty kynnyspitoisuus protrom- • · | binaasia, veren hyytyminen etenee loppuun saakka ja saa ai- ·;·*: kaan esimerkiksi hemorragian loppumisen. On sen vuoksi mitä {*·*; toivottavinta kehittää aineita, jotka estävät hyytymistä • · 25 inhiboimatta suoraan trombiinia.
, .·. Tämä keksintö koskee YIR-peptidejä, jotka ovat yh- • · · '.V. disteitä, jotka inhiboivat tekijän Xa aktiivisuutta mutta • · · * eivät inhiboi oleellisesti muiden verenhyytymisreaktiosar- jaan osallistuvien proteaasien aktiivisuutta. Tässä käytet- *·’ * 30 tynä termi "yhdiste" tai "YIR-peptidi" tarkoittaa luonnossa ··· esiintymätöntä Tyr-Ile-Arg (YIR) -peptidiä ja sen sellaisia .*j*. analogeja ja jäljitelmiä, jotka kykenevät inhiboimaan teki- .··♦. jän Xa aktiivisuutta. Itse YIR-sekvenssiä kutsutaan tässä • · "YIR-aiheeksi", ja se koostuu tripeptidistä tyrosiini- • ♦ · *·*·* 35 isoleusiini-arginiini tai sen funktionaalisesta vastinees- ··· ta, kuten pAph-Chg-PalMe (3) :sta, pAph-Chg-PalMe(3}-NH2: sta 8 tai pAph-Chg-AMP(4):stä (mitä lyhenteisiin tulee, tutustukaa taulukkoon 1) . Kyseiset keksinnön mukaiset yhdisteet sisältävät ainakin yhden YIR-aiheen tai sen funktionaalisen vastineen ja kykenevät inhiboimaan spesifisesti tekijän Xa 5 aktiivisuutta. Mukavuussyistä termejä "yhdiste" ja "YIR- peptidi" käytetään tässä yleisesti keksinnön mukaisista peptideistä niiden funktionaaliset vastineet, kuten pepti-dianalogit, peptidijäljitelmät ja synteettiset orgaaniset yhdisteet, mukaan luettuina. Keksinnön mukaisen YIR-pepti-10 din funktionaaliselle vastineelle voi olla osaksi tunnusomaista, että sillä on tässä esitetyn kaltainen rakenne ja että sen Ki, mitä tulee tekijän Xa aktiivisuuden inhibiti-oon, on 100 pmol/l tai sitä pienempi.
Keksinnön mukaisen YIR-peptidin peptidianalogeihin 15 kuuluvat esimerkiksi peptidit, jotka sisältävät luonnossa esiintymättömiä aminohappoja tai kemiallisesti muunnettuja aminohappoja edellyttäen, että asianomainen yhdiste säilyttää inhibitorisen vaikutuksen tekijän Xa suhteen (ks. esimerkiksi taulukko 2). Vastaavasti peptidijäljitelmät ovat amino-20 happoja sisältämättömiä kemiallisia rakenteita, jotka jäljittelevät keksinnön mukaisen YIR-peptidin rakennetta ja säilyt- ·· • ’·· tävät inhibitorisen vaikutuksen tekijän Xa suhteen. Sellai- ‘S**: sille jäljitelmille on yleensä tunnusomaista, että niillä on samanlaiset fysikaaliset ominaisuudet, kuten koko, varaus • · •j. 2 5 ja hydrofobisuus, joka on sopivasti avaruudellisesti orien- ·«·· . .·. toitunut, kuin jäljitelmän normaalilla YIR-peptidivasti- .···. neella. Yksi nimenomainen esimerkki peptidi jäi j itelmästä on • · · yhdiste, jossa amidisidos yhden tai useamman aminohapon vä- ... Iillä on korvautunut esimerkiksi hiili-hiilisidoksella tai • « · **|#* 30 muulla alalla tunnetulla sidoksella (tutustukaa esimerkiksi • · *···’ Sawyerin artikkeliin teoksessa Peptide Based Drug Design, :*·*: ACS, Washington DC 1995, s. 387 - 422, joka mainitaan tässä .***. viitteenä) . Keksintö koskee siis lisäksi tekijää Xa inhi- ··· .·. boivia yhdisteitä, joilla on tässä esitetyn määritelmän mu- • · · *·’·* 35 kainen rakenne A1-A2-(A3)m-B, jossa m on 0 tai 1 (ks. jäi- ··· *' • · • · ··· 9 jerapää). Tässä selityksessä annetaan esimerkkejä peptideistä, jotka voivat olla jäljitelmäyhdisteitä.
Termiä "aminohappo" käytetään tässä laajimmassa merkityksessään kahdestakymmenestä luonnossa esiintyvästä ami-5 nohaposta, jotka luetaan geneettisestä koodista ja sisältävät rakenneosinaan proteiineja ja joihin kuuluvat, ellei toisin ole erikseen mainittu, L-aminohapot ja D-aminohapot sekä kemiallisesti muunnetut aminohapot, kuten aminohappojen analogit, luonnossa esiintyvät aminohapot, joita ei ta-10 vallisesti sisälly proteiineihin, kuten norleusiini, ja kemiallisesti syntetisoidut yhdisteet, joilla on ominaisuuksia, joiden tiedetään olevan aminohapolle tunnusomaisia. Aminohappojen määritelmän piiriin kuuluvat esimerkiksi fe-nyylialaniinin tai proliinin analogit tai jäljitelmät, jot-15 ka mahdollistavat saman peptidiyhdisteiden konformaatiora-joituksen kuin luonnon Phe ja Pro ja jotka ovat ammattimie-hille tuttuja. Sellaisia analogeja ja jäljitelmiä kutsutaan tässä aminohapon "funktionaalisiksi vastineiksi". Muita esimerkkejä aminohapoista ja aminohappojen analogeista ovat 20 luetelleet Roberts ja Vellaccio (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, toim. Gross ja Meienhofer, osa 5, Aca- • · • *·· demic Press, Inc., NY 1983, s. 341, joka teos mainitaan *:··: tässä viitteenä) . Aminohappojen, aminohappojen analogien ja ·*·*: jäljitelmärakenteiden lyhenteitä on lueteltu taulukossa 1.
’ 25 ···· . Taulukko 1 • · · '•I*, Selityksessä käytettyjä lyhenteitä • · ♦
Yhdiste Lyhenne 1 Lyhenne 2* ... Asetyyli Ac • · ·
*·* * 30 Alaniini Ala A
• · · • · *···* 3-(2-tiatsolyyli)-L-alaniini Tza φ
:*·*: Amidiini AMDN
.**·. Amidoksiimi [C (NH2) =N-OH] (CHOH.NH2) ···
.*. (N-metyylipyridinium) metyyli AMP
• · · *·]·* 35 [4-(N-metyylipyridinium) ] - *···* netyyli AMP (4) 10
1-(N-metyylipyridinium)-1-etyyli AEMP
1-[4-(N-metyylipyridinium)]- 1- etyyli AEMP(4)
5 Arginiini Arg R
Asparagiini Asn N
Asparagiinihappo Asp D
Bentsoyyli Bz 2- bentsofuraankarboksi Bzf 10 Bentsyyli Bzl
Bentsyylioksikarbonyyli Cbz 5-bentsimidatsolikarboksi 5-Bzim t-butyylioksikarbonyyli Boc
Bentsotriätsoi-1-yylioksi-15 tris(dimetyyliamino)fosfo- niumheksafluorifosfaatti Bop β-alaniini BAla β-valiini BVal β-(2-pyridyyli)alaniini Pal(2) 20 β-(3-pyridyyli)alaniini Pal(3) β-(4-pyridyyli)alaniini Pal(4) • · • *·· β- (3-N-metyylipyridinium) - ·:··: alaniini PalMe(3) ·*·*; Bromitrispyrrolidinof osf o- • ·
25 niumheksaf luorifosfaatti PyBroP
• · · · . .·. t-butyyli tBu, But • · · '•V'' t-butyylioksikarbonyyli Boc • · ·
Kofeiinihappo Caff
Karbonyylidi-imidatsoli CDI
• · ·
*·’ ’ 30 Kysteiini Cys C
5-kloori-indoli-2-karboksi CICA
:*·*: Sykloheksyyli Chx .*·*. Sykloheksyylialaniini Cha • · ·
Sykloheksyyliglysiini Chg • · · 35 2, 4-diaminovoihappo Dab
Dab: n dimetyyliamidinium- 11 johdos Dab (Ny-C3H7N) 2,3-diaminopropionihappo Dap
Dap:n dimetyyliamidinium- johdos Dap (Ny~C3H7N) 5 3,5-dinitrotyrosiini Tyr(3,5-NC>2) Y(3,5-N02) 3.5- dijodityrosiini Tyr(3,5-I) Y(3,5-I) 3.5- dibromityrosiini Tyr(3,5-Br) Y(3,5-Br)
N,N-di-isobutyylikarboksamidi DIBA
N,N-di-isopropyylikarboks-10 amidi DIPA
4-(N,N-dimetyyli)amino-pyridiini DMAP
9-fluorenyylimetoksi-karbonyyli Fmoc
15 5-fluori-indoli-2-karboksi FICA
Formyyli For
Glutamiini Gin Q
Glutamiinihappo Glu E
γ-karboksiglutamiinihappo Gla
20 Glysiini Gly G
Histidiini His H
• ·
| Homoarginiini hArg hR
·;··: 5-hydroksi-indoli-2-karboksi 5-Hic {*.’· N-hydroksibentsotriatsoli HOBt • · 25 3-hydroksiproliini Hyp . .·. Iminodietikkahappo Ida • · ·
'.V. 5-aminoindoli-2-karboksi 5AM2IN
• · ·
' 5-nitroindoli-2-karboksi 5N0INDC
DL-indoliini-2-karboksi 2-INCA
• · · *·' * 30 Isobutyyli iBu • · ·
Isoleusiini Ile I
Isonikotiinihappo Isn .···. N-metyyli-isonikotiinihappo IsnMe
Isonipekotiinihappo Ina • · ·
*.*.* 35 Isopropanoli iPrOH
• · · *...· 1-isokinoliinikarboksi 1-Iqc 12 3- isokinoliinikarboksi 3-Iqc
Leusiini Leu L
t-leusiini Tie
Lysiini Lys K
5 Merkapto-β,β-syklopenta- metyleenipropionihappo Mpp
Merkaptoetikkahappo Mpa
Merkaptopropionihappo Mpr
Metanoli MeOH
10 Metioniini Met M
4- morfolinokarbonyyliami.no MORA
N-metyylimorfOliini NMM
1- naftyylialaniini Nal(l) 2- naftyylialaniini Nal{2) 15 Nikotiinihappo Nic
Nipekotiinihappo Npa N-metyylinikotiinihappo NicMe
Norarginiini nArg nR
Norleusiini Nle nL
20 Norvaliini Nva nV
Ornitiini Orn • · • Ornitiinin dimetyyliamidinium- ·:*·· johdos Orn (N5-C3H?N) {*·*. Fenyyli Ph • ·
.:. 25 Fenyylialaniini Phe F
. p-guanidinofenyylialaniini Phe(Gua) F{pGua) • · · '.I'. p-aminofenyylialaniini PhefNHh) F{pNH2) • · · * p-kloorifenyylialaniini Phe(Cl) F(pCl) p-fluorifenyylialaniini Phe(F) F(pF) '·’ 30 p-nitrofenyylialaniini Phe(N02) F(pN02) • · · *...* p-hydroksifenyyliglysiini Pgl (OH) .*j*; p-tolueenisulfonyyli Tos .···. 2, 2,5,7,8-pentametyyli- ··· kromaani-6-sulfonyyli Pmc • · · ’·*·* 35 m-amidinogenyylialaniini mAph • · · *...* p-amidinogenyylialaniini pAph 13
Fenyyliglysiini Pgl
Fenyylimalonihappo Pma
Piperidinyyli PIP
1- piperidinokarbonyyliamidi PIPA
5 L-pipekolonihappo Pip
Proliini Pro P
2- pyratsiinikarboksi Pza 2- kinoliinikarboksi 2-Qca 4- kinoliinikarboksi 4-Qca 10 Sarkosiini Sar 5- t-butyyli SBut
Tentageeliin liitetty SCAL-kytkentäaine SCAL-TG
Seriini Ser S
15 Tetrahydroisokiniili-3- karboksyyli Tie
Treoniini Thr T
Trifluoriasetyyli Tfa
Tryptofaani Trp W
20 Tyrosiini Tyr Y
3- jodityrosiini Tyr(3-1) Y(3—I) O-metyylityrosiini Tyr (Me) Y (Me)
·:··{ Väliini Vai V
• · · • · · • · • · 25 *Aminohappoja, joilla on D-konf iguraatio, merkitään joko etuliitteellä D- ja käyttämällä kolmikirjaimista koodia • · · I” (esim. D-Ala, D-Cys, D-Asp, D-Trp) tai pienin kirjaimin ja • · · *·* * käyttämällä yksikirjaimista koodia (vastaavasti a, c, d, w) .
Ilmaisu "tekijän Xa aktiivisuus" tarkoittaa tässä • · · *.* * 30 käytettynä itse tekijän Xa tai protrombinaasikompleksina • · · tunnetun, alayksiköistä koostuvan yhdistelmän osana olevan tekijän Xa kykyä katalysoida protrombiinin muuttumista .···. trombiiniksi. Termi "inhibitio", kun sitä käytetään tekijän • · *Γ Xa aktiivisuuden yhteydessä, sulkee sisäänsä sekä tekijän • · \V 35 Xa suoran että epäsuoran inhibition. Tekijän Xa aktiivisuu-• · · den suora inhibitio voidaan saavuttaa esimerkiksi niin, et- 14 tä keksinnön mukainen YIR-peptidi sitoutuu suoraan tekijään Xa tai protrombinaasiin ja estää siten protrombiinin sitoutumisen protrombinaasikompleksin aktiiviseen kohtaan. Tekijän Xa aktiivisuuden epäsuora inhibitio voidaan saavuttaa 5 esimerkiksi niin, että keksinnön mukainen yhdiste sitoutuu liukoiseen tekijään Xa ja estää siten sen liittymisen prot-rombinaasikompleksiin.
Termi "spesifinen" tarkoittaa tekijän Xa aktiivisuuden yhteydessä käytettynä sitä, että YIR-peptidi kykenee 10 inhiboimaan tekijän Xa aktiivisuutta inhiboimatta määrätty jen muiden proteaasien aktiivisuutta, joihin kuuluvat plas-miini ja trombiini (käytettäessä samaa inhibiittorin pitoisuutta) . Kyseiset proteaasit ovat osallisina verenhyytymis-ja fibrinolyysikaskadissa (ks. taulukko 2; ks. myös esi-15 merkki XXVII).
Taulukko 2
Eräiden yhdisteiden inhibitorinen aktiivisuus viittä entsyymiä vastaan, K* (pmol/1)
Yhdiste Xa Trombiini Flaamiini Trypsiini Bleetaasi
Ac-Y-1-R-L-A'A-F-T 1,5 100 NT >200* >100 .· AC-Y-1-R-L-P 0,5 >200 >200 >200 >100 • · I ** Y-l-R-L-P 0,2 >200 >200 >200 >100 ftc-(iBu)Y-I-R-L-p o,Oi 25 >200 NT >100 • ·
Tenstop 2 2 >200 NT >200 ·· · l * ί »Osoittaa, että mitään oleellista entsyymin lnhlbitiota ei esiintynyt suurimmatlekaan testissä . käytetyllä (mainitun} yhdisteen pitoisuudella.
·:· 20 ««·· . .·. Taulukossa 2 esitetyt tulokset osoittavat, että • · · keksinnön mukaiset YIR-peptidit ovat käyttökelpoisia teki- • · · * jän Xa inhibiittoreina mutta eivät inhiboi oleellisesti muiden verenhyytymis- ja fibrinolyysiprosessiin osallistu- • · · 25 vien seriiniproteaasien, kuten trombiinin tai plasmiinin, • · · • · aktiivisuutta.
:*·*: Termi "substituentti" tarkoittaa tässä käytettynä .···. mikä tahansa monista erilaisista ryhmistä, joka esiintyy • · » substituenttina peptidirungossa tai tässä esitetyn pepti- • · · *♦[·* 30 din, peptidianalogin tai -jäljitelmän tai orgaanisen yhdis- *...* teen sivuketjussa. Substituentti voi olla olla mikä tahansa 15 monista erilaisista, alan kirjallisuuden perusteella tunnetuista ryhmistä [ks. esimerkiksi Giannis ja Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32 (1993) 1244 - 1267, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä] . Tässä selityksessä on esitetty 5 lukuisia esimerkkejä, jotka havainnollistavat substituentin liittämistä, esimerkkinä p-NH2-substituentin liittäminen fe-nyylialaniiniin F(pNH2):n aikaansaamiseksi ja halogeenin liittäminen tyrosiiniin esimerkiksi Y(3-I):n tai Y{3,5-I):n aikaansaamiseksi. Lisäksi substituentti voi olla esimerkik-10 si heteroatomi, kuten typpi (N, vrt. esimerkiksi Pal), happi (O, vrt. esimerkiksi O~metyylityrosiini) tai rikki [S, vrt. esimerkiksi Tyr(S03H)], joka voi olla substituoi-tu. N-, S- tai O-atomin sisältävän ryhmän, kuten ryhmän —S03H, katsotaan siis olevan tässä esitetyn määritelmän mu-15 kainen "substituentti". Lisäksi substituentti voi olla ami-noryhmän tai karboksyyliryhmän suojaava ryhmä.
Termiä "alkyyliryhmä" tarkoittaa tässä, kun sitä käytetään laajimmassa merkityksessään, tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä, lineaarisia, haarautuneita tai syklisiä 20 ketjuja, jotka sisältävät 1-13 hiiliatomia. Termin "alkyyliryhmä" piiriin kuuluvat siten esimerkiksi metyyli-, : etyyli-, n-propyyli-, isopropyyli-, s-butyyli-, 1-metyyli- ·;··· butyyli-, 2,2-dimetyylibutyyli-, 2-metyylipentyyli-, 2,2- dimetyylipropyyli-, n-pentyyli- ja n-heksyyli ryhmä, alky- • · 25 leeniryhmät, sykliset hiiliketjut, kuten sykloheksyyli- ja syklopentyyliryhmä, sekä lineaaristen tai haarautuneiden hii- • · · liketjujen ja syklisten hiiliketjujen yhdistelmät, kuten * metyylisykloheksyyli- ja sykloheksyylimetyleeniryhmä. Li säksi tulisi käsittää, että tässä esitetyn määritelmän mu- • · · • · · *·* * 30 kainen alkyyliryhmä voi olla substituoitu. Vastaavasti "asyy- • · · liryhmä" tarkoittaa, kun sitä käytetään laajimmassa merki- tyksessään, esimerkiksi sellaisia ryhmiä kuin formyyli, ase- .···, tyyli, bentsoyyli ja vastaavat.
• · • Termi "aryyliryhmä" tarkoittaa aromaattisia ryhmiä, • · · *.*·* 35 jotka sisältävät noin 5-13 hiiliatomia ja käsittää aina- • · · :...· kin yhden "rengasryhmän", joka sisältää kon jugoituneen 16 π-elektronisysteemin. Esimerkkejä aryyliryhmistä ovat esimerkiksi heterosykliset aryyliryhmät, biaryyliryhmät ja niiden analogit ja johdokset, jotka kaikki voivat haluttaessa sisältää yhden tai useampia substituentteja. Termi "aryy-5 lialkyyliryhmä" tarkoittaa edellä esitetyn määritelmän mukaista alkyyliryhmää, joka on substituoitu aryyliryhmällä. Sopivia aryylialkyyliryhmiä ovat bentsyyli- ja pikolyyli-ryhmä sekä vastaavat, jotka kaikki voivat haluttaessa olla substituoituja.
10 Tässä selityksessä käytetään myös termejä "hetero- alkyyliryhmä", "heteroaryylialkyyliryhmä" ja "heteroaryyli-ryhmä", ja ne tarkoittavat vastaavasti alkyyli-, aryylial-kyyli- ja aryyliryhmiä, jotka on substituoitu yhdellä tai useammalla heteroatomilla, kuten N-, O- tai S-atomilla. Li- 15 säksi syklisen alkyyli- tai aryyliryhmän yhteydessä, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla heteroatomilla, käytetään myös termiä "heterosyklinen". Lukuisia esimerkkejä heteroalkyyli-, heteroaryylialkyyli-, heteroaryyli- ja he-terosyklisistä ryhmistä on esitetty esimerkiksi taulukoissa 20 1 ja 3, tai ne ovat muuten alalla tunnettuja.
Keksinnön mukaisten peptidien N-pääteasemaa tai ·· i *·· C-pääteasemaa voidaan muuntaa käyttämällä aminoryhmänsuo- ·:**: jaavaa ryhmää tai vastaavasti karboksyyliryhmän suo jaavaa ·*·*; ryhmää. Tässä on tuotu esille lukuisia sellaisia muuntoja • · 25 (ks. esimerkiksi taulukko 3) . Peptidin tai peptidianalogin ···· . .·. N-pääteasemaa voidaan muuntaa siten, että N-pääteaminoryhmä • · · substituoidaan esimerkiksi asetyyli-, syklopentyylikarbok- • · · * syyli-, isokinolyylikarboksyyli-, furoyyli-, tosyyli- tai. pyratsiinikarboksyyliryhmällä tai muulla sellaisella ryh- • · · 30 mällä, joka voi olla substituoitu edellä kuvatun kaltaisel- ♦ ·· *...· la substituentilla. N-pääteaminoryhmä voidaan myös korvata :*j*: esimerkiksi reversiibelillä amidisidoksella. Tulisi kasit- .···. tää, että termiä "aminoryhmä" käytetään tässä yleisesti mistä tahansa peptidissä esiintyvästä vapaasta aminoryhmästä, • · « *·'·* 35 joka sulkee sisäänsä primaarisen, sekundaarisen ja tertiaa- *...· risen arninoryhmän. Mitä tulee ilmaisuun "N-pääteasema”, se 17 tarkoittaa konventionaalisella tavalla kirjoitetussa peptidissä ensimmäisenä esiintyvän aminohapon α-aminoryhmää.
Keksinnön mukaisen peptidin N-pääteasema voidaan suojata liittämällä siihen aminoryhmän suojaava ryhmä. Ilmai-5 sua "aminoryhmän suojaava ryhmä" käytetään tässä yleisesti kemiallisesta ryhmästä, joka kykenee reagoidaan vapaan aminoryhmän kanssa, mm. esimerkiksi keksinnön mukaisen peptidin N-pääteasemassa esiintyvän α-aminoryhmän kanssa. Tämän reagoinnin ansiosta aminoryhmän suojaava ryhmää suojaa 10 muussa tapauksessa reaktiivisen aminoryhmän ei-toivotuilta reaktioilta, joita voi esiintyä esimerkiksi syntetisointi-prosessin aikana tai lopulliseen yhdisteeseen kohdistuvan eksopeptidaasiaktiivisuuden johdosta. Aminoryhmän muuntaminen voi tarjota myös lisäetuja, joihin kuuluvat esimerkiksi 15 yhdisteen liukoisuuden tai aktiivisuuden kohoaminen. Tässä on tuotu esille monenlaisia aminoryhmän suojaavia ryhmiä (ks. taulukko 3) tai ne ovat alalla muuten tunnettuja, ja niihin kuuluvat esimerkiksi asyyliryhmät, kuten asetyyli-, pikoloyyli- ja t-butyyliasetyyliryhmä, t-butyylioksikarbo-20 nyyli-, bentsyylioksikarbonyyli-, bentsoyyliryhmät, joihin kuuluu esimerkiksi bentsyylioksiimi, kuten 2-aryyli-2-0- • · • ’·· bentsyylioksiimi (ks. esimerkki XVI), sekä aminoasyyliryh- *:**: mä, joka itsessään voi olla aminoryhmän suo jäävällä ryhmäl- lä muunnettu. Muita aminoryhmän suojaavia ryhmiä on kuvattu • · ··. 25 esimerkiksi teoksissa The Peptides, osa 3, toim. Gross ja • · · · . Meienhofer (Academic Press, Inc., N.Y. 1981) ja Greene ja • · ·
Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. painos, • · · sivuilla 309 - 405 (John Wiley & Sons, New York 1991), jot- ... ka kumpikin mainitaan tässä viitteinä. Minkä tahansa sei- • · · *;]t* 30 laisen keksinnön mukaisen peptidin tai peptidianalogin N-pää- • · *···* te amino ryhmän muuntamisen tuotetta kutsutaan tässä "N-ter- minaaliseksi johdokseksi".
;***; Vastaavasti karboksyyliryhmä, kuten peptidin C-pää- ··· .*. teasemassa esiintyvä karboksyyliryhmä, voidaan muuntaa ke- • · » *·]·* 35 miallisesti käyttämällä jotakin karboksyyliryhmän suojaavaa • · *···* ryhmää. Ilmaisuja "karboksyyliryhmä" ja "C-pääteasema" käy- 18 tetään tavalla, joka vastaa edellä määriteltyjen ilmaisujen "aminoryhmä" ja "N-pääteasemaa" käyttötapaa. Karboksyyli-ryhmä, kuten peptidin C-pääteasemassa esiintyvä karboksyy-liryhmä, voidaan muuntaa pelkistämällä C-päätekarboksyyli-5 ryhmä alkoholiksi tai aldehydiksi tai muodostamalla oral-esteri tai liittämällä karboksyyliryhmään substituentti, kuten tiatsolyyli-, sykloheksyyli- tai jokin muu ryhmä. Oral-esterit ovat alalla tunnettuja, ja niihin kuuluvat esimerkiksi alkoksimetyyliryhmät, kuten metoksimetyyli-, etoksi-10 metyyli- ja isopropoksimetyyliryhmä sekä vastaavat; a- (Ci-4-alkoksi)etyyliryhmät, kuten metoksietyyli-, etoksietyyli-, propoksietyyli- ja isopropoksietyyliryhmä sekä vastaavat; 2-okso-l, 3-dioksolen-4-yylimetyyliryhmät, kuten 5-metyyli- 2-okso-l,3-dioksolen-4-yylimetyyli- ja 5-fenyyli-2-okso-l,3-15 dioksolen-4-yylimetyyliryhmä sekä vastaavat; Ci-3-alkyyli- tiometyyliryhmät, kuten metyylitiometyyli-, etyylitiometyy-li- ja isopropyylitiometyyliryhmä sekä vastaavat; asyyliok-simetyyliryhmät, kuten pivaloyylioksimetyyli- ja a-asetok-simetyyliryhmä seka vastaavat; etoksikarbonyyli-l-metyy-20 liryhmä; a-asyylioksi-a-substituoidut metyyliryhmät, kuten α-asetoksietyyliryhmä, 3-ftalidyyli- ja 5,6-dimetyyliftali- »· • *·· dyyliryhmä, 1-(Ci-4-alkyylioksikarbonyylioksi) et-l-yyliryhmä, *:*·: kuten 1-(etoksikarbonyylioksi) et-l-yyliryhmä; sekä l-(Ci-4- ;*·*: alkyyliaminokarbonyylioksi) et-l-yyliryhmä, kuten 1-(metyyli- • · .j. 25 aminokarbonyylioksi) et-l-yyliryhmä.
···· . ,·. Keksinnön mukaista peptidiä voidaan muuntaa liittä- • · · ,···. mällä siihen karboksyyliryhmän suojaava ryhmä. Karboksyyli- • · · ryhmän suojaavat ryhmät ovat alalla tunnettuja ja sitoutu- ... maila peptidiin suojaavat karboksyyliryhmää ei-toivotuilta • · · *·]/ 30 sivureaktioita (ks. esimerkiksi Greene ja Wuts, supra, *···* 1991, s. 224 - 276, joka teos mainitaan tässä viitteenä).
Ammattimies käsittänee, että edellä kuvatun kaltaisia muun-;*’*j toja, jotka voidaan toteuttaa peptidin N-pääteaminoryhmällä
• M
tai C-päätekarboksyyliryhmällä, voidaan tehdä samalla ta- • · · *.· 35 valla millä tahansa, esimerkiksi keksinnön mukaisen pepti- *···’ din sisältämän aminohapon tai aminohappoanalogin sivuket- 19 jussa esiintyvällä, reaktiivisella aminoryhmällä tai kar-boksyyliryhmälla. Tässä selityksessä on esitetty menetelmiä sellaisten muuntojen toteuttamiseksi, tai ne ovat muuten alalla tunnettuja.
5 Tämä keksintö koskee yhdisteitä, jotka inhiboivat spesifisesti tekijän Xa aktiivisuutta. Keksinnön mukaisen yhdisteen yleinen rakenne on Xi-YIR-X2 tai sitä funktionaa-lisesti vastaava, jossa kaavassa Χχ on H, asyyli-, alkyyli-tai aryylialkyyliryhmä tai yksi tai useampi aminohappo, X2 10 on muunnettu C-pääteryhmä, yksi tai useampi karboksyyliryh-män suojaava ryhmä, yksi tai useampi aminohappo tai muu substituentti, kuten aminoryhmän suojaava ryhmä. Keksinnön mukainen yhdiste on käyttökelpoinen antikoagulanttina monien erilaisten kliinisten tilojen hoidossa. Keksinnön mu-15 kaista yhdistettä voidaan myös käyttää monissa laboratorio-proseduureissa verinäytteiden hyytymisen estämiseksi.
Keksintö koskee yhdistettä, joka inhiboi spesifisesti tekijän Xa aktiivisuutta, jolla on yleinen kaava 20 Xi-R1-R2-R3-X2 • · • *·· jolloin ·:*·· Xl on H, asyyli-, alkyyli- tai arylalkyyliryhmä; j***j Rl on Tyr; 25 R2 on Ile; *·*· . .·. R3 on Arg; ja • * · IV. X2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat muunnettu C-pää- • · » • teryhmä, yksi tai useampi karboksyyliryhmän suojaava ryhmä, yksi tai useampi aminohappo tai muu substituentti, • · · *·* * 30 jolloin muunnettu C-pääteryhmä on muunnettu pelkistämällä
• M
C-päätteen karboksyyliryhmä alkoholiksi tai aldehydiksi ·*:*. tai muodostamalla oraalinen esteri tai substituoimalla • · ♦ .···. karboksyyliryhmä substituentilla; mukaan lukien yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.
• · · *·*·* 35 Keksintö koskee myös yhdistettä, joka inhiboi spe- • · · ·...· sifisesti tekijän Xa aktiivisuutta, jolla on yleinen kaava 20
A1-A2-A3-B
jolloin 5 AI on Tyr, F(pNH2), mAph, pAph, tai Nai(2), joka sisältää 0 tai 1 aminoryhmän suojaava ryhmä; A2 on Ile tai Chg; A3 on Arg, PalMe(3), Dab (NY-C3H7N) , Dap (Νβ-0:3Η7Ν) tai Orn (N5C3H7N) ; ja 10 B on -H, -OH, -NH2, 1 ~ 5 aminohappoa tai karboksyyliryh-män suojaava ryhmä, mukaan lukien yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.
Tässä esitetyt yleiset rakenteet edustavat erilaisia keksinnön mukaisia yhdisteitä, joilla säilyy inhibito-15 rinen aktiivisuus tekijän Xa suhteen, kuten tripeptidi YIR:n tarjoama inhibitorinen aktiivisuus. Tässä esitettyjen rakennekaavojen piiriin kuuluu myös yhdisteitä, jotka sisältävät luonnossa esiintymättömiä aminohappoja, aminohap-pojäljitelmiä ja muita orgaanisia rakenteita ja substi-20 tuentteja, jotka toimivat samalla tavalla. Sellaiset funktionaaliset vastineet tarjoavat sopivia toivottujen varaus- • · : ten ja voimien avaruudellisia ryhmityksiä, jotka antavat ·;·*: tulokseksi tehokkaan tekijän Xa inhibition.
·*·*. Erikoisesimerkkejä keksinnön mukaisista yhdisteistä • · 2 5 ovat esimerkiksi Ac-Tyr-Ile-Arg~Leu-Ala-NH2, Ac-Tyr-Ile- . Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-(iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Tyr-Ile-
Arg-N (CH3)0(CH3), Ac-Tyr-{Ψ(CH2NH) }-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, *·’’ Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2 (4-pyridyyli) , Ac-Tyr-Ile-{¥(CH2NH) }-
Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Tyr-Chg-Arg (N02) -{Ψ (CH2NH) }-Leu-NH2, Ac- V : 30 Tyr-Ile-Arg-{Ψ (COCH2) }-Gly-Pro-NH2, Ac-Tyr-Ile-Dab (NY-C3H7N) - • · ·
Leu-Ala-NH2, Ac-Tyr-Ile-PalMe (3} -NH2, Tyr-Ile-Arg-NH2, D-Tyr-
Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac- (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (3-guanidinopropyy- .···. li)Gly-NH2, syklo (Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly), Tfa-(iBu) Tyr-Chg-Arg- • · I” Leu-Pro-NH2, Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 ja Ac-Nal(2)-Chg- *.*.· 35 Arg-Leu-Pro-NH2. Lisää keksinnön mukaisia YIR-peptidejä on • · · ·...· esitetty esimerkiksi taulukoissa 3 ja 5.
21
Esimerkiksi eräässä keksinnön mukaisessa yhdisteessä AI on Tyr, F(pNH2), mAph, pAph tai Nai (2), joka ei sisällä yhtään tai sisältää yhden aminoryhmää suojaavan ryhmän; A2 on Ile tai Chg; A3 on Arg, PalMe(3), Dab (NY-C3H7N), 5 Dap(NB“C3H7N) tai Orn (N5-C3H7N) ; ja B on -H, -OH, -NH2, 1-5 aminohappoa tai niiden funktionaalista vastinetta käsittävä ryhmä tai karboksyyliryhmän suojaava ryhmä. Esimerkkejä sellaisista yhdisteistä ovat Ac-pAph-Chg-PalMe (3)-NH-CH2-Chx, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx, Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-10 pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, syklo-pentyyli-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2f 2-furoyyli-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 5-Me-tienyyli-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 ja Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-oli (ks. myös taulukko 5} .
15 Valinta, sisällytetäänkö tämän keksinnön mukaiseen yhdisteeseen L- vai D-aminohappo, voi riippua osaksi peptidille halutuista ominaisuuksista. Esimerkiksi yhden tai useamman D-aminohapon sisällyttäminen yhdisteeseen voi antaa yhdisteelle suuremman stabiilisuuden in vitro tai in 20 vivo. Yhden tai useamman D-aminohapon sisällyttäminen yh disteeseen voi myös lisätä tai pienentää yhdisteen farmako-·*·.. logista aktiivisuutta. Joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa sallia yhdisteen säilyä aktiivisena ainoastaan lyhyt ajanjakso. Sellaisissa tapauksissa yhden tai useamman • · 25 L-aminohapon sisällyttäminen yhdisteeseen saattaa mahdol- ***I listaa sen, että yksilössä esiintyvät endogeeniset pepti- • · · 'l\l daasit hajottavat yhdisteen in vivo ja rajoittavat siten • ♦ · ’·* * yksilön olemista alttiina aktiiviselle yhdisteelle. Ammat timies kykenee päättämään keksinnön mukaiselta yhdisteeltä • · « *.· : 30 vaadittavat ominaisuudet ottamalla huomioon esimerkiksi yk- ··· silön iän ja yleisen terveydentilan.
Keksinnön mukainen yhdiste voidaan syntetisoida ke- .···. miallisesti esimerkiksi käyttämällä automaattista synteti- • · saattoria (ks. esimerkki I) . Reaktiivisen ryhmän, kuten • · · ’·*·’ 35 peptidin arrdnohapposivuketjussa esiintyvän ryhmän tai reak- ··· ·...* tiivisen N- tai C-pääteryhmän, selektiivinen muunto saattaa antaa keksinnön mukaiselle yhdisteelle toivottuja ominai suuksia, kuten suuremman liukoisuuden tai suuremman inhibi- torisen vaikutuksen.
22
Silloin, kun käytetään kiinteäfaasisynteesimenetel-5 miä, yhdisteen kemiallista koostumusta voidaan manipuloida muodostuvan peptidin ollessa kiinnittyneenä hartsiin tai sen jälkeen, kun peptidi on irrotettu hartsista, esimerkiksi N-terminaalisen johdoksen, kuten yhdisteen, jonka N-pääteasema on asetyloitu, aikaansaamiseksi. Samaan tapaan 10 voidaan muuntaa myös yhdisteen karboksyyliryhmää, mukaan luettuna C-päätekarboksyyliryhmä, joka voidaan esimerkiksi amidoida. Ammattimies kykenee syntetisoimaan keksinnön mukaisen YIR-peptidin myös käyttämällä orgaanisen kemian liu-osfaasimenetelmiä. Syntetisoitu yhdiste voidaan puhdistaa 15 käyttämällä tunnettuja menetelmiä, kuten käänteisfaasisuur-painenestekromatografiaa (RP-HPLC; ks. esimerkki I) tai muita erotusmenetelmiä, jotka perustuvat esimerkiksi yhdisteen kokoon, varaukseen tai hydrofobisuuteen. Samoin voidaan keksinnön mukaisen rakenteen karakterisoinnissa käyttää 20 tunnettuja menetelmiä, kuten aminohapposekvenssianalyysiä tai massaspektrometriaa (MS) (ks. esimerkki I).
• · • *·· Keksinnön mukaiset YIR-peptidit voivat olla lineaa- *:*·: risia tai syklisiä (ks. esimerkiksi taulukko 3 jäljempänä) .
Syklisointi voidaan tehdä muodostamalla silta kahden ei- • · • j· 25 vierekkäisen happoryhmän, osan tai substituentin välille, • · · · . .·. jotka voivat sisältyä YIR-aiheeseen tai sijaita sen ulko- ,···. puolelle. Syklisointi voidaan tehdä myös esimerkiksi muo- • · · dostamalla silta yhden YIR-aiheeseen sisältyvän aminohappo- ... ryhmän ja YIR-sekvenssin ulkopuolella sijaitsevan, ei- ♦ · · * 30 viereisen happoryhmän, osan tai substituentin välille. Esi- • · *···* merkiksi peptidejä ja peptidi jäi jitelmiä voidaan syklisoida -S-S-, -CH2-S-, -CH2-O-CH2-, laktaami- tai esterisidosten • .***. välityksellä tai tavoilla, joita on raportoitu aikaisemmin .·. [ks. Hruby, Life Sei. 31 (1982) 189 - 199/ Toniolo, Int. J.
*·*·’ 35 Pept. Prot. Res. 35 (1990) 287 - 300; Kates et ai., Tetr.
• · · • · • · • · · 23
Lett. 34 (1993) 1549 - 1552, jotka kaikki mainitaan tässä viitteinä].
Ilmaisu "YIR-aiheen ulkopuolella sijaitseva" tarkoittaa tässä käytettynä muuta ryhmää kuin keksinnön mukai-5 sessa YIR-peptidissä tai sen vastineessa esiintyvän YIR-sek-venssin tyrosiini-, isoleusiini- ja arginiiniryhmää. Sitä vastoin ilmaisulla "YIR-aiheeseen sisältyvä" tarkoitetaan ainakin yhtä YIR-sekvenssin tai sen vastineen tyrosiini-, isoleusiini- ja arginiiniryhmistä. Termi "silta" tarkoittaa 10 syklisen yhdisteen yhteydessä sidosta, joka on muodostunut kahden keksinnön mukaisessa YIR-peptidissa esiintyvän ei-vierekkäisen aminohapon välille.
Syklisointi voidaan tehdä esimerkiksi muodostamalla Xi:n ja X2:n välille disulfidisilta tai laktaamisilta. Ryh-15 miä, jotka kykenevät muodostamaan disulfidisillan, ovat esimerkiksi Cys, Pen, Mpr ja Mpp sekä sen 2-aminoryhmän sisältävät vastineet. Ryhmiä, jotka kykenevät muodostamaan laktaamisillan, ovat esimerkiksi Asp, Glu, Lys, Orn, α,β-diaminopropionihappo, α-aminoadipiinihappo, a,y-diaminovoi-20 happo, diaminoetikkahappo, diaminobentsoehappo ja merkapto-bentsoehappo. Tässä esitetyt yhdisteet voidaan syklisoida • · • *·· esimerkiksi laktaamisidoksen välityksellä, jossa käytetään *:**: hyväksi ei-viereisen happoryhmän sivuketjuryhmää kovalent- tisen sidoksen Xi:n tai Y:n N-pääteaminoryhmään muodostami- ··· 25 seksi. Keksinnön mukaisten yhdisteiden syklisoinnissa voi- • ·· · . .·. daan käyttää myös toisenlaisia siltarakenteita, joihin kuu- .·;·. luvat peptidit ja peptidijäljitelmät, voidaan syklisoida • · · -S-S-, -CH2-S-, -CH2-O-CH2-, laktaami-, esteri- tai muiden ... sidosten välityksellä (ks. esimerkiksi Hruby, supra, 1982; • · « 30 Toniolo, supra, 1990; Kates et ai., supra, 1993).
• · *···* Tämän keksinnön mukainen koostumus voidaan tarjota :*·*: käytettäväksi homogeenisena koostumuksena tai erilaisia subs- * ·**'; tituenttien yhdistelmiä sisältävien yhdisteiden seoksena.
.*. Substituenttien valinnan mahdollistama joustavuus antaa • · · *;[·* 35 mahdollisuuden säädellä peptidiyhdisteanalogien fysikokemi- • · *···* allisia ominaisuuksia huomattavasti. Substituentin valinta 24 vaikuttaa myös yhdisteen sitoutumisaffiniteettiin (ks. esimerkit) .
Eri yhdisteillä, jotka sisältävät erilaisia substi-tuenttikokoonpanoja, on tasoltaan erilainen inhibitorinen 5 aktiivisuus tekijän Xa suhteen. Nämä yhdisteet syntetisoitiin noudattamalla esimerkeissä kuvattuja menettelytapoja. Peptidien inhibitorinen aktiivisuus testattiin käyttämällä esimerkeissä XXXVII ja XXXVIII kuvattuja testejä. Ammattimies kykenee syntetisoimaan tässä esitetyn yhdisteen, sen 10 muunnokset mukaan luettuna, ja määrittämään yhdisteen inhi-bitorisen aktiivisuuden tekijän Xa suhteen käyttämällä kyseisiä menetelmiä.
Keksintö koskee yhdisteitä, jotka inhiboivat spesifisesti tekijän Xa aktiivisuutta. Kyseisten yhdisteiden Ki 15 tekijän Xa aktiivisuuden suhteen on 100 pmol/l tai sitä pienempi, edullisesti 2 nmol/1 tai sitä pienempi, eivätkä ne inhiboi oleellisesti muiden hyytymiseen tai fibrinolyy-siin osallistuvien proteaasien aktiivisuutta suhteessa tekijän Xa inhibitioon (ks. taulukko 2 edellä). Sellaisiin 20 proteaaseihin kuuluvat esimerkiksi trombiini ja plasmiini. Keksinnön mukaisten yhdisteiden spesifisyyttä havainnollis-: ** tetaan jäljempänä esitetyssä esimerkissä XXXVII (ks. myös taulukko 2 edellä) .
• · · • *φί Keksinnön mukaista yhdistettä voidaan käyttää edul- *:* 25 lisesti antikoagulanttina, joka voidaan saattaa kosketuk-
• IM
:·*; siin verinäytteen kanssa hyytymisen estämiseksi. Vaikuttava ··· määrä keksinnön mukaista yhdistettä voidaan esimerkiksi saattaa kosketuksiin vastaotetun verinäytteen kanssa veri- #... näytteen hyytymisen estämiseksi. Ilmaisu "vaikuttava määrä" • · · 30 tarkoittaa tässä käytettynä, kun se viittaa keksinnön mu- • · ’*;** kaiseen yhdisteeseen, sellaista yhdisteen määrää, joka in- ·#· ί#! ! hiboi tekijän Xa aktiivisuutta. Ammattimiehelle lienee sel- vää, että keksinnön mukaisen yhdisteen vaikuttava määrä • · · voidaan määrittää käyttämällä tässä esitettyjä menetelmiä 35 (ks. esimerkit XXXVII ja XXXVIII) tai muulla tunnetulla ta- • · *···* valla.
25
Esille tuotu keksinnön mukaisen yhdisteen käyttömahdollisuus huomioon ottaen ammattimies käsittänee myös, että sellainen aine kuin esimerkiksi hepariini voidaan korvata keksinnön mukaisella yhdisteellä. Keksinnön mukaisen 5 yhdisteen sellainen käyttö voi johtaa esimerkiksi kustannussäästöihin muihin antikoagulantteihin verrattuna.
Keksinnön mukaista yhdistettä voidaan lisäksi käyttää farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen monien erilaisten kliinisten tilojen hoitamiseksi, mm. esimerkiksi 10 sydän-verisuonitaudin tai infektioon tai kirurgiseen toimenpiteeseen liittyvän komplikaation hoitamiseksi. Esimerkkejä sydän-verisuonisairauksista ovat verisuonenmuovaus-leikkausta seuraava restenoosi, aikuisella esiintyvä hengi-tysvaikeussyndrooma, monen elimen vajaatoiminta, aivohalva-15 us ja disseminoitunut suonensisäinen koagulaatio -hyytymishäiriö. Esimerkkejä läheisistä komplikaatioista, joita liittyy kirurgiaan, ovat esimerkiksi syvälaskimon ja Proksimaalisen laskimon tukos, joka voi ilmetä kirurgisen toimenpiteen jälkeen. Keksinnön mukainen yhdiste on siten käyttö-20 kelpoinen lääkkeenä, jonka on tarkoitus vähentää tai estää ei-toivottua hyytymistä.
• · : ’·· Koska keksinnön mukainen YIR-peptidi kykenee inhi- boimaan tekijän Xa aktiivisuutta, sellainen yhdiste voi so- :***: veltua veren hyytymisen vähentämiseen tai inhiboimiseen yk- • · ··· 25 silössä. Termi "yksilö" tarkoittaa tässä käytettynä selkä- «··· . .*. rankaista, joka sulkee sisäänsä nisäkkään, kuten ihmisen, • · · ·♦· jossa tekijä Xa on osallisena hyytymiskaskadissa.
• · ·
Veren hyytymistä yksilössä voidaan vähentää tai es- ... tää antamalla yksilölle terapeuttisesti vaikuttava määrä • · · \m* 30 keksinnön mukaista YIR-peptidiä. Ilmaisu "terapeuttisesti • « *·;·* vaikuttava määrä" tarkoittaa tässä käytettynä sitä YIR- peptidiannosta, joka yksilölle on annettava tekijän Xa ak- :***: tiivisuuden yksilössä inhiboimiseksi. Tarkemmin kuvattuna ··· .*. terapeuttisesti vaikuttava määrä keksinnön mukaista yhdis- • · · *[** 35 tettä inhiboi tekijän Xa katalyyttistä aktiivisuutta joko • · *···* suoraan protrombinaasikompleksin sisällä tai liukoisena 26 alayksikkönä tai epäsuorasti inhiboimalla tekijän Xa liittymistä protrombinaasikompleksiin. Erityisesti kyseisillä yhdisteillä on sellainen tekijän Xa aktiivisuutta inhiboiva vaikutus, että Ki on 100 pmol/l tai sitä pienempi ja edul-5 lisesti 2 nmol/1 tai sitä pienempi. Terapeuttisesti vaikuttava määrä voidaan määrittää käyttämällä menetelmiä, joita on kuvattu esimerkiksi esimerkeissä XXXVII ja XXXVIII, tai muulla tunnetulla tavalla.
Yksilölle terapeuttisesti vaikuttavan määrän saa-10 vuttamiseksi kulloinkin annettava annos farmaseuttista koostumusta määräytyy monien seikkojen mukaan, joihin kuuluvat esimerkiksi taudin luonne tai vakavuus, antosuunni-telma sekä yksilön ikä ja fyysiset ominaisuudet. Sopiva annostus voidaan päättää lääketieteen alalla tunnetuin klii-15 nisin perustein.
Keksinnön mukaista yhdistettä annetaan yksilölle yleensä koostumuksena, joka sisältää kyseistä yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta. Ilmaisu "farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine" tarkoittaa vä-20 liainetta tai koostumusta, joka ei ole myrkyllinen yksilöl le tai jonka myrkyllisyys on asianmukaisen valvontaelimen • · : *·· määrittelemissä hyväksyttävissä rajoissa. Ilmaisu "far- *:*'ί maseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine" kattaa tässä käy- j **: tettynä kaikki tavanomaiset farmaseuttiset kantaja-aineet, ··· 25 kuten fosfaattipuskuroidun fysiologisen suolaliuoksen, emul- ···· . siot, kuten öljy vedessä ja vesi öljyssä -emulsion, sekä • · · erityyppiset kostutteet. Martin on kuvannut sopivia far-
• I I
maseuttisia kantaja-aineita ja niitä sisältäviä koostumuk- ... siä teoksessa Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack • · · • · · 30 Publishing Co., Easton 1975), joka mainitaan tässä viittee- • · *···* nä. Kyseiset koostumukset sisältävät yleensä terapeuttises- :T: ti vaikuttavan määrän keksinnön mukaista yhdistettä ja so- :***; pivan määrän kantaja-ainetta, niin että muodostuu sopiva ··· .*. annos annettavaksi yksilölle. Patenttivaatimusten kohteina • · · lii 35 olevat yhdisteet voivat siis olla käyttökelpoisia lääkkei- • · • · • · · 27 nä, joiden on tarkoitus inhiboida tekijän Xa aktiivisuutta ja veren hyytymistä yksilössä.
Farmaseuttisesti hyväksyttävät kantaja-aineet voivat sisältää myös esimerkiksi muita väliaineita, yhdisteitä 5 tai tekijää Xa inhiboivan yhdisteen muunnoksia, jotka parantavat sen farmakologista toimintaa. Farmaseuttisesti hyväksyttävä väliaine voi sisältää esimerkiksi happoadditio-suolaa, esimerkiksi epäorgaanisen hapon, kuten suolahapon, vetybromidihapon, fosforihapon, rikkihapon tai perklooriha-10 pon, tai orgaanisen hapon, kuten etikkahapon, oksaalihapon, maleiinihapon, omenahapon, viinihapon, sitruunahapon, meri-pihkahapon tai malonihapon, kanssa muodostettua suolaa. Muita farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat esimerkiksi epäorgaaninen nitraatti, sulfaatti, asetaatti, ma-15 laatti, formiaatti, laktaatti, tartraatti, suksinaatti, sitraatti, p-tolueenisulfonaatti ja vastaavat, jotka sisältävät alkali- tai maa-alkalimetallikationeja, kuten natrium-, litium-, kalium-, kalsium- tai magnesiumioneja, tai myrkyttömiä ammonium-, kvaternaarisia ammonium- tai amiini-20 kationeja, kuten ammonium-, metyyli-ammonium-, dimetyyliam-monium-, trimetyyliammonium-, tetrametyyliammonium-, etyy- ·· • *·· liammonium-, trietyyliammonium- tai tetraetyyliammoniumio- ·:··· neja, kationien rajoittamatta kuitenkaan tässä mainittui- :*··; hin.
• · 25 Esimerkkejä muunnoista, jotka parantavat yhdisteen 1·«· , .·, farmakologista toimintaa, ovat esteröinti, kuten Ci-g-alkyy- • · · liestereiden, edullisesti Ci-^-alkyyliestereiden, joissa ai- • · · ' kyyliryhmä on suoraketjuinen tai haarautunut, muodostami nen. Muita sopivia estereitä ovat esimerkiksi C5_-7-sykloal- • · · 30 kyyliesterit ja aryylialkyyliesterit, kuten bentsyylieste- t« · rit. Tällaisia estereitä voidaan valmistaa tässä kuvatuista ·*;*· yhdisteistä käyttämällä tavanomaisia menetelmiä, jotka ovat .···. peptidikemian alalla tunnettuja.
Farmaseuttisesti hyväksyttävät muunnot voivat kä- • · · *·*·* 35 sittää myös esimerkiksi peptidiamidien muodostuksen. Sei- • · · ·...· laisiin amidimuunnoksiin, joita voidaan valmistaa keksinnön 28 mukaisista yhdisteistä, kuuluvat esimerkiksi muunnokset, joita saadaan ammoniakista, primaarisista Ci-6-dialkyyli-amiineista, joissa alkyyliryhmät ovat suoraketjuisia tai haarautuneita, tai eri tavoin substituoiduista aryyliamii-5 neista. Sekundaaristen amiinien tapauksessa amiini voi olla myös 5- tai 6-jäseninen heterosyklinen yhdiste, joka sisältää esimerkiksi typpiatomin. Menetelmät tällaisten amidien valmistamiseksi ovat alalla tunnettuja.
Yhdessä keksinnön mukaisessa toteutusmuodossa 10 YIR-peptidiä voidaan vielä käyttää testissä tekijän Xa esiintymisen toteamiseksi tai tekijän Xa eristämiseen suurin piirtein puhtaassa muodossa. Edullisesti keksinnön mukainen yhdiste leimataan esimerkiksi radioisotoopilla ja leimattu yhdiste detektoidaan rutiinimenetelmällä, joka so-15 veltuu asianomaisen leimausaineen detektointiin. Lisäksi YIR-peptidiä voidaan käyttää edullisesti koettimena tekijän Xa aktiivisuuden sijainnin tai määrän toteamiseksi in vivo, in vitro tai ex vivo.
On huomattava, että muunnokset, jotka eivät vaikuta 20 oleellisesti tämän keksinnön mukaisten eri toteutusmuotojen aktiivisuuteen, kuuluvat tässä esille tuodun keksinnön pii-• · * • · : ** riin. Seuraavien esimerkkien on siis tarkoitus valaista $ ’*’*· mutta ei rajoittaa tätä keksintöä.
: **: Esimerkki I
• · ··· 25 Menetelmiä peptidien syntetisoimiseksi • ·· · : j*j Synteeseissä käytetyt lähtöaineet hankittiin kerni-
• M
kaalien toimittajilta, kuten Aldrichilta, Sigmalta, Flukal- ta, Nova Biochemiltä ja Advance Chemtechiltä. Yhdisteiden #... syntetisoinnin aikana näissä menetelmissä käytettyjen ami- • · · I.. 30 nohappojohdosten funktionaaliset ryhmät olivat suojausryh- • · ···’ millä suojattuja sivureaktioiden estämiseksi kytkentävai- ··· ί heiden aikana. Esimerkkejä sopivista suojausryhmistä ja :***: niiden käytöstä on esitetty teoksessa The Peptides, supra, 1981 ja osassa 9, toim. Udenfriend ja Meienhofer, 1987, jo- • · · M 35 ka mainitaan tässä viitteenä.
• · • · • · · 29
Keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseen käytettiin yleistä kiinteäfaasipeptidisynteesiä. Sellaisia menetelmiä ovat kuvanneet esimerkiksi Stewart ja Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco 1969, 5 joka mainitaan tässä viitteenä).
Peptidit syntetisoitiin, ellei toisin ole mainittu, polystyreenihartsilla, joka oli silloitettu divinyylibent-seenillä (1 %). Kiinteään kantajaan kytkettiin hapolle herkkä kytkentäaine (Rinkin kytkentäaine) [Rink, Tetr. Lett. 10 28 (1987) 3787; Sieber, Tetr. Lett. 28 (1987) 2107, jotka kumpikin mainitaan tässä viitteenä]. Kytkentä tehtiin N, N 1 di-isopropyylikarbodi-imidiä käyttämällä ekvivalentti-sen määrän HOBt:tä ollessa läsnä. Kaikki kytkennät tehtiin joko Ν,Ν-dimetyyliformamidissa (DMF) tai DMF-dikloorimetaa-15 niseoksessa (1:1) huoneenlämpötilassa (RT) reaktioajan ollessa 40 minuuttia. Kytkennän täydellisyyttä seurattiin ninhydriinitestin avulla.
Fmoc-suojausryhmän poisto toteutettiin piperidiini-DMF-seoksessa (1:1) reaktioajan ollessa 10 minuuttia. Va-20 pautuneen Fmoc:n määrä määritettiin liuoksesta suojauksen poiston jälkeen mitatun absorbanssin (300 nm), pesuliuosten • · • *·· tilavuuden ja synteesissä käytetyn hartsin massan perus- ·:**: teella. Siinä tapauksessa, että kytkentä oli ensimmäisellä ·*·*· kerralla epätäydellinen, tehtiin toinen (kaksois-) kytken- • · 25 tä. Kukin kytkentäsykli ja menetelmät olivat seuraavanlai- ·«·* . .·. siä: • · · • · · • · · • t * • · ·
Vaihe Toimenpide Reagenssi ja liuote ... 1. 1 g peptidihartsia 10 ml DMF:a • · · *·' 30 2. 2,4-kertainen ylimäärä ··· • · *···* aminohappo johdosta
:*·*: 3. 2,4 ekvivalenttia DIC
.·**. 4. 2,4 ekvivalenttia HOBt • · r ··· .·. 5. 40 min:n kytkentä • · ·
*·*·* 35 6. Pesu (3x8 ml) DMF
• · · • · *···* 7. Ninhydriinitesti 30 8. Suojauksen poisto (10 min) 8 ml piperidiini- DMF-seosta (1:1)
9. Pesu (6 x 8 ml) DMF
10. Pesu (2 x 8 ml) Dikloorimetaani (DCM) 5 11. Ninhydriinitesti 12. Toisto vaiheesta 2 alkaen
Sen jälkeen kun koko peptidi oli saatu valmiiksi hartsilla, Fmoc-suojaus poistettiin lopullisesti ja sen jälkeen seurasivat normaalit pesuvaiheet ja suojauksen 10 poistossa vapautuneen Fmoc-ryhmän määrän määritys. Joissakin tapauksissa Na-suojaamaton peptidi asetyloitiin ravistamalla peptidihartsia 20-kertaisen ylimäärän kanssa etik-kahappoanhydridi-pyridiiniseosta (1:1) DCM:ssa 15 minuuttia. Peptidihartsi pestiin perätysten DCM:11a, DMF:11a ja 15 DCM:11a ja kuivattiin sitten alipaineessa.
Peptidihartsi suspendoitiin reagenssi K:ta [King et ai., Int. J. Pept. Prot. Res. 36 (1990) 255 - 266, joka mainitaan tässä viitteenä] sisältävään seokseen (5 ml/g peptidihartsia) 180 minuutiksi (RT), sen jälkeen lohkaisuseos 20 suodatettiin vedettömään dietyylieetteriin ja kiinteä sakka eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin alipaineessa kiin-ϊ ** teiden KOH-pellettien päällä. Kuivattu peptidi puhdistet- *·**’ täin HPLC:n avulla käyttämällä sopivaa veden, joka sisälsi ·· · • *#! 0,1 % TFAta, ja asetonitriilin (ACN) gradienttia. Synteesin ··· 25' päämääränä ollutta tuotetta sisältävän huipun keräyksen ···· ; ·*; jälkeen peptidiliuos kylmäkuivattiin (lyofilisoitiin) ja pep- ··· tidi identifioitiin, joka identifiointiprosessi käsitti elek-tronisuihku-MS- ja aminohappoanalyysin, sen varmistamisek-si, että oli syntetisoitu oikea yhdiste.
• · · I.. 30 Peptidin puhdistamiseksi kylmäkuivatusta, epäpuh- • · ·"* taasta peptidistä otettu näyte liuotettiin seokseen, joka ϊ#ϊ : sisälsi TFA:n 0,l-%:ista vesiliuosta ja 10 - 50 % ACN:ä.
:***; Tavallisesti peptidiliuos suodatettiin ruiskun kautta, joka ··· φ.\ oli yhdistetty Acrodisc 13 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) • · » *.* 35 -nailonsuodattimeen (0,45 pm). Sopiva määrä suodatettua pep- • · ’···* tidiliuosta injektoitiin puolipreparatiiviseen C18-kolon- 31 niin (Vydac Protein and Peptide C18, 218TP1010; The Preparation Group, Hesperia, CA) . Eluenttina käytetyn 0,l-%:isen TFA-puskurin ja ACN:n (HPLC-laatua) muuttuvan tai isokraat-tisen seoksen virtausnopeus pidettiin vakiona käyttämällä 5 Beckmanin System Gold -HPLC:tä. Peptidin eluoitumista seurattiin UV-detektion (230 nm) avulla (Beckman, System Gold, Programmable Solvent Module ja Programmable Detector Module 166, joita valvoi System Gold -ohjelma). Synteesin kohteena ollutta yhdistettä vastaavan huipun tunnistuksen (MS:n avul-10 la) jälkeen yhdiste kerättiin, kylmäkuivattiin ja testattiin biologisesti. MS toteutettiin käyttämällä SCIEX API III+ -laitetta. Lisäksi tehtiin NMR-mittaus käyttämällä General Electricin valmistamaa laitetta (300 MHz). NMR-mit-taukset tehtiin näytteistä tyypillisesti heksadeuterodime-15 tyylisulfoksidissa tai deuterokloroformissa (CDCI3, Aldrich) .
Aminohappoaldehydit valmistettiin käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä. Aminohappo- ja peptidialdehydeis-tä ovat raportoineet esimerkiksi Fehrentz ja Castro, Synthesis 1983, 676; Bajusz et ai., J. Med. Chem. 33 (1990) 20 1729; Kawamura et ai., Chem. Pharm. Bull. 17 (1969) 1902; ja Someno et ai., Chem. Pharm. Bull. 34 (1986) 1748, jotka ·· • *·· kaikki julkaisut mainitaan tässä viitteinä. Pelkistetyt "**ί peptidisidokset syntetisoitiin dipeptiditasolla liuoksessa :1: (esim. Tyr-ίΨ(CH2NH) }-Ile), ja asianmukaisella tavalla suo- • · ··· 25 jattu dipeptidi kytkettiin sitten loppuosaan peptidiä, joka «··· . oli kytkettynä hartsiin, käyttämällä kiinteäfaasipeptidi- ··· synteesiä. Vaihtoehtoisesti suojattu aminohappoaldehydi • · · kytkettiin peptidiin, joka oli kytkettynä hartsiin, käyttä- ... mällä menetelmiä, joita ovat kuvanneet Ho et ai. [Pept.
• · · *·]/ 30 Res. 6 (1993) 10 - 12 ja siinä lainatut lähdejulkaisut, • · *···* jotka kaikki mainitaan tässä viitteinä] .
··· • t · • · · ··» • · • # ·♦· • ♦ • · · • · · • · • · • · ·«« 32
Esimerkki II
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2: n synteesi
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2: n syntetisoinnissa käytettiin Rinkin hartsia {1 g, 0,6 iranol NH2/g hartsia) ja 5 edellä kuvattua menettelyä. Tulokseksi saatu peptidi analysoitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 659,4, laskettu {lask.) 659,9.
Esimerkki III
Ac-Tyr-Ile~Arg-Leu-Pro-NH2 :n synteesi 10 Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2:n syntetisoinnissa käy tettiin Rinkin hartsia (1 g, 0,6 mmol NH2/g hartsia) ja esimerkissä I kuvattua menettelyä. Tulokseksi saadun peptidin {M + H) + : todettu 685, 4, lask. 685, 9.
Esimerkki IV
15 Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2:n synteesi Käytettiin Rinkin hartsia (1 g, 0,6 mmol NH2/g hartsia). Sen jälkeen kun suojaus oli poistettu Tyr:sta ja peptidihartsi pesty asianmukaisesti, lisättiin isobutyral-dehydiä (50 ekv.) DMF:ssa, joka sisälsi 2 % jääetikkaa.
20 Muodostunutta seosta ravistettiin 4 h RT:ssa. Sen jälkeen kun peptidi oli pesty DMF:11a, joka sisälsi 2 % etikkahap- ! ** poa (2x8 ml), lisättiin NaBHsCN:ä (1 g) DMF:ssa (10 ml), ’***· joka sisälsi 2 % etikkahappoa. Peptidihartsia ravistettiin ·· · • 30 min ja sitten se suodatettiin, lisättiin tuoretta seos- •j* 25 ta, joka sisälsi NaBH3CN:ä DMF-etikkahapposeoksessa, ja re- : ·'· aktiota jatkettiin vielä 30 min.
···
Peptidihartsi pestiin sitten 2 % etikkahappoa sisältävällä DMF:lla (2x8 ml) ja DMF:lla (2x8 ml). Tulok- t...# seksi saatu peptidihartsi asetyloitiin etikkahappoanhydri- • · · 30 di-trietyyliamiiniseoksella DMF:ssa (30 ekv. 6 h). Sen jäi- • · keen kun peptidi oli pesty asianmukaisesti, se irrotettiin ··# Σ.ϊ · hartsista ja suojaus poistettiin esimerkissä I kuvatulla Γ**: tavalla. HPLC-puhdistettu peptidi analysoitiin MS:n avulla.
(M + H)+: todettu 758,4, lask. 758,5.
• · · • · ··« • · • · • m 33
Esimerkki V
Tfa-(iBu)Tyr-1le-Arg-Leu- Pr o -NH2: n synteesi (iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink-hartsin valmistamiseen käytettiin esimerkissä IV kuvattua menettelyä. Lopuksi teh-5 ty trifluoriasetylointi toteutettiin käsittelemällä pepti-dihartsia 45 min 0,7 M trifluorietikkahappoanhydridillä di-isopropyylietyyliamiinin (DIEA) ja N-metyyli-imidatsolin (NMI) ollessa läsnä (ekvivivalenttisuhde 1:3:0,3). Peptidin irrotus hartsista ja eristys tehtiin esimerkissä IV kuva-10 tulla tavalla. Puhdistettu peptidi identifioitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 812,4, lask. 812,5.
Esimerkki VI
Ac-Tyr-Ile-Arg-N (CH3) O (CH3) : n synteesi
Boc-Arg (NY-Tos)-N {CH3) 0 {CH3) syntetisoitiin noudat-15 tantalla kirjallisuudessa esitettyä menettelytapaa (Fehrentz ja Castro, supra, 1983). Boc-Arg (NY-Tos)-N (CH3)0(CH3) (200 mg) sekoitettiin RT:ssa trifluorietikkahappoon (TFA, 5 ml) ja seosta sekoitettiin 20 min. Lähtöaineen häviämistä seurattiin ohutkerroskromatorafisesti (TLC) käyttämällä eluentti-20 na CHCl3-MeOH-CH3COOH-seosta (90:9:1), ja visualisointi tapahtui ninhydriinisuihkeen ja UV-valon avulla. Jäljelle jää- • · • *·· neen TFA:n haihdutus ja kuivaus alipaineessa KOH-pellettien ·:**: päällä tuottivat tulokseksi kiinteää ainetta, jolla oli ·*·*: asianmukainen massa. (M + H} + : todettu 371,2, lask. 371,4.
• · •j. 25 Edellä valmistettu aine (150 mg) liuotettiin yhdes- • * · · . sä pullossa DMF:iin (1 ml), sitten lisättiin trietyyliamii- • · · .···. nia (57 μΐ) ja seos jäähdytettiin lämpötilaan 0 °C. Z-Tyr- • · «
Ile-OH (171 mg; Biochem Bioscience, Inc., Philadelphia, PA) ... liuotettiin toisessa pullossa vedettömään tetrahydrofuraa- • · · *·[ * 30 niin (THF) ja jäähdytettiin lämpötilaan -10 °C, sitten li- *···* sättiin N2-kaasun alla NNM:ää (44 μΐ) ja isobutyylikloori- :*·*: formiaattia (52 μΐ) ja seosta sekoitettiin 15 min. Z-Tyr- ·“*. Ile-OH-dipeptidin seka-anhydridiin lisättiin edellä valmis- • · · .·. tettu liuos, joka sisälsi Arg (Tos) N (CH3) O (CH3) : a DMF:ssa, ja • · · *·*·* 35 seosta sekoitettiin 30 min lämpötilassa -10 °C ja sen jäi- • · *···* keen yön yli RT:ssa.
34
Esimerkissä I kuvatulla tavalla suoritetun reak-tioseoksen loppukäsittelyn jälkeen peptidi kuivattiin alipaineessa, ja pieni osa puhdistettiin HPLC:n avulla ja analysoitiin MS:llä; peptidillä oli odotettu molekyylimassa 5 (781). Tulokseksi saatu peptidi Z-Tyr-Ile-Arg(Tos)- N (CH3) 0 (CH3) sekoitettiin anisolin (500 μΐ) kanssa, ja siitä poistettiin suojaus HF:lla tavanomaisella menettelytavalla. Loppukäsittelyn jälkeen saatiin eristetyksi 160 mg Tyr-Ile-Arg-N (CH3) O (CH3) : a ja se identifioitiin MS:n avulla (todettu 10 493,6, las. 494). Jäljelle jäänyt peptidi liuotettiin sit ten 1 N HCl:oon (1 ml) ja kylmäkuivattiin.
Tyr-Ile-Arg-N (CH3) O (CH3) -2HC1 (76 mg) liuotettiin ACN:iin ja jäähdytettiin lämpötilaan 0 °C, ja lisättiin py-ridiiniä (13 μΐ) ja sen jälkeen etikkahappoanhydridiä 15 (15 μΐ). Seosta sekoitettiin 3 h lämpötilassa 0 °C ja reak
tion täydellisyyttä seurattiin ninhydriinitestillä. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu 8 h RT:ssa, tehtiin loppukäsittely ja tuote, Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3) O (CH3), karakterisoitiin MS:n avulla (todettu 535,6, lask. 535,3). 20 Esimerkki VII
Ac-Tyr- {Ψ (CH2NH) }-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2: n synteesi • · • 1·· a) Raoc-Tyr(But)-H:n synteesi
Fmoc-Tyr (But)-OH:n (4,6 g, 10,0 mmol) , disyklohek-syylikarbodi-imidin (DCC; 2,1 g, 10,1 mmol), bentsyylimer- • · ··· 25 kaptaanin (1,26 g, 10,1 mmol) ja DMAP:n (0,12 g) annettiin ···· . reagoida DCM:ssa tavalla, jota ovat kuvanneet Ho ja Ngu (J. Org. Chem. 58 (1993) 2315, joka mainitaan tässä viit- • ♦ · teenä]. Loppukäsittelyn jälkeen eristettiin Fmoc-Tyr(But)- ... S-CH2C6H5, ja kun tämä tioesteri pelkistettiin sekoittamalla • · · *l!.' 20 sitä trietyylisilaanin kanssa 10 % Pd/hiili -katalyytin oi- • · "”·1 lessa läsnä ja puhdistettiin flash-kromatografisesti, saa- tiin Fmoc-Tyr (But) -H: ta (saanto 81 %) . Tuotteen NMR-spektri ja massa olivat odotusten mukaisia.
• · · · • · · • · · • · • · · • · • · • · · 35 b) Fmoc-Tyr (But) - {Ψ (CH2NH) } -lie- (O-allyylin) synteesi
Liuokseen, joka sisälsi TFA-Ile- (O-allyyliä) (0,516 g, 1,82 mmol) DMF:ssa (2 ml), lisättiin Fmoc-Tyr (But ) -OH: ta (0,73 g, 1,66 mol) ja NaBH3CN:ä (0,209 g, 5 3,32 mmol) DMF:ssa (20 ml), joka sisälsi 1 % AcOH:a. 2 h:n kuluttua reaktioseos loppukäsiteltiin ja lopputuote puhdistettiin flash-kromatografisesti (etyyliasetaatti-heksaani-seos (35:65), jolloin saatiin öljymäinen tuote, jolla oli asianmukainen NMR- ja massaspektri. (M + H)+: todettu 599, 10 lask. 598,7.
c) Fmoc-Tyr (But) - (Ψ (CH2NH) } -Ile-OH: n synteesi
Fmoc-Tyr (But) -{Ψ (CH2NH) }-Ile- (O-allyyliin) (0,467 g, 0,78 mmol), joka oli DCM:ssa (10 ml), lisättiin HOAc:a (89 μΐ, 1,56 mmol), trietyyliamiinia (TEA, 20 μΐ) ja 15 kompleksia PdCl2{Ph3)2 (0,02 g). Lisättiin Bu3SnH (231 μΐ, 0,86 nmol) yhdessä erässä ja seosta sekoitettiin 1 h RT:ssa. Reaktioseoksen asianmukaisen loppukäsittelyn jälkeen tuote puhdistettiin flash-kromatografisesti (CHCl3-MeOH-seos, 20:1), jolloin saatiin 0,319 g odotettua peptidiä 20 (saanto 69 %). (M + H)+: todettu 559, lask. 558.
Fmoc-Tyr(But)-(Ψ (CH2NH)}-Ile-OH kytkettiin sitten • ·
• *·· Arg (Pmc) -Leu-Pro-Rink-hartsiin käyttämällä esimerkissä I
*:**: pääpiirteittäin kuvattua yleistä kiinteäfaasimenetelmää.
·*·*: Valmiista peptidihartsista Ac-Tyr (But) - {Ψ (CH2NH) }-Ile- • · 25 Arg (Pmc) -Leu-Pro-Rink poistettiin suojaus ja peptidi irro- • · · · . .·. tettiin hartsista tavanomaisella tavalla, jota on kuvattu • · · .·;·. esimerkissä I, ja puhdistettiin HPLC:n avulla C18-kolon- • · · nissa.
... Esimerkki VIII
• · · *·] * 30 Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2 (4-pyridyylin) synteesi • · *···* Oksiimihartsiin [DeGrado ja Kaiser, J. Org. Chem.
45 (1980) 1295] (0,862 g, 0,6 mmo NH2l/g) kytkettiin yön e yli kestäneellä reaktiolla Boc-Arg (Tos) -OH DIC:n ja HOBt:n • · · .·. ollessa läsnä. Hartsi pestiin DMF: 11a ja sitten DCM:lla ja • · · *;[·* 35 asetyloitiin etikkahappo-DIEA-seoksella (ekvivalenttisuhde • · '···’ 1:1) DOM: ssa. Sen jälkeen kun hartsi oli pesty DCM:lla, 36 DMF:lla ja DCM:lla, siitä poistettiin suojaus 25 % TFA:a sisältävällä DCM:lla (30 min). Suojaamaton hartsi pestiin DCM:lla, isopropanolilla ja DCM:lla. TFA-Arg (Tos)-OxmR:ään kytkettiin Boc-Ile-OH symmetrisen anhydridin muodossa 5 (3 ekv.) DCM:ssa ja DIEA:n (1,5 ekv.) ollessa läsnä. Tois tettiin edellä kuvattu sykli, joka käsitti pesun, asety-loinnin ja suojauksen poiston. Suojauksen poiston jälkeen kytkettiin Boc-Tyr(2-BrZ)-OH samalla tavalla kuin Ile, ja valmiista peptidihartsista Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR 10 poistettiin suojaus ja se asetyloitiin, jolloin saatiin Ac-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR. Peptidihartsi kuivattiin alipaineessa, jolloin saavutettiin kokonaissaanto 0,216 g.
Kolmasosaan hartsia lisättiin 4-(dimetyyliamino)py-ridiiniä (100 μΐ, 800 pmol) seoksen, joka sisälsi jääetik-15 kaa (60 μΐ) ja DIEA:a (120 μΐ) DCM:ssa (6 ml), ollessa läsnä. Hartsia ravistettiin yön yli RTrssa. DCM-liuoksen suodatuksen jälkeen hartsi pestiin DMF:11a (3 ml) ja pesuliu-okset yhdistettiin DCM-suodoksen kanssa. Liuotteen haihdutuksen jälkeen jäljelle jääneestä peptidistä poistettiin 20 suojaus HF-anisoliseoksella ja se käsiteltiin tavanomaisella tavalla, jolloin saatiin odotettu peptidi. Toteutettiin • · i 1·· elektronisuihku-MS. (M + H)+: todettu 582, 3, lask. 582.
*”1: Esimerkki IX
Ac-Tyr-Ile-{Ψ(CHzNH) }-Arg-Leu-Pro-NH2:n synteesi • · •••25 a) Boc-Ile-H:n synteesi IM· . Aldehydi syntetisoitiin Boc-Ile-N (Me) O (Me) : stä Feh- rentzin ja Castron (supra, 1983) kuvaamalla tavalla. Aide- • · · hydi identifioitiin TLC:n ja NMR-spektrin avulla lähdejul- ... kaisussa kuvatulla tavalla.
• · · **[#1 30 b) Arg(Tos) -Leu-Pro-MBHA:n synteesi • ·
*···1 Tämä tripeptidihartsi syntetisoitiin esimerkissä I
kuvatulla yleisellä kiinteäfaasimenetelmällä.
··· • · • · • · • · · ··· • · · · • · • · ·»« 37 c) Boc-Ile-WCHsNH) }-Arg <Tos)-Leu-Pro-MBHA: n synteesi
Boc-Ile-H kytkettiin tripeptidihartsiin Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA pelkistysaminoinnilla käyttämällä DMF:iin, jo-5 ka sisälsi 1 % etikkahappoa, sekoitettua NaBH3CN:a. Boc-ryhmä poistettiin tavanomaisella tavalla ja kytkettiin Ac-Tyr-OH käyttämällä DIC-HOBt-seosta. Valmiista peptidihart-sista {0,7 g) poistettiin suojaus ja se irrotettiin hartsista käyttämällä HF-tioanisoliseosta. 19 mg epäpuhdasta 10 Ac-Tyr-Ile-f’PfCHsNH) }-Arg-Leu-Pro-NH2: ta puhdistettiin HPLC:n avulla C18-kolonnissa, jolloin saatiin noin 5 mg odotettua peptidiä, jonka puhtaus oli yli 90 %. {M + H)+: todettu 688,4, lask. 687,9.
Esimerkki X
15 Ac-Tyr-Ile-Dab (NY-C3H7N) -Leu-Ala-NH2: n synteesi SCAL-TG-hartsiin (0,2 g, 0,2 mmol NH2/g) [Patek ja Lebl, Tetr. Lett. 32 (1991) 3891 - 3894, joka mainitaan tässä viitteenä] kytkettiin Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH ja Fmoc-Tyr(But)-OH käyttämällä 20 esimerkissä I kuvattuja menetelmiä. N-pääteaseman asety-loinnin ja TFA:lla tehdyn sivuketjun suojauksen poiston • · • *·· jälkeen peptidihartsi Ac-Tyr-Ile-Dab-Leu-Ala-SCAL-TG pes- *:·*: tiin ja neutraloitiin, ja sitä käsiteltiin PyBroP-NMI- ·’·*: seoksella (0,3 mol/1) DMF:ssa 2 h. Valmis peptidi irrotet- • « 25 tiin hartsista käyttämällä seosta,, joka sisälsi trifenyyli- • · · · . fosfiinin ja (CH3)3SiCl:n yhdistelmää (1 mol/1) DCM:ssa • · · .···, (3 x 1 h), ja sen jälkeen 100-:ista TFA: a (1 h). Sen jäi- • · · keen peptidi oli eristetty epäpuhtaana dietyylieetterillä ... saostamalla, se kylmäkuivattiin TFA:n 0,l-%:isesta vesiliu- • · · 30 oksesta. Peptidi Ac-Tyr-Ile-Dab(NY-C3H7N)-Leu-Ala-NH2 puhdis- • · *···* tettiin HPLC:n ja karakterisoitiin MS:n avulla. (M + H)+: to- dettu 676, 4, lask. 676, 4.
·***· Esimerkki XI
• · • · · .*. Ae-Tyr-Ile-PalMe (3)-NH2 :n synteesi • · · 35 Rinkin hartsiin (1,0 g, 0,48 mmol NH2/g) kytkettiin • · ’···' Fmoc-Pal (3)-OH, Fmoc-Ile-OH ja Fmoc-Tyr (But} -OH käyttämällä 38 esimerkissä I kuvattuja menetelmiä. Valmiiseen peptidihart-siin Fmoc-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rink (0,25 g) lisättiin metyyli jodidia (Mel, 500 μΐ) DCMissa, ja peptidihartsia ravistettiin 6 tuntia. Valmiista peptidihartsista Fmoc-5 Tyr(But)-Ile-PalMe(3)-Rink poistettiin suojaus, se asety-loitiin ja peptidi irrotettiin hartsista esimerkissä I kuvatulla tavalla. Osa epäpuhtaasta peptidistä puhdistettiin HPLC:n avulla, ja lopullinen peptidi karakterisoitiin MS:ä käyttämällä.
10 Esimerkki XII
Ac-syklo (Glu-Tyr-Ile-Arg-Leu-Lys) -NH2: n synteesi SCAL-TG-hartsiin (1 g, 0,29 mmol NH2/g; ks. esimerkki X) kytkettiin Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH ja Fmoc-15 Glu(OtBu)-OH käyttämällä esimerkissä I kuvattuja menetelmiä. Fmoc-ryhmän poiston jälkeen peptidihartsi asetyloitiin ja pestiin DMF:lla ja sen jälkeen DCM:lla. Peptidihartsista Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Lys(Boc)-SCAL-TG poistettiin suojaus reagenssi K:11a, ja se pestiin, neutraloi-20 tiin ja syklisoitiin (2 h) BOP-HOBt-DIEA-seosta (ekvivalent- tisuhde 5:5:5) käyttämällä DMF:ssa. Kytkennän täydellisyyt- • · ί '* tä seurattiin Kaiserin [Kaiser et ai., Anal. Biochem. 34 *·“· (1970) 595, joka mainitaan tässä viitteenä] kuvaamalla nin- • · · • ’/· hydriinitestillä. Syklisoinnin jälkeen peptidi irrotettiin ·:· 25 hartsista, puhdistettiin HPLC:n ja karakterisoitiin MS:n : avulla. (M + H)+: todettu 844,5, lask. 844,5.
Esimerkki XIII
• · ·
Syklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly):n synteesi
Oksiimihartsiin (1 g, 0,6 mmol NH2/g; ks. esimerkki
I.. 30 VIII) kytkettiin yön yli kestäneellä reaktiolla Boc-Gly-OH
• · *;·* DIC:n ja HOBt:n ollessa läsnä. Hartsin pesun ja suojauksen ··· ’/· : poiston jälkeen kytkettiin Boc-Arg (Tos)-OH, Boc-Ile-OH ja :***; Boc-Tyr (2-BrZ) -OH käyttämällä esimerkissä VIII kuvattuja menetelmiä. Kolmasosasta peptidihartsia Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile- • · · I.* 35 Arg (Tos)-Gly-oksiimihartsi poistettiin suojaus, ja siihen • · *···* kytkettiin Boc-Gly-OH DIC:n ja HOBt:n ollessa läsnä. Vai- 39 miista peptidihartsista poistettiin suojaus, se neutraloitiin ja sitä syklisoitiin yön yli DMF:ssa, joka sisälsi 1 % etikkahappoa. Hartsi suodatettiin ja pestiin (DMF), suodok-set yhdistettiin ja orgaaninen liuote poistettiin haihdut-5 tamalla alipaineessa. Jäljelle jääneestä peptidistä poistettiin suojaus (HF-anisoliseos), ja se kylmäkuivattiin, puhdistettiin HPLCrn ja karakterisoitiin MS:n avulla. {M + H)+: todettu 547,8, lask. 547,8.
Esimerkki XIII
10 N-substituoitujen glysiiniyhdisteiden syntetisointi
Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidinopropyyli)Gly~NH2 :n synteesi N-substituoitujen glysiinien syntetisointiin käytettiin Zuckermannin et ai. esittämää menetelmää [J. Am.
15 Chem. Soc. 114 (1992) 10646, joka mainitaan tässä viitteenä] . SCAL-TG-hartsiin (1 g, 0,29 mmol NHa/g; ks. esimerkki X) kytkettiin bromietikkahappo DCM-DMF-seoksessa symmetristä anhydridiä käyttämällä. Kukin kytkentäreaktio toistettiin kahdesti. Br~CH2CO-SCAL~TG-hartsiin lisättiin Boc-NH- 20 CH2CH2CH2NH2:ta DMSO:ssa, ja hartsia ravistettiin 2 h. Suojauksen poiston jälkeen menettely toistettiin toteuttamalla • · • ’·· vuorotellen Br-CH2C00H:n kytkentä hartsiin ja bromietikka- *5**i happohartsin reaktio asianmukaisen amiinin kanssa. (Bzl)Gly- :1 2·1; (Chx) Gly- [Boc-NH- (CH2) 3] Gly-Scal-TG-hartsia asetyloitiin etik- • · ··· 25 kahappoanhydridi-DIEA-NMI-seoksella (1:1:0,25) DMF: ssa yön ···· . .·. yli· Boc-suojausryhmän poiston jälkeen Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly- (2-aminopropyyli) Gly-SCAL-TG-hartsia käsiteltiin 1,8 M kar- • · 1 boksiamidinopyratsolihydrokloridilla [Bernatowicz et ai., ... J. Org. Chem. 57 (1992) 2497 - 2502, joka mainitaan tässä • · · *·1 30 viitteenä] DMF:ssa DIEA: n (1:1) ollessa läsnä 3 h RT:ssa.
• · *···1 Guanyloitumisen täydellisyyttä seurattiin Kaiserin testil- lä. Tulokseksi saatu peptidi irrotettiin hartsista, käsi- ·’**; teltiin esimerkissä X kuvatulla tavalla ja analysoitiin .1. MS: n avulla. (M + H) + : todettu 502, 3, lask. 502,3.
• · · • · · • · · · • · • · 2 ·
Esimerkki XV
40
Diketopiperatsiiniyhdisteiden syntetisointi
Syklo(Ser-Ida)-Ile-Arg-Leu-Leu-Ala-NH2: n synteesi Lähtöaineena käytetty suojattu tetrapeptidi Fmoc-5 Ile-Arg(Pmc)-Leu-Ala-Rink valmistettiin Rinkin hartsilla käyttämällä Fmoc-suojausmenettelyä (ks. esimerkki I), Sen jälkeen kun Fmoc-suojausryhmä oli poistettu peptidihartsis-ta, kytkettiin perätysten Fmoc-Ida(OMe)-OH (3 ekv.; DIC, HOBt) ja Fmoc-Ser(tBu)-OH (7 ekv.; symmetrinen anhydridi).
10 Lopullinen suojauksen poisto ja spontaani syklisaatio to teutettiin samanaikaisesti saattamalla peptidihartsi 1 h:ksi kosketuksiin piperidiini-DMF-seoksen kanssa (1:1). Pesuvai-heiden jälkeen lopullinen peptidi irrotettiin hartsista ja siitä poistettiin suojaus käyttämällä TFA-tioanisoli-H20- 15 seosta (95:2,5:2,5). Tulokseksi saatu peptidi käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla ja analysoitiin HPLC:n (puhtaus yli 95 %) ja MS:n avulla. (M + H)+: todettu 655,4, lask. 655,38.
Esimerkki XVI
20 Ph-C (NOCH2Ph) -CO-I-R-NH2: n synteesi
Rinkin hartsiin (0,2 g) kytkettiin Fmoc-Arg(Pmc)-OH
·· • *·· ja Fmoc-Ile-OH, ja sen jälkeen Fmoc-suo jausryhmä poistet- *:*·: tiin (ks. esimerkki I). Peptidihartsiin Ile-Arg (Pmc) -Rink kytkettiin Ph-C (NOCH2Ph)-COOH käyttämällä edellä kuvattua • · .j. 25 DIC-HOBt-menettelyä. Valmis peptidihartsi Ph-C(NOCH2Ph)-CO-
MM
. Ile-Arg (Pmc)-Rink loppukäsiteltiin esimerkissä I kuvatulla • · · ,···. tavalla ja analysoitiin IMS: n avulla. (M + H) + : todettu 524,3, lask. 524,6.
Esimerkki XVII
··· 1 · · *·* 30 Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2:n synteesi • · *···* Synteesi toteutettiin Rinkin hartsilla (100 mg, :*·*; 0,48 mmol NH2/g) noudattamalla esimerkin I mukaista mene- .**·. telmää ja käyttämällä seuraavia aminohappojohdoksia: Fmoc- ·»· .·. Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH ja Fmoc- • · · *·]·* 35 pAph (Fmoc) -OH (raseeminen seos). Peptidi irrotettiin hart- • · ’···* sista ja eristettiin esimerkissä I kuvatulla tavalla. Mo- 41 lemmat diastereomeeriset peptidit eristettiin RP-HPLC:n ja identifioitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 754,4/ lask.
754,5.
Esimerkki XVIII
5 Ac-Tyr-Chg-Arg-olin synteesi
Peptidisekvenssi rakennettiin Fmoc-Arg(Pmc)-Sasrin-hartsilla (0,25 g, 0,5 mmol NH2/g; Bachem Bioscience) käyttämällä esimerkissä I kuvattua menetelmää. N-pääteaseman Fmoc-suojausryhmän poiston ja asetyloinnin jälkeen suojattu 10 peptidi irrotettiin hartsista pelkistämällä C-terminaalise-na alkoholina (Mergler et ai., Peptides, toim. Schneider ja Eberle, Leiden 1993, s. 177 - 178, joka mainitaan tässä viitteenä). Peptidihartsia ravistettiin 24 h liuoksen kanssa, joka sisälsi NaBH^a (4 ekv.) THF-EtOH-seoksessa (6:1, 15 2 ml). Lohkaisureaktion jälkeen hartsi pestiin DCM:lla, ja sen jälkeen lohkaisuliuos ja pesuliuokset yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. Kylmäkuivatusta peptidistä poistettiin suojaus käsittelemällä sitä TFA-vesi-tioanisoliseoksella (90:5:5) 2 h, ja se eristettiin saostamalla. HPLC-puhdis- 20 tettu peptidi analysoitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 505.3, lask, 505,3.
• 1·· Esimerkki XIX
·;··: Ac-Tyr-Chg-Arg-oli-asetaatin synteesi ·1·1: Suojattu peptidialkoholi valmistettiin esimerkissä • · 25 XVIII kuvatulla tavalla. 10 mg puhdistamatonta ainetta liu- ···· . .·. otettiin DCM-ACN-seokseen, ja sitä käsiteltiin 20 min etik- • · · kahappoanhydridillä (2 mmol) TEA:n (2,4 mmol) ollessa las- • · · nä. Liuos suodatettiin ja haihdutettiin, ja peptidistä ... poistettiin suojaus edellä kuvatulla tavalla. HPLC-puhdis- • · · '·[1 30 tettu peptidi analysoitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 547.3, lask. 547,3.
• · · • · · • · · • · · • · • · ··· · • · · • · · • · • · · • · • · • · ·
Esimerkki XX
42
Ac-Phe (pNH2) -Chg-Orn [C (NH) CH3] -Leu-Pro-NH2: n synteesi
Tentagel S -aminohartsi (1 g, 0,28 mmol NH2/g hartsia; Rapp Polymer, Tubingen, Saksa) funktionalisoitiin 5 SCAL-kytkentäaineella esimerkissä X kuvatulla tavalla ja siihen kytkettiin seuraavat aminohapot: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH ja Fmoc-Chg-OH. Peptidihartsi Fmoc-Chg-Orn(Boc)-Leu-Pro-SCÄL-TG käsiteltiin TFA-DCM-seok-sella (1:1) (yksi 1 min:n pesu, sitten yksi 30 min:n pesu), 10 pestiin kolmesti DOM:11a, neutraloitiin 5 % DIEA:a sisältävällä DCM:lla (2 x 30 s) ja pestiin kahdesti DCM:lla. Pepti-dihartsiin lisättiin liuos, joka sisälsi etyyliasetimidaat-tihydrokloridia (1,5 g; Aldrich) pyridiini-DIEA-seoksessa (1:1, 4 ml) ja DMF:ssa (3 ml), ja kytkentää jatkettiin yön 15 yli RT:ssa.
Peptidihartsista Fmoc-Chg-Orn[C (NH) CH3] -Leu-Pro-SCAL-TG poistettiin suojaus käsittelemällä sitä 20 % piperi-diiniä sisältävällä DMF:11a 12 min, se pestiin neljästi DMF:11a ja neljästi DCM:lla, ja siihen kytkettiin Fmoc-20 Ph(pNH-Boc)-OH DMF:ssa käyttämällä DIC-HOBt-kytkentää.
Fmoc-suojausryhmän poisto ja asetylointi (20 min) etikka- • · : *'· happoanhydridi-pyridiiniseoksella (1:1) tuottivat tuloksek- si peptidihartsin Ac-Phe (pNH-Boc) -Chg-Orn [C (NH) CH3) -Leu-Pro-j ’ : SCAL-TG. SCAL-kytkentäryhmän pelkistys ja peptidin irrotus ··· 25 hartsista, joita seurasi raakatuotteen HPLC-puhdistus, tuot- ···· ; ·*. tivat tulokseksi odotetun yhdisteen. (M + H)+: todettu .·!·. 740,2, lask. 740,48.
• · ·
Esimerkki XXI
Ac-Phe (pNH2) -Chg-Dap (Ν^ΟεΗιχΝ) -Leu-Pro-NH2:n synteesi I.. 30 SCAL-TG-hartsiin (0,5 g, 0,32 mmol NH2/g) kytket- • · *·;·’ tiin Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dap (Boc)-OH ja Fmoc- ί Chg-OH. Boc-ryhmä poistettiin sivuketjusta 50-%:ista TFA:a :1; käyttämällä (20 min) , ja peptidihartsi neutraloitiin pese- • · · mällä se 10 % DIEA:a sisältävällä DCM:lla. Sivuketjun vapaa • · · l.l 35 aminoryhmä muunnettiin dimetyyliamidiniumryhmäksi käsitte-• · *·*’ lemällä peptidihartsia PyBroP-NMI-seoksella (0,3 mol/1) DMF:ssa 20 min. Fmoc-suojausryhmän poisto piperidiini-DMF- seoksella (1:1) (60 min) johti dimetyyliamidiniumryhmän 43 vaihtumiseen piperidiniumryhmäksi Dap:n sivuketjussa. Sekvenssi saatettiin valmiiksi kytkemällä Fmoc-Phe(Boc)-OH ja 5 poistamalla Fmoc-suojausryhmä. Peptidi asetyloitiin ja irrotettiin esimerkissä X kuvatulla tavalla. HPLC-puhdistettu peptidi analysoitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 752,4, lask. 752,4.
Esimerkki XXII
10 Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2: n synteesi
Raseeminen H-Phe(pCN)-OH valmistettiin asetamidoma-lonaattimenetelmällä [Wagner et ai., DD-patenttijulkaisu 155 954 (julkaistu 21. heinäkuuta 1982, tutkittu uudelleen 9. marraskuuta 1988), joka mainitaan tässä viitteenä]. Ra-15 seeminen Ac-pAph-OH valmistettiin muuntamalla syaaniryhmä ammonolysoimalla vastaava metyylitioimidaatti (joka saatiin aikaan antamalla syaaniryhmän reagoida vetysulfidin kanssa) ja sen jälkeen metyloimalla Melrlla.
Peptidin syntetisointiin käytettiin Tentagel-hart-20 siä (1 g, substituutioaste = 0,21 mmol NH2/g hartsia) ja
Knorrin kytkentäainetta [Bernatowicz et ai., Tetr. Lett. 30 • · • ’·· (1989) 4645, joka mainitaan tässä viitteenä]. Dipeptidi *:**: Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG rakennettiin esimerkissä I kuvatulla :*·*: tavalla. 3-pyridyylialaniini metyloitiin sen jälkeen käsit- • · • j. 25 telemällä sitä Meljlla (1 ml) DCM:ssa yön yli. Fmoc-suo- • · · · . .·. jausryhmän poiston jälkeen kytkettiin Ac-pAph-OH käyttämäl- lä DIC-HOBt-menetelmällä, ja peptidi loppukäsiteltiin esi- « · · merkissä I kuvatulla tavalla. (M + H)+: todettu 550,3, ... lask. 550,31.
• · · • ♦ · • · « ♦ ··· ·«« * · · • · · ··· • · • · ··· « · • · · • · · • · 1 • ♦ • · • · ·
Esimerkki XXIII
44
Ac-Tyr-Chg-pAph-Leu-Pro-NH2: n synteesi
Pentapeptidi Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG rakennettiin Tentagel-hartsilla (0,4 g, substituutioaste 5 =0,2 mmol NH2/g hartsia) esimerkissä I kuvatulla tavalla.
Hartsia käsiteltiin suljetussa ruiskussa yön pyridiini-trietyyliamiiniseoksella (75:25, 8 ml), joka oli kyllästetty H2S:lla. Hartsiin sitoutunutta tioamidia metyloitiin Mel:a (0,5 ml) käyttämällä asetonissa (8 ml) 30 min lämpö-10 tilassa 50 °C, ja sitten se pestiin asetonilla ja me- tanolilla. Metyylitioimidin annettiin reagoida ammoniumase-taatin kanssa metanolissa 3 h lämpötilassa 55 °C, jolloin saatiin lopullinen yhdiste, joka irrotettiin hartsista ja puhdistettiin edellä kuvatulla tavalla. (M + H)+: todettu 15 761,4, lask. 760,43.
Esimerkki XXIV
Ac-Phe (pCH2NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2: n synteesi
Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 (puhdistamaton peptidi) syntetisoitiin Rinkin hartsilla (1 g, 0,6 mmol 20 NH2/g hartsia) esimerkissä I kuvatulla tavalla). Puhdista maton peptidi (125 mg) liuotettiin MeOH:iin (50 ml) ja li-! *·· sättiin raneynikkelisuspensiota (0,5 ml; Aldrich). Peptidin ja katalyytin seosta hydrattiin paineessa 240 kPa (35 psi) |**#: RT:ssa 4 h. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja liuos ··· 25 haihdutettiin kuiviin. Jäännös kylmäkuivattiin TFA:n ««·· ; 0,l~%:isen vesiliuoksen ja ACN:n (30 %) seoksesta. Kuivattu • · · raakatuote puhdistettiin HPLCrn ja analysoitiin MS:n avul- • · · la. (M + H)+: todettu 741,4, lask. 741,7.
... Esimerkki XXV
s · · 30 Ac-Phe [pC (NOH)NH2] -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2:n synteesi • · *·;·* Esimerkissä XXIV kuvatulla tavalla saatuun puhdis- :T: tamattomaan peptidiin (21,1 mg) sekoitettiin NH2OH-HCl:a (60,3 mg; Aldrich) MeOH:n (1,5 ml), pyridiinin (0,7 ml) ja * · · .*. TEA:n (0,5 ml) seoksessa. Seosta sekoitettiin 72 h RT:ssa, • · · *.* 35 ja sen jälkeen liuote ja haihtuvat aineet haihdutettiin • · • · • · · 45 alipaineessa. Peptidi puhdistettiin HPLC:n ja analysoitiin MS:n avulla. (M + H)+: todettu 770,4, task. 770,3.
Esimerkki XXVI (pelk. tekn. informaatiota varten) AI-A2-B-yhdisteiden syntetisointi 5 Al-A2-B-yhdisteet, so. sellaiset A1-A2- (A3)m-B-yh- disteet, joissa m on 0, valmistettiin tavalla, joka on esitetty pääpiirteittäin kuviossa 3. Lyhyesti kuvattuna rasee-misen N-asetyyli-4-syaanifenyylialaniinin kytkentä L-syklo-heksyyliglysiinin metyyliesteriin (H-Chg-OMe) tuotti tulok-10 seksi kahden diastereomeerisen dipeptidin seoksen, jotka erotettiin kromatografisesti. Raseemiselle N-asetyyli-4-syaanifenyylialaniinille tehtiin osittainen resoluutio muodostamalla suola L-sykloheksyyliglysiinin metyyliesterin kanssa. Huonommin liukeneva D,L-suola kiteytyi helposti, ja 15 sitä seurannut kytkentä tuotti tulokseksi Ac-F(pCN)-Chg- 0Me:tä suurin piirtein puhtaassa muodossa. "Emäliuokset" sisälsivät runsaasti L,L-suolaa, ja kytkentä johti epäpuhtaan Ac-F(pCN)-Chg-0Me:n muodostumiseen, joka puhdistettiin tarkemmin kromatografisesti silikageeIillä. Nämä dipepti-20 diesterit hydrolysoitiin vastaaviksi hapoiksi litiumhydrok-sidilla metanoli-vesiseoksessa RT:ssa. Molemmat dipeptidi- • · ί *' hapot muunnettiin substituoiduiksi amideiksi tavanomaisella ’·**· kytkentäreaktiolla asianmukaisten amiinien (RNH2) kanssa.
·· ♦ • Amiinit, joita ei ollut kaupan, valmistettiin tavanomaisin ·:* 25 kemiallisin menetelmin.
···« • ·’· Syaaniryhmien muunto vastaaviksi amidiineiksi teh- ··· .*i*. tiin tavanomaisin kemiallisin menetelmin, joko tioamidin ja • · « 9 metyylitioimidaatin kautta tai hydraamalla vastaava amidok-siimi (esimerkki XXV) . Viimeksi mainittu saatiin aikaan an- • 9 9 I.. 30 tamalla nitriilin reagoida hydroksyyliamiinin kanssa. Alla • · *···* annetut esimerkit valaisevat otsikon mukaisten yhdisteiden
• M
ί ϊ: valmistusta näillä nimenomaisilla menetelmillä. On huomat- tava, että keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa
• M
monenlaisilla muillakin menetelmillä ja että menettelyta- • · · 35 vat, joita tässä valaistaan esimerkein, valittiin mukavuus- • · **··* syistä.
Esimerkki XXVII
46
Ac-pAph-Chg-NHCHh (4-metyylipyri.diniumin) synteesi
Ac-pAph-Chg-NHCEh (4-metyylipyricinium) syntetisoitiin muuntamalla Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2 (4-pyridyyli) esimerkissä XXII 5 kuvatuin menetelmin. Lopullinen yhdiste puhdistettiin HPLC:n avulla esimerkissä I kuvatulla tavalla. MS-analyysi: (M + H)+: todettu 493, 3, lask. 493,29.
Lähtöaine valmistettiin seuraavasti: a} Ac-(D, L)-F(pCN) (2,32 g, 10 inmol) liuotettiin läm-10 niittämällä etanoliin (75 ml) . Lisättiin L-sykloheksyyligly-siinin metyyliesteriä (1,75 g, 10 mmoL), ja seosta sekoitettiin 2 h RT:ssa. Saostuneet kiteet erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 1,55 g D,L-suolaa. Suodos haihdutettiin osaksi ja laimennettiin eetterillä. 15 Erottuneet kiteet kerättiin ja kuivattiin, jolloin jäi jäljelle 2,1 g L,L-suolaa, joka sisälsi, epäpuhtautena D,L-suolaa. Epäpuhtaaseen L,L-suolaan sekoitettiin DMF:a (20 ml), HOBt:a (0,71 g) ja DCC:ä (1,18 g). Seosta sekoitettiin 24 h RT:ssa. Urea poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutet-20 tiin. Jäännös liuotettiin dikloorimetcaniin, ja liuos pes- .. tiin 1 N HClrlla ja kylläisellä natrijmvetykarbonaatin ve- • · • ’* siliuoksella. Orgaaninen kerros kuivattiin ja haihdutet- • * tiin. Jäännös puhdistettiin kromatografisesti silikageelil- • · · : *.· lä (60 g) käyttäen eluenttina diklooriTietaania, joka sisäl- ..*·* 25 si 20 til-% asetonia. Kiteyttämällä yhdistetyt puhtaat ja- : keet dikloorimetaani-eetteri-heksaaniseoksesta saatiin 1,6 g • · · :*·*: Ac-F(pCN)-Chg-OMe:tä värittöminä kiteinä, joiden sulamis- lämpötila (sp.) oli 178 - 180 °C.
b) Ac-F (pCN) -Chg-OMe:n (edeltä esimerkistä XXVIIa; • · · 30 1,93 g, 5 mmol), metanolin (100 ml), vaden (10 ml) ja liti- • · *!* umhydroksidihydraatin (0,75 g) seosta sekoitettiin typen »·· V * alla 24 h RT:ssa. Etikkahapon (2 ml) lisäyksen jälkeen liu- *··
otteet haihdutettiin, ja jäännökselle tehtiin partitio di-kloorimetaanin, joka sisälsi 20 % isopropanolia, ja 1 N
• · · 35 HCl:n kesken. Orgaaninen kerros kuivattiin ja haihdutet- • · tiin, ja jäännös kiteytettiin dikloorimetaani-eetteri-hek- 47 saaniseoksesta, jolloin saatiin 1, 6 g äc-F(pCN)-Chg-OH:ta värittöminä kiteinä {sp. 216 - 218 °C) .
c) Ac-F(pCN)-Chg-OH:n (edeltä; 150 mg, 0,4 mmol), 4-aminometyylipyridiinin (65 mg, 0,6 mmol), DCC:n (124 mg, 5 0,6 mmol), HOBt:n (60 mg, 0,44 mmol) ja DMF;n (5 ml) seosta sekoitettiin 20 h RT:ssa. Urea poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin. Jäännös lietettirn metanoliin ja liukenematon tuote kerättiin suodattamalla, jolloin saatiin 140 mg väritöntä Ac-F(pCN) -Chg-NHCH^ (4-pyridyyliä) . Analyy-10 sinäyte saatiin tekemällä kromatografinen puhdistus silika-geelillä (60 g) käyttäen eluenttina asetoni-dikloorimetaa-ni-metanoliseosta (4:5:1). Kiteisen kiinteän aineen sula-mislämpötila oli yli 250 °C.
Esimerkki XXVIII
15 Ac-f (4-amidino) -Chg-NHCH2 (4-metyylipyridinium) Tämä yhdiste valmistettiin antamalla Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2 (4-pyridyylin) (ks. edeltä) reagoida vetusulfidin kanssa ja sitten metyylijodidin ja ammoniumasetaatin kanssa. Tuote eristettiin HPLC;n avulla homogeenisena aineena. MS-analyy-20 si: (M + H) + : todettu 493,3, lask. 493,29.
Lähtöaine valmistettiin seuraavasti: • · • · • ’* a) Ac-f (pCN) - (L)-sykloheksyyliqflysiinimetyylieste- rin (2,8 g), HOBt:n (940 mg), DCC:n (1,57 g) ja DMF:n (30 ml) • · · • V seosta sekoitettiin 2 vuorokautta RT:ssa. Urea poistettiin *:* 25 suodattamalla ja suodos haihdutettiin. Jäännös liuotettiin • · · · : dikloorimetaaniin, ja liuos pestiin 1 N HCl:lla ja • ·· ;*f*. 10-%:isella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella. Orgaani- nen faasi kuivattiin ja haihdutettiin. Kiteyttämällä jään-nös dikloorimetaani-eetteri-heksaaniseoksesta saatiin 2,05 g #I..t 30 väritöntä Ac-f (pCN) -Chg-OMe: tä (sp 181 - 183 °C) .
b) Ac-F(pCN)-Chg-OMe (edeltä; 1,93 g) hydrolysoitiin • · · : litiumhydroksidimonohydraatilla (0,75 gi metanolin (100 ml) :>t<: ja veden (10 ml) seoksessa, käsiteltiin L, L-isomeerin yh- .V. teydessä kuvatulla tavalla (esimerkki XXVII edellä) ja suo- • · · #!.I 35 ritettiin kiteytys dikloorimetaani-eettsriseoksesta, jolloin **··* saatiin 1,65 g Ac-F(pCN)-Chg-OH: ta (sp. 180 - 182 °C) .
48 c) Ac-f (pCN)-Chg~OH:n (edeltä; 225 mg), 4-aminome-tyylipyridiinin (100 mg), HOBt:n (90 mcf), DCC:n (180 mg) ja DMF:n (6 ml) seosta sekoitettiin viikonlopun yli RTrssa. Urea poistettiin suodattamalla ja snodos haihdutettiin. 5 Jäännöstä sekoitettiin metanolin kanssa ja kiintoaines poistettiin suodattamalla, jolloin saatiin 190 mg kiteistä Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2 (4-pyridyyliä), jorka sulamislämpötila oli yli 250 °C.
Esimerkki XXIX
10 Ac-pAph-Chg-NHCH2CH2 (S-metyylipyridinium)
Ac-F(pCN)-Chg“NHCH2CH2 (3-metyylipyridyylin) (125 mg), DMSO:n (2 ml), pyridiinin (10 ml) ja trietyyliamiinin (5 ml) seos kyllästettiin vetysulfidillä, samalla kun sitä jäähdytettiin jäävedessä. Sen jälkeen cun seosta oli sekoi-15 tettu suljetussa pullossa RT:ssa yön yLi, liuotteet haihdutettiin, jäännöstä sekoitettiin asetoni-eetteriseoksen kanssa ja se kuivattiin, jolloin jäi jäljelle 125 mg tioamidia. Tämä aine sekoitettiin DMSOtn (2 ml) , asetonin (5 ml) ja metyylijodidin (0,75 ml) kanssa, ja seosta sekoitettiin 20 suljetussa pullossa RT:ssa yön yli. Tolueenilla laimennuk-.. sen jälkeen liuotteet haihdutettiin ja jäännöstä sekoitet- • *’ tiin eetterin kanssa. Eetteri dekantoitiin ja korvattiin tuoreella eetterillä ja sekoitusta jatkettiin, kunnes hart- • · · l .* simainen aine jähmettyi, jolloin jäljellä ollut eetteri 25 poistettiin suodattamalla ja jäännös kuivattiin.
Jäännös liuotettiin metanoliin (20 ml) ja käsitel-:T: tiin etikkahapolla (0,3 ml) ja ammoniumasetaatilla (0,4 g).
Seos kuumennettiin 2,5 h:ksi lämpötilaan 55 - 60 °C, ja sen jälkeen liuotteet haihdutettiin. Jäännös liuotettiin vesi- ♦ · · .♦··. 30 ACN-TFA-seokseen ja kylmäkuivattuun. Raakatuote puhdistet- • · ’·* tiin HPLC:n avulla. MS-analyysi: (M - H) + : todettu 507,3, ··· : lask. 507,31.
··· *...· Lähtöaine saatiin aikaan seuraavasti: Ac-F(pCN)-
Chg-OH:n (150 mg, 0,4 mmol), 2- (3-pyridyyli) etyyliamiinidi- .···. 35 hydrokloridin (120 mg, 0,6 mmol), DCC:n (125 mg), HOBt:n • « (60 mg), di-isopropyylietyyliamiinir. (0,5 ml) ja DMF:n 49 (10 ml) seosta sekoitettiin 24 h RT:ssa. Liuotteen haihdutuksen jälkeen jäännöstä sekoitettiin metanolin kanssa, ja liukenematon tuote kerättiin suodattamalla ja pestiin metano-lilla ja eetterillä, jolloin saatiin L10 mg värittömiä ki-5 teitä. Suodos haihdutettiin ja jäännös liuotettiin dikloori-metaani-isopropanoliseokseen. Tämä liuos pestiin 10-%:isella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella, kuivattiin ja haihdutettiin. Jäännös puhdistettiin kromatografisesti silika-geelillä (14 g) dikloorimetaani-asetoni-metanoliseosta 10 (5:4:1) käyttämällä, jolloin saatiin 40 mg Ac-F(pCN)-Chg- NHCH2CH2 (3-pyridyyliä) (sp. 265 - 268 °C) .
b) 2-(3-pyridyyli)etyyliamiinic;ihydrokloridi valmistettiin seuraavasti: 3-pyridyyliasetonatriilin (1,3 g), ra- neynikkelin (noin 3 g) ja 10 til-% ammoniakkia sisältävän me-15 tanolin (30 ml) seosta hydrattiin paineessa 240 kPa (35 psi) 20 h käyttämällä Parrin hydrauslaitetta. Katalyytti erotettiin piimään läpi suodattamalla ja suodos haihdutettiin. Jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin. Tuote muun-20 nettiin dihydrokloridiksi dioksaaniin liuotettua vetyklori-dia käyttämällä. Kiteytys metanoli-eetteriseoksesta tuotti : ’* tulokseksi 1,4 g värittömiä kiteitä (sp. 145 - 148 °C) ,
***** Esimerkki XXX
·· · • V Ac-pAph-Chg-NHCH2CH2 {4-metyylipyridinium) *:* 25 Tämä yhdiste valmistettiin edellä kuvatuin menetel- : min antamalla Ac-F(pCN) -Chg-NHCH2CH2 (4-pyridyylin) reagoida • · · vetysulfidin kanssa, mitä seurasivat metylointi metyyli jo-äidillä ja reaktio ammoniumasetaatin kanssa. Raakatuote puh-distettiin HPLC:n avulla. MS-analyysL: (M + H)+: todettu 30 507, 3, lask. 507,31.
« · ·” Lähtöaine saatiin aikaan kytkemällä Ac-F(pCN)-Chg- • · · V ! OH 2-(4-pyridyyli)etyyliamiinidihydrokloridiin edellä esi- :* : merkissä XXIX kuvatulla tavalla.
• · · .·)·, 2- (4-pyridyyli) etyyliamiinidihydrokloridi valmis- • · · 35 tettiin 2-(3-pyridyyli)etyyliamiinidihydrokloridin yhteydessä • · *** (edellä) kuvatulla tavalla hydraamalla pyridyyli-4-asetonit- 50 riili raneynikkelin ja ammoniakin ollessa läsnä. Dihydro-kloridin sulamislämpötila oli 220 °C.
Esimerkki XXXI
Ac-pAph-Chg-NHCik (4-amidinofenjyli) 5 Tämä yhdiste valmistettiin samankaltaisia menetel miä kuin edellä kuvatut käyttäen käsittelemällä Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2 (4-syaanifenyyli) vetysulfidillä DMSO:n, pyridii-nin ja trietyyliamiinin seoksessa. Saatu bistioamidi mety-loitiin metyylijodidilla DMSO-asetoniseoksessa, ja sitten 10 sen annettiin reagoida ammoniumasetaatin kanssa edellä kuvatulla tavalla. Raakatuote puhdisteltiin HPLC:n avulla. MS-analyysi: (M + H)+: todettu 520,3, lask. 520,30.
Lähtöaine saatiin aikaan seuraavasti: Ac-F(pCN)-
Chg-OH:n (75 mg, 0,2 mmol), (4-syaanifenyyli)metyyliamiini-15 hydrokloridin (50 mg, 0,3 mmol), DC3:n (62 mg), HOBtrn (30 mg), DIEA:n (0,2 ml) ja DMF:n (2 ml) seosta sekoitettiin 24 h RT:ssa. Suodatuksen jälkeen liuote haihdutettiin ja jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin, joka sisälsi 20 % isopropanolia. Liuos pestiin 1 N HCl:lla ja 10-%:isella 20 natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella ja sen jälkeen kui- .. vattiin ja haihdutettiin. Jäännöstä sekoitettiin pienen • · • “ määrän kanssa metanoli-vesiseosta ja erottunut kiintoaines * * kerättiin ja kuivattiin, jolloin jäi jäljelle 80 mg Ac- • · · : F(pCN)-Chg-NHCH2 (4-syaanifenyyliä) .
..*·* 25 (4-syaanifenyyli)metyyliamiinihydrokloridi valmis- : tettiin seuraavasti: a-bromi-p-tolunitriilin (2 g, 10 mmol), ··· :*·*: kaliumftalimidin (2 g, 10,8 mmol) ja DMF:n (30 ml) seos kuumennettiin 1 min:ksi palautusjäähdytyslämpötilaan. Jääh-dytyksen jälkeen seos tehtiin happamaksi etikkahapolla ja ♦ · · .·... 30 laimennettiin vedellä tuotteen kiteyttämiseksi. Kiteet ero- • · *!* tettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin, joi- ··· ·,· · loin jäi jäljelle 2,24 g väritöntä K- (4-syaanifenyyli)me- tyyliftalimidiä (sp. 182 - 184 °C) .
N- (4-syaanifenyyli) metyyli f tai Lmidi (1,5 g) suspen- • · · 35 doitiin kiehuvaan metanoliin (50 ml) ja käsiteltiin hydrat- • · siinihydraatilla (1 ml). 5 min:n jälkeen tuloksena oli kir- 51 kas liuos. Metanoli haihdutettiin ja jäännös käsiteltiin 2 N HCl:lla. Suspensio kuumennettiin kiehuvaksi ja jäähdytettiin sitten jäissä. Kiintoaines erotettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin. Jäännös Huollettiin veteen. Liuos 5 kuumennettiin jälleen kiehuvaksi, jäähdytettiin ja suodatettiin. Suodos tehtiin emäksiseksi natriumhydroksidilla ja uutettiin dikloorimetaanilla, joka si.sälsi isopropanolia. Orgaaninen faasi kuivattiin ja haihdutettiin, jäännös muunnettiin hydrokloridisuolaksi ja kiteytettiin isopropanoli-10 eetteriseoksesta ja saatiin 0,43 g värittömiä kiteitä, joiden sulamislämpötila oli yli 260 °C.
{3-syaanifenyyli)metyyliamiinihydrokloridi valmistettiin antamalla α-bromi-m-tolunitriilir reagoida kaliumfta-limidin kanssa, jolloin saatiin N-(3-syaanifenyyli)me-15 tyyliftalimidiä (sp. 147 - 148 °C) . Antamalla tämän aineen reagoida hydratsiinihydraatin kanssa ja muuntamalla tuote hydrokloridiksi kuten edellä saatiin (3-syaanifenyyli)me-tyyliamiinia (sp. 223 - 226 °C) .
Esimerkki XXXII
2 0 Ac-pAph”Chg-NHCH2 (3-amidinof enyyli) Tämä yhdiste valmistettiin käyttämällä edellä ku- • · ί 1 2 vattuja menetelmiä. Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3-syaanifenyyli) kä- ’·2· siteltiin vetysulfidillä DMS0:n, pyridiinin ja trietyyli- ·· · • amiinin seoksessa. Saatu bistioamidi metyloitiin metyylijo- *:* 25 äidillä DMSO-asetoniseoksessa, ja sitten sen annettiin rea- ···· ·2· goida ammoniumasetaatin kanssa edellä kuvatulla tavalla. Raa- • · · katuote puhdistettiin HPLC;n avulla. MS-analyysi: (M + H)+: todettu 520,3, lask. 520,30.
Lähtöaine saatiin aikaan seuraavasti: Ac-F(pCN)- 2 • · · 30 Chg-OH:n (300 mg, 0,8 mmol) , (3-syaanifenyyli)metyyliamii- 52 vattiin ja haihdutettiin. Jäännöstä sekoitettiin isopropa-noli-eetteriseoksen kanssa ja erottunut kiintoaines kerättiin ja kuivattiin, jolloin jäi jäljelle 400 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3-syaanifenyyliä).
5 Esimerkki XXXIII
Ac-pAph-Chg-NHCH(Me)(4-metyyIipyridinium)
Otsikon mukaisten yhdisteen diastereomeerien seos valmistettiin antamalla kahden diastereomeerisen Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-pyridyylin) reagoida vetysulfidin kanssa ja 10 sen jälkeen Melin ja ammoniumasetaatia kanssa. Diastereo-meerit erotettiin HPLC:n avulla. MS-analyysi: (M + H)+: to dettu 507,3, lask. 507,31.
Lähtöaine valmistettiin seuraavasti: Ac-F(pCN)-Chg-0H:n (150 mg, 0,4 mmol), raseemisen 1 -(4-pyridyyli)etyyli-15 amiinidihydrokloridin (120 mg, 0,6 mmol), DCC:n (125 mg), HOBt:n (60 mg), DIEA:n (0,5 ml) ja DMF;n (10 ml) seosta sekoitettiin 24 h RT:ssa. Suodatuksen jälkeen liuote haihdutettiin ja jäännös liuotettiin suureer määrään dikloorime-taania, joka sisälsi 20 % isopropanolia. Liuos pestiin 20 10-%:isella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella, kuivattiin ja haihdutettiin. Jäännöstä sekoitettiin isopropanoli- • · • ** eetteriseoksen kanssa ja erottunut kiintoaines kerättiin ja kuivattiin, jolloin jäi jäljelle 125 mg Ac-F (pCN)-Chg- ·· · • V NHCH(Me)(4-pyridyyliä) kahden diastereomeerin seoksena.
t>·:* 25 Raseeminen 1-(4-pyridyyli)etyyliamiinidihydroklori- : di valmistettiin seuraavasti: 4-asetyylipyridyyli-N-oksidin • · · (1,3 g), raneynikkelin (2 g) ja 20 til-% ammoniakkia sisäl-tävän metanolin (30 ml) seosta hydrattiin paineessa 210 kPa (30 psi) 24 h. Katalyytti poistettiin piimään läpi suodat- • · · "... 30 tamalla ja suodos haihdutettiin. Jääanös liuotettiin di- • · • · *;* kloorimetaaniin, suodatettiin ja haihdutettiin. Jäännös • · · V · liuotettiin isopropanoliin ja käsiteltiin eetteriin liuote- tulla vetykloridilla. Saostuneet kiteet kerättiin ja kui- ,·]·. vattiin, jolloin saatiin 1,9 g ainetta, jonka sulamislämpö- *:!:* 35 tila oli 198 - 200 °C.
• · • · • · · 53
Esimerkki XXXIV
DIPA(m)pAph”Chg-Arg-Leu-Pro-NHj :n synteesi a) (p-syaanibentsyyli) malonihappo [DIPA(m) Phe (pCN) ] -OH:n N,N-di-isopropyyliamidin synteesi 5 2-(p-syaanibentsyyli)malonihappo valmistettiin muun netulla menettelyllä [ks. Pinori et ai., US-patentti-julkaisu 5 061 911 (lokakuu 1991), joka mainitaan tässä viitteenä]. Liuokseen, joka sisälsi 2,2-dimetyyli-l,3-di-oksaani-4,6-dionia (Meldrumin happo, 3,8 g; Aldrich) ja 10 NaCNBH3:ä {1,12 g; Aldrich) DMF:ssa (25 ml), lisättiin p-syaanibentsaldehydiä (2,3 g; Aldrich) ja seosta sekoitettiin 2 h RT:ssa. Reaktioseokseen lisättiin vettä (400 ml), ja liuos jäähdytettiin jäähauteessa ja sen pH säädettiin arvoon 3,8-4 lisäämällä pisaroittair 20-%:ista HCl:n ve-15 siliuosta. Valkea sakka kerättiin lasisintterillä varustettuun Buchner-suppiloon ja pestiin kylmällä vedellä. Kerättyä sakkaa kuivattiin alipaineessa CaCl2tn päällä 24 h. Kerätyn kiinteän aineen NMR-spektri (CDCI3) osoitti yhdisteen 2,2-dimetyyli-5-(p-syaanibentsyyli)-1,3-dioksaani-4,6-di-20 oniksi (DCBD), jonka sulamislämpötila on 135 - 142 °C ja
Rf-arvo 0,45 (CHCl3-MeOH-etikkahapposeos, 95:4:1).
• · : ** Di-isopropyyliamiinin (1,5 ml) ja DCM:n (45 ml) se- ’·1’· okseen lisättiin N, O-bis (trimetyylisilyyli) asetamidia (BSA, • · · • \· 3 ml), ja liuosta palautusjäähdytettiin magneettisekoitti- ^•j· 25 mella ja jäähdyttimellä, jota suojasi SaCl2-putki, varuste- : tussa reaktiopullossa 7 h. Sen jälkeen kun liuos oli jääh- • · · dytetty RT:aan, lisättiin DCBD:tä ja reaktioseosta palau-tusjäähdytettiin 3 h (kunnes TLC osoitti muuttumisen tuot-teeksi täydelliseksi) . Reaktioseoksen jäähdytyksen jälkeen • · · 30 lisättiin varovasti 20-%:ista HCl: n vesiliuosta (5-8 ml).
• · ·”1 Kerrosten erotuksen jälkeen orgaaninen kerros pestiin ve- • · · ί,ί ί della, kuivattiin (MgS04) ja haihdutett.iin kuiviin, jolloin saatiin puhdas tuote, joka käytettiin seuraavassa vaiheessa • · · ilman lisäpuhdistusta. Yhdisteet identifioitiin NMR-spekt- • · · 35 rin (CDC13) ja massaspektrin perusteella.
• · • · • · · 54 b) DIPA (m) pÄph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2: n synteesi
Peptidihartsi DIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink syntetisoitiin esimerkissä I kuvatulla menetelmällä. Muodostunut peptidihartsi käsiteltiin hydroksyyliamiinihyd-5 rokloridilla esimerkissä XXV kuvatulLa tavalla, jolloin saatiin DIPA (m) Phe [pC (NOH) NH2] -Chg-Arg ( ?mc) -Leu-Pro-Rink.
Sen jälkeen kun peptidi oli irrotettu hartsista ja kylmäkuivattu, raakatuote (120 mg) liuotettiin MeOH:n (80 ml) NHstlla kyllästetyn MeOH:n (10 ml) seokseen. Reaktioseok-10 seen lisättiin raneynikkelisuspensiota (0,25 ml; Aldrich) ja seosta hydrattiin paineessa 310 kPa (45 psi) 24 h. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja liuote haihdutettiin pois, ja jäännös kylmäkuivattiin liuoksesta, joka sisälsi TFA:n 0,l-%:ista vesiliuosta ja ACN:ä suhteessa 1:1. Epä-15 puhdas peptidi puhdistettiin HPLC:n avtlla ja yhdiste identifioitiin MS:n avulla. MS-analyysi: (M + H)+: todettu 824,2, lask. 824,5.
• · • · • · · • · • · · • · · • · • · ·· · • ·· · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · * · · • · · t · · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · 1 · · • · • · • · · 55
Esimerkki XXXV
Syntetisoituja monisubstituenttisia yhdisteitä, jotka havaittiin voimakkaiksi tekijän Xa inhibiittoreiksi 5
Nro Yhdiste Lask. (todettu) 1. Ac-(2-CFJB2l)-Y-I-R~L-P-NH2 860,5 (860,3) 2. AC“(CH3CH2CHaCB(CH3)CHj)-y- 786,5 (786,5) I-R-L~P“NH2 3. CB3OCO-Y-1-R-L“P-NHj 742,4 (742,4) 4. Ac~Y-Chg-R~NB2 518,2 (518,2) 5. Nai(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH3 679,4 (679,4) 6. y-Tle-R-Nle-P-NHj 660,4 (660,4) 7. Phe(pF)-I-R-L-P-NH 662,3 (662,3) 8. Ac-(D) Tic(OH)-I~R-L~P-NH2 714,4 (714,4) 9. Ac-Phe(pCN)-I-R-L-P-NB, 711,4 (711,4) 10. Ac-Phe(pCONH2) -Chg-R-L-P-NB, 755,4 (755,4) 11. y-Chg-R-NH2 476,2 (476,2) 12. Ac-W-Chg-R-L-P-NH* 751,3 (751,3) • · · 13. Ac-Y-I-R-NH-CB(CHj)-(CH2)2-CB3 562,3 (562,3) 14. Ac-Y-Pgl-R-L-P-NHj 722,2 (722,2) • · φ>\:· 15. Ac-Y-Chg-R-lna-NHj 629,4 (629,4) 16. Ac-tPza-Chg-R-NHj 509,3 (509,3) • · · : 17. Ac-Y-Chg-R-Pip-NH2 629,4 (629,4) 18. Ac-Phe (pNB,)-Chg-R-NH, 517,2 (517,2) • · · • · · 19. Ac-(Bzl)G~ (Chx) Gly- 3-guanidinopropyyli) G-NH2 502,3 (502,3) 20. Ac-Y-Chg-R-oli · asetaatti 547,3 (547,3) 21. Ac-Y-Chg-R-OCH, 533,3 (533,3) T* 22. Ac-Y-Chg-R-OH 519,3 (519,3) \’0 23. Bz-Y-Chg-R-NH2 532,2 (532,2) • · · • · • · • · · 56
Esimerkki XXXVI
Sellaisten kemiallisten muutosten yhdistelmät, jotka erikseen ole parantaneet eiktiivisuutta, voivat parantaa aktiivisuutta 5 Mitattiin tekijän Xa aktiivisuuden inhibitio. Mika tahansa relevantti biologisen aktiivisuuden mitta, kuten keksinnön mukaisen YIR-peptidin vaikutus hyytymiseen, teho in vivo, puoliintumisaika in vivo, hyötyosuus suun kautta annettuna, teho suun kautta annettuna tai puoliintumisaika 10 suun kautta annettuna, voidaan kuitenkin päättää keksinnön mukaisen peptidin aktiivisuuden mitaksi..
Kuvataan monia spesifisiä muutoksia. Yhtenä esimerkkinä yhdistettiin kaksi muutosta sen osoittamiseksi, että yhdistämällä muutokset saavutettiin aktiivisuuden li-15 säparaneminen jopa silloin, kun alkuperäiset yksittäiset muutokset eivät parantaneet aktiivisuutta oleellisesti. Yksittäiset muutokset tuottivat tulokseksi yhdisteen Ac-Y-I-R-L-P, jonka Ki oli 0,49 pmol/l, ja (iBu)Y-I-R-L-P, jonka Kx oli 2,6 pmol/l, kun kantayhdiste oli Y-I-R-L-P (Kx =5,3 pmol/l). 20 Yhdistämällä nämä kaksi muutosta saatiin aikaan Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2, jonka Ki oli 0,04 pmol/l. Nämä tulokset osoit- • · : ** tavat siis, että keksinnön mukaisella peptidillä, joka si- ***** sältää kahden muutoksen yhdistelmän, voi olla oleellisesti • · · • suurentunut inhibitorinen aktiivisuus tekijän Xa suhteen ·;· 25 verrattuna vastaaviin yhdisteisiin, jcihin on tehty yksit- • · · · : ;*j täinen muutos, jopa silloin, kun yhdellä kantayhdisteellä, • · · kuten (iBu) Y-I-R-L-P-NH*: 11a ei ollut Dleellisesti parempaa aktiivisuutta kuin kanta-Y-I-R-L-P-NH2: Ha.
Taulukossa 3 on esitetty esimerkkejä määrätyistä • · · 30 kemiallisista muunnoista, jotka tuotti/at tulokseksi yhdis- • · *”* teitä, joiden Kx-arvot, mitä tekijän Xa inhibitioon tulee, *·· ί.ϊ · ovat arvojen 100 pmol/l ja 1 pmol/1 välillä.
Teknistä informaatiota varten taulukko käsittää ··· myös yhdisteitä, jotka eivät sisälly patenttivaatimuksissa • · · 1,1 35 esitettyjen kaavojen piiriin.
• · • · • · · 57
Taulukko 3
Tekijän Xa inhibiittoreita, joiden Ki < 100 pmol/l
Rakenne MS’ AA'
(2,2-DiMe~Propyl) Y**I~R*“L-P-NH2 OK OK
(2~CF3-Bzl) Y-I-R-L-P-NHj OK OK
{2-Et-nBu)Y”-I-R"L-P~NH2 OK OK
(2-Me-Bzl)Υ-ϊ-R-L-P-NBj OK OK
(2-Me~nBu)Y~I-R-L-P-NB2 OK OK
{2-Me-nPenty1)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
(3,3-DiMe-nBu)Y-I-R-L-P-NHj OK OK
3-fenoksipropionyyli~Y*-Chg-R-NH2 OK OK
5-Bzim-CO-Chg-R~L-P~NH2 OK OK
5~Bzim-CO-F{pNB2)-Chg-R-L“P“NB2 OK OK
Y (3,5-Br)-I-R-L-P~NH2 OK OK
Y(3,5~I)-I-R-L“P-NHj OK OK
(Chx-CBj) Y-I-R-L-P-RB2 OK OK
(iBu)Y-I-R-OH OK OK
(iBu)Y-I-R-L-A-NHj OK OK
(iBu)Y-I-R-L-P-NHj OK OK
.. (He) y-I-R-L-A-NH2 OK OK
: ” (Me)Y-I-R-L-A-NH2 OK OK
(Me) y*-I-R~L~P-NH2 OK OK
i (Me) Y-I~R-L~P"NH2 OK OK
...T 5-Hic-Chg-R-NH2 OK OK
:.0 Ac-{1,2,3,6-4H-Bzl)Y(S03H)-I-R-L-P-NH2 OK OK
:T: Ac-(1,2,3,6-4H~Bzl)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-(2,3-DiMe-n-pentyyli) Υ(S03H)-I~R-L-P-NH2 OK OK
Ac- {2,3-DiMe-m-pentyyli ) Y-I-R-L-P-NB2 OK OK
.··*. Ac-(2~CF3-Bzl)Y(S03H}-I-R-L-P“NH2 OK OK
Ac- (2-CFj-Bzl) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
’·* ' Ac- (2Et-nBu) Y~I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (2-Me-Bzl) Y (S03H ) -I-R-L-P-NH, OK OK
• *
Ac-{2-Me-BzlJY-I-R-L-P-RH, OK OK
• · • · · • · • · • · · 58
Ac - ( 2-Me-nBu ) Y {S03H ) -I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac- { 2-Me-n-pentyyli) y (S03H) -I~R-L-P-NBZ OK OK
Ac-{2-Me-n-pentyyli)Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac*-(3,3-DiMe-nBu)Y(SOjH)-I-R-L-P-NBa OK OK
Ac-(3,3-DiMe-nBu)Y-I-R~L-P-NH2 OK OK
Ac“(3,3-DiMe-n-pentyyH)Y(SOjH)-i-R-I-P-NHa OK OK
Ac-(3,5,5-Me-3-n-heksyyli) Y-I-R-NHj OK OK
Ac-(3,5,5-Me-3~n-heksyyli).Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac~(4-pyridyyli~CHs~) Y-I~R~NH2 OK OK
Ac-(4-MeO-Bzl)Y-I-R-NHj OK OK
Ac-(Bzl)Y-I-R-NH2 OK OK
Ac- (Chx-CH2) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (syklopropyyli-CBj) Y (S03H) -I-R-L-P-NHj OK OK
Ac- {syklopropyyli—CH2) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (Et-CH=C (CHa) -CH2) Y (S03H ) -I-R-L-P-NB2 OK OK
Ac- (Et~CH=C (CB3) -CBj) Y-I-R-L-P-NBj OK OK
Ac- (iBu) F {pNH2) -Chg-R-NB2 OK OK
Ac- (iBu) F {pNHj) -Chg-R-L-P-NHj OK OK
Ac-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NEj OK OK
Ac- (iBu) Y-Chg-R-NHj OK OK
·;··; Ac- {iBu) Y-Chg-R-L-P-NHj OK OK
Ac- {iBu) Y-I-Dab (Ny-C3H7N) -L~P-NH2 OK OK
* Ac- (iBu) Y-I-Orn (Ni-C3H7N) -L-P-NH2 OK OK
Ac- (iBu ) Y-I-R-NHj OK OK
:::* Ac-(iBu}Y-I-R~L~P-NB2 OK OK
Ac-(He)Y-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-(Me)Y-I-R-L-A-NHj OK OK
:*: ** Ac- (Me) Y-I-R-L-P-NHj OK OK
• · ·
Ac - (nBu) Y-I-R-NBj OK OK
Ac-{trans-CH3-CH=C(Ca3)-CB2)Y-I-R~L-P-NB2 OK ok
.···. Ac-Tyr (3,5-N03} -I-R-L-P-NH2 OK OK
/] Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly- (3-guanidinopropyyli) G~NH2 0K OK
:·**·: Ac-BAla-Y-I-R-G-NH, OK OK
• · · *
:···: Ac-B-Y-T-R-L-K-NH.* ‘ OK OK
59
Ac-E-Y-I-R-L-P-K-NH, OK OK
Ac-F(pCONH2)-Chg-R-L-P-NH3 OK OK
Ac-F(pCONH2)-X~R-L-P-NH2 OK OK
Ac-F{pF)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-f(pF)-I~R-L-P-NH2 OK OK
Ac-F(pCN)-I-R-L~P-NBj OK OK
Ac-F (pNB2) -Chg-R-NH2 OK OK
Ac-F{pNB2) -Chg-R-L-F-NH2 OK OK
Ac-F(pNH2)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac~F (pNH2} -Chg-R- {B21) G-G-OB OK OK
Ac-F{pNH2) -Chg-R- (Chx) G-G-OB OK OK
Ac-F(pNH2) -Chg-R- (CH3CH2CH2 OK OK
(CB3}) G-G-OH
Ac-G-G-Y-I-R-G-NBj OK OK
Ac-G-Y-Nle-R-L-NB2 OK OK
Ac-G-y-Nle-R-L-NH2 OK OK
Ac-G-Y-X-R-G-NHj OK OK
Ac-G-Y-I-R-L-NBj OK OK
Ac-Nal(1)-I-R-L~P~NH2 OK OK
Ac-Nal {2) -Cha-R-D(O-.aXlyyli) -NH2 OK OK
.. Ac-Nal (2) -Cha-R-L-P-NH2 OK OK
’· ** Ac-Nal (2)-Chg-R-NHj OK OK
Ac-Nal {2) -Chg-R-L-P-NHj OK OK
• · · : Ac-Nal {2) -I-R-L-P-NHj OK ΌΚ
Ac-Pgl (OH) -I-R-L-NHj OK OK
Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-pAph-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Phe(pGua)-I-R-L-P-NH2 OK OK
ac-s-y-i-r-Ij-p-nh, ok ok • · ·
.···. Ac-W-Chg-R-L-P-NHj OK OK
• ·
*“ Ac-W-L-R-L-A-NH, OK OK
···
: Ac-Y (Me) -I-R-L-A-NH2 OK OK
···
Ac-Y {Me) -I-R-L“P-NH2 OK OK
Ac-Y- (allo-I) -R-L-P“NH2 OK OK
.···. Ac-Y-Cha-R-L-P-NH2 OK OK
• · • · · 60
Ac-Y-Chg-R-NH2 OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-N {CRj)e OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-Bzl-4-OMe OK OK
Ac-Y~Chg-R-NH-CH2-Chx OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-N- (CH3) 2 OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH“CH2CH2*-0-CH3 OK OK
Ac-Y-Chg**R-NH“CH2CHj*-COOH OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-Chx OK OK
Ac-Y“Chg*-R-NH~CH2 (2- (1-Et )pyrrolidinyyli) OK OK
Ac-Y~Chg«R“NH-CH2(2“(6“EtO)bentayylitiatsolyyXiOK OK Ac-Y-Chg-R-I>P-NB2 OK OK
Ac-Y-Chg-R (N02) -{Ψ (CH2NH) >-L-NH2 OK OK
Ac~Y~Nva-R-NHj OK OK
Ac-Y-Pen{Me)-R-L~P-*NH2 OK OK
Ac-Y-Pgl“R“L-P-NB2 OK OK
Ac-Y-{¥(CH2N(Ac) ) }-I-R-L-P-RH2 OK ok
Ac-Y-{7(CH2NH) }-I-R-L-P-NB2 OK OK
Ac-Y-I-R-{Ψ (COCH2) )-~G“P-NHj OK OK
Ac-Y-I-Dab (KY~C3H7N) -L-A-RH2 OK OK
Ac-Y-I-hR-L-A-NHj OK OK
·*·.. Ac-Y-I-nR-L~A-NH2 OK OK
Ac-Y“I~PalMe(3)-NH2 OK OK
Ac-Y-I-PalMe{3) -L--P-NH2 OK OK
• ·
' .J. Ac-Y-I-ifiCHjNH) }-R-L-P-KH2 OK OK
***! Ac-y-I-R~NH2 OK OK
ac-y-i-r-nh2 ok ok
• · I
Ac-Y-I-R-N(Me)0-CH3 OK OK
Ac-Y-I-R“NH-CH2-4»pyridyyli OK OK
v‘ : Ac-Y-I-R-NH-CHjCHj-N{CH3)2 ok ok
Ac-Y-i-R-NH-4-tnorfolinyyli OK OK
Ac-Y-I-R-NH-OCB3 OK OK
• · ·
.·**. Ac~Y-I-R-Nle~Hyp OK OK
*·* Ac-Y-I-R-Nle-A3P OK OK
• ·
*·*·* Ac-Y-I~R~piperidyyli OK OK
• · ·
Ac—Y-I-R-I OK OK
61
Ac-Y-I-R-I-P OK OK
Ac-Y-I-R-L OK OK
Ac-y-I-R-L-A OK OK
Ac-Y-I-R-L-A OK OK
Ac*-Y-I-R-L-A~A~F~T~NE2 OK OK
Ac-y-I-R-Ii-P-NHj OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P{G-A)3) “OH OK OK
Ac-Y--I-R*-L*-P-Dab{ Ac-Y-I-R-L-P (G-A) t) **OB OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-Dab (Ac-Y"I~R-Xj-P ) -OH OK OK
Ac-Y-I-R-P-NH* OK OK
Ac-Y~K-R-L-E-NB? OK OK
Ac-Y-N-R-L-NH2 OK OK
Ac~Y-N~R“L-P“NBj OK OK
Ac-Y-T(Me)-R-L-P-NHj OK OK
BAla-Y-I-R-G OK OK
fiAla-Y“I“R~G-NH2 OK OK
Caff-I-R-NB* OK OK
Cbz~I~R-L-NH2 OK OK
Cbz-Y-I-R-NHj OK OK
·*·.. CClFj-CO-Y-I-R-L-P-NHj OK OK
CFjB~CO~Y“I-R-L-P-NHj OK OK
cf3~cf2co-y-i-r-l-p~nh2 OK OK
’ .j. CB3-CHC1~C0-Y-I“R-L**P-NH2 OK OK
*“i CHj-O-CO-Y-X-R-L-P-NH, OK OK
’li:* ch3-so2-y-i-r-l-p-nh2 ok ok • · * CHjCH2-0-C0-Y-I-R-L-P~NH2 ok ok
CIjCHCO-Y-I-R-L-P^NBj OK OK
··· * * : cicb2co-y-i-r~nh2 ok ok ·#·
C-Y-I-R-L-C-NH; OK OK
D-Tic-I-R-L-A-A-F-T-NH, OK OK
• · · *
.···. Et {Et} Y-I-R-L-P-NBj OK OK
• M
• E-Y-I-R-K-NH. OK OK
• · " ................. 1 1 *
B-Y-I-R^-L-K-NH, OK OK
• · · A
E-Y-I-R-L-P-K-RR, OK OK
62
P(pCl)-I-R-I-Sar-NH2 οκ 0K
F(pF)~I-R-L-P-NH2 ok ok
f(pF)-I-R-L-P-NHj 0K 0K
F (pNH2) -I-R-L-A-NH2 OK OK
FipNOjJ-I-R-L-A-RHj OK OK
f“I-R~F”P-NH2 ok ok
f-I-R-I-P-NH, OK OK
F-I-R-L-NH, OK OK
F-I-R-L-P-H~Y~G-NH2 OK OK
F-I-R-Xi-Y-V-W-Kl-NHj OK OK
For-y-I-R-L-P-NHj OK OK
For-Y-I-R-L-P-NHj OK OK
G-G-Y-I-R-G-NHj OK OK
G-Y-I-R-D-NH* OK OK
G-Y-I-R-F-NHj OK OK
G-Y-I-R-G-NH, OK OK
G-Y-I-R-G OK OK
G~Y~I-R-H-NH2 OK OK
G-Y-I-R-I-NH* OK OK
G-Y-I-R-K-MH* OK OK
g-y-i~r-l-nh2 ok ok
G~Y~I-R-L~P“NH2 OK OK
• ·
...... G-Y-I-R-L-P-A-M-NHj OK OK
‘ I G-Y-X-R-L-P-P-V-NB, OK OK
·»* *
•"I G-Y-I-R-L-P-Q-T-HH, OK OK
• · ·
*·:·* G-Y-X-R-L-P-S-Q-NH, OK OK
: G-Y-I-R-S-NHj OK OK
G“Y-I-R-T“NHj OK OK
• · ·
V : G-Y-I“R“V"NHj OK OK
*...: g-y-i-r-w*-nh2 ok ok g-y-x-r-y-nh2 ok ok • · ·
.···. (pOH) CjH^-CHjCHj (OH) -CO-I-R-L-Sar-NHj OK OK
• ·
(pOHJCjH^-CHjCBjCO-I-R-L-A-NHj OK OK
v.: (pOH) C6H4-CHjCHjCO-I-R-L-P-NH2 OK OK
• · ·
(pOHJC^-CHjCHOH-CO-I-R-L-P-NHj OK OK
63
(pOH)CtH4-OCB(CH3)CO-I-R-L-P~NH, OK OK
(pOH) C6H4-OCB2CQ-I-R-L-P-NHj OK OK
I“H-L-W~Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
I-H~L-W~y-I~R-L-P-NB2 OK OK
I-Q-L-G-Y-I-R-L-P-NH, OK OK
4-MeO-C$H4~CQ- I-R-L-A-NH2 OK OK
N-jnorfofinyyli-Co-F-I~R-L-P-NH2 OK OK
Nai(2)-Cha-R-D(O-allyyli)-NH2 OK OK
Nai(2)-Cha-R-D(O-allyyli)-Sar-NH 2 OK OK
Nai(2)-Chg-R-L-P-NHj OK OK
Nai(2)-I~R-C(Me)~P-NHS OK OK
N“G-Y-I-R“L“l~H-NHj OK OK
pal~C(SBut)-R-L-P-NHj OK OK
pal-I-R-C(SBut)-Byp-NHj OK OK
pal-I-R-C(SBut)-P~NB2 OK OK
Pgl(OH}-I-R-L-NHj OK OK
Ph-C(NOCHjPh)*-CO-I-R-NHj OK OK
Ph-CH=CH~CO-I~R-L-A--NH2 OK OK
Ph-CB2CK2CRj-CO-I-R-L-A-NE2 OK OK
Ph“CH2CHjCO-I-R-Ii“A-NHj OK OK
Pth-Y-I-R-L-P~NH2 OK OK
• · · * s-y-i-r-l~p~nb2 ok ok • ·
Tfa- (iBu) F (pNB2 ) -Chg-R--NH2 OK OK
• ·
* j Tfa- {iBu} F (pNB2) -Chg-R-L-P-NBj OK OK
•“I Tfa-{iBu)Nai(2)-Chg-R-L~P~NH2 OK OK
’•j·* Tf a- (iBu) Υ-Chg-R-NHj OK OK
: Tf a- (iBu) Y-Chg-R-L~P“NH2 OK OK
Tf a- ( iBu ) Y-I-Dab (Νγ-03Η7Ν) -L-P-NB2 OK OK
• · ·
Tfa- {iBu)Y-I-Orn (Ν4-θ3Η7Ν) -L-P-NH2 OK OK
Tfa- (IBu) Y-I-PalMe (3 ) ~NH2 OK OK
.···. Tfa- (iBu) Y-I-R-NHj OK OK
• · ·
Tfa-(iBu)Y-I-R-OH OK OK
• · ' · • ·
Ί* Tfa-{iBu}Y-I-R-G-NH2 OK OK
• ·
Tfa- (iBu) Y~I-R-L-P-NH2 OK OK
• · ·
Tfa-(Me) Y-I-R-L-A-NBj OK OK
64
Tfa-Y(Me)I-R-L-P-NBj 0K 0K
Tfa-Y-Chg-R-NRj 0K 0K
Tfa-Y-Chg-R-L-P-NH2 0K 0K
Tfa-y-I-R-L-P-NH, 0K 0K
Tf a~Y-I"R“L'-P-RH2 OK OK
T-F-G-Y“I-R-K-A-NH2 0K 0K
Tos-Y-I-R-NHj 0K 0K
lOs-G-I-R-v-Sar-KB, 0K ox
Tyr(Me)-I-R-Ii~A-NHa 0K 0K
W-F-R-E-M—G-G-G*-G“G-NHj OK OK
W-I-R-E-K-NHa OK 0K
W-I-R-N-P-NHj OK OK
VI- I~R“T”P“UH2 ok OK
w-L-R-L-A-NHj OK OK
W-L-R-L-A-NHj OK OK
W-L-R-L-A-G-G-G-G-G-NH, OK OK
W~3>R~V~A~WH2 OK OK
w-L-R-V-A-NHj OK OK
w*-l~r-v-a-g-g-g-g-g-nh2 OK OK
y(Me)-I-R-L-P-NH2 OK OK
·*·,. y~Chg~R~NH2 OK OK
....: y*-Chg-R-L-NH2 OK OK
y-Chg-R-L-P-NHj OK OK
• *
l y-Tle-R-Nle-P-NH, OK OK
··· * *
***I y-Tle-R-lUe-A2P-NH2 OK OK
Y-I-(nR)-L~A~NB2 OK OK
*·* * y-X-R(COCH2} -G-P-NH2 OK OK
y~I-R-NHj OK OK
··*
: y-i-r-nh2 ok OK
e·· Y-I“R-E*-F-S-D-Y-NH2 ok ok
Y-I-R-G-A-NH, OK OK
• · · *
.···. Y-I-R-I-NH2 OK OK
• ·
’·’ Y-I-R-I-Y-Nfl, OK OK
• · *
:.V Y-I-R-I-Y-E-R-E-NBj OK OK
···
Y-I-R-L~NB2 OK OK
65
y-I-R-L-A-NHj OK OK
Y-I-R-L-a-NHj OK OK
Y-I-R-L-A-NH3 OK OK
Y-I-R-L-A-A-NH2 OK OK
Y-I~R-L-A-A~F-NH? OK OK
Y-I-R-L-A-A-F-T-NHj OK OK
Y-I-R-L-M-E“M-T-NH2 OK OK
y-I-R-L-P-NHj OK OK
Y-I-R-L-P'*NH2 OK OK
Y-I-R-L-P-G-L—L-NHj OK OK
Υ-Ι-R-L-T-K-M-W-NHj OK OK
Y-I-R-V-A-Q-L-Y-NH, OK OK
y-I-R-V-M-N-H-R-MH, OK OK
Y-I-R-Y-R-N-P-I-NH, OK OK
Y-R-Y-P-R-D-R-N-NHj OK OK
Y-L-R-F-P-NHj OK OK
*MS =* massaspektrometria, AA = amlnohappoanalyysi. ^^Alleviivaus osoittaa peptidin sykliskituneen osan.
Esimerkki XXXVII
• · • ’·· Valittujen puhdistettujen koaςrulaatioentsyymien ja *:**: muiden seriiniproteaasien inhibitio in vitro ·*·*: 5 Keksinnön mukaisen yhdisteen kykyä inhiboida teki- • · jää Xa, trombiinia, plasmiinia, elastaasia ja trypsiiniä ···· . .·. tutkittiin määrittämällä YIR-peptidipitoisuus, joka inhiboi • # · IV·' entsyymiaktiivisuutta 50-%:isesti (IC50) · Kromogeenisissa • ♦ · * määrityksissä käytettiin puhdistettuja ensyymejä. Inhibi-10 tiovakion määrittämiseksi ICso-arvo kerjättiin substraatin • · · *·’ ' kanssa tapahtuvan kilpailun suhteen käyttämällä seuraavaa • · · ·...· yhtälöä: ··· • · · • · · .···. Ki = IC5o-{l/[l + substraattipitoisuus/(substraatin Km)]}.
• · ··« • 15 • · '·*·* [Chen ja Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22 (1973) 3099 - 3018; • ·· ·...· mainitaan tässä viitteenä] .
66 a. Tekijä Xa -määritys Tähän määritykseen käytettiin TBS-P-puskuria [50 mmol/1 Tris-Cl:a, pH 7,8, 200 mmol/1 NaClta, 0,05 % (m/V) PEG-8000:a, 0,02 % (m/V) NaN3: ä] . IC50 määritettiin 5 yhdistämällä Costar-puolipinta-alamikromaljän asianmukaisissa syvennyksissä 25 μΐ liuosta, joka sisälsi ihmisen tekijää Xa (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN) TBS-P:ssä; 40 μΐ liuosta, joka sisälsi 10 til-% DMS0:a TBS-P:ssä (inhiboimaton vertailunäyte) tai testattavaa pep-10 tidiä erilaisina pitoisuuksina liuoksessa, joka sisälsi 10 til-% DMSO:a TBS-P:ssä; ja substraattia S-2765 (Na-bent-syylioksikarbonyyli-D-Arg-Gly-L-Arg-p-nitroanilidi; Kabi Pharmacia, Inc., Franklin, OH) TBS-P:ssä.
Määritykset tehtiin esi-inkuboimalla peptidi-inhi-15 biittoria ynnä entsyymiä 10 min ja kä/nnistämällä määritys sitten lisäämällä substraattia, niin että lopulliseksi tilavuudeksi tuli 100 μΐ. Kromogeenisen substraatin hydrolyy-sin alkunopeus mitattiin aallonpituudella 405 nm saadun ab-sorbanssin muutoksen kautta käyttämällä Bio-tek Instrument-20 sin kineettistä maljanlukulaitetta (Ceres UV900HDi) lämpötilassa 25 °C reaktion etenemisen lineaarisen osan aikana (tavallisesti 1-5 min substraatin lisäämisen jälkeen) . ·;··· Inhibiittoripitoisuus, joka aiheutti ^0-%:isen laskun sub- straatin hydrolyysinopeudessa, ennustettiin lineaarisella • · 25 regressiolla, kun oli piirretty käyrä, joka kuvaa suhteel-lisiä hydrolyysinopeuksia {inhiboinattomaan vertailu- • * * III näytteeseen verrattuna) peptidipitoisuuden log: n funktio- * na. Entsyymikonsentraatio oli 0,5 nmol/1 ja substraattikon- sentraatio 140 pmol/l.
··· ♦ · · *.* *30 b. Trombiinimääritys «·· Tähän määritykseen käytettiin TBS-P-puskuria. IC50 määritettiin esimerkissä XXXVII.a. kuvatulla tavalla, pait- .···. si että substraatti oli S-2366 (L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-p-nit- ··· roanilidi; Kabi) ja entsyymi oli ihmisen trombiini (Enzyme • * · *·*·* 35 Research Laboratories, Inc., South Berd, IN). Entsyymikon- • · • · ··· 67 sentraatio oli 1 nmol/1 ja substraattikonsentraatio 175 μιηοΐ/l.
c. Plasmiinimääritys Tähän määritykseen käytettiin TBS-P-puskuria. IC50 5 määritettiin esimerkissä XXXVII.a. kuvatulla tavalla, paitsi että substraatti oli S-2251 [(D)-Val-L-Leu-L-Lys-p-nit- roanilidi; Kabi) ja entsyymi oli ihmisen plasmiini (Kabi). Entsyymikonsentraatio oli 5 nmol/1 ja substraattikonsentraatio 300 pmol/l.
10 d. Trypsiinimääritys Tähän määritykseen käytettiin TBS-P-puskuria, joka sisälsi 10 mmol/1 CaCl2:a. IC5o määritettiin esimerkissä XXXVII.a. kuvatulla tavalla, paitsi attä substraatti oli ΒΑΡΝΑ (bentsoyyli-L-Arg-p-nitroanilidi; Sigma Chemical Co., 15 St. Louis, MO) ja entsyymi oli naudan haiman trypsiini (tyyppi XIII, TPCK-käsitelty; Sigma). Entsyymikonsentraatio oli 50 nmol/1 ja substraattikonsentraatio 300 pmol/l. e. Elastaasimääritys Tähän määritykseen käytettiin Tris-Cl-puskuria, 20 pH 7,4, joka sisälsi 300 mmol/1 NaClra, 2 % (m/V) N-me- tyylipyrrolidonia ja 0,01 % (m/V) NaNjiä. IC50 määritettiin • · • *·· esimerkissä XXXVII.a. kuvatulla tavalla, paitsi että sub- *:**: straatti oli suksinyyli-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidi (Calbioc- ·*·*: hem-Nova Biochem Corp., San Diego, CA) ja entsyymi oli ih- 25 misen neutrofiilielastaasi (Athens Research and Technology, ···· . .·. Inc., Athens, GA) . Entsyymikonsentraatio oli 75 nmol/1 ja • · · ,·|·. substraattikonsentraatio 600 pmol/l.
• · ·
Valittujen testiyhdisteiden Xi-arvot verrattuina ... vertailuyhdisteeseen "TENSTOP" (N-alfa-tosyyli-Gly-p-amidi- • · · 30 nofenyylialaniinimetyyliesteri; American Diagnostica, Inc., • · *···* Greenwich, CT), joka on reversiibeli tekijän Xa inhibiitto- ri [Sturzebecher et ai., Thromb. Res. 54 (1989) 245 - 252; .***. Hauptmann et ai., Thromb. Haem. 63 (1990) 220 - 223; molem- ♦ ♦♦ .*. mat mainitaan tässä viitteinä] esitekään edellä olevassa • · * *·*♦* 35 taulukossa 2. Tulokset osoittavat, että keksinnön mukaiset ··· • · '···* YIR-peptidit pystyvät inhiboimaan tekijä Xa -aktiivisuutta 68 mutteivät inhiboi olennaisesti erilaisten muita seriinipro-teaaseja, tromobiini ja plasmiini mukaan luettuina, jotka ovat mukana veren koagulaatio- ja fibrinolyysiprosessissa.
Esimerkki XXXVIII
5 Testit koagulaation inhibition määrittämiseksi
Tutkittiin keksinnön mukaisten yhdisteiden kykyä inhiboida tekijä Xa -aktiivisuutta. Erilaisten yhdisteiden tehokkuutta tutkittiin in vitro protrombiiniaika (PT) -määrityksellä käyttämällä ihmisluovuttajden yhdistettyä plas-10 maa. Käytettiin myös ex vivo -määritystä, jossa plasmaa otettiin eri aikoina, sen jälkeen kun yhdistetttä oli annettu laskimonsisäisesti (i.v.) rotille ja kaniineille ja intraduodenaalisesti rotille, ja tehtiin analyysi käyttämällä PT-määritystä puoliintumisajan määrittämiseksi plas-15 massa. PT-määritys käynnistettiin trorrboplastiinilaimennok-sella, joka oli valittu siten, että saatiin pitkittynyt ja hyvin toistettavissa oleva koagulaation päätepiste, mitä kutsutaan "laimennoksen PT:n määritykseksi", kuten jäljempänä kuvataan. Erilaisten yhdisteiden tehokkuus määritet-20 tiin myös käyttämällä rotassa arteriovenöösisuntin avulla toteutettavaa in vivo -tromboosimallia, • · • *·· a. Laimennoksen protrombiiniajan määritys in -vitro ”··: 100 yl esilämmitettyä (37 °C) ihmisen yhdistettyä vähän verihiutaleita sisältävää plasmaa (PPP; platelet poor • · ··· 25 plasma} lisättiin fibrometrin kuppiin (Baxter Diagnostics, • ·· · . Inc., McGaw Park, IL). Lisättiin 50 ui liuoksia, jotka si- • · · ' .···. saisivat vaihtelevina pitoisuuksia testattavaa yhdistettä • · · kalsumpitoisessa TBS-BSA:ssa [50 mmol/1 Tris-Cl:a, 100 mmol/1 ... NaCl:a, 0,1 % (m/V) naudan seerumiaIbumiinia, 20 mmol/1 • · · 30 CaCl2:a]. Vertailukokeissa lisättiin T3SBSA:ta, joka sisäl- • · *···* si kalsiumia muttei testattavaa yhdistettä, inhiboimattoman koagulaatioajan mittaamiseksi. Lisättiin 150 μΐ kalsiumpi- • toista, laimennettua esilämmitettyä kaniinin tromboplastii- .*. nia (Baxter) fibrometrin kuppiin ja cäynnistettiin fibro- • ♦ ♦ 35 metrin ajastin. Kaniinin tromboplastiinilaimennuskäyrä mää- • · *··♦* ritettiin ennen yhdisteen testaamista ja sitä käytettiin 69 sellaisen tromoboplastiinilaimennoksen valitsemiseen, joka mahdollistaa PT-ajan noin 30 s inhiboimattomien vertailu-näytteiden ollessa kyseessä. Kokeellinen pitoisuus, joka antaa tulokseksi koagulaation 50-%risen inhibition (EC50) 5 testattavalla yhdisteellä (katso jäljempänä oleva taulukko 4), laskettiin laimennuskäyrältä saaduista ajoista.
Laimennoksen protrombiiniajan määritys toteutettiin vaihtoehtoisesti automaattisella koagulaatiolaiteella Instrumentation Laboratories (IL) ACL3000-plus (IL; Milano, Ita-10 lia) käyttämällä "research"-toimintatapaa. Tromboplastiinia laimennettiin, kunnes saavutettiin hyytymisaika 30 - 35 s.
Tämän hyytymisajan katsottiin vastaavan aktiivisuutta 100 %. Standardikäyrä kalibrointia varten määritettiin valmistamalla laimennetusta tromboplastiinireagenssista (kaniinin ai-15 vojen tromboplastiini; IL) laimennussarja, jossa pitoisuus laski aina puoleen. Määrityksen aikana sekoitettiin 50 μ1:η näyte (sentrifugoimalla erotettu plasma) 100 μ1:η kanssa tromboplastiinireagenssia ja otettiin nefelometrin lukemia 169 s:n ajan. Koagulaatioaika määritettiin laitteen laske-2 0 masta valonsironnan muuttumisen maksirrinopeudesta. Inhibi-tio ilmoitetaan prosentuaalisena aktiivisuutena, joka on • · : ’·· määritetty vertaamalla kalibrointikäyrään.
b. Laimennoksen protrombiiniajan määritys ex vivo :*·*: Tutkittavaa yhdistettä annettiin i.v. joko häntä- • ♦ ··· 25 laskimon (rotta) tai korvalaskimon (kar.iini) kautta noudat- ···· . tamalla hyväksyttyä käytäntöä. Verinäytteitä (1 ml) otet- • · · tiin määräajoin testattavan yhdisteen annon jälkeen kanyy- « « ·
Iillä varustetusta kaulavaltimosta (rotta) tai korvavalti- ... mosta (rotta). Kun oli tehty sentrifugcinti PPP:n saamisek- • · · 30 si, plasma varastoitiin välittömästi -jäihin tai pakastet- *···* tiin.
• :T: Laimennoksen protrombiiniajan määrittämiseksi plas- :***: ma esilämmitettiin ja tutkittiin edellä kuvatulla tavalla.
··· .*. Prosentuaalinen inhibitio laskettiin tromboplastiinilaimen- • · · l,m, 35 nuskäyrältä, joka määritettiin kullekin näytesarjalle ja • · *···* jota käytettiin sen ajan määrittämiseen, jonka kuluttua 70 plasmassa on jäljellä noin 50 % alkuperäisestä antikoagu-lanttiaktiivisuudesta (Tk) . Tämän kokeen tulokset osoittavat, että keksinnön mukaiset YIR-peptidit pystyvät inhiboimaan veren hyytymistä in vitro ja antamisen jälkeen in vivo 5 (katso taulukko 4).
Taulukko 4
Valittujen inhibiittoreiden aktiivisuudet ja puoliintumisajät 10 Rakenne EC50 T4
Yhdistetty Rotta Kaniini ihmisplasma ex vivo ex vivo in vitro 15 Ac-Y-Chg-R-NH2 2,5 pmol/l 5 min 5 min
Ac-Y-Chg-R-L-P-NH2 225 nmol/1 5 min 5 min
Ac-Nal(2)-Chg-R-L- P-NH2 140 nmol/1 6 min 5 min
Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L- 20 P-NH2 300 nmol/1 15 min 10 min
Tutkittiin myös erilaisten yhdisteiden antikoagu- • · : 1·· lanttiaktiivisuutta määrittämällä laimennoksen protrom- biiniaika ex vivo, sen jälkeen kun rottlle oli annettu i.v.
; 25 erilaisia kerta-annoksia. Taulukossa 5 luetelluilla yhdisti· teillä inhibitio oli vähintään 30 i, kun oli annettu ···· ; ·1· ^2 mg/kg kyseistä yhdistettä. Nämä tulokset osoittavat, et- ··· tä erilaisilla tätä keksintöä edustavilla YIR-peptideillä • 1 on olennainen antikoagulanttiaktiivisuus. Kaikkien taulu-30 kossa lueteltujen yhdisteiden rakenteet varmistettiin MS:lla ja AA:lla.
• · • · • · ·
Taulukko 5 71 6. Tos-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 7. Ac-Y(3-I)-Chg~R-L-P-NH2 8. Ac-pAph-Chg-AMP{4) 9. y-Chg-R-L-NH2 5 10. Ac-F(pNH2) -Chg-R-oli 11. Syklopentyyli-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 12. 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe (3)-NH.> 13. Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 14. 3-Iqc-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 10 15. Ac-F(pNH2) -Chg-R-tiatsolyyli 16. 2-furoyyli-pAph-Chg~PalMe(3)-NH2 17. 5-Me-2-tienyyli~CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 18. Ac-Nal(2)-Chg-R-tiatsolyyli 19. 2-Bzf-F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 15 20. Ac-pAph-Chg-Dab (NY-C3NH7) -L-P-NH2 21. Ac-Orn-Nal(2)-Chq-PalMe(3)-Sar-E-NH2* 22. Ac-Phe (3-1,4-NH2) -Chg-R-L-E'-NH2 23. Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH2 24. Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH2 20 25. Ac-pAph-Chg-R-Pen (CH2COOH)-P-NH2 26. Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2 • · : *·· 27. Ac-F (pNH2) -Chg-R- (Me) L-P-NP2 ·:··: 28. Ac-F(pNH2)-Chg-R-OEt :*·[: 29. Ac-F(pNH2)-Chg-Orn (N5-C3H7N)-L-P-NH2 ·;· 25 30. Ac-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 ···· . 31. Ac-Nal (2)-Chg-R-L-P-NH2 32. Ac-pAph-Chg-Dab(Νγ-θ3Η7Ν) • · · 33. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 ... 34. Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -L-P-NH2 • · · 30 35. Ac-pAph-Chg-R-NH2
*·"* 36. Ac-pAph-Chg-R-OH
:T: 37. Ac-Y-Chg-R-NH-Nip-NH2 38 · Ac-K-Nal (2) -Chg-R-Hyp-E-NH; 39. DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NH2 • · · *:// 35 40. DIPA-mF (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 :···: 41. Isn-F{pNH2)-Chg-R-L-P-NH2 72 42. Pza~F{pNH2)-Chg-R-L-P-NHa 43. Tfa- (iBu) F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 44. Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2 45. Tfa-(iBu)Y-I-Orn(N5-C3H7N)-L-P-NH2 5 ^Alleviivaus osoittaa yhdisteensyklisen osan.
Joissakin kokeissa testattavia yhdisteitä annettiin rotille käyttämällä intraduodenaalista annostelumenettelyä. Sprague-Dawley-urosrotat, joiden paino oli noin 300 g, nu-10 kutettiin subkutaanisesti ketamiini-ks/latsiiniyhdistelmäl- lä noudattamalla hyväksyttyä menettelyä. Oikea kaulavaltimo varustettiin kanyylillä verinäytteider ottoa varten. Testiin laparotomia, pohjukaissuoli kanyloitiin pallokärkisel-lä neulalla ja sidottiin paikalleen sen takaamiseksi, että 15 ommel sijaitsi distaalisesti kiinnityskohtaan nähden. Si joitettiin toinen side proksimaalisesti kiinnityskohtaan nähden mahalaukun sisällön vuotamisen estämiseksi. Se, että ommel esti tehokkaasti yhdistettä saavuttamasta kiinnityskohtaa, testattiin painetestillä kukin cokeen lopussa. Kiin-20 nityskohta oli noin 4 cm:n päässä pohjukaissuolen ja mahalaukun liitoskohdasta. Yhdisteet annett.iin 1 mlrssa normaa- • · • *·· lia fysiologista suolaliuosta. 0,7 ml:n verinäyte otettiin *:*·; ennen testattavan yhdisteen antoa ja 15, 30, 60, 90 ja 120 min:n kuluttua annosta. Plasma erotettiin sentrifugoi- • · 25 maila ja siitä määritettiin koagulaation inhibitio tekemäl- ···· . lä laimennoksen protrombiiniajän määritys.
• · · .··*. Seuraavilla yhdisteillä inhibitio oli vähintään • · · 30 % laimennoksen protrombiiniajan määrityksessä, kun oli ... annettu <50 mg/kg kyseistä yhdistettä: Ac-pAph-Chg-PalMe(3)- *·]* 30 NH-CH2-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-
PalMe (3) -NH2, Bzf-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2(· Ac-F (pNH2) -Chg-R-L-:*·*: P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) - .*·*. NH2; Ac-pAph-Chg-AMP (4) / syklopentyyli-30-pAph-Chg-PalMe(3)- .·. NH2; 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 2-furoyyli-pAph-Chg- 35 PalMe (3)-NH2; 5-Me-tienyyli-CO-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; Ac-Y(3- • · • · • · · 73 I)-Chg-R-L-P-NH2; Ac-F(pNH2)-Chg-R-oli ja Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-oli.
c. Rotassa arteriovenöösisuntiri avulla toteutettava tromboosimalli 5 Erilaisten keksinnön mukaisten yhdisteiden anti- tromboottinen aktiivisuus määritettiin käyttämällä rotan ruumiin ulkopuolella olevaa arteriovenöösi (AV) -sunttia. AV-sunttisilmukka koostui 20 cm: n pituisesta polyeteeni (PE) 60 -letkusta, joka oli sijoitettu oikeaan kaulavalti-10 moon, 6 cm:n pituisesta PE 160 -letkusta, joka sisälsi 6,5 cm merseroitua puuvillalankaa (5 cm alttiina verivir-ralle), ja toisesta 20 cm:n pituisesta PE 60 -letkusta, joka päätti silmukan vasempaan kaulalaskimoon. Koko silmukka täytettiin normaalilla fysiologisella suolaliuoksella ennen 15 kiinnittämistään.
Testattavia yhdisteitä annett.iin kestoinfuusiona häntälaskimoon käyttämällä ruiskupumppua ja läppäkateria (infuusiotilavuus 1,02 ml/h). Yhdistettä annettiin 30 min, suntti avattiin sitten ja veren annettiin virrata 15 min 20 (kokonaisinfuusioaika 45 min). Kyseisen 15 min:n jakson lo pussa silmukka suljettiin pinteellä ja lanka poistettiin varovasti ja punnittiin analyysivaa'alla.
·;··· Trombin muodostuksen prosentuaalinen inhibitio las- |·.*. kettiin käyttämällä trombin massaa, joka mitattiin vertai- • · 25 lurotilla, joihin infusoitiin fysiologista suolaliuosta.
. .·. Seuraavat yhdisteet inhiboivat vähintään noin • · · VV. 30-%:isesti trombin muodostusta, kun vhdistettä oli infu- * soitu <33 pg/(kg-min): Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac- pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph- 30 Chg-PalMe (3) -L~P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; Ac-pAph-Chg-AMP (4); syklopentyyli-CO-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; 3-Iqc-pAph-:*·*: Chg-PalMe (3) -NH2; 2-furoyyli-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 5-Me- .**·. tienyyli-CO-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -oli ja Tos~F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2.
• · · • · · • · ··· • · • ♦ ··· j

Claims (18)

74
1. Yhdiste, joka inhiboi spesifisesti tekijän Xa aktiivisuutta ja jolla on yleinen kaava 5 Xi-R1-R2-R3-X2 jolloin Xl on H, asyyli-, alkyyli- tai arylalkyyliryhmä;
2-Bzf-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-Dab (NY-C3H7N) -L-P-NH2; Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH2;
2. Yhdiste, joka inhiboi spesifisesti tekijän Xa ψ · : *·· aktiivisuutta ja jolla on yleinen kaava • m "**: A1-A2-A3-B • · ··· 25 ···· • ·#· nolloin • · · ^ AI on Tyr, F(pNH2), mAph, pAph, tai Nai (2), joka sisältää • · · 0 tai 1 aminoryhmän suojaava ryhmä; ... A2 on Ile tai Chg; • · · *:’/ 30 A3 on Arg, PalMe(3), Dab <Νγ-03Η7Ν) , Dap (Νβ-03Η7Ν) tai :·:·** 0rn(N5C3H7N) ; ja ί*Γ: B on -H, -OH, -NH2, l - 5 aminohappoa tai karboksyyliryh- :***; män suojaava ryhmä, mukaan lukien yhdisteen farmaseutti- ··· .*. sesti hyväksyttävät suolat. • · · ·]·* 35
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdiste, • · ’···* jolloin aminoryhmän suojaava ryhmä valitaan ryhmästä, jon- 75 ka muodostavat formyyli, asetyyli, pikoloyyli, tert-bu-tyyliasetyyli, tert-butyylioksykarbonyyli, bentsyylioksy-karbonyyli, 2-aryyli-2-o-bentsyylioksime, aminoasyyli, bent-soyyli, tosyyli, 3-fenoksipropioni, 5-bensimidatsolikar-5 boksi, CCIF2-CO, CF2H-CO, CF3-CF2CO, CH3-CHCI-CO, CH3-O-CO, CH3-SO2, CH3CH2-O-CO, CI2CHCO, C1H2C0, (pOH)C6H4-CH2CH(OH) -CO, (pOH}C6H4-CH2CHOH-CO, (pOH) C6H4-OCH (CH3) CO, (pOH)C6H4-OCH2CO, 4-MeO-C6H4-CO, N-morfolinyyli-CO, Ph-C (NOCH2Ph)-CO, Ph-CH-CH-CO, Ph-CH2CH2CH2-CO, Ph-CH2CH2-CO, trifluoroase-10 tyyli, tai on N-päätteen aminoryhmän substituentti, joka on syklopentyylikarboksyyli-, isokinolyylikarboksyyli- tai pyratsiinikarboksyyliryhmä.
4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen yhdiste, jolloin farmaseuttisesti hyväksyttävä suola on happoaddi- 15 tiosuola.
5 Ac-Tyr-Ile-Arg- {Ψ (COCH2) }-Gly-Pro-NH2, Ac-Tyr-Ile-Dab (NY-C3H7N) -*Leu-Ala-NH2, Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2, Tyr-Ile-Arg-NH2, D-Tyr-Ile-Arg~Leu-Pro~NH2,
5-Me-tienyyli-CO-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; :*·*: Ac-pAph-Chg-PalMe {3) -ol; .***. Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2, Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, * · ·
35 Ac- (iBu) Tyr-Ile-\Arg-Leu“Pro-NH2, :...: Ac-Tyr-Ile-Arg-N (CH3) O (CH3) , 79 Ac-Tyr{Ψ(CH2NH) }-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyyli), Ac-Tyr-Ile{T(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Tyr-Chg-Arg (NO2) - {Ψ (CH2NH) }-Leu-NH2,
5 Ac-pAph-Chg-R-Pen (CH2COOH) -P-NH2; Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2; Ac-F(pNH2) -Chg-R- (Me)L-P-NH2; Ac-F{pNH2) -Chg-R-OEt; Ac-F (pNH2) -Chg-Orn (N5-C3H7N) -L-P-NH2;
5 Ac-pAph-Chg-Pal(3)Me-Leu-Pro-NH2; (bentsoyyli) -Phe (pNH2) Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(2-metyylipentanyyli)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(2-metyylibutyyli)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Phe (pNH2) -Chg~Arg-Leu-Pro-NH2;
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, jolloin happoadditiosuola on suola, joka muodostuu epäorgaanisesta haposta, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu vetykloridi-happo, vetybromidihappo, rikkihappo tai perkloorihappo, 20 tai on suola, joka muodostuu orgaanisesta haposta, joka valitaan ryhmästä johon kuuluu etikkahappo, oksaalihappo, ·· • *·· maleiinihappo, maliinihappo, tartarihappo, sitruunahappo, •f: sukkinihappo tai malonihappo.
·*·*: 6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen yhdiste, t · 25 jolloin farmaseuttisesti hyväksytty suola valitaan ryhmäs- • Ml . ,·, tä, johon kuuluu epäorgaaninen nitraatti, sulfaatti, ase- • · · taatti, malaatti, formiaatti, laktaatti, tartraatti, suk- • 1 · * ' ’ * ' • · · kinaatti, sitraatti ja p-tolueenisulfonaatti.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdiste, jolloin • · · *·] ’ 30 farmaseuttisesti hyväksyttävä suola on p-tolueenisulfo- ·...* naatti.
8. Patenttivaatimusten 1, ja 3 - 7 mukainen yhdis- .*··. te, jolloin Xl valitaan ryhmästä, johon kuuluu metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, sek-butyyli, 1-metyylibu- • · · ••V 35 tyyli, 2,2-dimetyylibutyyli, 2-metyylipentyyli, 2,2-dime- *...* tyylipropyyli, n-pentyyli, n-heksyyli, syklopentyyli, me- 76 tyyli-sykloheksyyli ja syklopropyyli-metyleeni, formyyli, asetyyli, bentsoyyli, bentsyyli, pikolyyli.
9. Patenttivaatimusten 1 ja 3 - 7 mukainen yhdiste, jolloin oraalinen esteri valitaan ryhmästä, johon kuu- 5 luvat alkoksimetyyliryhmät, a-(Ci~C4) alkoksietyyliryhmät, 2-okso-l,3-dioksoleen-4-yylimetyyliryhmät, Ci~C3-alkyylitio-metyyliryhmät, asyylioksimetyyliryhmät, a-asyylioksi-a-subs-tituoidut metyyliryhmät, 1-(Ci-C4-alkyylioksikarbonyyliok-si)et-l-yyliryhmät ja 1-(Ci-C^-alkyyliaminokarbonyyliok-10 si)et-l-yyliryhmät.
10 Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyyli)Gly-NH2, syklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly) , Tfa-(iBu)Tyr-Chg~Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2,
10 Ac-F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-Dab (NY-C3H7N) -NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2;
10 Ac-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac- (iBu) -Phe (pNH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac- (Chx-CH2) -Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; (2-bentsofuroyyli)-pAph-Chg-Pal(3)Me-NH2; Ac-(iBu)Phe(pNH2)-Chg-Arg-NH2;
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen yhdiste, jolloin oraalinen esteri valitaan ryhmästä, johon kuuluu me-toksimetyyli, etoksimetyyli, iso-propoksimetyyli, metok-sietyyli, etoksietyyli, propoksietyyli, isopropoksietyyli, 15 5-metyyli-2-okso-l,3-dioksoleen-4-yylimetyyli, 5-fenyyli- 2-okso-l,3-dioksoleen-4-yylimetyyli, metyylitiometyyli, etyy-litiometyyli, isopropyylitiometyyli, pivaloyylioksimetyyli, a-asetoksimetyyli, etoksikarbonyyli-l-metyyli, or-asetoksi- etyyli, 3-ftalidyyli, 5,6-dimetyyliftalidyyli, 1-etoksikarbo-20 nyylioksi)et-l-yyli ja 1-(metyyliaminokarbonyylioksi)et-1-yyli.
·· • *·· 11. Patenttivaatimusten 1-10 mukainen yhdiste, *ί**ϊ joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu Γ**: CF3C (0) - (iBu) Phe (NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; ··· 25 Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; . .·. CF3C (0) - (iBu) Nai (2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; .···. Ac-Phe (31,4NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; • · · CF3C(0)-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; ... {5-bentsimidatsoyyli) -Phe (NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; • ♦ · *·]/ 30 CF3C (O) - (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; *···* Ac- (Chx-CH2) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; :T: D-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2,' :***· Ac-Trp-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; ··« Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; • · ·
35 Ac-pAgh-Chg-Arg-Gla-Pro-NH2; *···* Ac- (iBu) Nai (2) -Chg~Arg-Leu-Pro-NH2; 77 Ac-Phe(p-CONH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Phe (pNH2) -Chg-Arg- (Me) Leu-Pro-NH2; Ac-(Chx-CH2) Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
10 Rl on Tyr; R2 on Ile; R3 on Arg; ja X2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat muunnettu C-pää-teryhmä, yksi tai useampi karboksyyliryhmän suojaava ryh-15 mä, yksi tai useampi aminohappo tai muu substituentti, jolloin muunnettu C-pääteryhmä on muunnettu pelkistämällä C-päätteen karboksyyliryhmä alkoholiksi tai aldehydiksi tai muodostamalla oraalinen esteri tai substituoimalla karboksyyliryhmä substituentilla; mukaan lukien yhdisteen 20 farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.
12. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää jonkin 20 patenttivaatimuksen 1-11 mukaisen yhdisteen.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen farmaseuttinen koostumus, joka edelleen sisältää farmaseuttisesti hyväksi··· syttävän kantajan.
14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukaisen yh- • · 25 disteen käyttö valmistettaessa farmaseuttisen koostumuksen inhiboimaan spesifisesti tekijän Xa aktiivisuutta. • · · I” 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, joi- • · · * loin farmaseuttinen koostumus on tarkoitettu hoitamaan sydän- ja verisuonitautia, joka valitaan ryhmästä, johon ♦ · · *·* * 30 kuuluu verisuonenmuovausleikkausta seuraavaa restenoosi, ··· aikuisen hengitysvaikeussyndrooma, monen elimen vajaatoi- minta, aivohalvaus ja disseminoitunut suonensisäinen koa-• · · ** .···. gulaatio -hyytymishäiriö. • ·
15 Ac-pAph-Chg-PalMe-NH2, Ac-D-pAph-Chg-Pal (Me) -Leu-Pro-NH2, Ac-D-pAph-Chg-Pal(Me)-NH2, ja Ac-Phe (pNH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2.
15 Ac-pAph-Chg-R-NH2; Ac-pAph-Chg-R-OH; DIPA-(m)pAph-Chg-R-L-P-NH2; DIPA- (m) F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; Isn-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2;
20 Pza-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2; j*··· Tfa- (iBu) Y-l-Orn (N5-C3H7N) -L-P-NH2; ·:··: Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-CH2-Chx; :*·*: Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-Chx; • · .:. 25 Bzf-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; . .·. Ac-pAph-Chg-PalMe (3)-L-P-NH2; • · · .*··. Ac-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; Syklopentyvli-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; ... 3-lqc-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 30 2-furoyyli-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2;
15 Ac-pAph-Chg-Arg-NH2; CF3C (0) - (iBu) Phe (pNH2) -Chg-Arg-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-NH2; Ac-pAph-Chg-Pal(3)Me-NH2; CF3C(0) (iBu) -Tyr-Ile-Arg-NH2;
20 Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-Chx; ·:··· Ac-F (pNH2) -Chg-Dab (Ny-C3NH7) -L-P-NH2; Bz-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NK2; * 25 Tos-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; .**[1. Ac-Y (3-1)-Chg-R-L-P-NH2; III y-Chg-R-L-NH2; • · · ’*’ * Ac-F (pNH2) -Chg-R-ol; Syklopentyyli-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; *·* * 30 3-lqc-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; • · · Bzf-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 3-lqc-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2; .··*. Ac-F (pNH2) -Chg-R-NH-2-tiatsolyyli; • · 2-furoyyli-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; *·'·’ 35 5-Me-2-tienyyli-CO-pAph-Chg-PalMe (3)-NH2; • · · *...· Ac-Nal (2) -Chg-R-NH-2-tiatsolyyli; 78
16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, joi- • · · *·*.* 35 loin farmaseuttinen koostumus on tarkoitettu hoitamaan • · · häiriöitä, jotka liittyvät kirurgiaan, jotka valitaan ryh- 80 mästä, johon kuuluu syvälaskimon ja Proksimaalisen laskimon tukos.
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, jolloin farmaseuttinen koostumus on tarkoitettu vähentämään 5 tai estämään veren hyytymistä.
18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukaisen yhdisteen käyttö antikoagulanttina estämään verinäytteen koagulaation. • · • · • ·· • · • · · • · 1 • · • · ·1· «··♦ • · ♦ • · · ··· • · · • · · • · ♦ ··· • · « • · · ··· • · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · ··· • · • · · • · · • · · · • · • · • · · 81
FI964317A 1994-04-26 1996-10-25 Tekijän Xa inhibiittoreita FI120494B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23305494A 1994-04-26 1994-04-26
US23305494 1994-04-26
US9505268 1995-04-25
PCT/US1995/005268 WO1995029189A1 (en) 1994-04-26 1995-04-25 FACTOR Xa INHIBITORS

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI964317A FI964317A (fi) 1996-10-25
FI964317A0 FI964317A0 (fi) 1996-10-25
FI120494B true FI120494B (fi) 2009-11-13

Family

ID=22875692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI964317A FI120494B (fi) 1994-04-26 1996-10-25 Tekijän Xa inhibiittoreita

Country Status (27)

Country Link
EP (2) EP0758341B1 (fi)
JP (1) JP3655632B2 (fi)
KR (1) KR100380124B1 (fi)
CN (1) CN1181091C (fi)
AT (1) ATE262536T1 (fi)
AU (1) AU707653B2 (fi)
CA (1) CA2186497C (fi)
CZ (1) CZ296439B6 (fi)
DE (1) DE69532754T2 (fi)
DK (1) DK0758341T3 (fi)
EE (1) EE03973B1 (fi)
ES (1) ES2214500T3 (fi)
FI (1) FI120494B (fi)
HU (1) HUT76346A (fi)
IL (1) IL113505A (fi)
LT (1) LT4218B (fi)
LV (1) LV11740B (fi)
NO (1) NO318759B1 (fi)
NZ (1) NZ284977A (fi)
PL (1) PL188132B1 (fi)
PT (1) PT758341E (fi)
RU (1) RU2152954C1 (fi)
SI (1) SI9520044B (fi)
SK (1) SK286094B6 (fi)
TW (1) TW409129B (fi)
WO (1) WO1995029189A1 (fi)
ZA (1) ZA953361B (fi)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA199700186A1 (ru) * 1995-02-17 1998-02-26 Басф Акциенгезельшафт Новые дипептидные амидины, используемые в качестве ингибиторов тромбина
US5747458A (en) * 1995-06-07 1998-05-05 Chiron Corporation Urokinase receptor ligands
US6069130A (en) * 1995-06-07 2000-05-30 Cor Therapeutics, Inc. Ketoheterocyclic inhibitors of factor Xa
DK0868526T3 (da) * 1995-12-20 2002-12-02 Aventis Pharma Inc Fremgangsmåde til fremstilling af N-acetyl(L)-4-cyanophenylalanin Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH og N-acetyl-(L)-p-amidinophenylalanincyclohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alanin Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
US5766932A (en) * 1995-12-20 1998-06-16 Hoechst Marion Roussel, Inc. Process for preparing N-acetyl(L)-4-cyanophenylalanine from a mixture of the corresponding D,L ethyl esters using subtilisin
US6194435B1 (en) 1996-10-11 2001-02-27 Cor Therapeutics, Inc. Lactams as selective factor Xa inhibitors
US6262047B1 (en) 1996-10-11 2001-07-17 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6369080B2 (en) 1996-10-11 2002-04-09 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6063794A (en) 1996-10-11 2000-05-16 Cor Therapeutics Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6369063B1 (en) 1997-04-14 2002-04-09 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
WO1998046626A1 (en) 1997-04-14 1998-10-22 Cor Therapeutics, Inc. SELECTIVE FACTOR Xa INHIBITORS
CA2285705A1 (en) * 1997-04-14 1998-10-22 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor xa inhibitors
US7109326B2 (en) 1997-04-15 2006-09-19 Genentech, Inc. Halo-alkoxycarbonyl prodrugs
US6218382B1 (en) 1997-08-11 2001-04-17 Cor Therapeutics, Inc Selective factor Xa inhibitors
US6333321B1 (en) 1997-08-11 2001-12-25 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6228854B1 (en) 1997-08-11 2001-05-08 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
GB9727123D0 (en) * 1997-12-22 1998-02-25 Int Centre Genetic Eng & Bio Synthesis of diamines
DE69829879T2 (de) 1997-12-24 2006-03-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Indolderivate als faktor xa inhibitoren
EP0987274A1 (en) * 1998-09-15 2000-03-22 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Factor VIIa Inhibitors
EP1016663A1 (en) * 1999-01-02 2000-07-05 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor Xa activity)
EP1022268A1 (en) * 1999-01-02 2000-07-26 Aventis Pharma Deutschland GmbH Arylalkanoyl derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them
WO2000040571A1 (en) 1999-01-02 2000-07-13 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor xa activity)
IL144095A0 (en) 1999-01-02 2002-05-23 Aventis Pharma Gmbh Arylalkanoyl derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them
EP1059302A1 (en) * 1999-06-08 2000-12-13 Aventis Pharma Deutschland GmbH Factor VIIa inhibitors
EP1095933A1 (en) 1999-10-30 2001-05-02 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them
JP5088598B2 (ja) * 1999-12-14 2012-12-05 昭和電工株式会社 シアノベンジルアミン類の塩の製造方法
EP1151989A4 (en) * 1999-12-14 2009-01-21 Showa Denko Kk PROCESS FOR PRODUCING A CYANOBENZYLAMINE SALT OR ONE OF ITS DERIVATIVES
HUP0301986A2 (hu) 2000-01-28 2003-09-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Eljárás acetil-amidinofenilalanil-ciklohexilglicil-piridinioalanin-amidok elżállítására, valamint kiindulási anyagok és köztitermékek
EP1127884A1 (en) 2000-02-26 2001-08-29 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use as inhibitor of factor XA activity and pharmaceutical compositions containing them
DE10029015A1 (de) 2000-06-15 2001-12-20 Curacyte Ag Hemmstoffe für den Gerinnungsfaktor Xa
EE200300192A (et) * 2000-12-06 2003-08-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Guanidiini ja amidiini derivaadid, nende valmistamismeetod ja kasutamine, farmatseutiline preparaatning eelravim
EP1314733A1 (en) 2001-11-22 2003-05-28 Aventis Pharma Deutschland GmbH Indole-2-carboxamides as factor Xa inhibitors
US7838560B2 (en) 2002-03-11 2010-11-23 The Medicines Company (Leipzig) Gmbh Urokinase inhibitors, production and use thereof
WO2004050637A2 (en) 2002-12-03 2004-06-17 Axys Pharmaceuticals, Inc. 2-(2-hydroxybiphenyl-3-yl)-1h-benzoimidazole-5-carboxamidine derivatives as factor viia inhibitors
US7358268B2 (en) 2002-12-04 2008-04-15 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Imidazole derivatives as factor Xa inhibitors
US7429581B2 (en) 2002-12-23 2008-09-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pyrazole-derivatives as factor Xa inhibitors
DE10301300B4 (de) 2003-01-15 2009-07-16 Curacyte Chemistry Gmbh Verwendung von acylierten 4-Amidino- und 4-Guanidinobenzylaminen zur Inhibierung von Plasmakallikrein
US7223780B2 (en) 2003-05-19 2007-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Triazole-derivatives as blood clotting enzyme factor Xa inhibitors
US7741341B2 (en) 2003-05-19 2010-06-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzimidazole-derivatives as factor Xa inhibitors
EP1479680A1 (en) 2003-05-19 2004-11-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH Azaindole derivatives as Factor Xa inhibitors
US7317027B2 (en) 2003-05-19 2008-01-08 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Azaindole-derivatives as factor Xa inhibitors
EP1479677A1 (en) 2003-05-19 2004-11-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH New indole derivatives as factor xa inhibitors
EP1479675A1 (en) 2003-05-19 2004-11-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH Indazole-derivatives as factor Xa inhibitors
DE10342108A1 (de) 2003-09-11 2005-04-14 Curacyte Chemistry Gmbh Basisch-substituierte Benzylaminanaloga als Inhibitoren des Gerinnungsfaktors Xa, ihre Herstellung und Verwendung
EP1568698A1 (en) 2004-02-27 2005-08-31 Aventis Pharma Deutschland GmbH Pyrrole-derivatives as factor Xa inhibitors
AU2005299693B2 (en) 2004-10-26 2012-07-05 Janssen Pharmaceutica, N.V. Factor Xa compounds
EP1724269A1 (en) 2005-05-20 2006-11-22 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Heteroaryl-carboxylic acid (sulfamoyl alkyl) amide - derivatives as factor Xa inhibitors
DE102005044319A1 (de) 2005-09-16 2007-03-22 Curacyte Chemistry Gmbh 2-(Aminomethyl)-5-Chlor-Benzylamid-Derivate und ihre Verwendung als Hemmstoffe des Gerinnungsfaktors Xa
DE102006050672A1 (de) 2006-10-24 2008-04-30 Curacyte Discovery Gmbh Hemmstoffe des Plasmins und des Plasmakallikreins
EP1918718A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-07 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Vorrichtungen zur elektrochemischen Bestimmung von Faktor Xa-Inhibitoren in Blutproben
AU2008239659B2 (en) 2007-04-13 2013-09-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Combination anticoagulant therapy with a compound that acts as a factor Xa inhibitor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
CA1161431A (en) * 1979-05-11 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives
US4469679A (en) * 1983-02-16 1984-09-04 Smithkline Beckman Corporation Octapeptide vasopressin antagonists
HU191961B (en) * 1984-08-02 1987-04-28 Richter Gedeon Vegyeszet Process for producing 1,5 and 8 substituted peptides of angiotenzin-ii antagonistic activity
EP0627929B1 (en) * 1992-02-14 1998-09-30 Corvas International, Inc. Inhibitors of thrombosis

Also Published As

Publication number Publication date
NO964553D0 (no) 1996-10-25
SI9520044A (en) 1997-10-31
DK0758341T3 (da) 2004-06-28
LT96151A (en) 1997-05-26
PL317067A1 (en) 1997-03-03
NO318759B1 (no) 2005-05-02
EP0758341A1 (en) 1997-02-19
CN1181091C (zh) 2004-12-22
NZ284977A (en) 1998-09-24
CA2186497A1 (en) 1995-11-02
IL113505A0 (en) 1995-07-31
FI964317A (fi) 1996-10-25
RU2152954C1 (ru) 2000-07-20
DE69532754D1 (de) 2004-04-29
HUT76346A (en) 1997-08-28
CZ296439B6 (cs) 2006-03-15
EE03973B1 (et) 2003-02-17
CA2186497C (en) 2008-06-17
EP0758341B1 (en) 2004-03-24
LT4218B (en) 1997-09-25
LV11740A (lv) 1997-04-20
DE69532754T2 (de) 2005-03-10
CZ314096A3 (en) 1997-05-14
IL113505A (en) 1999-12-31
SK286094B6 (sk) 2008-03-05
FI964317A0 (fi) 1996-10-25
SK136696A3 (en) 1997-05-07
EP1384725A3 (en) 2007-02-21
ZA953361B (en) 1996-01-12
WO1995029189A1 (en) 1995-11-02
EE9600146A (et) 1997-04-15
ES2214500T3 (es) 2004-09-16
LV11740B (en) 1997-12-20
SI9520044B (sl) 2004-08-31
JP3655632B2 (ja) 2005-06-02
PL188132B1 (pl) 2004-12-31
ATE262536T1 (de) 2004-04-15
EP1384725A2 (en) 2004-01-28
CN1147261A (zh) 1997-04-09
NO964553L (no) 1996-12-27
AU707653B2 (en) 1999-07-15
PT758341E (pt) 2004-08-31
KR100380124B1 (ko) 2003-08-02
AU2368395A (en) 1995-11-16
HU9602954D0 (en) 1996-12-30
JPH10503477A (ja) 1998-03-31
TW409129B (en) 2000-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120494B (fi) Tekijän Xa inhibiittoreita
KR100665490B1 (ko) 인자 Ⅶａ 억제제
JPH0262892A (ja) 抗―凝集ペプチド
US7879792B2 (en) Synthetic peptide inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
CA2026376C (en) Anticoagulant peptides
US5849510A (en) Factor Xa inhibitors
US20040220110A1 (en) Synthetic peptide analogs of Arg-Pro-Pro-Gly-Phe as selective inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
US6759384B1 (en) Factor Xa inhibitors
KR100330465B1 (ko) 삼관능성항트롬빈및항혈소판펩티드

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120494

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed