ES2199963T3 - Peptidos trifuncionales antitrombina y antiplaquetarios. - Google Patents

Peptidos trifuncionales antitrombina y antiplaquetarios.

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ES2199963T3
ES2199963T3 ES94920004T ES94920004T ES2199963T3 ES 2199963 T3 ES2199963 T3 ES 2199963T3 ES 94920004 T ES94920004 T ES 94920004T ES 94920004 T ES94920004 T ES 94920004T ES 2199963 T3 ES2199963 T3 ES 2199963T3
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Robert J. Broersma, Jr.
Thomas J. Owen
John L. Krstenansky
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Abstract

COMPUESTOS DE LA FORMULA: X-A-B-C-Y EN DONDE X ES UN RESIDUO TERMINAL AMINO SELECCIONADO DE HIDROGENO, UNO O DOS GRUPOS ALKILO DE 1 A 6 ATOMOS DE CARBONO, UNO O DOS GRUPOS ACILO DE DESDE 2 A 10 ATOMOS DE CARBONO, CARBOBENZILOXI, H{SUB, 2}NC(=NH)-, O UN GRUPO CARBONILO T-BUTILOXI; A ES UN ANALOGO DE PEPTIDO DE LA FORMULA: A{SUB, 1}-A{SUB, 2}-A{SUB, 3} EN DONDE A{SUB, 1} ES (D)PHE, (D)PHG, (D)1-TIQ, (D)3-TIQ, N-ME- (D)PHE, (D)CHA, (D)CHG, (D)NAG, O (D)THG; A{SUB, 2} ES PRO, PIP O AZT; A{SUB, 3} ES ARG, LYS, ORN, O HARG; B ES UN ANALOGO DE PEPTIDO DE FORMULAS (3) O (4) EN DONDE B{SUB, 1} ES GLY, ALA, (D)ALA, VAL, (D)VAL, O GLYGLY; B{SUB, 2} ES GLY, GLY-GLY, GLY-GLY-GLY, GLY-GLY-GLY-GLY O CUALQUIER (D) AMINOACIDO; B{SUB, 2}'' ES ARG-ILE-PRO O LYS-ILEPRO; B{SUB, 3} ES ARG, HARG, N-ME-ARG O LYS; B{SUB, 4} ES NLE, PHE, MET O CHA; C ES UN ANALOGO DE PEPTIDO DE LA FORMULA: ASPC{SUB, 1}-C{SUB, 2}-C{SUB, 3}-C{SUB, 4}-C{SUB, 5}-C{SUB, 6}C{SUB, 7}-C{SUB, 8}-C{SUB, 9} EN DONDE C{SUB, 1} ES PHE, PC1PHE, PNO{SUB, 2}PHE, THA, NPA, TYR O TRP; C{SUB, 2} ES GLU O ASP; C{SUB, 3} ES CUALQUIER AMINOACIDO; C{SUB, 4} ES ILE, VAL, LEU O PHE; C{SUB, 5} ES PRO, HYP, SAR, NMEPGL O D-ALA; C{SUB, 6} ES CUALQUIER AMINOACIDO; C{SUB, 7} ES CUALQUIER AMINOACIDO; C{SUB, 8} ES TYR, GLU, PRO, ALA-CHA, TYR-CHA, TYR-LEU Y ALA-TYR; C{SUB, 9} ES UN ENLACE O ES GLU, (D)GLU, GLN, PRO, LEU-GLN, ASP-GLU, O LEU-PRO; E Y ES UN RESIDUO TERMINAL CARBOXI SELECCIONADO DE OH, ALKOXI C{SUB, 1}-C{SUB, 6}, AMINO, AMINO SUSTITUIDO CON ALKILO MONO- O DI-(()C{SUB, 1}-C{SUB, 6}()), O BENZILAMINO; O SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES DE LOS MISMOS SON AGENTES ANTICOAGULANTES UTILES. ESTA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE AL USO DE LOS COMPUESTOS ANTERIORES EN EL TRATAMIENTO DE OCLUSION DE POSTANGIOPLASTIA AGUDA, CITOPENIA DE CIRCULACION INDUCIDA EXTRACORPORAL, INFARTO DE MIOCARDIO Y OCLUSION DE TERAPIA POST FIBRINOLITICA.

Description

Péptidos trifuncionales antitrombina y antiplaquetarios.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a nuevos péptidos que son agentes anticoagulantes y antiplaquetarios útiles.
Antecedentes de la invención
Los anticoagulantes son agentes terapéuticos útiles en el tratamiento farmacológico de, por ejemplo, la trombosis venosa profunda aguda, la embolia pulmonar, la embolización arterial aguda de las extremidades, el infarto de miocardio, los accidentes cerebrovasculares y la coagulación intravascular diseminada. Se cree que la administración profiláctica de anticoagulantes evita la recurrencia de la embolia en pacientes con enfermedad cardíaca arteriosclerótica o reumática, y evita ciertas complicaciones tromboembólicas de la cirugía. También se ha indicado la administración de anticoagulantes en el tratamiento de la enfermedad de arteria coronaria y cerebrovascular. La trombosis arterial, en particular en arterias que suministran al músculo cardíaco y al cerebro, es una causa principal de muerte.
La trombosis arterial mediada por plaquetas es un importante mecanismo patógeno para los trastornos listados en el párrafo anterior. Por consiguiente, la combinación de la inhibición de la agregación plaquetaria y la trombina sugiere una aproximación útil al diseño de agentes antitrombóticos. La unión del fibrinógeno a través de la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) a receptores de glicoproteína (GP) IIb/IIIa de plaquetas activada, un miembro de la familia de las integrinas, es una etapa esencial de la agregación plaquetaria inducida por diversos agonistas, F.A. Marguerie, et al., J. Biol. Chem., 254, 5357-5363 (1979); D. Collen, et al., Thrombolysis in Cardiovascular Disease, D. Julian, et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1989), pp. 45-67. Esta unión es inhibida por péptidos sintéticos que contienen RGD lineal y cíclica, E.F. Flow, et al., Prog. Hemostats. Thromb., 9, 117-156 (1989); E.F. Flow, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8057-8061 (1985).
Estudios recientes han demostrado que la estrategia de combinar la inhibición de la trombina y el bloqueo del receptor de glicoproteína (GP) IIb/IIIa (integrina) de plaquetas en un único péptido híbrido conduce a una actividad anticoagulante y antiplaquetaria, F.C. Church, et al., J. Biol. Chem., 266, 11975-11979 (1991). Además, en fechas recientes se han indicado inhibidores de trombina peptídicos que combinan los componentes de los inhibidores de secuencia exositio de unión a aniones y catalíticos, J.M. Maraganore, et al., Biochemistry, 29, 7095-7101 (1990), y J. DiMaio, et al., J. Biol. Chem., 265, 21698-21703 (1990). Una característica clave para determinar las actividades de estos péptidos es la separación de los dos componentes que se unen al sitio y exositio activo de la trombina mediante un espaciador con una longitud adecuada. Estos estudios han demostrado que los péptidos que contienen un mínimo de cuatro restos aminoácidos entre el inhibidor del sitio catalítico y la secuencia exositio de unión a aniones son necesarios para la inhibición máxima de la trombina. Estos informes apoyan los resultados del los estudios de entrecruzamiento que indican que la distancia entre el NH2 terminal de los análogos de hirudina unidos al exositio de unión a aniones en la trombina, y el grupo hidroxilo de Ser-195 en el hueco catalítico de la trombina, es aproximadamente 18-20 \ring{A};, B. Furie, et al., J. Biol. Chem., 257, 3875-3882 (1982), y W. Bode, et al., EMBO J., 8, 3457-3475 (1989).
La publicación de la solicitud del Tratado de Cooperación de Patentes nº WO 92/10575, publicada el 25 de junio, 1992, describe de forma específica inhibidores trifuncionales de la activación plaquetaria y la trombina. Estos inhibidores consisten en un resto inhibidor de la glicoproteína IIb/IIIa y un resto inhibidor de la trombina que consiste en un resto dirigido específico de sitio que se une e inhibe el sitio activo de la trombina. El resto dirigido específico de sitio catalítico se une a un resto asociador de exositio de unión a aniones a través de un resto enlazador que tiene una cadena principal con una longitud calculada de entre aproximadamente 18 \ring{A}; y 42 \ring{A};.
Los inventores han descubierto que cuando un inhibidor de sitio catalítico de la trombina (por ejemplo, (D)Phe-Pro-Arg, o un análogo del mismo) se acopla con un resto asociador de exositio de unión a aniones (análogo de hirudina_{55-65}) a través de una secuencia "puente" Arg-Gly-Asp-X cíclica, se obtiene un péptido trifuncional que combina la inhibición del exositio de unión a aniones y catalítica de la trombina con la inhibición del receptor de glicoproteína (GP) IIb/IIIa. Además se advierte un aumento significativo en la inhibición del péptido de la agregación plaquetaria y la actividad anticoagulante, cuando los restos cisteína que proporcionan los enlaces disulfuro que unen el inhibidor de sitio catalítico de la trombina con el análogo de hirudina_{55-65} se encuentran en la configuración (D). Se advierte otro aumento cuando la norleucina se sustituye por fenilalanina en la secuencia "puente" Arg-Gly-Asp-X cíclica. Esta nueva clase de compuestos debe proporcionar una terapia adjunta útil debido al modo de acción dual y la mayor potencia.
\newpage
Sumario de la invención
Los compuestos de fórmula
(1)X-A-B-C-Y
en la que
X es hidrógeno, acetilo o un grupo t-butiloxicarbonilo;
A es un análogo de péptido de fórmula
(2)A_{1}-A_{2}-A_{3}
en la que
A_{1} es (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq, N-Me-(D)Phe;
A_{2} es Pro;
A_{3} es Arg;
B es un análogo de péptido de fórmulas
1
2
en las que
B_{1} es Gly;
B_{2} es Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro;
B_{2}' es Arg-Ile-Pro;
B_{3} es Arg o N-Me-Arg;
B_{4} es Nle o Phe;
C es un análogo de péptido de fórmula
(5)Asp-C_{1}-C_{2}-C_{3}-C_{4}-C_{5}-C_{6}-C_{7}-C_{8}-C_{9}
en la que
C_{1} es Phe o Tyr;
C_{2} es Glu;
C_{3} es Glu o Pro;
C_{4} es Ile;
C_{5} es Pro o D-Ala;
C_{6} es Glu o Ala;
C_{7} es Glu;
C_{8} es Tyr, Ala-Cha, Tyr-Cha o Tyr-Leu;
C_{9} es un enlace o (D)Glu; e
Y es OH, alcoxi C_{1}-C_{6}, amino sustituido con mono- o dialquilo (C_{1}-C_{4}),
o su sal farmacéuticamente aceptable, son agentes anticoagulantes útiles. Esta invención también se refiere al uso de los anteriores compuestos para tratar la oclusión postangioplástica aguda, la citopenia inducida por circulación extracorporal, el infarto de miocardio en curso, y la oclusión post-terapia fibrinolítica.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra, en forma de gráfico de barras, el efecto del péptido 2 sobre el tiempo de oclusión arterial de FeCl_{3} en ratas. El control está representado por las barras blancas, mientras que el péptido 2 está representado por las barras rayadas. En esta figura, p representa la probabilidad, mientras que n representa el número de animales ensayados.
La figura 2 muestra, en forma de gráfico de barras, el efecto del péptido 2d (no es de esta invención) sobre el tiempo de oclusión arterial de FeCl_{3} en ratas. El control está representado por las barras blancas, mientras que el péptido 2 está representado por las barras rayadas. En esta figura, p representa la probabilidad, mientras que n representa el número de animales ensayados.
La figura 3 muestra el efecto del péptido 1 sobre la agregación de sangre completa amplificada con trombina. Los triángulos negros representan muestras de sangre humana. Las cruces representan muestras de sangre de rata.
La figura 4 muestra el efecto de la infusión del péptido 1 sobre los tiempos de trombina en un perro anestesiado. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 5 muestra el efecto del péptido 1 sobre aPTT en un perro anestesiado. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 6 muestra el efecto de la infusión del péptido 1 sobre la agregación plaquetaria-trombina en perros. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 7 muestra el efecto del péptido 1 sobre el tiempo de sangrado en perros anestesiados. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 8 muestra el efecto de la infusión del péptido 1 sobre el recuento de plaquetas en perros anestesiados. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 9 muestra el efecto del péptido 1 sobre la presión sanguínea media en perros anestesiados. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 10 muestra el efecto de la infusión del péptido 1 sobre la frecuencia cardíaca en perros anestesiados. Los triángulos negros representan una velocidad de 5 nmol/kg/min. Las cruces representan una velocidad de 1 nmol/kg/min. La barra punteada representa el periodo de infusión.
La figura 11 muestra, en forma de gráfico de barras, el efecto del péptido 1 sobre el tiempo de oclusión arterial de FeCl_{3} en ratas. El control está representado por las barras blancas, mientras que el péptido 1 está representado por las barras rayadas. En esta figura, p representa la probabilidad, mientras que n representa el número de animales ensayados.
Descripción detallada de la invención
En esta solicitud se utilizan las siguientes abreviaturas comunes de aminoácidos y grupos amino y carboxi terminales:
Gly (o G): glicina
Ala (o A): alanina
Val (o V): valina
Leu (o L): leucina
Ile (o I): isoleucina
Pro (o P): prolina
Phe (o F): fenilalanina
Trp (o W): triptófano
Ser (o S): serina
Met (o M): metionina
Thr (o T): treonina
Cys (o C): cisteína
Tyr (o Y): tirosina
Gln (o Q): glutamina
Asn (o N): asparagina
Asp (o D): ácido aspártico
Glu (o E): ácido glutámico
Lys (o K): lisina
Arg (o R): arginina
His (o H): histidina
Nle: norleucina
Chg: ciclohexilglicina
Cha: \beta-ciclohexilalanina
Pip: ácido pipecólico, ácido pipecolínico, o ácido 2-piperidincarboxílico
Azt: ácido 2-azetidincarboxílico
Orn: ornitina
hArg: homoarginina
N-Me-Arg: N-metilarginina
N-Me-(D)Phe: N-metil-D-fenilalanina
Thg: 3-tienilglicina
Nag: naftilglicina
1-Tiq: ácido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolein-1-carboxílico
3-Tiq: ácido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolein-3-carboxílico
Phg: fenilglicina
pClPhe: para-cloro-fenilalanina
pNO_{2}Phe: para-nitro-fenilalanina
Tha: 3-(2-tienilalanina)
Npa: \beta-(2-naftil)alanina
Hyp: hidroxiprolina
Sar: sarcosina (N-metilglicina)
N-Me-Phg: N-metilfenilglicina
Pen: penicilamina
Cys':
3
En esta solicitud, cuando dos o más aminoácidos se combinan para formar un péptido se eliminan los elementos de agua, y lo que queda de cada aminoácido se denomina un resto. Por tanto, "resto" es un aminoácido que carece de un átomo de hidrógeno en el grupo amino terminal y/o carece del grupo hidroxilo en el grupo carboxilo terminal. Utilizando una terminología aceptada, un guión (-) delante (indicando la pérdida de un hidrógeno) y/o detrás (indicando la pérdida del hidroxilo) de un código de tres letras para un aminoácido o derivado de aminoácido indica un resto.
Los restos Cys' se representan mediante la fórmula (5), que ilustra un resto cisteína sin un resto sulfuro en su cadena lateral de grupo R. Como se ilustra en las fórmulas (3) y (4), los restos (D)Cys' están unidos mediante un enlace disulfuro. El resto disulfuro está unido a los restos (D)Cys' mediante el resto metileno de los restos (D)Cys', como se ilustra en la fórmula (6):
4
Nótese que las fórmulas (5) y (6) pueden ilustrar, de forma genérica, restos D o L.
En esta solicitud se utilizan las siguientes abreviaturas comunes de diversos grupos protectores:
Boc = t-butiloxicarbonilo
Bzl = bencilo
Mbz = p-metilbencilo
Chx = ciclohexilo
Tos o Tosilo = p-toluensulfonilo
Cbz = carbobenciloxi
BrZ = bromobenciloxicarbonilo
Suc = succinilo
Ac = acetilo
PAM = fenilacetamidometilo
Un grupo alquilo y la porción alquilo de un grupo alcoxi incluyen grupos alquilo lineales, ramificados o cíclicos, por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, sec-pentilo, ciclopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo y ciclopentilmetilo. Un grupo halógeno es un grupo fluoro, cloro, bromo o yodo.
Los aminoácidos que aparecen en la naturaleza son glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, metionina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptófano, cisteína, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, ornitina y lisina. Los ejemplos de \alpha-aminoácidos que "no forman parte de proteínas" son norleucina, norvalina, aloisoleucina, homoarginina, triaprolina, deshidroprolina, hidroxiprolina (Hyp), homoserina, ciclohexilglicina (Chg), ácido \alpha-amino-n-butírico (Aba), ciclohexilalanina (Cha), ácido aminofenilbutírico (Pba), fenilalaninas sustituidas en la posición orto, meta o para del resto fenilo con uno o dos de los siguientes grupos alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), halógeno o nitro, o sustituidas con un grupo metilendioxi, \beta-2- y 3-tienilalanina, \beta-2- y 3-furanilalanina, \beta-2-, 3- y 4-piridilalanina, \beta-(benzotienil-2- y 3-il)alanina, \beta-(1- y 2-naftil)alanina, derivados O-alquilados de serina, treonina o tirosina, cisteína S-alquilada, el éster O-sulfato de tirosina, 3,5-diyodotirosina y los isómeros D de los aminoácidos que aparecen en la naturaleza.
Los aminoácidos naturales, excepto la glicina, contienen un átomo de carbono quiral. A menos que se indique lo contrario, los aminoácidos ópticamente activos indicados en la presente están en la configuración L. La estereoquímica en el átomo de carbono que porta el sustituyente R está en la configuración D o L. Para los fines de esta solicitud, un aminoácido en la configuración D se denomina D-aminoácido, (D)aminoácido o con una letra minúscula cuando se emplea el sistema de denominación de una letra, por ejemplo, para la D-fenilalanina, D-Phe, (D)Phe o f son definiciones aceptables. Como resulta acostumbrado, la estructura de los péptidos descritos en la presente es tal que el extremo amino terminal se encuentra en el lado izquierdo de la cadena, y el extremo carboxi terminal se encuentra en el lado derecho de la cadena.
Los polipéptidos de fórmula I pueden formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido orgánico o inorgánico no tóxico. Los ejemplos de ácidos inorgánicos que forman sales de adición de ácidos adecuados incluyen el ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, y las sales metálicas ácidas como monohidrógeno ortofosfato de sodio y bisulfato de potasio. Los ejemplos de ácidos orgánicos que forman sales adecuadas incluyen ácidos mono-, di- y tricarboxílicos. Los ejemplos de estos ácidos incluyen, por ejemplo, ácido acético, trifluoroacético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinnámico, salicílico, 2-fenoxibenzoico y ácidos sulfónicos, como ácido metansulfónico y ácido 2-hidroxietansulfónico. Las sales del resto aminoácido carboxi terminal incluyen las sales de ácidos carboxílicos no tóxicas formadas con cualquier base orgánica o inorgánica adecuada. Como ejemplo, estas sales incluyen las de metales alcalinos, por ejemplo sodio y potasio; metales alcalino-térreos, como calcio y magnesio; metales ligeros del grupo IIIA, incluyendo aluminio; y aminas orgánicas primarias, secundarias y terciarias, como por ejemplo trialquilaminas, incluyendo trietilamina, procaína, dibencilamina, 1-etenamina, N,N'-dibenciletilendiamina, dihidroabietilamina, N-(alquilo inferior)piperidina y cualquier otra amina adecuada.
Los compuestos de fórmula 1 son nuevos péptidos que combinan la inhibición de la trombina con un antagonismo de los receptores de la glicoproteína (GP) IIb/IIIa de plaquetas en un único péptido híbrido. Los péptidos de esta invención contienen cada uno un inhibidor del sitio catalítico de la trombina (es decir, la porción A) unido a un inhibidor de exositio de unión a aniones de la trombina (es decir, la porción C) a través de un resto enlazador que contiene un "puente" conector y una secuencia RGD-X cíclica como antagonista del receptor de GP IIb/IIIa de plaquetas (es decir, la porción B).
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La porción A describe un inhibidor dirigido específico de sitio catalítico de la trombina. Este resto dirigido específico de sitio catalítico se une al sitio activo de la trombina e inhibe o retarda la actividad proteolítica de la trombina. La porción C describe un agente inhibidor de trombina que se caracteriza como un resto que se asocia a exositio de unión a aniones. Puesto que las permutaciones de la porción C son estructuralmente similares a la porción carboxi terminal de la hirudina, se supone que la porción C en realidad se une al exositio de unión a aniones de la trombina.
La porción B contiene dos porciones funcionales: el "puente" conector entre el inhibidor del sitio catalítico (porción A) y el inhibidor de exositio de unión a aniones (porción C), y un resto inhibidor de la glicoproteína IIb/IIIa de RGD-X cíclica. El "puente" conector entre el inhibidor del sitio catalítico (porción A) y el inhibidor del exositio de unión a aniones (porción C) es la base de la secuencia RGD-X cíclica. Se cree que estos restos que contienen el puente del resto B_{1}, Pro, (D)Cys' y los enlaces disulfuro que conectan los dos restos (D)Cys' de la porción B, actúan como un espaciador apropiado entre la secuencia del inhibidor del sitio catalítico y la secuencia de reconocimiento de exositio de unión a aniones. Este "puente" conector contiene un resto prolina entre los restos B_{1} y A_{3}, puesto que el enlace imida que aparece en la naturaleza entre A_{3} y Pro se rompe a una velocidad mucho más lenta que el enlace amida de los otros restos aminoácidos. Se propone la teoría, aunque esta invención no se ve limitada por esta teoría, de que la presencia de este enlace imida es el responsable del efecto inhibidor del resto dirigido específico de sitio catalítico. Por supuesto, se contempla que otros aminoácidos con enlace amida sustituido actúen como equivalentes funcionales, como sulfuros, cetonas, ésteres y amidas reducidos.
El resto inhibidor de la glicoproteína IIb/IIIa de RGD-X cíclica de la porción B, es decir, los restos aminoácidos entre los dos restos D-Cys de la porción B, inhibe la interacción entre el fibrinógeno y su receptor, la glicoproteína IIb/IIIa. El resto inhibidor de la glicoproteína IIb/IIIa de RGD-X cíclica de la porción B puede contener desde 6 a 11 de los aminoácidos, como se especifica en las fórmulas (3) y (4). Preferiblemente, el resto inhibidor de la glicoproteína IIb/IIIa de RGD-X cíclica de la porción B es la fórmula (3), y contiene desde 6 a 9 de los aminoácidos, como se especifica en la fórmula (3).
Para los fines de esta invención, debe entenderse que A_{1} se une al resto amino terminal (X), mientras que A_{3} se une al resto Pro que está en el N-terminal o lado izquierdo del resto B. El resto Asp en el N-terminal o lado izquierdo del resto C se une al resto B_{1} en el C-terminal o lado derecho del resto B.
Al igual que en cualquier grupo genérico de compuestos químicos, se prefieren ciertos grupos. Los inventores prefieren los derivados peptídicos de fórmula (1), en la que:
X es hidrógeno, acetilo, o un grupo carbonilo;
A_{1} es (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq, o N-Me-(D)Phe;
A_{2} es Pro;
A_{3} es Arg;
B es la fórmula (3) o la fórmula (4);
B_{1} es Gly;
B_{2} es Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro, cuando B tiene la fórmula (3);
B_{2}' es Arg-Ile-Pro, cuando B tiene la fórmula (4);
B_{3} es Arg o N-Me-Arg;
B_{4} es Nle o Phe;
C_{1} es Phe o Tyr;
C_{2} es Glu;
C_{3} es Glu o Pro;
C_{4} es Ile;
C_{5} es Pro o (D)Ala;
C_{6} es Glu o Ala;
C_{7} es Glu;
C_{8} es Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha o Ala-Cha;
C_{9} es un enlace o (D)Glu; e
Y es OH, alcoxi C_{1}-C_{6} o amino sustituido con mono- o dialquilo (C_{1}-C_{4}).
También se prefieren los compuestos de fórmula (1), en la que:
X es hidrógeno, acetilo, o un grupo t-butiloxicarbonilo;
A_{1} es (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq, o N-Me-(D)Phe;
A_{2} es Pro;
A_{3} es Arg;
B es la fórmula (3) o la fórmula (4);
B_{1} es Gly;
B_{2} es Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro, cuando B tiene la fórmula (3);
B_{2}' es Arg-Ile-Pro, cuando B tiene la fórmula (4);
B_{3} es Arg o N-Me-Arg;
B_{4} es Nle o Phe, con la condición de que cuando B_{2} es (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro, entonces B_{4} es Nle;
C_{1} es Phe o Tyr;
C_{2} es Glu;
C_{3} es Glu o Pro;
C_{4} es Ile;
C_{5} es Pro o (D)Ala;
C_{6} es Glu o Ala;
C_{7} es Glu;
C_{8} es Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha o Ala-Cha;
C_{9} es un enlace o (D)Glu; e
Y es OH, alcoxi C_{1}-C_{6} o amino sustituido con mono- o dialquilo (C_{4}-C_{4}).
Se prefieren especialmente los derivados peptídicos de fórmula (1), en los que:
X es hidrógeno, acetilo, o un grupo t-butiloxicarbonilo;
A_{1} es (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq, o N-Me-(D)Phe;
A_{2} es Pro;
A_{3} es Arg;
B es la fórmula (3);
B_{1} es Gly;
B_{2} es Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro;
B_{3} es Arg;
B_{4} es Nle o Phe, con la condición de que cuando B_{2} es (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro, entonces B_{4} es Nle;
C_{1} es Phe;
C_{2} es Glu;
C_{3} es Pro;
C_{4} es Ile;
C_{5} es Pro;
C_{6} es Glu o Ala;
C_{7} es Glu;
C_{8} es Tyr, Tyr-Cha o Ala-Cha;
C_{9} es un enlace o (D)Glu; e
Y es OH o alcoxi C_{1}-C_{6}.
Los péptidos de la invención pueden prepararse mediante una diversidad de procedimientos que los expertos en la técnica conocen. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan al procedimiento secuencial de fase sólida que puede realizarse utilizando métodos automáticos establecidos, como mediante el uso de un sintetizador de péptidos automático. En este procedimiento, un aminoácido \alpha-protegido se une a un soporte de resina. El soporte de resina empleado puede ser cualquier resina empleada de forma convencional en la técnica de la preparación en fase sólida de un polipéptido, preferiblemente poliestireno que se ha entrecruzado con divinilbenceno desde 0,5 a aproximadamente 3%, que se clorometilado o hidroximetilado para proporcionar sitios para la formación de ésteres con el aminoácido \alpha-protegido inicialmente introducido.
Un ejemplo de una resina de hidroximetilo se describe en Bodanszky et al., Chem. Ind (Londres), 38, 1597-1598 (1966). Una resina clorometilada se encuentra disponible en el mercado en Bio Rad Laboratories, Richmond, California, y la preparación de esta resina se describe en Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco, 1969), capítulo 1, pp. 1-6. El aminoácido protegido puede unirse a la resina mediante el procedimiento de Gisin, Helv. Chem. Acta., 56, 1476 (1973). Por ejemplo, para preparar el polipéptido en el que el extremo carboxi terminal es un resto (D)Glu, se acopla un Boc-D-Glu(Bzl) al poliestireno clorometilado en forma de su sal césica a aproximadamente 50ºC.
Después del acoplamiento del \alpha-aminoácido al soporte de resina se elimina el grupo protector utilizando cualquier procedimiento adecuado, como utilizando ácido trifluoroacético en cloruro de metileno, sólo ácido trifluoroacético, o HCl en dioxano. La desprotección se realiza a una temperatura entre 0ºC y la temperatura ambiente. Pueden utilizarse otras condiciones y reactivos de ruptura convencionales para la eliminación de los grupos protectores de \alpha-amino. Después de la eliminación del grupo protector de \alpha-amino se acoplan los otros aminoácidos \alpha-amino-protegidos en etapas en el orden deseado. Como alternativa, pueden acoplarse múltiples grupos aminoácidos mediante el método de disolución antes de acoplar con la secuencia de aminoácidos que está sobre el soporte de resina.
El grupo protector de \alpha-amino empleado con cada aminoácido introducido en la secuencia polipeptídica puede ser cualquier grupo protector conocido en la técnica. Entre las clases de grupos protectores de \alpha-amino contempladas se encuentran (1) grupos protectores de tipo acilo como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo, toluensulfonilo (tosilo), bencensulfonilo, nitrofenilsulfenilo, tritilsulfenilo, o-nitrofenoxiacetilo y \alpha-clorobutirilo; (2) grupos protectores de tipo uretano aromático como benciloxicarbonilo y benciloxicarbonilo sustituido, como p-clorobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, \alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxi-benciloxicarbonilo y benzhidriloxicarbonilo; (3) grupos protectores de uretano alifático como terc-butiloxicarbonilo (Boc), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo y aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores de tipo ciclolalquiluretano como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicarbonilo; (5) grupos protectores de tipo tiouretano como feniltiocarbonilo; (6) grupos protectores de tipo alquilo como trifenilmetilo (tritilo) y bencilo; y (7) grupos trialquilsilano como trimetilsilano. El grupo protector de \alpha-amino preferido es terc-butiloxicarbonilo.
La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado se encuentra dentro de la técnica. Un reactivo de acoplamiento particularmente adecuado en el que el aminoácido que se añade es Gln, Asn o Arg es N,N'-diisopropilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol. El uso de estos reactivos evita la formación de nitrilo y lactamas. Otros agentes de acoplamiento son (1) carbodiimidas (por ejemplo, N,N'-diciclohexilcarbodiimida y N-etil-N'-(\gamma-dimetilaminopropilcarbodiimida); (2) cianamidas (por ejemplo, N,N-dibencilcianamida); (3) ceteniminas; (4) sales isoxazólicas (por ejemplo, N-etil-5-fenilisoxazolio- 3'-sulfonato); (5) amidas heterocíclicas que contienen nitrógeno monocíclico de carácter aromático que contienen de uno a cuatro nitrógenos en el anillo, como imidazolidas, pirazolidas y 1,2,4-triazolidas. Las amidas heterocíclicas específicas que son útiles incluyen N,N'-carbonildiimidazol y N,N-carbonildi-1,2,4-triazol; (6) acetileno alcoxilado (por ejempolo, etoxiacetileno); (7) reactivos que forman un anhídrido mixto con el resto carboxilo del aminoácido (por ejemplo, etilcloroformiato e isobutilcloroformiato) o el anhídrido simétrico del aminoácido que se va a acoplar (por ejemplo, Boc-Ala-O-Ala-Boc); y (8) compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno que tienen un grupo hidroxi en un nitrógeno del anillo (por ejemplo, N-hidroxiftalimida, N-hidroxisuccinimida y 1-hidroxibenzotriazol). Otros reactivos activantes y su uso en el acoplamiento de péptidos se describen en Kapoor, J. Pharm. Sci., 59, pp. 1-27 (1970). Los inventores prefieren el uso del anhídrido simétrico como reactivo de acoplamiento para todos los aminoácidos, excepto Arg, Asn y Gln.
Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegido se introduce en el reactor de fase sólida en un exceso desde aproximadamente dos veces a aproximadamente cuatro veces. El acoplamiento se realiza en un medio de dimetilformamida:cloruro de metileno (1:1), o en dimetilformamida sola o cloruro de metileno sólo. En los casos en los que se produce un acomplamiento incompleto, el procedimiento de acoplamiento se repite antes de la eliminación del grupo protector de \alpha-amino, antes del acoplamiento del siguiente aminoácido en el reactor de fase sólida. El éxito de la reacción de acoplamiento en cada etapa de la síntesis se controla mediante la reacción de ninhidrina, según se describe en E. Kaiser et al., Analyt. Biochem., 34, 595 (1970).
Después de obtener la secuencia de aminoácidos deseada, el péptido se retira de la resina bajo condiciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, esto se puede realizar mediante el tratamiento del polipéptido unido a la resina con una disolución de anisol al 5% en ácido fluorhídrico anhidro.
Como se conoce en la técnica de la síntesis peptídica en fase sólida, muchos aminoácidos portan funcionalidades que requieren protección durante la preparación de la cadena. El uso y selección del grupo protector apropiado se encuentra dentro de la capacidad de un experto en la técnica, y depende del aminoácido que se va a proteger y de la presencia de otros restos aminoácidos protegidos en el péptido. La selección de este grupo protector de cadena lateral es crítica, porque debe ser un grupo que no se elimine durante la ruptura del grupo protector del resto \alpha-amino. Por ejemplo, el grupo hidroxilo carboxílico del ácido aspártico y del ácido glutámico puede protegerse con un grupo bencilo o ciclohexilo. El grupo protector preferido es bencilo.
Estos grupos pueden eliminarse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. La eliminación del grupo protector se realiza, de forma típica, después de terminar la síntesis de la cadena peptídica. Por ejemplo, el péptido se desprotege al mismo tiempo que la retirada del péptido de la resina mediante un tratamiento con una disolución de anisol al 5% en ácido fluorhídrico anhidro. Los grupos protectores también pueden eliminarse en cualquier otro momento apropiado.
La dosis anticoagulante y antiplaquetaria de un análogo de péptido de esta invención es desde 0,2 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal del paciente por día, dependiendo del paciente, la gravedad del trastorno trombótico que se va a tratar, y el análogo de péptido seleccionado. La dosis adecuada para un paciente concreto puede determinarse con facilidad. Preferiblemente se administran desde 1 a 4 dosis diarias, de forma típica con 5 mg a 100 mg de compuesto activo por dosis.
La terapia anticoagulante está indicada para el tratamiento y la prevención de una diversidad de trastornos trombóticos, en particular la enfermedad de arteria coronaria y cerebrovascular, así como para el tratamiento, por ejemplo, de la oclusión coronaria, disolviendo los coágulos existentes. La terapia antiplaquetaria está indicada para la prevención de la reaparición de infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Los expertos en este campo advertirán con facilidad las circunstancias que requieren una terapia anticoagulante y antiplaquetaria. Se cree que los péptidos de esta invención serán particularmente provechosos en la prevención de la trombosis coronaria después de angioplastia, la prevención de la trombocitopenia durante la circulación extracorporal, la oclusión post-terapia fibrinolítica, y para detener o retrasar un infarto de miocardio en curso.
El término "paciente", tal como se utiliza en la presente, significa mamíferos como primates, incluyendo seres humanos, ovejas, caballos, ganado vacuno, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones.
Aunque algunos de los derivados peptídicos pueden sobrevivir al paso a través del intestino después de la administración oral, los inventores prefieren la administración no oral, por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal; la administración mediante inyección depot; mediante la preparación de implantes; o mediante la aplicación a membranas mucosas, como las de la nariz, garganta y tubos bronquiales, por ejemplo, en una lata de aerosol que contiene un derivado peptídico de esta invención en forma de pulverizado o polvo seco.
Para la administración parenteral, los compuestos pueden administrarse como dosificaciones inyectables de una disolución o suspensión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril, como agua y aceites con o sin la adición de un tensioactivo y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de aceites que pueden emplearse en estas preparaciones son los aceites de petróleo, animales, vegetales, o de origen sintético, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general los vehículos líquidos preferidos son agua, disolución salina, dextrosa acuosa y disoluciones de azúcares relacionados, etanol y glicoles como propilenglicol o polietilenglicol, en particular para disoluciones inyectables.
Ejemplos
Los ejemplos 1-12 representan la síntesis típica de los péptidos de fórmula 1. Estos ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que limiten la invención de ninguna manera. Un experto en la técnica puede adquirir los reactivos y materiales de partida para los ejemplos 1-12. Tal como se utilizan en los ejemplos 1-12, los siguientes términos tienen los significados indicados: "DCM" se refiere a diclorometano, "DIEA" se refiere a diisopropiletilamina, "MeOH" se refiere a metanol, "DCC" se refiere a N,N'-diciclohexilcarbodiimida, "DMF" se refiere a N,N'-dimetilformamida, "HOBt" se refiere a 1-hidroxibenzotriazol, "TFA" se refiere a ácido trifluoroacético, "eq." se refiere a equivalentes, "meq" se refiere a miliequivalentes, "g" se refiere a gramos, "mg" se refiere a miligramos, "mmol" se refiere a milimoles, "ml" se refiere a mililitros, "ºC" se refiere a grados Celsius, "TLC" se refiere a cromatografía en capa fina, "R_{f}" se refiere al factor de retención, "\mul" se refiere a microlitros, "\mug" se refiere a microgramos, "\muM" se refiere a micromolar, "mm Hg" se refiere a milimetros de mercurio, y "\delta" se refiere a partes por millón campo abajo del tetrametilsilano.
Ejemplo 1 Preparación de:
5
(SEQ ID NO:1)
Una Boc-(D)Glu(Bzl)-Pam-resina (Peninsula Laboratories, Belmont, California) se alarga mediante la desprotección en etapas y acoplamiento del posterior Boc-aminoácido utilizando un sintetizador de péptidos semiautomático Dupont 250 según el siguiente protocolo:
Reactivo/disolvente Tiempo (segundos) n^{o} de repeticiones
DCM 30 1
MeOH 30 2
DCM 30 3
TFA:anisol:DCM (48:2:50) 60 1
TFA:anisol:DCM (48:2:50) 1200 1
DCM 30 3
DIEA:DCM (10:90) 60 3
DCM 30 2
Boc-aminoácido 1800 1
DMF 30 1
DCM 30 1
DIEA:DCM (10:90) 30 1
DCM 30 2
Todos los Boc-aminoácidos se acoplan en forma de sus anhídridos simétricos preformados en exceso de dos veces, con la excepción de Arg que se acopla en un exceso de cuatro veces como su éster HOBt. Los anhídridos simétricos se preparan como sigue:
Disolver los Boc-aminoácidos (4 eq.) en DCM, seguido de la adición de DCC 0,5 M/DCM (2 eq.). Agitar la reacción durante 5 minutos. La formación del anhídrido simétrico produce la precipitación de diciclohexilurea, que se elimina mediante filtración. Después añadir el filtrado al péptido-resina y diluir la mezcla de acoplamiento con un volumen igual de DMF.
El éster HOBt de Arg se forma de modo similar. Disolver Boc-Arg(Tos) (4 eq.) en DCM. Añadir HOBt 0,5 M/DMF (4 eq.) y DCC 0,5 M/DCM (4 eq.). Eliminar la diciclohexilurea mediante filtración, añadir el filtrado al péptido-resina y diluir la mezcla de acoplamiento con un volumen igual de DMF.
\newpage
Ensayar el péptido-resina después de cada acoplamiento para detectar la presencia de cualquier amina libre utilizando el procedimiento de ninhidrina de Kaiser, como se conoce en la técnica. Los aminoácidos se reacoplan si es necesario.
Después del anterior procedimiento, la elongación de la Boc-D-Glu(Bzl)- Pam-resina (8,06 g, 0,31 meq/g, 2,5
mmol, adquirida en Peninsula Laboratories, Belmont, California) produce el péptido-resina (D)Phe^{1}-Pro-Arg(Tos)-Pro-Gly^{5}- (D) Cys(Mbz)-Gly-Arg(Tos)-Gly-Asp(Chx)^{10}-Nle-Pro-(D) Cys(Mbz)-Gly-Asp(Chx)^{15}-Tyr(BrZ)-Glu(Bzl)-Pro-Ile-Pro^{20}-Glu(Bzl)-Glu (Bzl)-Ala-Cha-(D)Glu(Bzl)-Pam-resina (19,4 g de péptido-resina). Los siguientes aminoácidos requieren un segundo acoplamiento con un equivalente molar de su anhídrido simétrico: Boc-Cha^{24}, Boc-Glu(Bzl)^{21}, Boc-Tyr(BrZ)^{16}, Boc-Asp(Chx)^{15}, Boc-(D)Cys(Mbz)^{6}, Boc-Pro^{4}, Boc-Pro^{2} y Boc-(D)Phe1. El acoplamiento de Boc-Arg(Tos)^{2} se repite dos veces con un exceso de dos veces de su éster HOBt y posteriormente se remata con anhídrido acético:DIEA:DCM (10:5:85).
El péptido-resina preparado anteriormente (D)Phe^{1}-Pro-Arg(Tos)-Pro-Gly^{5}-(D)Cys(Mbz)-Gly-Arg(Tos)-Gly-Asp (Chx)^{10}-Nle-Pro-(D)Cys(Mbz)-Gly-Asp(Chx)^{15}-Tyr(BrZ)-Glu (Bzl)-Pro-Ile-Pro^{20}-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-(D)
Glu(Bzl)-Pam-resina se divide en 5 porciones. Cada porción se rompe, se desprotege y se cicla bajo las siguientes condiciones. Suspender el péptido-resina (3,88 g) en ácido fluorhídrico anhidro (20 ml) en presencia de anisol (al 5%). Agitar la reacción a aproximadamente 0ºC durante aproximadamente 30 minutos. Después eliminar el ácido fluorhídrico al vacío y extraer el residuo con ácido acético al 50% (2 x 10 ml), ácido acético (2 x 5 ml) y agua (3 x 10 ml). Diluir los extractos reunidos hasta 1 litro con agua y ajustar el pH a 8,5 con hidróxido de amonio. Añadir
K_{3}Fe(CN)_{6} (1,0 M, aproximadamente 55 ml) durante 15 minutos hasta que persiste un color amarillo, y agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ajustar el pH hasta 4,0 con ácido acético. Añadir la resina de intercambio aniónico (AG3 x 4A, Bio-Rad) y agitar hasta que desaparece el color amarillo. Recoger la resina mediante filtración y liofilizar el filtrado para suministrar el péptido bruto.
Disolver el péptido bruto en ácido acético al 50% y aplicar a una columna de Sephadex G-10 (2,5 x 70 cm). Eluir con ácido acético al 50% a aproximadamente 10,5 ml/hora. El péptido eluye a aproximadamente 70-150 ml. Diluir este eluido con agua y liofilizar para proporcionar un total de 6,17 g. El material desalado se purifica aún más mediante HPLC preparativa en fase inversa (Dynamax C_{18}, 21,4 x 250 mm, Rainin) a aproximadamente 40 ml/min con un gradiente de TFA acuoso al 0,1%/acetonitrilo utilizando un sistema Beckman Prep 350 para proporcionar el péptido puro (1,3 g).
6
(SEQ ID NO:1)
El péptido de los siguientes ejemplos puede prepararse mediante el mismo método o un método análogo.
Ejemplo 2
7
(SEQ ID NO:2)
Ejemplo 3
8
(SEQ ID NO:20)
Ejemplo 4
9
(SEQ ID NO:11)
Ejemplo de referencia 5
No está incluido en la presente invención.
10
(SEQ ID NO:12)
Ejemplo 6
11
(SEQ ID NO:15)
Ejemplo 7
12
(SEQ ID NO:16)
Ejemplo 8
13
(SEQ ID NO:18)
Ejemplo 9
14
(SEQ ID NO:19)
Ejemplo 10
15
(SEQ ID NO:21)
Ejemplo 11
16
(SEQ ID NO:22)
Ejemplo 12
17
(SEQ ID NO:10)
Ensayos biológicos
Como se ha indicado anteriormente, los compuestos de esta invención poseen la propiedad de mostrar una inhibición significativa de la trombina, indicando que son anticoagulantes eficaces útiles para la prevención de enfermedades trombóticas venosas y arteriales, así como de la angina inestable, la prevención de la oclusión abrupta de vasos después de angioplastia coronaria, como terapia adyuvante a la trombolisis y la trombosis de venas profundas después de cirugía ortopédica. Puesto que los compuestos de esta invención también contienen secuencias RGD-X cíclicas, que se encuentran en el resto enlazador de la porción B, también actúan como antagonistas del receptor de GP IIb/IIIa de plaquetas.
Efecto anticoagulante y antitrombótico del péptido del ejemplo 2
El péptido del ejemplo 2 (péptido 2) (SEQ ID NO:2), compuesto de un inhibidor del sitio catalítico de la trombina (fPR) acoplado a un análogo de hirudina_{55-65} mediante un antagonista de receptor de GP IIb/IIIa de plaquetas cíclico (RGD-X), se compara con sus componentes peptídicos individuales. Nótese que simplemente se sugiere el equipo experimental que aparece a continuación y no se pretende que limite la invención de ninguna manera.
Animales experimentales
Las ratas macho Sprague-Dawley (300-400 g) pueden adquirirse en Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN 46229) y se utilizan en estos estudios.
Toma de muestras de sangre
Pueden extraerse muestras de sangre en jeringas de plástico que contienen citrato de trisodio al 3,8% (1:10). El plasma se preparó mediante centrifugación a 2.000 g de fuerza durante 10 minutos. La sangre venosa para los estudios in vitro se recoge de hombres voluntarios, sanos, que no toman fármacos.
Ensayos de coagulación
Las determinaciones del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) se realizan utilizando los reactivos y métodos de Dade Diagnostics, Inc. (Aguada, Puerto Rico, 00602). Los tiempos de coagulación de la trombina se determinan mediante incubación de 0,1 ml de plasma de rata a 37ºC con 0,1 ml de tampón Tris 0,1 M, pH 7,5, durante 30 segundos. La coagulación comienza con 0,1 ml de una disolución de trombina bovina (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO 63178) (12 unidades NIH/ml). Todos los tiempos de coagulación se miden de forma semiautomática utilizando un contador de tiempo de coagulación automático MLA-Electra 750, MLA, Inc. (Pleasantville, NY 10570). La concentración requerida para doblar el tiempo de coagulación (ID_{2}) se calcula utilizando una regresión lineal simple.
Agregación plaquetaria in vitro
Se preparó plasma rico en plaquetas humano (PRP) mediante centrifugación a 200 g de fuerza durante 10 minutos a temperatura ambiente. El plasma pobre en plaquetas (PPP) se prepara mediante centrifugación a 2.000 g de fuerza durante 10 minutos. El PRP se expone sólo a equipo de laboratorio de plástico. Todos los experimentos se terminan a las 3 horas de la recogida de sangre. La agregación plaquetaria se mide de forma fotométrica utilizando un agregómetro de canal dual (Chrono-log Corp., Haverstown, PA 19083). Se define una transmisión de luz de 100% con PPP autólogo.
\newpage
El porcentaje máximo de cambio en la transmisión de luz se determina a partir de PRP después de la adición de ADP (1 \muM) o trombina. La agregación plaquetaria inducida por trombina (0,2-2,0 unidades/ml) depende de la concentración, y se utiliza la concentración semimáxima para los estudios de inhibición. El péptido 2 (SEQ ID NO:2) se incuba con PRP (0,45 ml) durante 30 segundos antes de la adición de ADP o trombina. La agregación se mide en un volumen total de 0,5 ml. Las respuestas inhibitorias se expresan como porcentaje de inhibición cuando se comparan con un valor control. La concentración que produce 50% de inhibición de la agregación (IC_{50}) se calcula mediante una regresión lineal simple.
Modelo de trombosis arterial por FeCl_{3} en ratas (in vivo)
También se utilizan los efectos antitrombóticos in vivo del péptido 2 (SEQ ID NO:2) en ratas para la evaluación. Por ejemplo, el péptido 2 (SEQ ID NO:2) se evalúa para determinar su actividad antitrombótica en un modelo de trombosis de la arteria carótida en ratas inducida por FeCl_{3} mediada por trombina y dependiente de plaquetas, según R.J. Broersma, et al., Thromb. Res., 64, 405-412 (1991).
Resultados
Los resultados de este estudio demuestran que el péptido 2 (SEQ ID NO:2) es más potente que sus componentes individuales como anticoagulante y antitrombina en los ensayos de coagulación del plasma y de agregación plaquetaria.
Con respecto a las tablas, los restos aminoácidos dentro de las secuencias peptídicas se nombran utilizando el sistema de nomenclatura de una letra, excepto para algunos de los aminoácidos modificados y/o grupos protectores, que pueden indicarse mediante el sistema de nomenclatura de tres letras y se encierran entre paréntesis. Además, el enlace disulfuro que conecta los restos (D)Cys' se representa mediante un subrayado bajo los dos restos (D)Cys', y todos los restos que estén en la parte de bucle de la porción B.
TABLA I Actividad anticoagulante del péptido 2 en plasma humano comparada con sus componentes
Péptido Secuencia peptídica ID_{2} \mum
aPTT tiempo de
trombina
2 fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,060 0,024
2a cGRGDFPc - >1.000
2b (Suc)YEPIPEEA(Cha)e 4 0,564
2c fPRPG >1000 510
2d (CH_{3})fPR 2 0,587
El valor ID_{2} es la concentración necesaria para doblar el tiempo de coagulación del control por triplicado. aPTT, tiempo de tromboplastina parcial activada.
Haciendo referencia a la tabla I, la actividad anticoagulante del péptido 2 (SEQ ID NO:2) se compara con sus componentes (péptido 2a (SEQ ID NO:3), péptido 2b (SEQ ID NO:4), péptido 2c (SEQ ID NO:5) y péptido 2d (SEQ ID NO:6)) en ensayos del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) y del tiempo de trombina en plasma humano normal. Los péptidos 2a-2d (SEQ ID NO:3-6) no son de esta invención. El péptido 2 (SEQ ID NO:2) dobla (ID_{2}) el aPTT y los tiempos de trombina en aproximadamente 60 y 24 nM, respectivamente. El péptido 2 (SEQ ID NO:2) es al menos 20 veces más activo que el péptido 2b (SEQ ID NO:4) o 2d (SEQ ID NO:6) (el inhibidor del sitio catalítico estable Me-fPR), mientras que 2c (SEQ ID NO:5) (el pentapéptido fPRPG) tiene actividad anticoagulante sólo a concentraciones mucho mayores. El péptido 2a (SEQ ID NO:3) (el péptido cíclico RGD-X) es inactivo como anticoagulante.
TABLA II Efecto del péptido 2 sobre ensayos de coagulación y plaquetas en rata y ser humano
Rata Ser humano
ID_{2}, nM
Actividad anticoagulante aPTT 181\pm43 60\pm18
Tiempo de trombina 116\pm12 24\pm7
IC_{50}, \muM
Inhibición de la agregación plaquetaria ADP 65\pm2 19\pm5
Trombina 0,014\pm0,002 0,060\pm0,026
El valor ID_{2} es la concentración necesaria para doblar el tiempo de coagulación del control por triplicado. aPPT, tiempo de tromboplastina parcial activada.
Haciendo referencia a la tabla II, los estudios anticoagulantes del péptido 2 (SEQ ID NO:2) se realizan en plasma de rata. El ID_{2} para aPPT y el tiempo de trombina es aproximadamente 181 y 116 nM, respectivamente. Por tanto, el péptido 2 (SEQ ID NO:2) es 3-5 veces menos activo como anticoagulante en plasma de rata cuando se compara con plasma humano.
TABLA III Inhibición de la agregación plaquetaria humana
Péptido Secuencia peptídica ID_{50} \mum
ADP Trombina
2 fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA(Cha)e 19 0,060
2a cGRGDFPc 20 13
2b (Suc)YEPIPEEA(Cha)e 895 3
2d CH_{3}fPR >1.000 0,2
El valor ID_{50} es la concentración necesaria para inhibir la agregación plaquetaria en PRP en 50% de la agregación control por triplicado.
Como se ilustra en la tabla III, la agregación de plaquetas humanas inducida por ADP y trombina es inhibida por el péptido 2 (SEQ ID NO:2). La concentración que inhibe la agregación plaquetaria inducida por ADP en 50% (IC_{50}) es aproximadamente 19 \muM. Es similar a la del péptido RGD-X cíclico (IC_{50} = 20 \muM), el péptido 2a (SEQ ID NO:3). Los péptidos antitrombina 2b (SEQ ID NO:4) y 2d (SEQ ID NO:6) son esencialmente inactivos como inhibidores de la agregación plaquetaria inducida por ADP (IC_{50} = 895 y >1.000 \muM, respectivamente). El péptido 2 (SEQ ID NO:2) inhibe la agregación plaquetaria inducida por trombina con un valor de IC_{50} de 60 nM, y es más activo que sus componentes (péptido 2b (SEQ ID NO:4) (IC_{50} = 2 \muM), péptido 2d (SEQ ID NO:6) (IC_{50} = 200 nM) y péptido 2a (SEQ ID NO:3) (IC_{50} = 13 \muM).
Por contraste, la agregación de plaquetas de rata inducida por ADP y trombina es inhibida por el péptido 2 (SEQ ID NO:2) con una IC_{50} = 65 \muM y 14 nM, respectivamente (véase la tabla II). Por tanto, el péptido 2 (SEQ ID NO:2) es 3-4 veces menos activo en plasma de rata cuando se compara con plasma humano rico en plaquetas.
TABLA IV Efecto del péptido 2 sobre la trombosis arterial en ratas
péptido 2 n tiempo de oclusión (min) n animales
(nmol/kg/min)ª control tratados ocluidos/tratados
10 6 15,2\pm 2,0 26,3\pm5,4* 5/6
25 5 16,9\pm1,1 50,8\pm5,4** 2/5
50 5 16,8\pm1,8 55,5\pm10,8*^{b} 1/5
^{a} Infusionado en 60 min comenzando 15 minutos antes de las lesiones con FeCl_{3}.
^{b} Tiempo de oclusión > 90 min (n = 4); *p < 0,05 frente al control;
p
> 0,01 &&!5i frente al control.
El péptido 2 (SEQ ID NO:2) se evalúa para determinar su actividad antitrombótica en el modelo de trombosis de arteria carótida de rata inducida por FeCl_{3}. La oclusión trombótica disminuye de una manera dependiente de la dosis mediante la infusión intravenosa continua del péptido 2 (SEQ ID NO:2) durante 1 hora, comenzando 15 minutos antes de la aplicación de FeCl_{3} a la arteria con una velocidad de 10, 25 y 50 nmol/kg/min (véase la figura 1). La oclusión se evita en cuatro de cinco ratas con una dosis de 50 nmol/kg/min. Con una velocidad de 25 y 10 nmol/kg/min, la oclusión se evita en tres de cinco, y una de seis ratas, respectivamente. El compuesto antitrombina de sitio catalítico (péptido 2d) (SEQ ID NO:6) prolonga, de una manera dependiente de la dosis, el tiempo de oclusión con unas velocidades de infusión de 50, 100 y 200 nmol/kg/min (véase la figura 2).
TABLA V Efecto del péptido 2 y sus componentes sobre la trombosis arterial en ratas
Péptido Dosificación^{a} n Tiempo de oclusión (min) n animales
control tratados ocluidos/tratados
2 A 5 16,8\pm1,8 55,5\pm10,8* 1/5
2a B 4 18,5\pm1,2 19,1\pm2,0 4/4
2b C 6 16,9\pm1,9 22,4\pm7,1 5/6
2d D 5 19,3\pm1,5 44,1\pm1,0** 1/5
^{a} Infusionado en 60 min comenzando 15 minutos antes de las lesiones con FeCl_{3}
*p < 0,05 frente al control; **p > 0,01 frente al control.
A: 50 nmol/kg/min, vía intravenos
B: 100 nmol/kg/min, vía intravenosa
C: 500 nmol/kg/min, vía intravenosa
D: 200 nmol/kg/min, vía intravenosa
La oclusión se evita en cuatro de cinco ratas con una velocidad de dosis de 50 nmol/kg/min. Ni el análogo de hirudina (péptido 2b) (SEQ ID NO:4), a 500 nmol/kg/min, ni el péptido RGD-X cíclico (péptido 2a) (SEQ ID NO:3), a 100 nmol/kg/min, evita la oclusión en estas velocidades en este modelo.
TABLA VI Efecto del péptido 2 intravenoso en ensayos de coagulación^{a}
péptido 2 nmol/kg/min control múltiple
aPTT^{b} tiempo de trombina
10 2,9\pm0,7(5) 3,9\pm0,5(5)
25 3,6\pm1,2(4) 5,8\pm1,8(4)
50 3,7\pm0,7(2) 4,2\pm0,4(2)
^{a} Las muestras de sangre se toman al final de los estudios de oclusión arterial
inducida por FeCl_{3} en ratas.
^{b} aPTT, tiempo de tromboplastina parcial activada (n = ratas)
Efectos anticoagulante y antitrombótico del péptido del ejemplo 1
El péptido del ejemplo 1 (péptido 1) (SEQ ID NO:1), al igual que el péptido 2 (SEQ ID NO:2), compuesto de un inhibidor de sitio catalítico de trombina (fPR) acoplado con un análogo de hirudina_{55-65} mediante un antagonista del receptor de GP IIb/IIIa de plaquetas cíclico (RGD-X), se comparó con sus componentes peptídicos individuales. Sin embargo, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) es un análogo del péptido 2 (SEQ ID NO:2), en el que la fenilalanina (Phe) en la secuencia RGD-X cíclica del péptido 2 (SEQ ID NO:2) se sustituye por norleucina (Nle). En este estudio, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) se compara con el péptido 2 (SEQ ID NO:2), el péptido 3 (SEQ ID NO:7) (un análogo del péptido 1 en el que el resto asociador de exositio de unión a aniones (porción C) está truncado) y el péptido 4 (SEQ ID NO:8) (un análogo del péptido 1 que contiene sólo L-aminoácidos naturales. Además, el péptido 5 (SEQ ID NO:9) (un análogo del péptido 1 (SEQ ID NO:1) que posee un bucle RGD-X de 10 aminoácidos y sólo L-aminoácidos naturales) se compara con el péptido 6 (el péptido del ejemplo 12) (SEQ ID NO:10) (un análogo del péptido 1 que posee un bucle RGD-X de 10 aminoácidos) para ilustrar los efectos que la orientación del bucle RGD-X tiene sobre la actividad de los péptidos de esta invención. Los péptidos 1, 2 y 6 (SEQ ID NO:1, 2 y 10) son de esta invención, mientras que los péptidos 3-5 (SEQ ID NO:7-9) no son de esta invención. Nótese que simplemente se sugiere el equipo experimental que aparece a continuación y no se pretende que limite la invención de ninguna manera.
Animales experimentales
Las ratas macho Sprague-Dawley (300-400 g) pueden adquirirse en Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN 46229) y en estos estudios se utilizan perros sabuesos de raza mestiza de ambos sexos (6-11 kg).
Los perros se anestesian con pentobarbital sodio (30 mg/kg, por vía intravenosa). La arteria femoral y ambas venas femorales se aislan y se canulan para registrar la presión sanguínea (Gould P23ID, Gould Inc., Medical Products Division, Oxnard, CA 93030), para la toma de muestras y la administración del fármaco. Se colocan terminales de electrocardiógrafo para las patas de forma subcutánea para controlar la ECG II de terminal de electrocardiógrafo. Se registra la presión sanguínea y las medidas de ECG (aparato registrador Gould 440, Gould Inc., Instruments Systems Division, Cleveland, OH 44114).
Toma de muestras de sangre
Pueden extraerse muestras de sangre en jeringas de plástico que contienen citrato de trisodio al 3,8% (1:10). El plasma se preparó mediante centrifugación a 2.000 g de fuerza durante 10 minutos. La sangre venosa para los estudios in vitro se recoge de hombres voluntarios, sanos, que no toman fármacos.
Ensayos de coagulación, tiempo de sangrado moderado y hematología
Las determinaciones del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) se realizan utilizando los reactivos y métodos de Dade Diagnostics, Inc. (Aguada, Puerto Rico, 00602). Los tiempos de coagulación de la trombina se determinan mediante incubación de 0,1 ml de plasma de rata a 37ºC con 0,1 ml de tampón Tris 0,1 M, pH 7,5, durante 30 segundos. La coagulación comienza con 0,1 ml de una disolución de trombina bovina (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO 63178) (12 unidades NIH/ml). Todos los tiempos de coagulación se miden de forma semiautomática utilizando un contador de tiempo de coagulación automático MLA-Electra 750, MLA, Inc. (Pleasantville, NY 10570). La concentración requerida para doblar el tiempo de coagulación (ID_{2}) se calcula utilizando una regresión lineal simple. La determinación de t_{1/2} se calcula para la actividad antitrombina (tiempo de trombina) después de la infusión del péptido 1 (SEQ ID NO:1) a una velocidad de 1 y 5 nmol/kg/min. La estimación de t_{1/2} se realiza mediante una regresión lineal de los datos de la respuesta frente al tiempo.
Los tiempos de sangrado moderado se realizan en la superficie mediana de la pata izquierda después de eliminar el pelo (Nair, Carter-Wallace, Inc., Nueva York, NY 10105) utilizando un dispositivo de tiempo de sangrado Surgicutt® (International Technidyne Corp., Edison, NJ 08820). Los tiempos de sangrado moderado se determinan 60 y 30 min antes de la administración del fármaco, 15, 30, 60, 120, 180 y 240 min después de la administración del fármaco.
Los recuentos de células sanguíneas completas y el análisis del contenido en hemoglobina se determinan en una muestra de 140 \mul de sangre anticoagulada con EDTA procesada con un analizador de hematología (Technicon Hl, Miles Technicon, Tarrytown, NY 10591). Las muestras se toman 60 y 30 min antes de la administración del fármaco, 15, 30, 60, 120, 180 y 240 min después de la administración del fármaco.
Ensayos de agregación de plaquetas
El plasma humano rico en plaquetas (PRP) se prepara mediante centrifugación a 200 g de fuerza durante 10 minutos a temperatura ambiente. El plasma pobre en plaquetas (PPP) se prepara mediante centrifugación a 2.000 g de fuerza durante 10 minutos. El PRP se expone sólo a equipo de laboratorio de plástico. Todos los experimentos se terminan a las 3 horas de la recogida de sangre. La agregación plaquetaria se mide de forma fotométrica utilizando un agregómetro de canal dual (Chrono-log Corp., Haverstown, PA 19083). Se define una transmisión de luz de 100% con PPP autólogo. El porcentaje máximo de cambio en la transmisión de luz se determina a partir de PRP después de la adición de ADP (1 \muM) o trombina. La agregación plaquetaria inducida por trombina (0,2-2,0 unidades/ml) depende de la concentración, y se utiliza la concentración semimáxima para los estudios de inhibición. El péptido 2 (SEQ ID NO:2) se incuba con PRP (0,45 ml) durante 30 segundos antes de la adición de ADP o trombina. La agregación se mide en un volumen total de 0,5 ml. Las respuestas inhibitorias se expresan como porcentaje de inhibición cuando se comparan con un valor control. La concentración que produce 50% de inhibición de la agregación (IC_{50}) se calcula mediante una regresión lineal simple.
La agregación plaquetaria en sangre se realiza en sangre citrada diluida con disolución salina (1:2) utilizando un agregómetro de sangre completa (Chrono- log, modelo 540-VS). Se colocan partes alícuotas de sangre diluida en cubetas de plástico y se incuban a 37ºC durante 15 minutos. Se utiliza la adición de ADP (2 \muM) o trombina (0,4 U/ml) para inducir la agregación y se registra el cambio en la impedancia eléctrica sobre un aparato registrador de cinta. La agregación se mide en un volumen de sangre total de 1,0 ml. Las respuestas inhibitorias se expresan como porcentaje de inhibición cuando se comparan con un valor control. La concentración que produce 50% de inhibición de la agregación (IC_{50}) se calcula mediante una regresión lineal simple.
Modelo de trombosis arterial con FeCl_{3} en ratas (in vivo)
También se utilizan para la evaluación los efectos antitrombóticos in vivo del péptido 1 (SEQ ID NO:1) en ratas. Por ejemplo, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) se evalúa para determinar su actividad antitrombótica en el modelo de trombosis de arteria carótida en rata inducida por FeCl_{3} mediada por trombina y dependiente de plaquetas, según R.J. Broersma et al., Thromb. Res., 64, 405-412 (1991).
Resultados
Los resultados de este estudio demuestran que el péptido 1 (SEQ ID NO:1), de forma sorprendente, es mucho más potente que el péptido 3 (SEQ ID NO:7), el péptido 4 (SEQ ID NO:8), o incluso el péptido 2 (SEQ ID NO:2) como inhibidor de la agregación plaquetaria inducida por trombina.
TABLA VII Actividad anticoagulante en plasma humano del péptido 1 comparado con los péptidos 2, 3 y 4
Péptido Secuencia peptídica ID_{2}, nM^{a}
aPTT tiempo de
trombina
3 fPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPE 998\pm108 141\pm52
4 fPRPGCGRGD(Nle)PCGDYEPIPEEAYD 115\pm24 14\pm3
2 fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA(Cha)e 60\pm18 24\pm7
1 fPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 12\pm0,2 5\pm1
^{a} El valor ID_{2} (media \pm D.E.) es la concentración necesaria para doblar los tiempos de
coagulación (en segundos) del control por triplicado. aPTT, tiempo de tromboplastina
parcial activada.
Haciendo referencia a la tabla VII, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) es un análogo del péptido 2 (SEQ ID NO:2), en el que la fenilalanina (Phe) en la secuencia RGD-X cíclica del péptido 2 (SEQ ID NO:2) se sustituye por norleucina (Nle). El péptido 3 (SEQ ID NO:7) es un análogo del péptido 2 (SEQ ID NO:2), en el que el resto asociador de exositio de unión a aniones (porción C) está truncada. El péptido 4 (SEQ ID NO:8) es un análogo del péptido 4 (SEQ ID NO:4) que contiene sólo L-aminoácidos naturales. Mientras que el péptido 1 (SEQ ID NO:1) y 2 (SEQ ID NO:2) son de esta invención, los péptidos 3 (SEQ ID NO:7) y 4 (SEQ ID NO:8) no son de esta invención.
El péptido 1 (SEQ ID NO:1) dobla (ID2) el aPTT y el tiempo de trombina con unas concentraciones de 12 y 4 nM, respectivamente. Esto corresponde a un aumento en cinco veces de los valores de la actividad anticoagulante, comparado con el péptido 2 (SEQ ID NO:2). La tabla VII indica que los péptidos 3 (SEQ ID NO:7) y 4 (SEQ ID NO:8) tienen menos actividad anticoagulante que el péptido 2.
TABLA VIII Inhibición de la agregación plaquetaria humana por el péptido 1 comparado con los péptidos 2, 3 y 4
Péptido Secuencia peptídica IC_{50}^{a}
ADP \muM trombina nM
3 FPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPE 29,3\pm7,8 407\pm372
4 FPRPGCGRGD(Nle)PCGDYEPIPEEAYD 35,9\pm0,5 408\pm180
2 FPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA(Cha)e 18,7\pm4,6 60\pm26
1 FPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 31,7\pm2,3 0,4\pm0,05
^{a} El valor IC_{50} (media \pm D.E.) es la concentración necesaria para inhibir la agregación
plaquetaria en PRP en 50% de la agregación control por duplicado.
Agregación plaquetaria inducida por trombina
La inhibición dependiente de la dosis de la agregación plaquetaria humana de los péptidos 1-4 (SEQ ID NO:1, 2, 7 y 8) se ilustra en la tabla VIII. La agregación plaquetaria inducida por trombina es inhibida de forma más eficaz por el péptido 1 (SEQ ID NO:1) con un valor de IC_{50} de 399 \pm 76 pM, un aumento de 150 veces frente al péptido 2 (SEQ ID NO:2) (IC_{50} = 60 \pm 26 nM).
El péptido 4 (SEQ ID NO:8), el análogo que tiene sólo L-aminoácidos naturales, y el péptido 3 (SEQ ID NO:7), el análogo con el COOH-terminal acortado, son aproximadamente 1.000 menos activos que el péptido 1.
Agregación plaquetaria inducida por ADP
La actividad desintegrina se mide mediante la inhibición dependiente de la dosis de la agregación de plaquetas humanas inducida por ADP y se ilustra en la tabla VIII. Se demuestra que el péptido 1 (SEQ ID NO:1) (IC_{50} = 32 \muM) y el péptido 2 (SEQ ID NO:2) (IC_{50} = 19 \muM) tienen actividad similar. El péptido 4 (SEQ ID NO:8), el análogo que tiene sólo L-aminoácidos naturales, y el péptido 3 (SEQ ID NO:7), el análogo con el COOH-terminal acortado, son aproximadamente equivalentes al péptido 1 (SEQ ID NO:1) en actividad desintegrina.
Agregación plaquetaria en sangre completa
La agregación plaquetaria en sangre completa humana y de rata inducida por una combinación de ADP (0,5 \muM) y trombina (0,025 U/ml) es inhibida por el péptido 1 con una IC_{50} de 2,9 y 42,5 nM, respectivamente (véase la figura 3). Por tanto, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) es aproximadamente 15 veces más activo en sangre humana cuando se compara con sangre de rata. Además, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) inhibe completamente la agregación en sangre humana, por contraste con una inhibición en meseta en sangre de rata a aproximadamente 50%.
Administración intravenosa del péptido 1 en perros
El péptido 1 (SEQ ID NO:1) demuestra inhibición de la trombina y la agregación plaquetaria cuando se infusiona durante 1 hora en perros anestesiados. Además, el efecto del péptido 1 (SEQ ID NO:1) es de corta duración después de terminar la infusión. Los tiempos de trombina (figura 4) y aPTT (figura 5) se prolongan de forma dependiente de la dosis con unas velocidades de infusión dee 1 y 5 nmol/kg/min. Los tiempos de trombina son más sensibles a la inhibición por la infusión del péptido 1 (SEQ ID NO:1) que los ensayos de aPTT. El resumen de los datos en la figura 2 ilustra que la inhibición máxima es completa a los 15-30 minutos. Después de terminar la infusión (60 min) se restablece la actividad trombina con una farmacodinámica t_{1/2} de 17 \pm 0,1 y 26 \pm 3,2 min, respectivamente, para una infusión de 1 y 5 nmol/kg/min.
La inhibición de la agregación plaquetaria confirma el efecto del péptido 1 (SEQ ID NO:1) sobre los ensayos de coagulación. La infusión del péptido 1 (SEQ ID NO:1) inhibe la agregación plaquetaria inducida por trombina en 15 min (figura 6). La inhibición se mantiene durante un periodo de infusión de 1 hora en 2 de 3 perros. Se restablece la actividad plaquetaria con una farmacodinámica t_{1/2} de 12,8 \pm 1,1 min después de terminar la infusión de 1 nmol/kg/min.
La agregación plaquetaria inducida por ADP es inhibida en 1 de 3 perros en cada velocidad de dosis. La agregación plaquetaria inducida por ADP in vitro es inhibida con niveles de \muM. Se cree, aunque esta invención no está limitada por esta suposición, que la dilución de sangre con disolución salina 1:2 en la agregación plaquetaria de sangre completa reduce la concentración del péptido 1 (SEQ ID NO:1) necesaria para una inhibición eficaz de la agregación plaquetaria inducida por ADP. Los tiempos de sangrado (figura 7) y los recuentos de plaquetas (figura 8) permanecen estables en perros que reciben el péptido 1 (SEQ ID NO:1). La presión sanguínea (figura 9) y la frecuencia cardíaca (figura 10) se elevan de forma modesta de una manera dependiente de la dosis. Estos parámetros vuelven a los valores control de línea basal 2 horas después de terminar la infusión.
TABLA IV Efecto del péptido 1 sobre la trombosis arterial en ratas
Péptido 1 nmol/kg/minª Tiempo de oclusión n animales
Control Tratados ocluidos/tratados
5 15,7\pm1,4 24,1\pm5,8 6/6
10 17,1\pm1,3 40,4\pm5,8** 4/7
25 18,6\pm1,7 58,1\pm9,5** 1/5
^{a} Infusionado a lo largo de 60 min, comenzando 15 min antes de las lesiones con FeCl_{3}.
**p<0,01 frente al control.
El péptido 1 (SEQ ID NO:1) se evalúa para determinar su actividad antitrombótica en el modelo de trombosis de arteria carótida en rata inducida por FeCl_{3}. La oclusión trombótica se prolonga de una manera dependiente de la dosis mediante una infusión intravenosa continua durante 1 hora, comenzando 15 min antes de la aplicación FeCl_{3} con una velocidad de dosis de 5, 10 y 25 nmol/kg/min (véase la tabla IX y la figura 11). La oclusión se evita durante la infusión en 4 de 5 ratas con una velocidad de dosis de 25 nmol/kg/min. A una velocidad de 10 y 5 nmol/kg/min la oclusión se evita en 4 de 7, y en 0 de 6 ratas, respectivamente. La velocidad de dosis del péptido 1 (SEQ ID NO:1) requerida para doblar el tiempo de oclusión después de la aplicación de FeCl_{3} es 19,3 nmol/kg/min, comparada con 33,7 nmol/kg/min previamente observada para el péptido 2 (SEQ ID NO:2).
TABLA X Inhibición de la agregación plaquetaria humana: "bucle (L)Cys" frente a "bucle (D)Cys"
Péptido Secuencia peptídica IC_{50}^{a}
ADP \muM trombina nM
5 fPRPGCRIPRGD(Nle)PADCGDYEPIPEEA(Cha)e 1,4\pm0,3 231\pm187
6 fPRPGcRIPRGD(Nle)PADcGDYEPIPEEA (Cha)e 2,1\pm0,4 21\pm20
^{a} El valor IC_{50} (media \pm D.E.) es la concentración necesaria para inhibir la agregación
plaquetaria en PRP en 50% de la agregación control por triplicado.
La tabla X ilustra la diferencia entre los dos estereoisómeros que se producen por la sustitución de los restos (D)Cys por (L)Cys en el "puente" conector entre el inhibidor del sitio catalítico y la secuencia de reconocimiento de exositio de unión a aniones. Los péptidos 5 (SEQ ID NO:9) y 6 (SEQ ID NO:10) representan análogos del péptido 1 (SEQ ID NO:1) que contienen otros restos en la secuencia RGD cíclica. El péptido 5 (SEQ ID NO:9) también se diferencia en que posee restos (L)Cys en el "puente" conector, en oposición a (D)Cys. La diferente orientación espacial que confiere a la secuencia RGD cíclica produce una mayor inhibición de la agregación plaquetaria inducida por trombina de plaquetas humanas por el análogo de (D)Cys, el péptido 6 (SEQ ID NO:10). Se advierte una diferencia en 10 veces en la actividad trombina entre los dos estereoisómeros. Sin embargo, no hay diferencias en la inhibición de la agregación plaquetaria inducida por ADP y la actividad anticoagulante. Nótese que la modificación del péptido 1 (SEQ ID NO:1) que produce un análogo que sólo contiene L-aminoácidos naturales (el péptido 4 (SEQ ID NO:8)) amplifica la diferencia entre los dos estereoisómeros. En efecto, el péptido 1 (SEQ ID NO:1) presenta una inhibición aproximadamente 1.000 veces mayor de la agregación plaquetaria inducida por trombina que el péptido 4 (SEQ ID NO:8) (véase la tabla VIII). No hay diferencia entre estos dos estereoisómeros en la inhibición de la agregación plaquetaria inducida por ADP. Sin embargo, la actividad anticoagulante es mayor en el análogo que contiene (D)Cys (péptido 1 (SEQ ID NO:1) que en el análogo que sólo contiene aminoácidos naturales (péptido 4 (SEQ ID NO:8)).
Actividad relativa del péptido 1 frente a análogos del péptido 1
Las tablas XI-XIV ilustran las razones entre los análogos del péptido 1 (SEQ ID NO:1) a los datos establecidos de IC_{50} de inhibición plaquetaria y ID_{2} de anticoagulación. Para los fines de estas comparaciones, la muestra del péptido 1 (SEQ ID NO:1) tiene la siguiente actividad: coagulación - ID_{2}(aPTT = 27,9 nM; tiempo de trombina = 15 nM); agregación - IC_{50} (trombina = 5,8 nM; ADP = 11,4 \muM). Los valores para aPTT, tiempo de trombina, trombina y ADP para los péptidos 7-18 (SEQ ID NO:11-22) en las tablas XI-XIV representan sólo valores comparativos y no se pretende que representen concentraciones reales de péptidos y, por tanto, no se proporcionan unidades. Por ejemplo, un valor de aPTT de 0,99 para el péptido 7 (SEQ ID NO:11) significa que el péptido 7 (SEQ ID NO:11) es 99% tan activo como el péptido 1 (SEQ ID NO:1) en ensayos de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) en plasma humano normal.
TABLA XI Actividad relativa: péptido 1 frente a análogos B_{4}-sustituidos
Péptido Secuencia peptídica Coagulación Agregación
aPTT tiempo de trombina ADP
trombina
7 FPRPGcGRGDMPcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,99 0,19 0,10 0,74
8 FPRPGcGRGD(Cha)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,60 1,04 0,12 0,43
La tabla XI ilustra las diferencias entre dos análogos del péptido 1 (SEQ ID NO:1) (los péptidos 7 (SEQ ID NO:11) y 8 (SEQ ID NO:12)). El péptido 7 (SEQ ID NO:11) es un análogo del péptido 1 (SEQ ID NO:1), en el que el Nle en el resto B_{4} se ha sustituido por Met, y el péptido 8 (SEQ ID NO:12) es un análogo del péptido 1 (SEQ ID NO:1), en el que el Nle en el resto B_{4} se ha sustituido por Cha. El péptido 8 (SEQ ID NO:12) es aproximadamente 1/3 menos activo que el péptido 1 (SEQ ID NO:1) en ensayos de aPTT, pero el valor de aPTT del péptido 7 (SEQ ID NO:11) es esencialmente el mismo que el del péptido 1 (SEQ ID NO:1). Con respecto a los valores del tiempo de trombina, estos valores varían con cada péptido (el péptido 7 (SEQ ID NO:11) es sólo 19% tan activo como el péptido 1 (SEQ ID NO:1), mientras que el péptido 8 (SEQ ID NO:12) es, en realidad, más activo que el péptido 1 (SEQ ID NO:1)). Se advierte una diferencia en 10 veces en la actividad trombina entre el péptido 1 (SEQ ID NO:1) y cualquiera de los análogos. Con respecto a la actividad ADP, el péptido 8 (SEQ ID NO:12) es aproximadamente 1/2 tan eficaz como el péptido 1 (SEQ ID NO:1), mientras que el péptido 7 (SEQ ID NO:11) es aproximadamente 3/4 tan eficaz como el péptido 1 (SEQ ID NO:1).
TABLA XII Actividad relativa: péptido 1 frente a análogos de penicilamina B_{3}-sustituidos
Péptido Secuencia peptídica Coagulación Agregación
aPTT tiempo de trombina ADP
trombina
9 FPRPGcGRGD(Nle)P(D-Pen)GDYEPIPEEA(Cha)e 0,11 0,15 0,06 0,13
10 FPRPGcG(Me-R)GD(Nle)P(D-pen)GDYEPIPEEA(Cha)e 0,52 0,92 0,08 6,0
La tabla XII ilustra las diferencias entre dos análogos de penicilamina del péptido 1 (SEQ ID NO:1) (los péptidos 9 (SEQ ID NO:13) y 10 (SEQ ID NO:14), ninguno de los cuales son péptidos de esta invención). Esta tabla se ofrece para demostrar la intercambiabilidad de la Arg en el resto B_{3} con Me-Arg. La introducción del resto penicilamina disminuye en gran medida la actividad del péptido 9 (SEQ ID NO:13) en todas las categorías. Con respecto al péptido 10 (SEQ ID NO:14), se advierte la misma disminución en la actividad trombina que en el péptido 9 (SEQ ID NO:13). Sin embargo, sólo aparece una ligera disminución en el tiempo de trombina, mientras que la actividad ADP aumenta en seis veces comparada con el péptido 1 (SEQ ID NO:1).
TABLA XIII Actividad relativa: péptido 1 frente a análogos B_{2}-sustituidos
Péptido Secuencia peptídica Coagulación Agregación
aPTT tiempo de trombina ADP
trombina
11 fPRPGcvRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,37 0,86 0,13 0,18
12 fPRPGcvRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,53 1,38 0,14 0,18
13 fPRPGcRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,40 0,27 0,04 0,20
14 fPRPGctRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,75 0,93 0,18 0,22
15 fPRPGcpRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,59 1,12 0,36 0,26
La tabla XIII ilustra la intercambiabilidad del resto Gly en B_{2} con diversos restos D-aminoácidos. Los péptidos 11 (SEQ ID NO:15), 12 (SEQ ID NO:16), 14 (SEQ ID NO:18) y 15 (SEQ ID NO:19) son análogos del péptido 1 (SEQ ID NO:1), en los que el resto B_{2} se ha sustituido por diversos D-aminoácidos, y son péptidos de esta invención. El péptido 13 (SEQ ID NO:17), que no es un péptido de esta invención, es un análogo del péptido 1 (SEQ ID NO:1), en el que el resto Gly en B_{2} está delecionado.
TABLA XIV Actividad relativa: péptido 1 frente a análogos A_{1}-sustituidos
Péptido Secuencia peptídica Coagulación Agregación
aPTT tiempo de trombina ADP
trombina
16 (D-Phg)RPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,72 1,03 0,94 0,54
17 (D-3-Tiq)PRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 0,62 0,93 0,13 1,27
18 (N-Me-f)PRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e 1,73 0,77 0,55 0,43
La tabla XIV ilustra la intercambiabilidad del resto (D)Phe en el resto A_{1}. Los péptidos 16-18 (SEQ ID NO:20-22) son todos péptidos de esta invención. El péptido 16 (SEQ ID NO:20) muestra esencialmente la misma actividad trombina y tiempo de trombina que el péptido 1 (SEQ ID NO:1). El péptido 17 (SEQ ID NO:21) muestra esencialmente el mismo valor de tiempo de trombina que el péptido 1 (SEQ ID NO:1) y tiene un valor ADP mayor, pero es 10 veces menos activo en su valor de trombina. Por comparación, el péptido 18 (SEQ ID NO:22) muestra un aumento perceptible en los valores de aPTT comparado con el péptido 1 (SEQ ID NO:1), pero muestra un tiempo de trombina sólo 77% tan activo como el péptido 1 (SEQ ID NO:1), mientras que los valores de trombina y ADP son sólo la mitad de activos que los del péptido 1 (SEQ ID NO:1).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 2110 E. Galbraith Road, Apartado de correos 156300
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Cincinnati
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Ohio
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 45215-6300
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 513/948-6566
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 513/948-7961 ó 4681
\vskip0.333000\baselineskip
(I)
TELEX: 214320
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos antiplaquetas antitrombina trifuncionales
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión n!º 1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/076.066
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 11 de junio 1993
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 esciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Phe Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 8"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 8
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 8 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 1"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Arg Gly Asp Phe Pro Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es Tyr sustituida con un grupo succinilo"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 9
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 9 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 10
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 10 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D y está sustituido con un grupo metilo"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Cys Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Cys Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Tyr Asp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 28 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 29
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 29 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Cys Arg Ile Pro Arg Gly Asp Xaa Pro Ala Asp}
\sac{Cys Gly Asp Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 17"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 17
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 17 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 28 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 29
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 29 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Arg Ile Pro Arg Gly Asp Xaa Pro Ala Asp}
\sac{Xaa Gly Asp Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Met Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es cisteína en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es penicilamina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es cisteína en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 8
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 8 es metilarginina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es penicilamina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Xaa Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 7 es tirosina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 7 es valina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 12"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 10
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 10 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 12
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 12 es D-Cys y está unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 23
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 23 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr Glu}
\sac{Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 7 es treonina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilalanina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 7 es prolina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es fenilglicina en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es ácido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolein-3-carboxílico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 1 es N-metilfenilalanina en la configuración D"
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 6 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 13"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 11
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 11 es norleucina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 13 es D-Cys unida mediante enlace sulfuro a D-Cys en la posición 6"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 24 es ciclohexilalanina"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
MÁS INFORMACIÓN: /nota = "Xaa en la posición 25 es ácido glutámico en la configuración D"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr}
\sac{Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa}

Claims (18)

1. Un compuesto de fórmula
(1)X-A-B-C-Y
en la que
X es hidrógeno, acetilo o un grupo t-butiloxicarbonilo;
A es un análogo de péptido de fórmula
(2)A_{1}-A_{2}-A_{3}
en la que
A_{1} es (D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq, N-Me-(D)Phe;
A_{2} es Pro;
A_{3} es Arg;
B es un análogo de péptido de fórmulas
18
en las que
B_{1} es Gly;
B_{2} es Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr o (D)Pro;
B_{2}' es Arg-Ile-Pro;
B_{3} es Arg o N-Me-Arg;
B_{4} es Nle o Phe;
C es un análogo de péptido de fórmula
(5)Asp-C_{1}-C_{2}-C_{3}-C_{4}-C_{5}-C_{6}-C_{7}-C_{8}-C_{9}
en la que
C_{1} es Phe o Tyr;
C_{2} es Glu;
C_{3} es Glu o Pro;
C_{4} es Ile;
C_{5} es Pro o D-Ala;
C_{6} es Glu o Ala;
C_{7} es Glu;
C_{8} es Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha o Ala-Cha;
C_{9} es un enlace o (D)Glu; e
Y es OH, alcoxi C_{1}-C_{6}, amino sustituido con mono- o dialquilo (C_{1}-C_{4}),
o su sal farmacéuticamente aceptable.
2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que B es un péptido de fórmula (3).
3. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que B es un péptido de fórmula (4).
4. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que B_{4} es Nle.
5. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que Y es OH o alcoxi C_{1}-C_{6}.
6. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
19
(SEQ ID NO:1)
7. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
20
(SEQ ID NO:2)
8. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
21
(SEQ ID NO:3)
9. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
22
(SEQ ID NO:10)
10. Un compuesto según la reivindicación 1 para su utilización como compuesto farmacéuticamente activo.
11. Una composición farmacéutica que contiene un compuesto según la reivindicación 1, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno trombótico venoso o arterial.
13. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la angioplastia después de una trombosis coronaria.
14. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la oclusión postangioplastia aguda.
15. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la citopenia inducida por circulación extracorporal.
16. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un infarto de miocardio en curso.
\newpage
17. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la oclusión post-terapia fibrinolítica.
18. El uso de un compuesto según la reivindicación 1, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la trombocitopenia durante la circulación extracorporal.
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