KR100330465B1 - 삼관능성항트롬빈및항혈소판펩티드 - Google Patents

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로버트 제이.쥬니어 브로어스마
토마스 제이. 오웬
존 엘. 크르스테난스키
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메렐 파마슈티칼스 인크.
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Abstract

다음 일반식의 화한물 또는 그의 제약학상 허용 가능한 염은 유용한 항응고제이다.
X - A - B - C - Y
상기 식중,
X는 수소, 1 내지 6 탄소원자를 갖는 1 또는 2 개의 알킬기, 2 내지 10 탄소자를 갖는 1 또는 2개의 아실기, 카르보벤질옥시, H2NC(=NH)-, 또는 t-부틸옥시 카르보닐기로 부터 선택된 아미노 말단 잔기이며,
A는 다음 일반식의
A1- A2- A3
(여기서, A1은 (D)Phe, (D) Phg, (D)1-Tiq, (D)3-Tiq, N-Me-(D)Phe, (D)Cha, (D) Chg, (D) Nag, 또는 (D)Thg이며; A2는 Pro, Pip, 또는 Azt이며; A3는 Arg, Lys, Orn, 또는 hArg임)
B는 다음 일반식(3) 또는 (4)의 펩티드 유사체이며,
(여기서, B1은 Gly, Ala, (D)Ala, Va1, (D)Val, 또는 G1y-G1y이며; B2는 Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-G1y-G1y-Gly 또는 임의의 (D) 아미노산이며; B2'는 Arg-Ile-Pro 또는 Lys-Ile-Pro이며; B3는 Arg, hArg, N-Me-Arg 또는 Lys이며: B4는 Nle, Phe, Met 또는 Cha임)
C는 다음 일반식의 펩티드 유사체이며;
Asp-C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9
(여기서, C1은 Phe, pC1Phe. pNOZPhe, Tha, Npa, Tyr 또는 Trp 이며; C2는 Glu 또는 Asp이며; C3는 임의의 아미노산이며; C4는 Ile, Val, Leu 또는 Phe이며: C5는 Pro, Hyp, Sar, NMePgl 또는 D-Ala이며: C6는 임의의 아미노산이며; C7은 임의의 아미노산이며; C8은 Tyr, Glu, Pro, Ala-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu 및 Ala-Tyr이며; C9은 결함 또는 Glu, (D)Glu, Gln, Pro, Leu-Gln, Asp-Gln, 또는 Leu-Pro임) Y는 OH, C1-C6알콕시, 아미노, 모노- 또는 디-(C1-C4)알킬 치환된 아미노, 또는 벤질아미노로 부터 선택된 카르복시 말단 잔기이다.
본 발명은 급성 후속혈관형성술 교합, 체외 혈액순환-유발 혈구감소증, 전개성 심근증의 경색 및 후속 섬유소용해성 치료 교합의 치료에 있어서 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

삼관능성 항트롬빈 맞 항혈소판 펩티드{Trifunctional Antithrombin and Antiplatelet Peptides}
[발명의 분야]
본 발명은 유용한 항응고제 및 항혈소판제인 신규 펩티드에 관한 것이다.
[발명의 배경]
항응고제는 급성 심부정맥 혈전증, 폐동맥 색전증, 손발의 급성 동맥 색전증, 심근경색, 발작 및 산재된 혈관내 응고의 약리학상 치료에 있어서 유용한 치료제이다. 항응고제를 예방 투여하면 류마티스성 또는 동맥경화성 심장 질환 환자의 색전증의 재발이 예방되고, 외과 수술의 특정 혈전색전성 합병증이 예방되는 것으로 믿어진다. 또한, 항응고제를 투여하면 관상 동맥 및 모세혈관 질병이 치료되는 것으로 나타난다. 동맥 혈전증은 특히 심장근육 및 뇌에 공급하는 동맥에 있어서 사망의 선두적인 원인이 되고 있다.
혈소판 매개 동맥 혈전증은 상기 나열된 질병에 대해 중요한 병원성 메카니즘이다. 결과적으로, 항혈전증제의 고안에 유용한 시도로 혈소판 응집 및 트롬빈을 함께 억제하는 것이 제안 되었다. 피브리노겐이 Arg-Gly-Asp (RGD) 서열을 통해 인테그린(integrin) 족의 구성원인 활성화된 혈소판 당단백질 (GP) Ⅱb/Ⅲa 수용체에 결합하는 것은 다양한 동근에 의해 유도된 혈소판 응집의 필수적인 단계이다 [문헌:F. A. Marguerie, et al., J. Biol. Chem. 254, 5357-5363 (1979); D. Collen,et al., Thrombolysis in Cardiovascular Disease, D. Julian, et al., (eds), Marcel Dekker,fInc., New York (1989); pp45-67]. 상기 결합은 선형 및 고리형 RGD-함유 합성 펩타드에 의해 억제된다 [문헌: E. F. Plow, et al., Prog. Hemostas. Thromb. 9. 117-156(1989); E. F. Plow, et al., Proc. Natl. Acad., Sci., USA 82, 8057-8061(1985)].
최근 연구는 단일 하이브리드 펩티드 중 트롬빈 억제 및 혈소판 당단백질(GP)Ⅱb/Ⅲa (인테그린) 수용체 봉쇄의 조합 전략이 항응고제 및 항혈소판 활성 모두를 나타냄을 보여주고 있다 [문헌 F. C. Church 등, J. Bio1. Chem. 226, 11975-11979, 1991]. 또한, 최근에 촉매 위치 억제제 및 음이온 결합 외부위치 서열 억제제를 한데합한 펩티드 트롬빈 억제제가 개시되었다 [문헌: J. M. Maraganore, et al., Biochemistry, 29, 7095-7101(1990) 및 J. DiMaio, et al., J. Bio1. Chem., 265, 21698-21703 (1990)]. 상기 펩티드의 활성을 결정하는 중요한 특성은 적합한 길이의 공간자 (spacer)에 의해 트롬빈 활성위치 및 외부위치에 결합하는 2개의 구성성분을 분리시키는 것이다. 이들 연구는 촉매 위치 억제제 및 음이온 결합 외부위치 서열사이에 최소 4개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드가 최대 트롬빈 억제를 위해 필요하였다는 것을 보여주고 있다. 상기 보고는 트롬빈 상의 음이온-결합 외부위치에 결합된 히루딘 유사체의 NH2말단과 트롬빈의 촉매 주머니 중 Ser-195의 히드록실기 사이의 거리가 약 18-20Å임을 나타내는 교차 연결 연구로 부터의 결과를 지지하고 있다 [문헌: B. Furie, et al., J. Biol. Chem.,257, 3875-3882(1982) 및 W. Bode, et al., EMBO J., 8, 3467-3475(1989)].
1992년 6월 25일에 공개된 특허협력조약 출원 공개 제 WO 92/10575호는 혈소판 활성하 및 트롬빈 모두의 삼관능성 억제제를 구체적으로 기재하고 있다. 이들 억제제는 당단백질 Ⅱb/Ⅲa 억제 부분 및 트롬빈의 활성 위치에 결합하여 억제시키는 촉매 위치 배향 부분을 포함하는 트롬빈 억제 부분을 포함한다. 촉매 위치 배향 부분은 길이 계산치가 약 18Å 및 42Å인 기본 골격사슬을 갖는 연결자(linker) 부분을 통해 음이온 결합 외부위치 관련 부분에 결합된다.
본 발명의 출원인은 트롬빈 촉매 위치 억제제 (예, (D)Phe-Pro-Arg 또는 이들의 유사체)가 고리형 Arg-Gly-Asp-X "다리화" 서열을 통해 음이온 결합 외부위치 관련 부분 (히루딘55-65유사체)에 커플링될 때, 트롬빈 촉매 위치 억제 및 음이온 결합 외부위치 억제와 혈소판 당단백질 (GP) Ⅱb/Ⅲa 수용체 억제를 결합시킨 삼관능성 펩티드가 얻어짐을 발견하였다. 더우기, 펩티드의 혈소판 응집 및 항응고 활성의 억제의 확실한 증가는 트롬빈 촉매 위치 억제제를 히루딘55-65유사체에 결합시키는 이황화물 결합을 제공하는 시스테인 잔기가 (D)배열일때 나타난다. 추가의 증가는 노르루이신이 고리형 Arg-Gly-Asp-X "다리화" 서열 중의 페닐알라닌으로 치환될 때 나타난다. 이들 신규의 화합물 군은 작용 및 증가된 잠재성의 이중 모드로 인해 유용한 부가적인 치료를 제공한다.
[발명의 요약]
다음 일반식 (1)의 화합물 또는 그의 제약학상 허용 가능한 염은 유용한 항응고제이다.
X - A - B - C - Y (1)
상기 식 중,
X는 수소, 탄소 원자수 1 내지 6의 1 또는 2개의 알킬기, 탄소 원자수 2 내지 10의 1 또는 2개의 아실기, 카르보벤질옥시, H2NC(=NH)-, 또는 t-부틸옥시 카르보닐기로부터 선택된 아미노 말단 잔기이며,
A는 다음 일반식 (2)의 펩티드 유사체이며,
A1- A2- A3(2)
(여기서,
A1은 (D)Phe, (D)Phg, (D)1-Tiq, (D)3-Tiq, N-Me-(D)Phe, (D)Cha, (D)Chg, (D)Nag, 또는 (D)Thg이며;
A2는 Pro, Pip, 또는 Azt이며;
A3은 Arg, Lys, Orn, 또는 hArg임)
B는 다음 일반식 (3) 또는 (4)의 펩티드 유사체이며
또는
(여기서,
B1은 Gly, Ala, (D)Ala, Val, (D)Val, 또는 Gly-Gly이며;
B2는 Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly 또는 임의의 (D) 아미노산이며;
B2' 는 Arg-Ile-Pro 또는 Lys-Ile-Pro이며;
B3은 Arg, hArg, N-Me-Arg 또는 Lys이며;
B4는 Nle, Phe, Met 또는 Cha임)
C는 다음 일반식 (5)의 펩티드 유사체이며,
Asp-C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9(5)
(여기서,
C1은 Phe, pClPhe, pNO2Phe, Tha, Npa, Tyr 또는 Trp 이며;
C2는 Glu 또는 Asp이며;
C3은 임의의 아미노산이며;
C4는 Ile, Val, Leu 또는 Phe이며;
C5는 Pro, Hyp, Sar, NMePgl 또는 D-Ala이며;
C6은 임의의 아미노산이며;
C7은 임의의 아미노산이며;
C8은 Tyr, Glu, Pro, A1a-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu 및 Ala-Tyr이며;
C9는 결합 또는 Glu, (D)Glu, Gln, Pro, Leu-Gln, Asp-Glu, 또는 Leu-Pro임)
Y는 OH, C1-C6알콕시, 아미노, 모노- 또는 디-(C1-C4)알킬 치환된 아미노, 또는 벤질아미노로부터 선택된 카르복시 말단 잔기이다.
또한, 본 발명은 급성 혈관형성술 후 폐색, 체외 혈액순환 유발 혈구감소증, 발달성 심근경색 및 섬유소용해 처치 후 폐색의 치료에 있어서 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
다음의 아미노산 및 아미노 및 카르복시 말단기의 통상적인 약어가 본 명세서 전반에 걸쳐서 사용되고 있다.
Gly(또는 G) - 글리신 Ala(또는 A) - 알라닌
Va1(또는 V) - 발린 Leu(또는 L) - 루이신
Ile(또는 I) - 이소루이신 Pro(또는 p) - 프롤린
Phe(또는 F) - 페닐알라닌 Trp(또는 W) - 트립토판
Ser(또는 S) - 세린 Met(또는 M) - 메티오닌
Thr(또는 T) - 트레오닌 Cys(또는 C) - 시스테인
Tyr(또는 Y) - 티로신 Gln(또는 Q) - 글루타민
Asn(또는 N) - 아스파라긴 Asp(또는 D) - 아스파르트산
Glu(또는 E) - 글루타민산 Lys(또는 K) - 리신
Arg(또는 R) - 아르기닌 His (또는 H) - 히스티딘
Nle - 노르루이신 Chg - 시클로헥실글리신
Cha - 베타-시클로헥실-알라닌
Pip - 피페콜산, 피페콜린산 또는 2-피페리딘 카르복실산
Azt - 2-아제티딘 카르복실산 Orn - 오르니틴
hArg - 호모아르기닌 N-Me-Arg - N-메틸아르기닌
N-Me-(D)Phe - N-메틸-D-페닐알라닌 Thg - 3-티에닐글리신
Nag - 나프틸글리신
1-Tiq - 1, 2, 3, 4,-테트라히드로이소퀴놀린-1-카르복실산
3-Tiq - 1, 2, 3, 4,-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산
Phg - 페닐글리신 pClPhe - 파라-클로로-페닐알라닌
pNO2Phe - 파라-니트로-페닐알라닌
Tha - 3-(2-티에닐-알라닌) Npa - 베타-(2-나프틸)알라닌
Hyp - 히드록시프롤린 Sar - 사르코신 (N-메틸글리신)
N-Me-Phg - N-메틸-페닐글리신 Pen - 페니실아민
2개 이상의 아미노산이 조합되어 펩티드를 형성할때, 물 원소가 제거되고 남은 각각의 아미노산을 본 명세서에서는 잔기라 칭한다. 따라서, "잔기"는 말단 아미노기의 수소 원자가 부족하고(거나) 말단 카르복실기의 히드록실기가 부족한 아미노산이다. 공인된 용어를 사용함에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체에 대한 3자코드 앞의 대시(수소의 손실을 나타냄) 및/또는 뒤의 대시(히드록실의 손실을 나타냄)는 잔기를 나타낸다.
Cys' 잔기는 일반식 (5)로 나타냈으며, 이것은 R기의 곁사슬 중에 황화물 부분이 없는 시스테인 잔기를 예시한다, 일반식 (3) 및 (4) 중에 예시한 바와 같이, (D)Cys' 잔기는 이황화물 결합을 통해 연결되어 있다. 이황화물 부분은 다음 일반식(6)에 예시한 바와 같이 (D)Cys' 잔기의 메틸렌 부분을 통해 (D)Cys' 잔기에 결합되어 있다.
일반식 (5) 및 (6)은 통상 D- 또는 L- 잔기 중 하나이다.
다음의 다양한 보호기 약어가 본 명세서를 통해 사용되고 있다.
Boc = t-부틸옥시카르브닐 Bzl = 벤질
Mbz = p-메틸-벤질 Chx = 시클로헥실
Tos 또는 토실 = p-톨루엔술포닐 Cbz = 카르보벤질옥시
BrZ = 브로모벤질옥시카르보닐 Suc = 숙시닐
Ac = 아세틸 PAM = 페닐아세트아미도메틸
알킬기 및 알콕시기의 알킬 부분으로는 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 알킬기, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 시클로펜틸, 헥실, 이소헥실, 시클로헥실 및 시클로펜틸메틸이 있다. 2 내지 10 탄소 원자의 아실기로는 기 당 1 또는 2개의 카르보닐 부분을 갖는 직쇄, 분지쇄, 고리형의 포화 및 불포화 아실기, 예를 들면 아세틸, 벤조일 숙시닐, 말레일 및 글루타릴이 있다. 할로겐 기는 플루오로, 클로로, 브르모 또는 요오도 기이다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "임의의 아미노산"이란 용어는 천연 아미노산 뿐만 아니라 천연 펩티드의 합성 유사체를 제조할때 펩티드 화학 분야의 기술자들에 의해 통상적으로 사용된 기타 "비단백질" 알파-아미노산을 포함한다. 천연 아미노산의 예로서는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 프롤린, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민산, 글루타민, 아르기닌, 오르니틴 및 리신을 들 수 있다· "비단백질" 알파-아미노산의 예로서는 노르루이신, 노르발린, 알로이소루이신, 호모아르기닌, 티아프롤린, 탈수소프롤린, 히드록시프롤린(Hyp), 호모세린, 시클로헥실글리신(Chg), 알파-아미노-n-부티르산(Aba), 시클로헥실알라닌(Cha), 아미노페닐부티르산(Pba), 페닐 부분의 오르토-, 메타-, 또는 파라 위치에 1 또는 2개의 다음의 기들, 즉 (C1-C4) 알킬, (C1-C4) 알콕시, 할로겐 또는 니트로 기에 의해 치환되거나 또는 메틸렌디옥시 기에 의해 치환된 페닐알라닌, 베타-2- 및 3-티에닐알라닌, 베타-2- 및 3-푸라닐알라닌, 베타-2-, 3- 및 4-피리딜알라닌, 베타-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌, 베타-(1- 및 2-나프틸)알라닌, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 O-알킬화 유도체, S-알킬화 시스테인, 티로신의 O-황산염 에스테르, 3,5-디요오도티로신 및 천연 발생 아미노산의 D-이성질체를 들 수 있다.
천연 아미노산은 글리신은 예외이지만 키랄 탄소 원자를 함유하고 있다. 다른 특별한 지시가 없는한 광학 활성 아미노산은 본 명세서에 언급된 바와 같이 L-배열을 가진다. R 치환체를 함유하는 탄소 원자의 입체화학은 D- 또는 L-배열 중하나이다. 본 명세서의 목적상 D-배열의 아미노산은 D-아미노산, (D)아미노산 또는 계를 칭하는 단일 글자를 사용할때 단축된 글자로서 묘사될 수 있으며, 예를들면 D-페닐알라닌, D-Phe, (D)Phe 또는 f가 허용 가능한 표시 방법이다. 통상적인 사용에서와 같이 본 명세서에 기재된 펩티드 구조는 아미노 말단이 사슬의 좌측상에 존재하며, 카르복시 말단이 사슬의 우측에 존재한다.
일반식 (1)의 폴리펩티드는 임의의 비독성, 유기 또는 무기산과 함께 제약학상 허용 가능한 산부가염을 형성할 수 있다. 적합한 산부가염을 형성하는 무기산의 예로서는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 및 산금속염, 예를 들면 오르토인산일수소나트륨 및 황산수소칼륨을 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 유기산의 예로서는 모노-, 디-, 및 트리카르복실산을 들 수 있다. 이러한 산의 예로서는 아세트산, 트리플루오로아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 히드록시 말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산 및 술폰산, 예를 들면 메탄술폰산 및 2-히드록시에탄 술폰산을 들 수 있다. 카르복시 말단 아미노산 잔기의 염으로는 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기로 형성된 비독성 카르복실산 염을 들 수 있다. 상기 염들의 예로서는 알칼리 금속, 예를 들면 나트륨 및 칼륨; 알칼리 토금속, 예를 들면 칼슘 및 마그네슘; 알루미늄을 포함한 ⅢA족 경금속; 및 유기 1차, 2차 및 3차 아민, 예를 들면 트리에틸아민을 포함한 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N' -디벤질에틸렌디아민, 디히드로아비에틸아민, N-(저급)알킬피페리딘 및 임의의 기타 적합한 아민의 염을 들 수었다.
일반식 (1)의 화합물은 단일 하이브리드 펩티드 중에 트롬빈 억제제와 혈소판 당단백질 (GP) Ⅱb/Ⅲa 수용체의 길항질이 배합된 신규 펩티드이다. 본 발명의 펩티드는 각각 언결 "다리" 및 혈소판 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체의 길항질로서 고리형 RGD-X 서열을 함유하는 연결자 부분(즉, 부분 B)을 통해 트롬빈의 음이온 결합 외부위치 억제제 (즉, 부분 C)에 결합된 트롬빈의 촉매 위치 억제제 (즉, 부분 A)를 함유한다.
부분 A는 트롬빈의 촉매 위치 배향 억제제를 나타낸다. 상기 촉매 위치 배향 부분은 트롬빈의 활성 위치에 결합하여 트롬빈의 단백질 분해 활성을 억제 또는 지연시킨다. 부분 C는 음이온 결합 외부위치 관련 부분으로서 특징지워지는 트롬빈 억제제를 설명하고 있다. 부분 C의 순열은 구조적으로 히루딘의 카르복시 말단 부분과 유사하기 때문에, 부분 C는 트롬빈 상의 음이온 결합 외부위치에 용이하게 결합되는 것으로 보인다.
부분 B는 2개의 관능 부분 -- 촉매위치 억제제 (부분 A)와 음이온 결합 외부위치 억제제 (부분 C) 사이의 연결 "다리" 및 고리형 RGD-X 당단백질 Ⅱb/Ⅲa 억제제 부분을 함유한다. 촉매 위치 억제제 (부분 A) 및 음이온 결합 외부위치 억제제 (부분 C) 사이의 연결 "다리"는 고리형 RGD-X 서열의 기초이다. B1부분, Pro, (D)Cys' 및 부분 B의 2개의 (D)Cys' 잔기를 연결하는 이황화물 결합을 함유하는 상기 다리는 촉매 위치 억제제 서열과 음이온 결합 외부위치 인식 서열 사이에서 적절한 공간자로서 작용하는 것으로 믿어진다. 연결 "다리"는 B1과 A3부분 사이에 프롤린 잔기를 함유하는데, 그 이유는 A3및 Pro 사이의 천연 이미드 결합이 기타 아미노산 잔기의 아미드 결합보다 훨씬 낮은 속도로 분할되기 때문이다. 비록 본 발명은 하기 이론에 구속받지는 않지만, 이미드 결합의 존재는 촉매 위치 배향 부분의 억제 효과를 설명한다는 것은 이론화 되어 있다. 물론, 다른 아미드 결합 대체 아미노산은 관능성 등가물, 예를 들면 환원 아미드, 에스테르, 케톤 및 술피드로서 작용하는 것으로 여겨진다.
부분 B의 고리형 RGD-X 당단백칠 Ⅱb/Ⅲa 억제제 부분, 즉 부분 B의 2개의 D-Cys 잔기 사이의 아미노산 잔기는 피브리노겐 및 그의 수용체인 당단백질 Ⅱb/Ⅲa 사이의 상호작용을 억제한다. 부분 B의 고리형 RGD-X 당단백질 Ⅱb/Ⅲ 억제제 부분은 일반식 (3) 및 (4)에 구체화된 바와 같이 아미노산 6 내지 11개를 함유한다. 바람직하게는, 부분 B의 고리형 RGD-X 당단백질 Ⅱb/Ⅲa 억제제 부분은 일반식 (3)이며, 일반식 (3)에 구체화된 바와 같이 아미노산 6 내지 9개를 함유한다.
본 발명의 목적을 위해서, A1은 아미노 말단 부분 (X)에 결합되는 반면에 A3은 N-말단 또는 부분 B의 좌측에 위치하는 Pro 잔기에 결합되는 것으로 이해해야 한다. N-말단 또는 부분 C의 좌측에 위치하는 Asp 잔기는 C-말단 또는 부분 B의 우측에 위치하는 B1잔기에 결합된다.
임의의 일반적인 화합물군에서와 같이, 특정 군이 바람직하다. 본 발명자들은 X는 수소, 아세틸, 숙시닐 또는 t-부틸옥시 카르보닐기이며;
A1은 (D)Phe, (D)Chg, (D)Cha, (D)Phg, (D)1-Tiq, (D)3-Tiq 또는 N-Me-(D)Phe이며;
A2는 Pro이며;
A3은 Arg 또는 Lys이며;
B는 상기 일반식 (3) 또는 (4)이며;
B1은 Gly, Ala, 또는 Gly-Gly이며;
B가 일반식 (3)인 경우 B2는 Gly, Gly-Gly 또는 임의의 (D) 아미노산이며;
B가 일반식 (4)인 경우 B2'는 Arg-Ile-Pro 또는 Lys-Ile-Pro이며;
B3은 Arg 또는 N-Me-Arg이며;
B4는 Nle, Phe, Cha, Met이며;
C1은 Phe, Npa 또는 Tyr이며;
C2는 Glu 또는 Asp이며;
C3은 임의의 아미노산이며;
C4는 Ile 또는 Val이며;
C5는 Pro, Hyp 또는 (D)Ala이며;
C6은 임의의 아미노산이며;
C7은 Glu, Asp 또는 Ala이며;
C8은 Tyr, Glu, Tyr-Leu, Tyr-Cha 또는 Ala-Cha이며;
C9는 결합, (D)Glu, Glu, Gln, Leu-Gln 또는 Leu-Pro이며;
Y는 OH, C1-C6알콕시 또는 모노- 또는 디-(C1-C4)알킬 치환 아미노인 일반식 (1)의 펩티드 유도체를 선호한다. 또한
X가 수소, 아세틸, 또는 t-부틸옥시 카르보닐 기이며;
A1은 (D)Phe,(D)Phg,(D)3-Tiq 또는 N-Me-(D)Phe이며;
A2는 Pro이며;
A3은 Arg이며;
B는 상기 일반식 (3) 또는 (4)이며;
B1은 Gly이며;
B가 일반식 (3)인 경우 B2는 Gly,(D)Tyr,(D)Val,(D)Thr 또는 (D)Pro이며;
B가 일반식 (4)인 경우 B2'는 Arg-Ile-Pro이며;
B3은 Arg 또는 N-Me-Arg이며;
B4는 Nle 또는 Phe이되, 단 B2가 (D)Tyr,(D)Val,(D)Thr 또는 (D)Pro인 경우 B4는 Nle이며;
C1은 Phe 또는 Tyr이며;
C2는 Glu이며;
C3은 Glu 또는 Pro이며;
C4는 Ile이며;
C5는 Pro 또는 (D)Ala이며;
C6은 Glu 또는 Ala이며;
C7은 Glu이며;
C8은 Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha 또는 Ala-Cha이며;
C9는 결합 또는 (D)Glu이며;
Y는 OH, C1-C6알콕시 또는 모노- 또는 디-(C1-C4)알킬 치환 아미노인 일반식 (1)의 화합물도 바람직하다. 특히,
X가 수소, 아세틸 또는 t-부틸옥시 카르보닐기이며;
A1은 (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq 또는 N-Me-(D)Phe이며;
A2는 Pro이며;
A3은 Arg이며;
B는 상기 일반식 (3)이며;
B1은 Gly이며;
B2는 Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr 또는 (D)Pro이며;
B3은 Arg이며;
B4는 Nle 또는 Phe이되, 단 B2가 (D)Tyr,(D)Val,(D)Thr 또는 (D)Pro인 경우 B4는 Nle이며;
C1은 Phe이며;
C2는 Glu이며;
C3은 Pro이며;
C4는 Ile이며;
C5는 Pro이며;
C6은 Glu 또는 Ala이며;
C7은 Glu이며;
C8은 Tyr, Tyr-Cha 또는 Ah-Chaㅇ1며;
C9는 결합 또는 (D)Glu이며;
Y는 OH 또는 C1-C6알콕시인 일반식 (1)의 펩티드 유도체가 바람직하다·
본 발명의 펩티드는 당분야의 숙련된 기술자에게 공지된 다양한 공정에 의해쉽게 제조될 수 있다. 상기 공정으로는 자동 펩티드 합성기의 사용과 같은 공인된자동화 방법을 사용하여 행할 수 있는 고체상 서열 공정이 있지만 이것에만 한정되는 것은 아니다. 상기 공정에 있어서, 알파-아미노 보호 아미노산은 수지 지지체에 결합되어 있다. 사용된 수지 지지체는 당분야에서 폴리펩티드의 고체상 제조에 통상적으로 사용되는 임의의 적합한 수지, 바람직하게는 0.5 내지 약 3% 디비닐 벤젠과 가교 결합되어 있으며 클로로메틸화 또는 히드록시메틸화되어 초기 도입된 알파-아미노 보호 아미노산과 에스테르를 형성하는 위치를 제공하는 폴리스티렌일 수 있다.
히드록시메틸 수지의 예는 문헌 [Bodanszky 등, Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966)]에 기재되어 있다. 클로로메틸화 수지는 제품으로 시판되고 있고(Bio Rad Laborato7, Richmond, California), 상기 수지의 제법은 문헌[Stewart 등, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Chapter 1, pp. 1-6]에 기재되어 있다. 보호 아미노산은 문헌[Gisin, Helv. Chem. Acta. 56, 1476 (1973)]의 공정에 의해 상기 수지에 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 카르복시 말단이 (D)Glu 잔기인 폴리펩티드를 제조하기 위해서는 Boc-D-Glu(Bzl)을 약 50℃에서 세슘염으로서의 클로로메틸화 폴리스티렌에 저플링시킨다.
알파-아미노산을 수지 지지체에 커플링시킨 다음 보호기를 적합한 방법, 예를 들면 염화메틸렌 중 트리플루오로아세트산, 트리플루오로아세트산 단독 또는 디옥산 중 HCl을 사용하여 제거시킨다. 0 ℃ 내지 실온 사이의 온도에서 탈보호 반응을 수행한다. 다른 표준 분할제(cleaving agent) 및 특정 알파-아미노 보호기의 제거 조건이 사용될 수 있다. 알파-아미노 보호기를 제거시킨 후 다른 알파-아미노 보호된 아미노산을 목적하는 바람직한 순서를 따라서 단계적으로 커플링시킨다. 별법으로는 다증 아미노산기를 용액 방법에 의해 커플링시킨 후 수지 지지된 아미노산 서열과 커플링시킬 수 있다.
폴리펩티드 서열에 도입된 각각의 아미노산과 함께 사용된 알파-아미노 보호기는 당분야에 공지된 임의의 보호기일 수 있다. 알파-아미노 보호기 군의 예로서는 (1) 아실형 보호기, 예를 들면 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 톨루엔술포닐(토실), 벤젠술포닐, 니트로페닐술페닐, 트리틸술페닐, o-니트로페녹시아세틸 및 알파-클로로부티릴; (2) 방향족 우레탄형 보호기, 예를 들면 벤질옥시카르보닐 및 치환 벤질옥시카르보닐, 예를 들면 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p- 메톡시벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐릴)-1-메틸에톡시카르브닐, 알파, 알파-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐 및 벤즈히드릴옥시카르보닐; (3) 지방족 우레탄 보호기, 예를 들면 t-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐; (4) 시클로알킬 우레탄형 보호기, 예를 들면 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐; (5) 티오 우레탄형 보호기, 예를 들면 페닐티오카르보닐; (6) 알킬형 보호기, 예를 들면 트리페닐메틸 (트리틸) 및 벤질; 및 (7) 트리알킬실란기, 예를 들면 트리메틸실란을 들 수 있다. 바람직한 알파-아미노 보호기는 t-부틸옥시카르보닐이다.
적당한 커플링제의 선택은 당 분야의 기술내에 속한다. 첨가되는 아미노산이 Gln, Asn 또는 Arg인 경우에 특히 적합한 커플링제는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸이다. 상기 시약을 사용하면 니트릴 및 락탐의 형성을 방지한다. 다른 커플링제의 예로서는 (1) 카르보디이미드 (예, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-에틸-N'(γ-디메틸아미노프로필카르보디이미드); (2) 시아나미드, (예, N,N-디벤질시아나미드); (3) 케텐이민; (4) 이속사졸륨 염(예, N-에틸-5-페닐-이속사졸륨-3'-술포네이트); (5) 고리 중에 1 내지 4개의 질소를 함유하는 방향족 특성의 일고리형 질소 함유 헤테로고리형 아미드, 예를 들면 이미다졸리드, 피라졸리드 및 1,2,4-트리아졸리드를 들 수 있다. 유용한 특정 헤테로고리형 아미드의 예로서는 N, N'-카르보닐디이미다졸 및 N, N-카르보닐-디-1,2,4-트리아졸; (6) 알콕실화 아세틸렌 (예, 에톡시아세틸렌); (7) 아미노산의 카르복실 부분과 함께 혼성 무수물 (예, 에틸클로로포르메이트 및 이소부틸클로로포르메이트)을 형성하거나 또는 커플링하고자 하는 아미노산의 대칭성 무수물 (예, Boc-Ala-O-Ala-Boc)을 형성하는 시약 및 (8) 1개의 고리 질소 상에 히드록시기를 갖는 질소 함유 헤테로고리형 화합물 (예, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시숙신이미드 및 1-히드록시 벤조트리아졸)을 들 수 있다. 다른 활성화제 및 펩티드 커플링에서의 이들의 용도는 문헌[Kapoor, J. Phann. Sci.,59, pp. 1-27 (1970)]에 기재되어 있다. 본 발명자들은 Arg, Asn 및 Gln을 제외한 모든 아미노산에 대한 커플링제로서 대칭성 무수물의 사용을 선호한다.
각각의 보호 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 2 내지 4배 과량으로 고체상반응기에 도입된다. 커플링은 디메틸포름아미드:염화메틸렌 (1:1)의 매질 또는 디메틸포름아미드 단독 또는 염화메틸렌 단독 중에서 수행한다. 불완전 커플링이 발생하는 경우, 알파-아미노 보호기를 제거하기 전에 커플링 공정을 반복한 후 다음 아미노산을 고체상 반응기 중에서 커플링시킨다. 각 합성 단계에서 성공적인 커플링 반응은 문헌 [E. Kaiser 등, Analyt. Biochem. 34, 595 (1970)]에 기재된 바와 같이 닌히드린 반응으로 모니터한다.
목적하는 아미노산 서열을 얻은 후에, 펩티드는 당분야에 공지된 조건하에서 수지로부터 제거한다. 예를 들면, 이는 수지 결합 폴리펩티드를 무수 불소화수소산 중 5% 아니졸 용액으로 처리함으로써 성취될 수 있다.
고체상 펩티드 합성 분야에 공지된 바와 같이, 다수의 아미노산은 사슬이 형성되는 동안에 보호가 요구되는 관능기를 함유하고 있다. 적합한 보호기의 사용 및 선택은 당분야의 숙련된 기술자의 능력내에 속하며, 보호하고자 하는 아미노산 및 펩티드 상의 다른 보호 아미노산 잔기의 존재에 의존한다. 이러한 측쇄 보호기의 선댁은 알파-아미노 부분의 보호기의 분할 동안에 제거되지 않는 것이어야만 한다는 점에서 중요하다. 예를 들면, 아스파르트산 및 글루탐산의 카르복실성 히드록시기는 벤질 또는 시클로헥실기에 의해 보호될 수 있다. 바람직한 보호기는 벤질이다.
상기 기들은 당분야에 공지된 공정에 의해 제거될 수 있다. 통상적으로, 보호기제거는 펩티드 사슬 합성이 완결된 후에 수행한다. 예를 들면, 펩티드는 무수 불소화수소산 중 5% 아니졸 용액으로 처리함으로써 수지로부터 펩티드의 제거와 동시에 탈보호된다. 보호기는 또한 다른 적절한 시간에 제거될 수 있다.
본 발명의 펩티드 유사체의 항응고제 및 항혈소판 투여량은 환자, 치료하고자하는 트롬빈 질병의 경중 및 선택된 펩티드 유사체에 의존하여 하루 당 환자 체중의 0.2 mg/kg 내지 250mg/kg이다. 구체적인 환자에 대한 적합한 투여량은 용이하게 결정할 수 있다. 바람직하기로는, 하루 1 내지 4회 투여량을 통상적으로 투여 당 활성 화합물의 5 내지 10Omg으로 투여할 수 있다.
항응고성 치료는 존재하는 응괴를 용해시킴으로써 다양한 트롬빈 질병, 구체적으로는 관상동맥 및 뇌혈관 질명의 치료 및 예방 뿐만 아니라 예를 들면 관상 폐색의 치료를 나타낸다. 항혈소판 치료는 심근경색 및 발작 재발의 예방을 나타낸다. 당분야의 숙련된 기술자는 항응고제 및 항혈소판 치료에 요구되는 조건을 쉽게 인식한다. 본 발명의 펩티드는 혈관형성술에 이은 관상 혈전증의 예방, 체외순환 동안에 혈소판 감소증의 예방, 섬유소용해성 치료후 폐색 및 진행되는 심근경색의 정지 또는 지연에 특히 유익하다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "환자"란 용어는 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 생쥐를 포함한 영장동물과 같은 포유동물을 의미한다.
비록 약간의 펩티드 유도체가 경구 투여후 소화관 통과 중에서 잔존할 수 있을지라도, 본 발명자들은 비경구성 투여, 예를 들면 피하투여, 정맥투여, 근육내투여 또는 복강내 투여; 디폿 주사(depot injection)에 의한 투여; 임플란트 제조에 의한 투여; 또는 점막, 예를 들면 코의 점막, 목 및 기관지관에 대한 투여, 예를 들면 본 발명의 펩티드 유도체를 스프레이 또는 건식 분말 형태로 함유하는 에어로졸 깡통에의한 투여를 선호한다.
비경구 투여를 위해서, 화합물은 계면활성제 및 다른 제약학상 허용 가능한 부형제를 포함하거나 포함하지 않고, 생리학상 허용 가능한 희석제 중의 화합물과 물 및 오일과 같은 멸균 용액일 수 있는 제약학상 담체의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 상기 제조에 사용될 수 있는 오일의 예로서는 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유, 예를 들면 땅콩유, 대두유 및 광유를 들 수 있다. 통상, 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 당 용액, 에탄올 및 글리콜, 예를 들면 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 특히 주사 가능한 용액을 위한 바람직한 액상 담체이다.
제 1도는 쥐에 있어서 FeCl3동맥 폐색 시간에 대한 펩티드 2의 효과를 막대그래프로서 나타낸다. 대조는 빗금을 안친 막대기로 나타내는 반면에, 펩티드 2는 빗금친 막대기로 나타낸다. 본 도면에서 p는 확률을 나타내며, n은 시험한 동물수를 나타낸다.
제 2도는 쥐에 있어서 FeCl3동맥 폐색 시간에 대한 펩티드 2d(본 발명이 아님)의 효과를 막대그래프로서 나타낸다. 대조는 빗금을 안친 막대기로 나타내는 반면에, 펩티드 2d는 빗금친 막대기로 나타낸다. 본 도면에서 p는 확률을 나타내며, n은 시험한 동물수를 나타낸다.
제 3도는 트롬빈 증폭 전혈 응집에 대한 펩티드 1의 효과를 나타낸다. (▲)은 인간 혈액 시료를 나타낸다. (+)는 쥐의 혈액 시료를 나타낸다.
제 4도는 마취된 개에 있어서 트롬빈 시간에 대한 펩티드 1 주입의 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노ahf/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 5도는 마취된 개에 있어서 aPTT 대한 펩티드 1의 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 6도는 개에 있어서 트롬빈-혈소판 응집에 대한 펩티드 1 주입의 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 7도는 마취된 개에 있어서 출혈 시간에 대한 펩티드 1의 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 8도는 마취된 개에 있어서 혈소판 수에 대한 펩티드 1의 주입 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 9도는 마취된 개에 있어서 평균 혈압에 대한 펩티드 1의 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 10도는 마취된 개에 있어서 심장 박동율에 대한 펩티드 1의 주입 효과를 나타낸다. (▲)은 5 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (+)는 1 나노몰/kg/분 속도를 나타낸다. (■■)은 주입 시간을 나타낸다.
제 11도는 쥐에 있어서 FeCl3동맥 폐색 시간에 대한 펩티드 1의 효과를 막대그래프로서 나타낸다. 대조는 빗금을 안친 막대기로 나타내는 반면에, 펩티드 1은 빗금친 막대기로 나타낸다. 본 도면에서 p는 확률을 나타내며, n은 시험한 동물수를 나타낸다.
실시예 1 - 12는 일반식 (1)의 펩티드의 대표적인 합성법을 나타낸다. 이들 실시예들은 단지 예시적인 것이며, 본 발명을 어떠한 방법으로든지 한정시키려는 의도는 없다. 실시예 1-12에 대한 시약 및 출발 물질은 당분야의 통상의 기술자가 용이하게 입수할 수 있다. 실시예 1-12에 사용된 바와 같이, 다음의 용어는 정의된 의미를 나타낸다. "DCM"은 디클로로메탄을 나타내며, "DIEA"는 디이소프로필에틸아민을 나타내며, "MeOH"는 메탄올을 나타내며, "DCC"는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 나타내며, "DMF"는 N,N'-디메틸포름아미드를 나타내며, "HOBt"는 1-히드록시벤조트리아졸을 나타내며, "TFA"는 트리플루오로아세트산을 나타내며, "eq."는 당량을 나타내며, "meq"는 밀리당량을 나타내며, "g"는 그람을 나타내며, "mg"는 밀리그람을 나타내며, "nmol"은 밀리몰을 나타내며, "mL"은 밀리리터를 나타내며,"℃"는 섭씨온도를 나타내며, "TLC"는 박막 크로마토그래피를 나타내며, "Rf"는 체류 인자를 나타내며, "μL"은 마이크로리터를 나타내며, "μg"는 마이크로그람을 나타내며, "μM"은 마이크로몰을 나타내며, "mmHg"는 수은의 밀리미터를 나타내며, "δ"는 테트라메틸실란으로부터 백만 당 1부의 다운 필드를 나타낸다.
실시예 1
다음 화합물의 제조 방법.
Boc-(D)Glu(Bz1)-Pam-수지(Peninsula Laboratories, Belmont, CaliLrnia)를 다음의 방법에 따라서 듀폰 250(Dupont 250) 반자동화 펩티드 합성기를 사용하여후속 Boc-아미노산의 단계적 탈보호 및 커플링에 의해 연장시켰다.
모든 Boc-아미노산은 2배 과량으로 미리 형성된 대칭성 무수물로서 커플링되며, 예의적으로 Arg는 4배 과량으로 HOBt 에스테르로서 커플링하였다. 대칭성 무수물은 다음과 같이 제조하였다.
Boc-아미노산 (4 eq)을 DCM 중에 용해시킨 후, 0.5M DCC/DCM (2 eq)을 첨가하였다. 반응물을 5분 동안 교반시켰다. 대칭성 무수물이 형성되어 디시클로헥실우레아가 침전되었으며, 이것을 여과에 의해 제거시켰다. 이어서, 여액을 펩티드 수지에 첨가하고, 커플링 혼합물을 동부피의 DMF로 희석시켰다.
Arg의 HOBt 에스테르를 유사하게 형성시켰다. Boc-Arg(Tos) (4 eq)를 DCM중에 용해시켰다. 0.5M HOBt/DMF (4 eq) 및 0.5M DCC/DCM (4 eq)를 첨가하였다. 여과에 의해 디쿨로로헥실우레아를 제거하고, 여액을 펩티드 수지에 첨가하고, 커플링 혼합물을 동부피의 DMF로 희석시켰다.
커플링시킨후, 당분야에 공지된 카이저 닌히드린 공정(Kaiser′s ninhydrin procedure)을 사용하여 임의의 유리 아민의 존재에 대해 펩티드 수지를 시험하였다·아미노산은 필요에 따라 재커플링시켰다.
다음의 방법을 따라서, Boc-D-Glu(Bzl)-Pam-수지(8.06 g, 0.31 meq/gm, 2.5mmol, California. Belmont, Peninsula Laboratories사로부터 구입하였음)을 연장시켜서 펩티드-수지 (D)Phe1-Pro-Arg(Tos)-Pro-Gly5-(D)Cys(Mbz)-Gly-Arg(Tos)-Gly-Asp(Chx)10-Nle-Pro-(D)Cys(Mbz)-Gly-Asp(Chx)15-Tyr(BrZ)-Glu(Bzl)-Pro-Ile-Pro20-G1u(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-(D)Glu(Bzl)-Pam-수지(19.4 g, 펩티드 수지)를 얻었다. 다음 아미노산은 1몰 당량의 그의 대칭성 무수물에 의한 제2 커플링이 요구되었다: Boc-Cha24, Boc-Glu(Bzl)21, Boc-Tyr(BrZ)16, Boc-Asp(Chx)15, Boc-(D)Cys(Mbz)6, Boc-Pro4, Boc-Pro2및 Boc-(D)-Phe1. Boc-Arg(Tos)2의 커플링을 2배 과량의 HOBt 에스테르로 2회 반복하고, 이어서 아세트산 무수물: DIEA:DCM (10:5:85)로 캡핑(Capped)시켰다.
상기 제조한 펩티드수지
(D)-Phe1-Pro-Arg(Tos)-Pro-Gly5-(D)Cys(Mbz)-Gly-Arg(Tos)-Gly-Asp(Chx)10-Nle-Pro-(D)Cys(Mbz)-Gly-Asp(Chx)15-Tyr(BrZ)-Glu(Bzl)-Pro-Ile-Pro20-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-(D)Glu(Bzl)-Pam-수지를 5 부분으로 나누었다. 각각의 부분을 다음의 조건하에서 분할, 탈보호 및 고리화시켰다. 펩티드 수지(3.88 g)을 아니졸(5%) 존재하에 무수 불화수소산(20 mL) 중에 현탁시켰다. 반응물을 약 0 ℃에서 약 30분 동안 교반시켰다. 이어서, 불화수소산을 진공하에 제거시키고, 잔기를 50 % 아세트산(2 x 10 mL), 아세트산(2 x 5 mL) 및 물(3 x 10 mL)로 추출시켰다. 합한추출물을 물로 희석하여 1 리터로 만들고, 수산화암모늄을 사용하여 pH를 8.5로 조절하였다. K3Fe(CN)6(1.0 M, 약 55 mL)를 황색이 잔존할 때까지 15분 동안에 걸쳐서 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 아세트산을 사용하여 pH를 4. 0으로 맞추었다. 음이온 교환 수지 (AG3 x 4A, Bio-Rad)를 첨가하고 황색이 없어질 때까지 교반시켰다. 수지를 여과에 의해 회수하고, 여액을 동결건조시켜서 조 펩티드를 얻었다.
조 펩티드를 50 % 아세트산 중에 용해시키고, 세파덱스(Sephadex) G-10 컬럼(2.5 x 70 cm)에 적용시켰다. 50 % 아세트산으로 약 10.5 mL/시의 속도로 용출시켰다. 펩티드를 약 70-150 mL에서 용출시켰다. 용출물을 물로 희석시키고, 동결건조시켜서 전체 6.17 g을 얻었다. 탈염된 물질을 베크만 프렙 350 시스템(Beckman Prep 350 system)을 사용하고 0.1 % 수성 TFA/아세토니트릴의 구배를 사용하여 약40 mL/분의 속도로 역상 조제 HPLC(Dynamax C18, 21.4 x 250 mm, Rainin)에 의해 추가로 정제하여 순수한 물질(1.3 g)을 얻었다.
실시예 2
실시예 3
실시예 4
실시예 5
실시예 6
실시예 7
실시예 8
실시예 9
실시예 10
실시예 11
실시예 12
생물학적 특성
상기한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 탁월한 트롬빈 억제 특성을 가지며, 이정맥 및 동맥 혈전증 뿐만 아니라 불안정한 협심증의 예방, 만성 혈관형성술 후에 갑작스런 혈관 폐쇄의 예방/ 혈전증의 보조 치료 및 정형외과 수술후 심부 정맥 혈전증에 대한 보조 치료에 유효한 항응고제임을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 또한 고리형 RGD-X 서열을 함유하고 있으며, 상기 서열은 부분 B의 연결 부분에 위치하고 있기때문에, 이들은 또한 혈소판 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체 길항질로서 작용한다.
실시예 2의 펩티드의 항응고성 및 항혈전증 효과
고리형 혈소판 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체 길항질(RGD-X)에 의해 히루딘55-65유사체에 커플링된 촉매 위치 트롬빈 억제제(fPR)를 포함하는 실시예 2(펩티드 2) (서열 번호: 2)의 펩티드를 이것의 개별적인 성분 펩티드와 비교하였다. 하기 실험 장비는 단지 제안에 그치며, 본 발명은 어떠한 방법으로든지 제한하려는 의도가 전혀 없음을 인지하여야 한다.
실험 동물
수컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 쥐(300-400 gm)를 스프라그 다울리 인크(Sprague Dawley, Inc., Indianapolis,IN 46229)로부터 구입 할 수 있으며, 본 연구에 사용하였다.
혈액 샘플링
혈액 시료를 3.8 % 트리소듐 시트레이트(1:10)를 함유하는 플라스틱 주사기 중에 주입할 수 있다. 혈장은 2,00O g-힘으로 10분 동안 원심분리에 의해 제조하였다. 시험관내 연구를 위한 정맥 혈액은 건강하고, 마약을 하지 않은 남성 자원자로부터 채취하였다.
응고 분석
활성화 부분적 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 결정은 데이드 다이아그노스틱스인크[Dade Diagnostics, Inc.(Aguada, Puerto Rico 00602)의 시약 및 방법을 사용하여 수행하였다. 쥐 혈장 0.1 ml를 37 ℃에서 0.1M Tris 완충 용액,(pH 7.5) 0.1 ml로 30초 동안 배양시킴으로써 트롬빈 응괴 시간을 결정하였다. 응고는 소 트롬빈(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO 63178) 용액(12 NIH 단위/ml) 0.1 ml로 개시하였다. 모든 응괴 시간은 MLA-Electra 750 자동 응고화 타이머(MLA,Inc. 제품:Pleasantville, NY 10570)를 사용하여 반자동으로 측정하였다. 응괴 시간 2배화에요구되는 농도(ID2)는 단순 선형회귀분석을 사용하여 계산하였다.
시험관내 혈소판 응집
인간 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 실온에서 200 g-힘으로 10분 동안 원심분리를행함으로써 제조하였다. 혈소판 빈약 혈장(PPP)을 2,O00 g-힘으로 10분 동안 원심분리에 의해 제조하였다. PRP를 플라스틱 실험실용 제품에만 노출시켰다. 모든 실험은 채취 3시간 내에 완결하였다. 혈소판 응집은 이중 채널 응집측정기(Chrono-log Corp. 제품, Harverstown, PA 19083)를 사용하여 광도법으로 측정하였다. 일백 퍼센트의 광투과율을 자동로거스(autologus) PPP로 정의하였다. 광투과율 중의 최대 변화율은 PRP에 이은 ADP(1 μM) 또는 트롬빈의 첨가로부터 결정하였다. 트롬빈 (0.2-2.0 단위/ml) 유도 혈소판 응집은 농도에 의존하였으며, 1/2 최대 농도는 억제 연구에 사용하였다. 펩티드 2(서열 번호: 2)를 PRP(0.45 ml)와 함께 30초 동안 배양시킨 후 ADP 또는 트롬빈을 첨가하였다. 응집은 전체 부피 0.5 ml 중에서 측정하였다. 억제성 반응은 대조 값과 비교할 때의 억제 비율로서 나타내었다. 응집의 50 % 억제를 나타내는 농도(IC50)는 단순 선형회귀분석에 의해 계산하였다.
쥐에 있어서 FeCl 3 동맥 혈전증 모델(생체내)
쥐에 있어서 펩티드 2(서열 번호: 2)의 생체내 항혈전증 효과를 또한 이용하여 평가하였다. 예를 들면, 펩티드 2(서열 번호: 2)는 문헌[R.J. Broersma, 등, Thromb. Res. 64, 405-412(1991)]에 따라 혈소판 의존 트롬빈 매개 FeCl3유발 쥐 경동맥 혈전증 모델에서의 항혈전증 활성에 대해 평가하였으며, 상기 참고 문헌은 본 명세서에 단지 참고로 기재하였다.
결과
본 연구 결과는 펩티드 2(서열 번호: 2)가 혈장 응고 및 혈소판 응집 분석에 었어서 항응고제 및 항트롬빈으로서 개별 성분보다 더욱 유력하다는 것을 보여주었다.
하기 표에 있어서 펩티드 서열내의 아미노산 잔기는 단일 글자 명명 시스템을 사용하여 명명하였으며, 약간의 변형된 아미노산 및/또는 보호기는 예외로 3글자 명명 시스템으로 괄호 안에 나타낼 수 있다. 또한,(D)Cys' 잔기들을 연결하는 이황화물 결합은 두개의 (D)Cys' 잔기 밑에 그린 선에 의해 나타내며, 모든 잔기들은 부분 B의 루프 부분 증에 존재한다.
표 I을 참고하여, 펩티드 2(서열 번호: 2)의 항응고 활성을 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 및 정상 인간 혈장 중의 트롬빈 시간의 분석에 있어서 각각의 성분-펩티드 2a(서열 번호: 3), 펩티드 2b(서열번호: 4), 펩티드 2c(서열 번호: 5) 및 펩티드 2d(서열 번호: 6)와 비교하였다. 펩티드 2a-2d(서열 번호: 3-6)는 본 발명이 아니었다. 펩티드 2(서열 번호: 2)는 각각 약 60 및 24 nM에서 aPTT 및 트롬빈 시간이 2배였다(ID2). 펩티드 2(서열 번호: 2)는 펩티드 2b(서열 번호: 4) 또는 펩티드 2d(서열 번호: 6) 보다 적어도 20배 더 활성이었으며(안정한 촉매 위치 억제제 Me-fPR), 반면에 펩티드 2c(서열 번호: 5)(fPRPG 펜타펩티드)는 훨씬 고농도에서 단지 항응고 활성만을 가졌다. 펩티드 2a(서열 번호: 3) (고리형 RGD-X 펩티드)는 항응고제로서 불활성이었다.
표II를 참고하여, 펩티드 2(서열 번호: 2)의 항응고 연구를 쥐 혈장 중에서 수행하였다. aPTT 및 트롬빈 시간에 대한 ID2 값은 각각 약 181 및 116 nM이었다. 따라서, 펩티드 2 (서열 번호: 2)는 인간 혈장에 비해 쥐 혈장에서 항응고제로서 3-5배 덜 활성이었다.
표 Ⅲ에 예시한 바와 같이, ADP 및 트롬빈에 의해 유도된 인간 혈소판의 응집은 펩티드 2(서열 번호: 2)에 의해 억제되었다. ADP-유도 혈소판 응집을 50 % 만큼 억제시키는 농도(IC50)는 약 19 μM이었다. 이것은 고리형 RGD-X 펩티드(IC50= 20 μm), 펩티드 2a(서열 번호: 3)와 유사하였다. 항트롬빈 펩티드 2b(서열 번호: 4) 및 2d(서열 번호: 6)는 ADP-유도 혈소판 응집(IC50= 895 및 ＞ 1,000 μM)의 억제제로서 본질적으로 불활성이었다. 펩티드 2(서열 번호: 2)는 60 nM의 IC50값을 갖는 트롬빈 유도 혈소판 응집을 억제하였으며, 각각의 성분 펩티드 2b(서열 번호: 4)(IC50= 2 μM), 펩티드 2d(서열 번호: 6) (IC50= 200 nM) 및 펩티드 2a(서열 번호: 3) (IC50= 13 μM) 보다 더 활성었었다.
이와는 대조적으로, ADP 및 트롬빈에 의해 유도된 쥐 혈소판의 응집은 각각IC50= 65 μM 및 14 nM (표 Ⅱ 참조)에서 펩티드 2(서열 번호: 2)에 의해 억제되었다. 따라서, 펩티드 2(서열 번호: 2)는 인간 혈소판 풍부 혈장에 비해 쥐 혈장에서 3-4배 덜 활성이었다.
펩티드 2(서열 번호: 2)를 혈전중의 FeCl3- 유도 쥐 경동맥 모델에서 항혈전증활성에 대해 평가하였다. 혈전성 폐색은 10,25 및 50 nmol/kg/분의 속도로 FeCl3를 동맥에 투입시키기 15분 전에 시작하여 1시간 동안 펩티드 2(서열 번호: 2)의 계속적인 정맥내 주입에 의해 투여량에 의존하여 감소하였다(제1도 참고). 폐색은 50nmol/kg/분의 투여량으로 5마리 귀 중 4마리에서 예방되었다. 25 및 10 nmol/kg/분의 속도에서, 폐색은 각각 5마리 중 3마리 및 6마리 중 1마리에서 예방되었다. 촉매 위치 항트롬빈(펩티드 2d)(서열 번호: 6)은 투여량에 의존하여 50, 100 및 200nmol/kg/분의 주입 속도에서 폐색 시간을 지연시켰다(제 2도 참조).
폐색은 50 nmol/kg/분의 투여 속도에서 5마리 쥐 중에 4마리에서 예방되었다. 500 nmol/kg/분에서 히루딘 유사체(펩티드 2b) (서열 번호: 4) 및 100 nmol/kg/분의 속도에서 고리형 RGD-X 펩티드(펩티드 2a) (서열 번호: 3) 모두는 본 발명 모델 중 상기의 상기 쥐들에서 폐색을 예방하지 못하였다.
실시예 1의 펩티드의 항응고 및 항혈전증 효과
실시예 1의 펩티드(펩티드 1) (서열 번호: 1)은 펩티드 2(서열 번호: 2)와 같이 고리형 혈소판 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체 길항질(RGD-X)에 의해 히루딘55-65유사체에 커플링된 촉매 위치 트롬빈 억제제(fPR)로 구성되어 있으며, 이것을 각각의 성분 펩티드와 비교하였다. 그러나, 펩티드 1(서열 번호: 1)은 펩티드 2(서열 번호: 2)의 유사체이며, 여기서 펩티드 2(서열 번호: 2)의 고리형 RGD-X 서열 중의 페닐알라닌(Phe)이 노르루이신(Nle)으로 치환되어 있다. 본 연구에 있어서, 펩티드 1(서열 번호: 1)을 펩티드 2(서열 번호: 2), 펩티드 3(서열 번호: 7) [음이온 결합 외부위치 관련 부분(부분 C)이 꼭대기가 잘린 펩티드 1의 유사체], 및 펩티드 4(서열 번호: 8) [천연L-아미노산만을 함유하는 펩티드 1의 유사체]와 비교하였다. 또한, 펩티드 5(서열번호: 9) [10개 아미노산 RGD-X 루프 및 천연 L-아미노산만을 함유하는 펩티드 1(서열 번호: 1)의 유사체]를 펩티드 6(실시예 12의 펩티드)(서열 번호:10)[10개의 아미노산 RGD-X 루프를 함유하는 펩티드 1의 유사체]와 비교하여 본 발명의 펩티드의 활성에 대한 RGD-X 루프 작용의 배향의 효과를 예시하였다. 펩티드 1,2 및 6(서열 번호: 1, 2 및 10)은 본 발명인 반면에 펩티드 3-5(서열 번호: 7-9)는 본 발명이 아니다. 하기 실험 장치의 사용은 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방법으로든지 본 발명을 제한하려는 의도가 없음을 주지하여야 한다.
실험 동물
수컷 스프라그-다울리 쥐(300-400 gm)를 스프라그 다울리 인크(인디아나주 46229 인디아나폴리스)로부터 구입할 수 있으며, 양성(both sexes)의 잡종 품종 사냥개(hound) (6-11 kg)를 본 연구에 사용하였다.
개를 소듐 펜토바르비탈(30 mg/kg, 정맥내 투여)로 마취시켰다. 대퇴 동맥 및 대퇴 정맥 모두를 분리시키고, 혈압(Gould P23ID, Gould Inc. 제품, Medical Products Division, Oxnard, CA 93030), 혈액 샘플링, 및 약물 투여의 기록을 위해 캐뉼레이션하였다. 가지 도선(limb leads)을 도선 Ⅱ ECG를 모니터하기 위해 피하에 설치하였다. 혈압 및 ECG 측정치롤 기록하였다(Gould 440 recorder, Gound Inc., Instrument Systems Division, Cleveland, OH 44114).
혈액 샘플링
혈액 시료는 3.8 % 트리소듐 시트레이트(1:10)를 함유하는 플라스틱 주사기 중에 주입될 수 있다. 혈장은 2,O00 g-힘으로 10분 동안 원심분리에 의해 제조하였다. 시험관내 연구를 위한 정맥 혈액을 건강하고, 마약을 하지 않은 남성 자원자로부터 채취하였다.
응고화 분석, 탬플레이트 출혈 시간(Template bleeding Time) 및 혈액학
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 결정은 데이드 다이아그노스틱스인크[(Aguada, Puerto Rico 00602]사의 시약 및 방법을 사용하여 수행하였다. 트롬빈 응괴 시간은 쥐 혈장 0.1 ml를 37 ℃에서 0.1M Tris 완충 용액, (pH 7.5) 0.1 ml로 30초 동안 배양시킴으로써 결정하였다. 응고는 소 트롬빈(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO 63178) 용액(12 NIH 단위/ml) 0.1 ml로 개시하였다. 모든 응괴 시간은 MLA-Electra 750 자동 응고화 타이머(MLA, Inc. 제품: Pleasantville, NY 10570)를 사용하여 반자동으로 측정하였다. 응괴 시간을 2배로 만드는데 요구되는 농도(ID2)는 단순 선형회귀분석을 사용하여 계산하였다. t1/2의 결정은 1 및 5 nmol/kg/분의 속도로 펩티드 1(서열 번호: 1)을 주입시킨 후 항트롬빈 활성(트롬빈 시간)에 대해 계산하였다. t1/2의 예측은 시간에 대한 반응 데이타의 선형 회귀분석으로 수행하였다.
템플레이트 출혈 시간은 털을 제거시킨(Nair, Carter-Wallace, Inc., New York, NY 10105) 후 좌측 다리의 중간 표면 상에서 서지컷(Surgicutt?) 출혈 시간 장치(International Technidyne Corp. 제품, Edison, NJ 08820)를 사용하여 수행하였다. 템플레이트 출혈 시간은 약물 투여 60 및 30분 전, 약물 투여 15, 30, 60, 120, 180및 240분 후에 측정하였다.
전혈 세포 계수 및 헤모글로빈 함량의 분석은 혈액학 분석기(Technicon H1, Miles Technicon, Tarrytown, NY 10591)로 처리된 EDTA로 항응고화시킨 140 μL 혈액 시료에 대해 측정하였다. 시료는 약물 투여 60 및 30분 전, 약물 투여 15, 30, 60, 120, 180 및 240분 후에 채취하였다.
혈소판 응집 시험
인간 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 실온에서 200 g-힘으로 10분 동안 원심분리함으로써 제조하였다. 혈소판 빈약 혈장(PPP)를 2,000 g-힘으로 10분 동안 원심분리에의해 제조하였다. PRP를 플라스틱 실험실용 제품에만 노출시켰다. 모든 실험은 혈액 채춰 3시간 내에 완결하였다. 혈소판 응집은 이중 채널 응집측정기(Chrono-1og Corp. 제품, Harverstown, PA 19083)롤 사용하여 광도법으로 측정하였다. 일백 퍼센트 광투과율은 자동로거스 PPP로 정의하였다. 광투과율 중의 최대 변화율은 PRP에 이은 ADP(1 μM) 또는 트롬빈의 첨가로부터 결정하였다. 트롬빈 (0.2-2.0 단위/ml) 유도 혈소판 응집은 농도에 의존하였으며. 1/2 최대 농도롤 억제 연구에 사용하였다. 펩티드 2(서열 번호: 2)를 ADP 또는 트롬빈을 첨가하기 전에 PEP(0. 45ml)로 30초 동안 배양시켰다. 응집은 전체 부피 0.5 ml 중에서 측정하였다. 억제성반응은 대조 값과 비교하여 억제율로서 나타내었다. 응집을 50% 억제 하는 농도(IC50)는 단순 선형 회귀분석에 의해 계산하였다.
혈 중의 혈소판 응집은 전혈 응집 측정기(Chrono-log, model 540-VS)를 사용하여 염수로 희석된 (1:2) 시트레이트화 혈액 중에서 수행하였다. 화석 혈액의 분취량을 플라스틱 큐베트에 위치시키고, 37 ℃에서 15분 동안 배양시켰다. ADP(2 μM) 또는 트롬빈(0.4 U/ml)을 첨가하여 응집을 유도하고, 전기 임피던스의 변화는스트립 챠트 기록기에 기록하였다. 응집은 전혈 부피 1.O ml 중에서 측정하였다. 억제성 반응은 대조 값과 비교하여 억제율로서 나타내었다. 응집을 50% 억제 하는 농도(IC50)는 단순 선형 회귀분석에 의해 계산하였다.
쥐에 있어서 FeCl 3 동맥 혈전증 모델(생체내)
쥐에 있어서, 펩티드 1(서열 번호: 1)의 생체내 항혈전증 효과를 또한 평가에 사용하였다. 예를 들면, 펩티드 1(서열 번호: 1)은 문헌 [R.J. Broersma, 등, Thromb. Res. 64, 405-412(1991)]에 따라 혈소판 의존 트름빈 매개 FeCl3유도 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 항혈전 활성에 대해 평가하였으며, 상기 참고 문헌은 본 명세서에 참고로 기재하였다.
결과
본 연구 결과는 펩티드 1(서열 번호: 1)이 트롬빈 유도 혈소판 응집 억제제로서 펩티드 3(서열 번호: 7), 펩티드 4(서열 번호: 8) 또는 심지어 펩티드 2(서열 번호: 2) 보다 훨씬 더 유력하다고 나타내었다.
표 Ⅶ을 참고로 하여, 펩티드 1(서열 번호: 1)은 펩티드 2(서열 번호: 2)의 유사체이며, 여기서 펩티드 2(서열 번호: 2)의 고리형 RGD-X 서열 중의 페닐알라닌(Phe)이 노르루이신(Nle)으로 치환되어 있다. 펩티드 3(서열 번호: 7)은 펩티드 2(서열 번호: 2)의 유사체이며, 여기서 음이온 결합 외부위치 관련 부분(부분 c)은 끝이 잘린 모양이다. 펩티드 4(서열 번호: 8)은 천연 L-아미노산만을 함유하는 펩티드 4(서열 번호: 4)의 유사체이다. 펩티드 1(서열 번호: 1) 및 펩티드 2(서열 번호: 2)는 본 발명인 반면에, 펩티드 3(서열 번호: 7) 및 펩티드 4(서열 번호: 8)는 본 발명이 아니었다.
펩티드 1(서열 번호: 1)은 각각 12 및 5 nM 농도(ID2)에서 aPTT 및 트롬빈 시간을 2배로 하였다. 이것은 펩티드 2(서열 번호: 2)와 비교할 때 항응고 활성의 값의 5배 증가에 해당한다. 표 Ⅶ은 펩티드 3(서열 번호: 7) 및 펩티드 4(서열 번호: 8)가 펩티드 2 보다 덜 항응고 활성을 가짐을 예시하고 있다.
트롬빈 유도 혈소판 응집
펩티드 1-4(서열 번호:1, 2, 7 및 8)의 인간 혈소판 응집의 투여량-의존 억제는 표 Ⅷ에 예시하였다. 트롬빈 유도 혈소판 응집은 399±76 pM의 IC50값을 가지며, 펩티드 2(서열 번호: 2)(IC50= 60±26 nM) 보다 150배 증가한 펩티드 1 (서열 번호: 1)에 의해 가장 유효하게 억제되었다.
모든 천연 L-아미노산이 있는 유사체인 펩티드 4(서열 번호: 8) 및 단축된 COOH 말단이 있는 유사체인 펩티드 3(서열 번호: 7)은 펩티드 1 보다 약 1000배 덜 활성이었다.
ADP 유도 혈소판 응집
붕해 활성은 인간 혈소판의 ADP 유도 응집의 투여량 의존 억제에 의해 측정하고, 표 Ⅷ에 예시하였다.
펩티드 1(서열 번호: 1)(IC50= 32 μM) 및 펩티드 2(서열 번호:2)(IC50= 19 μM)는 유사한 활성을 갖는 것으로 나타났다. 모든 천연 L-아미노산이 있는 유사체인 펩티드 4(서열 번호: 8) 및 단축된 COOH 말단이 있는 유사체인 펩티드 3(서열 번호: 7)은 붕해 활성에 있어서 펩티드 1 (서열 번호: 1)과 대략 등가물이었다.
전혈 혈소판 응집
ADP(0.5 μM) 및 트롬빈(0.025 U/ml)의 조합에 의해 유도된 인간 및 쥐 전혈혈소판 응집은 각각 IC502.9 및 42.5 nM인 펩티드 1에 의해 억제되었다(도 3 참고)·따라서, 펩티드 1 (서열 번호: 1)은 쥐 혈액과 비교할 때 인간 혈액 중에서 약 15배 더 활성이었다. 더우기, 펩티드 1(서열 번호: 1)은 약 50 %에서 쥐 혈액 중에 억제플라토와는 대조적으로 인간 혈액 중에서 응집을 완전히 억제하였다.
개에게 폡티드 1의 정맥내 투여
펩티드 1(서열 번호: 1)은 마취된 개에 1시간 동안 주입시킬 경우 트롬빈 및 혈소판 응집 억제를 나타내었다. 더우기, 펩티드 1(서열 번호: 1)의 효과는 주입이 정지된 후에 단기간이었다. 트롬빈 시간(도 4) 및 aPTT(도 5)는 1 및 5 nmol/kg/분의 주입 속도에 의해 투여량에 의존하여 지연되었다. 트롬빈 시간은 aPTT 분석보 다 펩티드 1 (서열 번호: 1)의 주입에 의한 억제에 대해 더욱 민감하였다. 도 2의 요약 데이타는 최대 억제가 15-30분 내에 완전 종결되었음을 예시하고 있다. 주입이 종결된 후(60분), 트롬빈 활성은 각각 1 및 5 nmol/kg/분의 주입에 대해 17±0.1 및 26±3.2분의 약력학적 t1/2을 갖는 상태로 복원되었다.
혈소판 응집 억제는 응고 시험에 대해 펩티드 1(서열 번호: 1)의 효과를 확인하였다. 펩티드 1(서열 번호: 1)의 주입은 15분 동안에 트롬빈 유도 혈소판 응집을 억제하였다(도 6). 억제는 3마리 개 중의 2마리에서 1시간 주입 기간 동안 유지되었다. 혈소판 활성이 복원되고, 1 nmol/kg/분의 주입이 정지된 후에 약력학적 t1/212.8±1.1분을 가졌다.
ADP 유도 혈소판 응집은 각각 투여속도에서 3마리 개중의 1마리에서 억제되었다. 생체외에서, ADP 유도 혈소판 응집은 μM 수준에서 억제되었다. 전혈소판 응집시에 혈액 대 염수의 희석물(1:2)은 ADP 유도 혈소판 응집을 효과적으로 억제하는데 필요한 펩티드 1(서열 번호: 1)의 농도를 감소시키는 것으로 생각되지만, 본 발명은 이와 같은 생각에 구애받지 않는다. 출혈 시간(도 7) 및 혈소판 수(도 8)는 펩티드 1(서열 번호: 1)을 수용하는 개에 있어서 안정을 유지하였다. 혈압(도 9) 및 심장 박동률(도 10)은 투여량 의존 유형으로 약간 상승되었다. 상기 변수들은 주입이 끝난 2시간 후에 기저선 대조값으로 되돌아왔다.
펩티드 1(서열 번호: 1)은 FeCl3유도 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 항혈전증 활성에 대해 평가하였다. 혈전 폐색은 투여 속도 5, 10 및 25 nmol/kg/분 (표 IX 및 도 11 참조)으로 FeCl3을 투여시키기 15분전에 시작하여 1시간 동안 계속적인 정맥내 주입에 의해 투여량에 따라 지연되었다. 폐색은 투여 속도 25 nmol/kg/분으로 5마리 쥐 중 4마리에서 주입 동안에 예방되었다. 10 및 5 nmol/kg/분의 속도에서, 폐색은 각각 7다리 중 4마리 및 6마리 중 0마리의 쥐에서 예방되었다. FeCl3투여 후 폐색 시간을 2배로 만드는데 필요한 펩티드 1(서열 번호: 1)의 투여 속도는 펩티드 2(서열 번호: 2)에 대해 전에 관찰된 33.7 nmol/kg/분에 비하여 19.3 nmol/kg/분이었다.
표 X은 촉매 위치 억제제 및 음이온 결합 외부위치 인식 서열 사이의 결합 "다리"에서 (D)Cys를 (L)Cys로 치환시킴으로써 얻은 2개의 입체이성질체간의 차이를 예시하고 있다. 펩티드 5(서열 번호: 9) 및 6 (서열 번호: 10)은 고리형 RGD 서열에 추가 잔기를 함유하는 펩티드 1(서열 번호: 1)의 유사체를 나타낸다. 또한 펩티드 5(서열 번호: 9)는 (D)Cys와 반대로서 결합 "다리"에 (L)Cys 잔기를 함유하는 것이 다르다. 고리형 RGD 서열 상에 부여된 상이한 공간 배향은 (D)Cys 유사체인 펩티드 6(서열 번호: 10)에 의한 인간 혈소판의 트롬빈 유도 혈소판 응집을 보다 많이 억제시킨다. 2개의 입체이성질체 사이에서 트롬빈 활성의 10배 차이가 나타났다. 그러나, ADP 유도 혈소판 응집 및 항응고 활성의 억제에 대한 차이는 없었다. 펩티드 1(서열 번호: 1)을 변형시켜 천연 L-아미노산만을 함유하는 유사체 펩티드4(서열 번호: 8)를 생성하여 2개의 입체이성질체 사이의 차이를 증폭시킴을 알아야 한다. 사실상, 펩티드 1(서열 번호: 1)은 펩티드 4(서열 번호: 8)보다 트롬빈 유도혈소판 응집을 약 1000배 더 억제시킨다(표 Ⅷ 참조). ADP 유도 혈소판 응집을 억제하는데 상기 2개의 입체이성질체 사이에는 차이가 없다. 그러나, 항응고 활성은 모든 천연 아미노산 유사체 펩티드 4(서열 번호: 8) 보다 (D)Cys 함유 유사체 펩티드 1(서열 번호: 1)에서 보다 크다.
펩티드 1 대 펩티드 1 유사체의 상대적 활성
표 XI-XIV는 공인된 IC50혈소판 억제 및 ID2항응고 데이타 대 펩티드 1(서열 번호: 1)의 유사체의 비율을 예시하고 있다. 비교하기 위해 펩티드 1(서열 번호: 1)시료는 응고-ID2(aPTT = 27.9 nM; 트롬빈 시간 = 15 nM); 응집-IC50(트롬빈 = 5.8nM; ADP = 11.4 μM)인 활성을 갖는다. 표 XI-XIV에서 펩티드 7-18 (서열 번호: 11-22)에 대한 aPTT, 트롬빈 시간, 트롬빈 및 ADP의 값은 단지 비교값이며, 펩티드의 실제 농도를 나타내려는 의도가 아니므로 단위가 제공되지 않았다. 예를 들면, 펩티드 7(서열 번호: 11)에 대한 aPTT 값 0.99는 펩티드 7 (서열 번호: 11)이 정상적인 인간 혈장 중에 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)의 분석에서 펩티드 1(서열 번호: 1)의 99 % 활성임을 확인하여 주었다.
표 XI은 모두 본 발명의 화합물인 펩티드 1(서열 번호: 1)의 2개의 유사체 펩티드 7(서열 번호: 1) 및 펩티드 8(서열 번호: 12) 사이의 차이를 예시하고 있다. 펩티드 7(서열 번호: 11)은 B4부분에서 Nle이 Met로 대체된 펩티드 1(서열 번호: 1)의 유사체이며, 펩티드 8(서열 번호: 12)은 B4부분에서 Nle이 Cha로 대체된 펩티드 1의 유사체(서열 번호: 1)이다. 펩티드 8(서열 번호: 12)은 aPTT의 분석에 있어서 펩티드 1(서열 번호: 1) 보다 약 ⅓ 덜 활성이지만, aPTT 값 펩티드 7(서열 번호: 11)은 펩티드 1(서열 번호: 1)의 값과 필수적으로 동일하였다. 트롬빈 시간 값에 있어서, 이들 값은 각각의 펩티드에 따라 변하며, 펩티드 7(서열 번호: 11)은 펩티드 1(서열 번호: 1)와 같이 단지 19 %만큼 활성인 반면에 펩티드 8(서열 번호: 12)은 실제로 펩티드 1(서열 번호: 1)보다 더욱 활성이다. 트롬빈 활성의 10배 차이는 펩티드 1(서열 번호: 1)과 유사체 중의 하나 사이에서 나타났다. ADP 활성에 있어서, 펩티드 8(서열 번호: 12)은 대략 펩티드 1(서열 번호: 1)의 1/2 만큼 유효한 반면에 펩티드 7(서열 번호: 11)은 펩티드 1(서열 번호: 1)의 약 3/4 만큼 효과적이다.
표 XII는 펩티드 1(서열 번호: 1)의 2개의 페니실아민 유사체, 펩티드 9(서열 번호: 13) 및 펩티드 10(서열 번호: 14) 사이의 차이를 예시하고 있으며, 상기 두 펩티드는 모두 본 발명이 아니었다. 상기 표는 B3부분에서 Arg와 Me-Arg의 상호 변환성을 보여주기 위해 제시되었다. 페니실아민 부분의 도입은 모든 범주에서 펩티드 9(서열 번호: 13)의 활성을 크게 감소시켰다. 펩티드 9(서열 번호: 13)에서와 같이, 펩티드 10(열 번호: 14)에 대해서 트롬빈 활성의 동일한 감소가 나타났다. 그러나, 트롬빈 시간에서는 단지 약간의 감소가 나타난 반면에, ADP 활성은 펩티드 1(서열 번호: 1)에 비하여 6배 증가하였다.
표 XⅢ은 B2에서 Gly 잔기의 다양한 D-아미노산 잔기로의 상호 변환성을 예시하고 있다. 펩티드 11(서열 번호: 15), 펩티드 12(서열 번호: 16), 펩티드 14(서열 번호: 18) 및 펩티드 15(서열 번호: 19)는 B2부분이 다양한 D-아미노산으로 치환되고 본 발명의 펩티드인 펩티드 1(서열 번호: 1)의 유사체들이다. 펩티드 13(서열 번호: 17)은 본 발명의 펩티드는 아니지만, B2부분에서 Gly 잔기가 삭제된 펩티드 1(서열 번호: 1)의 유사체이었다.
표 XIV는 A1부분에서 (D)Phe 잔기의 상호 변환성을 예시하고 있다. 펩티드16-18(서열 번호: 20-22)은 모두 본 발명의 펩티드들이었다. 펩티드 16(서열 번호: 20)은 기본적으로 펩티드 1(서열 번호: 1)과 동일한 트롬빈 활성 및 트롬빈 시간을 나타냈다. 펩티드 17(서열 번호: 21)은 펩티드 1(서열 번호: 1)과 동일한 트름빈 시간 값을 나타내며, 더 큰 ADP 값을 가지지만, 트롬빈 값에 있어서는 10배 더 약한활성을 나타냈다. 이에 비하여, 펩티드 18(서열 번호: 22)은 펩티드 1(서열 번호: 1)에 비교할 때 aPTT 값에 있어서 상당한 증가를 나타냈지만, 그러나 트롬빈 시간은 단지 펩티드 1(서열 번호: 1)의 77 % 활성을 나타낸 반면에, 트롬빈 및 ADP 값은 단지 펩티드 1(서열 번호: 1)의 절반 값의 활성만을 가졌다.
서열 목록
(1) 일반 정보
(i) 출원인
(A) 이름: 메렐 다우 파마세틸칼스 인크·
(B) 거리: 피.오. 박스 156300, 이. 갈브레이스 로드 2110
(C) 도시: 신시내티
(D) 주: 오하이오주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 45215-6300
(G) 전화번호: 513/948-6566
(F) 팩스번호: 513/948-7961 또는 4681
(I) 텔렉스: 214320
(ii) 발명의 명칭: 삼관능성 항트롬빈 항혈소판 펩티드
(ii) 서열 번호: 22
(iv) 컴퓨터 해독 인자:
(A) 매개 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 오퍼레이팅 시스뎀: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPO)
(vi) 우선권 출원 데이타:
(A) 출원번호: US 08/076,066
(B) 출원일: 1993 년 6월 11일
(2) 서열 번호: 1에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 의치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:1
(2) 서열 번호: 2에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보:주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:2
(2) 서열 번호: 3에 대한 일반 정보.
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 8 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 졍보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 8에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 8
(D) 다른 정보: 주의= 위치 8에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 1에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:3
(2) 서열 번호: 4에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 10 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 숙시닐기로 치환된 Tyr이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 9
(D) 다른 정보= 주의= 위치 9에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 10
(D) 다른 정보: 주의=위치 10에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:4
(2) 서열 번호: 5에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산·
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변헝된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 졍보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:5
(2) 서열 번호: 6에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 3 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이며, 메틸기로 치환되었다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:6
(2) 서열 번호: 7에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의=위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:7
(2) 서열 번호: 8에 대한 일반 졍보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:8
(2) 서열 번호: 9에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 29 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의= 위치 13에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 28
(D) 다른 정보: 주의= 위치 28에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 29
(D) 다른 정보: 주의=위치 29에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:9
(2) 서열 번호: 10에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 29 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의=위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 17에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의= 위치 13에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 17
(D) 다른 정보: 주의=위치 17에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 28
(D) 다른 정보: 주의= 위치 28에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 29
(D) 다른 정보: 주의=위치 29에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:10
(2) 서열 번호: 11에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:11
(2) 서열 번호: 12에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:12
(2) 서열 번호: 13에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-배열의 시스테인이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-배열의 페니실아민이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:13
(2) 서열 번호: 14에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-배열의 시스테인이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 8
(D) 다른 정보: 주의= 위치 8에서의 Xaa는 메틸아르기닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-배열의 페니실아민이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:14
(2) 서열 번호: 15에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 7
(D) 다른 정보: 주의= 위치 7에서의 Xaa는 D-배열의 티로신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시쿨로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위처
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보:주의= 위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:15
(2) 서열 번호: 16에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키:변형된 위치
(B) 위치:1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 의치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 7
(D) 다른 졍보: 주의= 위치 7에서의 Xaa는 D-배열의 발린이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술:서열 번호:16
(2) 서열 번호: 17에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키:변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 12에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 10
(D) 다른 정보:주의= 위치 10에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 12
(D) 다른 정보:주의= 위치 12에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에사의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 23
(D) 다른 정보: 주의=위치 23에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:17
(2) 서열 번호: 18에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상:선헝
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보:주 의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보:주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 7
(D) 다른 정보: 주의= 위치 7에서의 Xaa는 D-배열의 트레오닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보:주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 경보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:18
(2) 서열 번호: 19에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 7
(D) 다른 정보: 주의= 위치 7에서의 Xaa는 D-배열의 프롤린이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:19
(2) 서열 번호: 20에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 페닐글라신이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:20
(2) 서열 번호: 21에 대한 일반 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보:주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시클로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:21
(2) 서열 번호: 22에 대한 일반 졍보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상= 선형
(ii) 분자 타입: 펩티드
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 1
(D) 다른 정보: 주의= 위치 1에서의 Xaa는 D-배열의 N-메틸페닐알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 6
(D) 다른 정보: 주의= 위치 6에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 13에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 11
(D) 다른 정보: 주의= 위치 11에서의 Xaa는 노르루이신이다·
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 13
(D) 다른 정보: 주의=위치 13에서의 Xaa는 D-Cys이며, 위치 6에서의 D-Cys에 결합된 황화물이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 24
(D) 다른 정보: 주의=위치 24에서의 Xaa는 시콜로헥실알라닌이다.
(ix) 특성:
(A) 이름/키: 변형된 위치
(B) 위치: 25
(D) 다른 정보: 주의=위치 25에서의 Xaa는 D-배열의 글루탐산이다.
(xi) 서열 기술: 서열 번호:22

Claims (5)

  1. 다음 일반식의 화합물 또는 그의 제약학상 허용 가능한 염.
    X - A - B - C - Y
    상기 식 중,
    X는 수소, 아세틸 또는 t-부틸옥시 카르보닐기이며;
    A는 다음 일반식의 펩티드 유사체이며,
    A1- A2- A3
    [여기서,
    A1은 (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq 또는 N-Me-(D)Phe이며;
    A2는 Pro이며;
    A3은 Arg임];
    B는 다음 일반식의 펩티드 유사체이며,
    또는
    [여기서,
    B1은 Gly이며;
    B2는 Gly, (D)Tyr, (D)Va1, (D)Thr 또는 (D)Pro이며;
    B2'는 Arg-Ile-Pro이며;
    B3은 Arg이며;
    B4는 Nle 또는 Phe임];
    C는 다음 일반식의 펩티드 유사체이며,
    Asp-C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9(5)
    [여기서,
    C1은 Tyr이며;
    C2는 Glu이며;
    C3은 Pro이며;
    C4는 Ile이며;
    C5는 Pro이며;
    C6은 Glu이며;
    C7은 Glu이며;
    C8은 Ala-Cha이며;
    C9는 (D)Glu임];
    Y는 OH 또는 C1-C6알콕시이다.
  2. 제1항에 있어서, 다음 식의 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 다음 식의 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 다음 식의 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 다음 식의 화합물.
KR1019950705595A 1993-06-11 1994-05-13 삼관능성항트롬빈및항혈소판펩티드 KR100330465B1 (ko)

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