DE69432983T2

DE69432983T2 - Trifunktionelle antithrombin-und antiplättchenpeptide

Info

Publication number: DE69432983T2
Application number: DE69432983T
Authority: DE
Inventors: J. Robert BROERSMA; J. Thomas OWEN; L. John KRSTENANSKY
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2014-05-14
Also published as: US5681925A; NO954991D0; AU7093894A; NO954991L; TW295590B; ATE246203T1; FI955905A; PT702696E; AU685470B2; CA2164712C; HUT73187A; EP0702696A1; CA2164712A1; WO1994029349A1; KR100330465B1; CN1124964A; JPH08511518A; DE69432983D1; NZ268159A; FI955905A0

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Peptide, die nützliche Antikoagulanzien und Antiplättchenagenzien sind.
Hintergrund der Erfindung
Antikoagulanzien sind nützliche therapeutische Agenzien in der pharmakologischen Behandlung von, zum Beispiel, akuter schwerer venöser Thrombose, Lungenembolie, akuter arterieller Embolie der Extremitäten, Myocardinfarkt, Schlaganfall und verbreiteter intravaskulärer Koagulation. Es wird angenommen, dass die prophylaktische Verabreichung von Antikoagulanzien ein Wiederauftreten der Embolie in Patienten mit rheumatischer oder arteriosklerotischer Herzkrankheit verhindert und dass sie gewisse thromboembolische Komplikationen der Chirurgie verhindert. Die Verabreichung von Antikoagulanzien ist auch zur Behandlung von Krankheiten, die die koronare Arterie und Gehirngefäße betreffen, angezeigt worden. Arterielle Thrombose, insbesondere in Arterien, die den Herzmuskel und das Gehirn versorgen, ist eine Haupttodesursache.
Plättchen-vermittelte arterielle Thrombose ist ein wesentlicher Krankheitsmechanismus für die im vorstehenden Absatz aufgeführten Zustände. Folglich deutet die Kombination der Hemmung der Plättchenaggregation und von Thrombin auf einen nützlichen Ansatz für den Erfindung von antithrombotischen Agenzien an. Die Bindung von Fibrinogen über die Arg-Gly-Asp (RGD)-Sequenz an aktivierte Plättchenglycoprotein (GP) IIb/IIIa-Rezeptoren, ein Mitglied der Integrinfamilie, ist ein wesentlicher Schritt der durch verschiedene Agonisten induzierten Plättchenaggregation. F. A. Marguerie, et al., J. Biol. Chem. 254, 5357–5363 (1979); D. Collen, et al., Thromobolysis in Cardiovascular Disease, D. Julian, et al. (Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., New York (1989); S. 45–67. Diese Bindung wird durch lineares und cyclisches RGD enthaltende synthetische Peptide gehemmt. E. F.
Plow, et al., Prog. Hemostas. Thromb. 9, 117–156 (1989); E. F. Plow, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 8057–8061 (1985).
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Strategie der Kombination der Hemmung von Thrombin und der Blockade des Plättchenglycoprotein (GP) IIb/IIIa (Integrin)-Rezeptors in einem einzigen Hybridpeptid zu sowohl Antikoagulans- als auch Antiplättchen-Aktivität führt. F. C. Church, et al., J. Biol. Chem. 266, 11975–11979 (1991). Zusätzlich sind Peptid-Thrombininhibitoren, die die Bestandteile katalytischer Inhibitoren und Inhibitoren einer Anion-bindenden ausserhalb liegenden Sequenz kombinieren, kürzlich berichtet worden. J. M. Maraganore, et al., Biochemistry, 29, 7095–7101 (1990) und J. DiMaio, et al., J. Biol. Chem, 265, 21698–21703 (1990). Eine Schlüsseleigenschaft zur Bestimmung der Aktivitäten dieser Peptide war die Trennung der zwei Bestandteile, die an das aktive Zentrum von Thrombin und ausserhalb durch einen Spacer geeigneter Länge binden. Diese Studien haben gezeigt, dass Peptide, die ein Minimum von vier Aminosäureresten zwischen dem Inhibitor der katalytischen Stelle und der Anion-bindenden ausserhalb liegenden Sequenz enthalten, zur maximalen Thrombinhemmung notwendig waren. Diese Berichte unterstützen die Ergebnisse von Kreuzvernetzungsstudien, die andeuten, dass der Abstand zwischen dem NH₂-Ende von Hirudin-Analoga, gebunden an die Anion-bindende ausserhalb liegende Sequenz in Thrombin, und der Hydroxylgruppe von Ser-195 in der katalytischen Tasche von Thrombin etwa 18–20 Å beträgt. B. Furie, et al., J. Biol. Chem, 257, 3875–3882 (1982) und W. Bode, et al., EMBO J., 8, 3467–3475 (1989).
Patentübereinkommensvertrag Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO 92/10575, veröffentlicht am 25. Juni 1992, offenbart speziell trifunktionelle Inhibitoren sowohl der Plättchenaktivierung als auch von Thrombin. Diese Inhibitoren bestehen aus einer Glycoprotein IIb/IIIa inhibitorischen Einheit und einer Thrombin inhibitorischen Einheit, die aus einer auf die katalytische Stelle gerichteten Einheit besteht, die das aktive Zentrum von Thrombin bindet und hemmt. Die auf die katalytische Stelle gerichtete Einheit ist an eine Anion-bindende ausserhalb assoziierende Einheit über eine Linker-Einheit, die eine Rückgrat-Kette mit einer berechneten Länge zwischen etwa 18Å und 42Å besitzt, gebunden.
Die Anmelder haben entdeckt, dass, wenn der Inhibitor der katalytischen Stelle von Thrombin (z. B. (D)Phe-Pro-Arg oder ein Analogon davon) mit einer Anion-bindenden ausserhalb assoziierenden Einheit (Hirudin_55–65-Analogon) über eine cyclische Arg-Gly-Asp-X „Brücken"-Sequenz gekoppelt ist, ein trifunktionelles Peptid erhalten wird, das sowohl die katalytische als auch die Anion-bindende Hemmung von Thrombin ausserhalb mit der Hemmung des Plättchen-Glycoprotein (GP) IIb/IIIa-Rezeptors verbindet. Darüber hinaus wird eine bedeutende Erhöhung der Hemmung der Plättchenaggregation und der Antikoagulans-Aktivität durch das Peptid bemerkt, wenn die Cysteinreste, die die Disulfid-Bindungen bereitstellen, die den Inhibitor der katalytischen Stelle von Thrombin mit dem Hirudin_55–65-Analogon verbinden, in der (D)-Konfiguration vorliegen. Eine zusätzliche Erhöhung wird bemerkt, wenn Norleucin durch Phenylalanin in der cyclischen Arg-Gly-Asp-X „Brücken"-Sequenz ersetzt wird. Diese neue Klasse von Verbindungen sollte eine nützliche Zusatztherapie aufgrund der doppelten Wirkungsart und erhöhter Wirksamkeit bereitstellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Verbindungen der Formel
X-A-B-C-Y (1)wobei X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder eine t-Butyloxycarbonylgruppe ist;

A ein Peptidanalogon der Formel A₁-A₂-A₃ (2)ist, wobei A₁(D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq, N-Me-(D)Phe ist; A₂ Pro ist, A3 Arg ist;
B ein Peptidanalogon der Formel
oder
ist, wobei B₁ Gly ist; B₂ Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr oder (D)Pro ist; B_2' Arg-Ile-Pro ist; B₃ Arg oder N-Me-Arg ist; B₄ Nle oder Phe ist;
C ein Peptidanalogon der Formel Asp-C₁-C₂-C₃-C₄-C₄-C₆-C₇-C₈-C₉ (5) ist, wobei C₁ Phe oder Tyr ist; C₂ Glu ist; C₃ Glu oder Pro ist; C₄ Ile ist; C₅ Pro oder (D)Ala ist; C₆ Glu oder Ala ist; C₇ Glu ist; C₈ Tyr, Ala-Cha, Tyr-Cha oder Tyr-Leu ist; C₉ eine Bindung oder (D)Glu ist; und Y eine Hydroxygruppe, ein C₁-C₆-Alkoxyrest oder ein mono- oder di-(C₁-C₄)alkylsubstituierter Aminorest ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon sind nützliche Antikoagulans-Agenzien. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Behandlung von akutem postangioplastischem Verschluss, von Zytopenie, die von extrakorporaler Zirkulation verursacht wird, eines sich entwickelnden Myocardinfarkts und von nach fibrinolytischer Therapie auftretendem Verschluss.

Kurze Beschreibun dg er Figuren
1 zeigt in graphischer Form von Balken die Wirkung von Peptid 2 auf die arterielle Verschlusszeit durch FeCl₃ in Ratten. Die Kontrolle wird durch die unschraffierten Balken dargestellt, während Peptid 2 durch die schraffierten Balken dargestellt wird. In dieser Figur stellt p die Wahrscheinlichkeit dar, während n die Anzahl getesteter Tiere darstellt.
2 zeigt in graphischer Form von Balken die Wirkung von Peptid 2d (nicht aus dieser Erfindung) auf die arterielle Verschlusszeit durch FeCl₃ in Ratten. Die Kontrolle wird durch die unschraffierten Balken dargestellt, während Peptid 2d durch die schraffierten Balken dargestellt wird. In dieser Figur stellt p die Wahrscheinlichkeit dar, während n die Anzahl getesteter Tiere darstellt.
11 zeigt in graphischer Balkenform die Wirkung von Peptid 1 auf die arterielle Verschlusszeit durch FeCl₃ in Ratten. Die Kontrolle wird durch die unschraffierten Balken dargestellt, während Peptid 1 durch die schraffierten Balken dargestellt wird. In dieser Figur stellt p die Wahrscheinlichkeit dar, während n die Anzahl getesteter Tiere darstellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die folgenden allgemeinen Abkürzungen der Aminosäuren und terminalen Amino- und Carboxygruppen werden in dieser ganzen Beschreibung verwendet:
Wenn sich zwei oder mehr Aminosäuren verbinden, um ein Peptid zu bilden, werden die Elemente des Wassers entfernt, und was von jeder Aminosäure zurückbleibt, wird in dieser Anmeldung ein Rest genannt. Ein „Rest" ist daher eine Aminosäure, der ein Wasserstoffatom der terminalen Aminogruppe fehlt und/oder der die Hydroxylgruppe der terminalen Carboxylgruppe fehlt. Unter Verwendung anerkannter Bezeichungen bedeutet ein Gedankenstrich (–) vor (was den Verlust eines Wasserstoffatoms anzeigt) und/oder nach (was den Verlust der Hydroxylgruppe anzeigt) dem Drei-Buchstaben-Code für eine Aminosäure oder ein Aminosäurederivat ein Rest.
Die Cys'-Reste werden durch die Formel (5) dargestellt, die einen Cysteinrest ohne eine Sulfideinheit in seiner R-Gruppenseitenkette darstellt. Wie in den Formeln (3) und (4) dargestellt ist, sind die (D)Cys'-Reste über eine Disulfidbrücke verbunden. Die Disulfideinheit ist mit den (D)Cys'-Resten über die Methyleneinheit der (D)Cys'-Reste verbunden, wie durch die Formel (6) dargestellt:
Man beachte, dass die Formeln (5) und (6) gattungsmäßig entweder D- oder L-Reste darstellen.
Die folgenden gebräuchlichen Abkürzungen verschiedener Schutzgruppen werden in dieser ganzen Beschreibung verwendet:
Eine Alkylgruppe und der Alkylteil einer Alkoxygruppe wird verstanden, gerade, verzweigte oder cyclische Alkylgruppen, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, sek-Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl und Cyclopentylmethyl einzuschließen. Eine Halogengruppe ist eine Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodgruppe.
Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Arginin, Ornithin und Lysin. Beispiele von „Nicht-Protein" α-Aminosäuren sind Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thiaprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin (Hyp), Homoserin, Cyclohexylglycin (Chg), α-Amino-n-Buttersäure (Aba), Cyclohexylalanin (Cha), Aminophenylbuttersäure (Pba), Phenylalanin, substituiert an der ortho-, meta- oder para-Position der Phenyleinheit mit einer oder zwei der folgenden Gruppen, einer (C₁-C₄) Alkyl-, (C₁-C₄) Alkoxy-, Halogen oder Nitrogruppe, oder substituiert mit einer Methylendioxygruppe, β-2- und 3-Thienylalanin, β-2- und 3- Furanylalanin, β-2-, 3- und 4-Pyridylalanin, β-(Benzothienyl-2- und 3-yl)alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)alanin, O-alkylierten Derivaten von Serin, Threonin oder Tyrosin, S-alkyliertem Cystein, O-Sulfatester von Tyrosin, 3,5-Diiodtyrosin und den D-Isomeren der natürlich vorkommenden Aminosäuren.
Die natürlichen Aminosäuren, mit Ausnahme von Glycin, enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Wenn es nicht spezifisch anders angezeigt ist, besitzen die optisch aktiven Aminosäuren, auf die hier verwiesen wird, die L-Konfiguration. Die Stereochemie am Kohlenstoffatom, das den R-Substituenten trägt, ist entweder die D- oder L-Konfiguration. Zum Zweck dieser Offenbarung wird eine Aminosäure in der D-Konfiguration als D-Aminosäure, (D)Aminosäure oder als ein Kleinbuchstabe bei Verwendung des Einzelbuchstaben-Bezeichnungssystems bezeichnet, z. B. sind D-Phenylalanin, D-Phe, (D)Phe oder f alles akzeptierte Bezeichnungen. Wie gebräuchlich ist die Struktur von Peptiden, die hier ausgeschrieben werden, derart, dass das aminoterminale Ende auf der linken Seite der Kette und das carboxyterminale Ende auf der rechten Seite der Kette ist.
Die Polypeptide der Formel 1 können pharmazeutisch verträgliche Säurezusatzsalze mit jeder nicht-toxischen organischen oder anorganischen Säure bilden. Veranschaulichende anorganische Säuren, die geeignete Säurezusatzsalze bilden, schließen Salzsäure, Bromsäure, Schwefel- oder Phosphorsäure und saure Metallsalze wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat ein. Veranschaulichende organische Säuren, die geeignete Salze bilden, schliessen die Mono-, Di- und Tricarboxylsäuren ein. Veranschaulichungen für solche Säuren sind, zum Beispiel, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Fumarsäure, Malinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Phenylessigsäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäure wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Salze der carboxyterminalen Aminosäureeinheit schließen die nicht-toxischen Carboxylsäuresalze, die mit jeder geeigneten anorganischen oder organischen Base gebildet werden, ein. Veranschaulichend schließen diese Salze solche der Alkalimetalle, wie zum Beispiel Natrium und Kalium, ein; Erdalkalimetalle, wie Calcium und Magnesium; Leichtmetalle der Gruppe IIIA einschließlich Aluminium; und organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, wie zum Beispiel Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin, N-(niedrigeres)Alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin.
Die Verbindungen der Formel 1 sind neue Peptide, die die Thrombininhibition mit einem Antagonismus der Plättchenglycoprotein (GP) IIb/IIIa-Rezeptoren in einem einzigen Hybridpeptid vereinen. Die Peptide dieser Erfindung enthalten jedes einen Inhibitor der katalytischen Stelle von Thrombin (d. h. Teil A), verbunden mit einem Inhibitor einer Anionbindenden ausserhalb liegenden Sequenz von Thrombin (d. h. Teil C) über eine Linkereinheit, die eine verbindende „Brücke" und eine cyclische RGD-X-Sequenz als den Plättchen-GP IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten enthält (d. h. Teil B).
Teil A beschreibt einen auf die katalytische Stelle gerichteten Inhibitor von Thrombin. Diese auf die katalytische Stelle gerichtete Einheit bindet das aktive Zentrum von Thrombin und hemmt oder verlangsamt die proteolytische Aktivität von Thrombin. Teil C beschreibt ein Thrombin-hemmendes Agens, das als eine Anion-bindende ausserhalb assoziierende Einheit charakterisiert ist. Da die Austausche des Teils C strukturell ähnlich zum carboxyterminalen Teil von Hirudin sind, wird vermutet, dass Teil C leicht an die Anion-bindende Stelle ausserhalb von Thrombin bindet.
Teil B enthält zwei funktionelle Teile – die verbindende „Brücke" zwischen dem Inhibitor der katalytischen Stelle (Teil A) und dem Inhibitor der ausserhalb liegenden Anionbindenden Stelle (Teil C) und eine cyclische RGD-X Glycoprotein IIb/IIIa inhibitorische Einheit. Die verbindende „Brücke" zwischen Inhibitor der katalytischen Stelle (Teil A) und dem Inhibitor der Anion-bindenden Stelle ausserhalb (Teil C) ist der Hauptbestandteil der cyclischen RGD-X-Sequenz. Diese Brücke, enthaltend Reste der B₁-Einheit, Pro, (D)Cys' und Disulfidbrücken, die die zwei (D)Cys'-Reste von Teil B verbinden, wird für den geeigneten Spacer zwischen der Inhibitorsequenz der katalytischen Stelle und der Erkennungssequenz der Anion-bindenden ausserhalb liegende Stelle gehalten. Diese verbindende „Brücke" enthält einen Prolinrest zwischen den B₁ und den A₃-Einheiten, da die natürlich vorkommende Imidbindung zwischen A₃ und Pro in viel geringerer Geschwindigkeit gespalten wird als die Amidbindung anderer Aminosäurereste. Es wird angenommen, obwohl diese Erfindung nicht von dieser Theorie abhängt, dass die Anwesenheit dieser Imidbindung für die inhibitorische Wirkung der auf die katalytische Stelle gerichteten Einheit verantwortlich ist. Natürlich wird erwartet, dass andere die Amidbindung ersetzende Aminosäuren als funktionelle Äquivalente dienen, wie reduzierte Amide, Ester, Ketone und Sulfide.
Die cyclische RGD-X Glycoprotein IIb/IIIa inhibitorische Einheit des Teils B, z. B. die Aminosäurereste zwischen den zwei D-Cys-Resten des Teils B, hemmt die Interaktion zwischen Fibrinogen und seinem Rezeptor, Glycoprotein IIb/IIIa. Die cyclische RGD-X Glycoprotein IIb/IIIa inhibitorische Einheit von Teil B kann zwischen 6 und 11 der wie in den Formeln (3) und (4) definierten Aminosäuren enthalten. Bevorzugt ist die cyclische RGD-X Glycoprotein IIb/IIIa inhibitorische Einheit von Teil B Formel (3) und enthält zwischen 6 und 9 der wie in Formel (3) definierten Aminosäuren.
Zum Zweck dieser Erfindung soll definiert werden, dass A₁ an die aminoterminale Einheit (X) gebunden ist, während A₃ an den Pro-Rest gebunden ist, der an der N-terminalen oder linken Seite von Teil B liegt. Der Asp-Rest an der N-terminalen oder linken Seite von Teil C ist an den B₁-Rest an der C-terminalen oder rechten Seite der Einheit B gebunden.

Wie mit jeder Gattungsgruppe chemischer Verbindungen, sind bestimmte Gruppen bevorzugt. Die Anmelder bevorzugen die Peptidderivate der Formel (1), wobei

X	ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder Carbonylgruppe ist;
A₁	(D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq oder N-Me-(D)Phe ist;
A2	Pro ist;
A₃	Arg ist;
B	Formel (3) oder Formel (4) ist;
B₁	Gly ist;
B2	Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr oder (D)Pro ist, wenn B Formel (3) ist;
B_2'	Arg-Ile-Pro ist, wenn B Formel (4) ist;
B₃	Arg oder N-Me-Arg ist;
B₄	Nle oder Phe ist;
C₁	Phe oder Tyr ist;
C2	Glu ist;
C₃	Glu oder Pro ist;
C₄	Ile ist;
C₅	Pro oder (D)Ala ist;
C6	Glu oder Ala ist;
C₇	Glu ist;
C₈	Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha oder Ala-Cha ist;
C₉	eine Bindung oder (D)Glu ist; und
Y	eine Hydroxylgruppe, ein C₁-C₆-Alkoxyrest oder mono- oder di-(C₁-C₄) alkylsubstituierter Aminorest ist.

Auch bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (1), wobei

X	ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder eine t-Butyloxycarbonylgruppe ist;
A₁	(D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq oder N-Me-(D)Phe ist;
A2	Pro ist;
A3	Arg ist;
B	Formel (3) oder Formel (4) ist;

B₁	Gly ist;
B₂	Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr oder (D)Pro ist, wenn B Formel (3) ist;
B_2'	Arg-Ile-Pro ist, wenn B Formel (4) ist;
B3	Arg oder N-Me-Arg ist;
B4	Nle oder Phe ist, unter der Bedingung, dass, wenn B₂(D)Tyr, (D)Val, (D)Thr oder (D)Pro ist, dann B₄ Nle ist;
C₁	Phe oder Tyr ist;
C2	Glu ist;
C₃	Glu oder Pro ist;
C4	Ile ist;
C₅	Pro oder (D)Ala ist;
C₆	Glu oder Ala ist;
C₇	Glu ist;
C₈	Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha oder Ala-Cha ist;
C9	eine Bindung oder (D)Glu ist; und
Y	eine Hydroxylgruppe, ein C₁-C₆-Alkoxyrest oder mono- oder di-(C₁-C₄) alkylsubstituierter Aminorest ist.

Besonders bevorzugt sind solche Peptidderivate der Formel (1), wobei

X	ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder eine t-Butyloxycarbonylgruppe ist;
A₁	(D)Phe, (D)Phg, (D)3-Tiq oder N-Me-(D)Phe ist;
A₂	Pro ist;
A₃	Arg ist;
B	Formel (3) ist;
B₁	Gly ist;
B₂	Gly, (D)Tyr, (D)Val, (D)Thr oder (D)Pro ist;
B₃	Arg ist;
B₄	Nle oder Phe ist, unter der Bedingung, dass, wenn B₂(D)Tyr, (D)Val, (D)Thr oder (D)Pro ist, dann B₄ Nle ist;
C₁	Phe ist;
C₂	Glu ist;
C₃	Pro ist;
C₄	Ile ist;

C₅	Pro ist;
C₆	Glu oder Ala ist;
C₇	Glu ist;
C₈	Tyr, Tyr-Cha oder Ala-Cha ist;
C₉	eine Bindung oder (D)Glu ist; und
Y	eine Hydroxylgruppe oder ein C₁-C₆-Alkoxyrest ist.

Die Peptide dieser Erfindung können mittels verschiedener Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann ohne weiteres bekannt sind. Solche Verfahren schliessen, sind aber nicht darauf beschränkt, das sequentielle Festphasenverfahren ein, das mittels etablierter automatisierter Verfahren, wie mittels der Verwendung eines automatisierten Peptidsynthesegeräts, durchgeführt werden kann. In diesem Verfahren ist eine α-Amino geschützte Aminosäure an eine Harzfestphase gebunden. Die verwendete Harzfestphase kann jedes geeignete Harz sein, dass herkömmlicherweise im Fachgebiet für die Festphasenherstellung eines Polypeptids verwendet wird, bevorzugt Polystyrol, das mit 0.5 bis etwa 3 Prozent Divinylbenzol kreuzvernetzt wurde, das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert wurde, um Stellen zur Esterbildung mit der anfänglich eingeführten α-Amino geschützten Aminosäure bereitzustellen.
Ein Beispiel eines Hydroxymethylharzes wird von Bodanszky et al., Chem. Ind. London 38, 1597–98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist von Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, käuflich erhältlich, und die Herstellung eines solchen Harzes wird von Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S. 1–6, beschrieben. Die geschützte Aminosäure kann an das Harz mittels des Verfahrens von Gisin, Helv. Chem. Acta. 56, 1476 (1973), gebunden werden. Zum Beispiel wird, um das Polypeptid herzustellen, in dem das carboxyterminale Ende ein (D)Glu-Rest ist, ein Boc-D-Glu(Bzl) an chlormethyliertes Polystyrol als sein Cäsiumsalz bei etwa 50°C gekoppelt.
Nach der Kopplung der α-Aminosäure an die Harzfestphase wird die Schutzgruppe mittels irgendeines geeigneten Verfahrens, wie mittels der Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan, entfernt. Die Entschützung wird bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standardspaltungsreagenzien und -bedingungen zur Entfernung spezifischer α-Amino-Schutzgruppen können verwendet werden. Nach Entfernen der α-Aminoschutzgruppe werden die anderen α-Amino geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform können mehrere Aminosäuregruppen mittels des Lösungsverfahrens vor der Kopplung mit der Aminosäuresequenz an der Harzfestphase gekoppelt werden.
Die α-Aminoschutzgruppe, die bei jeder in die Polypeptidsequenz eingeführten Aminosäure verwendet wird, kann irgendeine solche im Fachgebiet bekannte Schutzgruppe sein. Unter den betrachteten Klassen von α-Aminoschutzgruppen sind (1) Schutzgruppen des Acyltyps, wie: Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulfonyl, Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl und α-Chlorbutyryl; (2) Schutzgruppen des aromatischen Urethantyps, wie Benzyloxycarbonyl und substituierte Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyl-oxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl, α, α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl und Benzhydryloxycarbonyl; (3) Schutzgruppen des aliphatischen Urethantyps, wie tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Düsopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl; (4) Schutzgruppen des Cycloalkylurethantyps, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Aamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; (5) Schutzgruppen des Thiourethantyps, wie Phenylthiocarbonyl; (6) Schutzgruppen des Alkyltyps, wie Triphenylmethyl (Trityl) und Benzyl; (7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan. Die bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist tert-Butyloxycarbonyl.
Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsreagens liegt im Wissen des Fachgebiets. Ein besonders geeignetes Kopplungsreagens, bei dem die hinzuzufügende Aminosäure Gln, Asn oder Arg ist, ist N,N'-Diisopropylcarbodümid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die Verwendung dieser Reagenzien verhindert Nitril- und Lactambildung. Andere Kopplungsagenzien sind (1) Carbodiimide (z. B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid); (2) Cyanamide (z. B. N,N-Dibenzylcyanamid); (3) Ketenimine; (4) Isoxazoliumsalze (z. B. N-Ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat; (5) monocyclischer Stickstoff, enthaltend heterocyclische Amide aromatischen Charakters mit einem bis vier Stickstoffmolekülen im Ring, wie Imidazolide, Pyrazolide, und 1,2,4-Triazolide. Spezifische nützliche heterocyclische Amide schliessen N,N'-Carbonyldiimidazol und N,N-Carbonyl-di-1,2,4-triazol ein; (6) alkoxyliertes Acetylen (z. B. Ethoxyacetylen); (7) Reagenzien, die ein gemischtes Anhydrid mit der Carboxyleinheit der Aminosäure bilden (z. B. Ethylchlorformat und Isobutylchlorformat) oder das symmetrische Anhydrid der zu koppelnden Aminosäure (z. B. Boc-Ala-O-Ala-Boc) und (8) Stickstoff enthaltende heterocyclische Verbindungen mit einer Hydroxygruppe auf einem Ringstickstoff (z. B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol). Andere aktivierende Reagenzien und ihre Verwendung in der Peptidkopplung werden von Kapoor, J. Pharm. Sci. 59, S. 1–27 (1970), beschrieben. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung der symmetrischen Anhydride als ein Kopplungsreagens für alle Aminosäuren, mit Ausnahme von Arg, Asn und Gln.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem etwa zweifachen oder etwa vierfachen Überschuss eingeführt. Die Kopplung wird in einem Medium von Dimethylformamid : Methylenchlorid (1 : 1) oder in Dimethylformamid allein oder Methylenchlorid allein durchgeführt. In Fällen, in denen unvollständige Kopplung auftritt, wird das Kopplungsverfahren vor dem Entfernen der α-Aminoschutzgruppe, vor der Kopplung der nächsten Aminosäure im Festphasenreaktor wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion bei jedem Schritt der Synthese wird mittels der Ninhydrinreaktion überwacht, wie von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970), beschrieben.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten wurde, wird das Peptid vom Harz unter im Fachgebiet gut bekannten Bedingungen entfernt. Das kann zum Beispiel durch Behandlung des an das Harz gebundenen Polypeptids mit einer Lösung von 5% Anisol in wasserfreier Hydrofluorsäure erreicht werden.
Wie im Fachgebiet der Festphasenpeptidsynthese bekannt ist, besitzen viele der Aminosäuren Funktionalitäten, die während der Kettenherstellung geschützt werden müssen. Die Verwendung und Auswahl der geeigneten Schutzgruppe liegt im Vermögen des Fachmanns und wird von der zu schützenden Aminosäure und der Anwesenheit anderer geschützter Aminosäurereste im Peptid abhängen. Die Auswahl solch einer Seitenkettenschutzgruppe ist darin kritisch, dass es eine sein muss, die während der Spaltung der Schutzgruppe der α-Aminoeinheit nicht entfernt wird. Zum Beispiel können die Carboxylhydroxylgruppe der Asparaginsäure und Glutaminsäure mit einer Benzyl- oder Cyclohexylgruppe geschützt werden. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Benzyl.
Diese Gruppen können mittels im Fachgebiet gut bekannter Verfahren entfernt werden. Typischerweise wird das Entfernen der Schutzgruppen durchgeführt, nachdem die Peptidkettensynthese vollständig ist. Zum Beispiel wird das Peptid gleichzeitig mit Entfernen des Peptids vom Harz durch Behandlung mit einer Lösung von 5% Anisol in wasserfreier Hydrofluorsäure entschützt. Die Schutzgruppen können auch zu jeder anderen geeigneten Zeit entfernt werden.
Die Antikoagulans- und Antiplättchendosis eines Peptidanalogons dieser Erfindung liegt zwischen 0.2 mg/kg und 250 mg/kg des Körpergewichts des Patienten pro Tag, abhängig vom Patienten, der Schwere des zu behandelnden Thromboseleidens und des ausgewählten Peptidanalogons. Die geeignete Dosis für einen einzelnen Patienten kann leicht bestimmt werden. Bevorzugt zwischen 1 und 4 täglichen Dosen würden typischerweise mit zwischen 5 mg und 100 mg aktiver Verbindung pro Dosis verabreicht werden.
Antikoagulanstherapie ist zur Behandlung und Vorbeugung verschiedener Thromboseleiden geeignet, besonders koronare Arterien- und cerebrovaskuläre Krankheit sowie zur Behandlung von, zum Beispiel, koronarem Verschluss durch Auflösen vorhandener Blutgerinnsel. Antiplättchentherapie ist zur Vorbeugung des Wiederauftretens eines Myocardinfarkts und Schlaganfalls geeignet. Der Fachmann wird die Umstände leicht erkennen, die Antikoagulans- und Antiplättchentherapie erfordern. Es wird geglaubt, dass die Peptide dieser Erfindung besonders nützlich zur Vorbeugung koronarer Thrombose nach Angioplastie durch Verhindern der Thrombozytopenie während extrakorporaler Zirkulation, nach fibrinolytischer Therapie auftretendem Verschluss und, um einen sich entwickelnden Myocardinfarkt zu stoppen oder zu verzögern, sein würden.
Der hier verwendete Begriff „Patient" meint Säugetiere, wie Primaten, einschließlich Menschen, Schafe, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse.
Obwohl einige der Peptidderivate das Durchwandern des Darms nach oraler Verabreichung überleben könnten, bevorzugen die Anmelder die nicht-orale Verabreichung, zum Beispiel, subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal; Verabreichung durch Depotinjektion; durch Implantatherstellung; oder durch Verabreichung an die Schleimhäute, wie denen der Nase, des Rachens und der Bronchienröhren, zum Beispiel, in einer Aerosoldose, die ein Peptidderivat dieser Erfindung in einer Spray- oder Trockenpulverform enthält.
Zur parenteralen Verabreichung können die Verbindungen als injizierbare Dosen einer Lösung oder Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden, der eine sterile Flüssigkeit, wie Wasser und Öle, mit oder ohne den Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels und anderer pharmazeutisch verträglicher Adjuvantien sein kann. Beispiele für Öle, die in diesen Herstellungen verwendet werden können, sind solche aus Erdöl, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, zum Beispiel Erdnussöl, Sojabohnenöl und Mineralöl. Allgemein sind Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, Ethanol und Glykole, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, bevorzugte flüssige Träger, besonders für injizierbare Lösungen.
BEISPIELE
Beispiele 1–12 stellen typische Synthesen von Peptiden der Formel 1 dar. Diese Beispiele sind nur zur Veranschaulichung und beabsichtigen nicht, die Erfindung auf irgendeine Art einzuschränken. Die Reagenzien und Startmaterialien für die Beispiele 1–12 sind dem Durchschnittsfachmann leicht verfügbar. Wie in den Beispielen 1–12 verwendet, haben die folgenden Begriffe die angegebenen Bedeutungen: „DCM" bezieht sich auf Dichlormethan, „DIEA" bezieht sich auf Diisopropylethylamin, „MeOH" bezieht sich auf Methanol, „DCC" bezieht sich auf N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, „DMF" bezieht sich auf N,N'-Dimethylformamid, „HOBt" bezieht sich auf 1-Hydroxybenzotriazol, „TFA" bezieht sich auf Trifluoressigsäure, „eq" bezieht sich auf Äquivalente, „meq" bezieht sich auf Milliäquivalente, „g" bezieht sich auf Gramm, „mg" bezieht sich auf Milligramm, „mmol" bezieht sich auf Millimol, „mL" bezieht sich auf Milliliter, „°C" bezieht sich auf Grad Celsius, „TLC" bezieht sich auf Dünnschichtchromatographie, „R_f" bezieht sich auf den Zurückhaltefaktor, „μL" bezieht sich auf Mikroliter, „μg" bezieht sich auf Mikrogramm, „μM" bezieht sich mikromolar, „mmHg" bezieht sich auf Millimeter Quecksilber und „δ" bezieht sich auf Teile pro Million im darunterliegenden Feld von Tetramethylsilan.
Beispiel 1 Herstellung von:
Ein Boc-(D)Glu(Bzl)-Pam-Harz (Peninsula Laboratories, Belmont, Kalifornien) wird durch schrittweises Entschützen und Koppeln der folgenden Boc-Aminosäure mit einem Dupont 250 halbautomatischen Peptidsynthesegerät entsprechend dem folgenden Protokoll verlängert:
Alle Boc-Aminosäuren sind als ihre vorgeformten symmetrischen Anhydride in zweifachem Überschuss gekoppelt, mit der Ausnahme von Arg, das in einem vierfachen Überschuss als sein HOBt-Ester gekoppelt ist. Die symmetrischen Anhydride werden wie folgt hergestellt;
Löse die Boc-Aminosäuren (4 eq) in DCM, gefolgt von der Zugabe von 0.5 M DCC/DCM (2 eq). Rühre die Reaktion für 5 Minuten. Die Bildung der symmetrischen Anhydride resultiert in der Präzipitation von Dicyclohexylharnstoff, der durch Filtration entfernt wird. Dann gib das Filtrat zum Peptidharz und verdünne das Kopplungsgemisch mit einem äquivalenten Volumen DMF.
Der HOBt-Ester von Arg wird ähnlich gebildet. Löse Boc-Arg(Tos) (4 eq) in DCM. Gib 0.5 M HOBt/DMF (4 eq) und 0.5 M DCC/DCM (4 eq) zu. Entferne den Dicyclohexylharnstoff durch Filtration, gib das Filtrat zum Peptidharz und verdünne das Kopplungsgemisch mit einem äquivalenten Volumen DMF.
Teste das Peptidharz nach jeder Kopplung auf Anwesenheit irgendeines freien Amins mittels des Kaiser Ninhydrin-Verfahrens, wie im Fachgebiet gut bekannt. Aminosäuren werden wie nötig wieder gekoppelt.
Nach dem vorstehenden Verfahren ergibt die Verlängerung des Boc-D-Glu(Bzl)-Pam-Harzes (8.06 g, 0.31 meq/g, 2.5 mmol, gekauft von Peninsula Laboratories, Belmont, Kalifornien) das Peptidharz (D)Phe¹-Pro-Arg(Tos)-Pro-Gly⁵-(D)Cys(Mbz)-Gly-Arg(Tos)-Gly-Asp(Chx)¹⁰-Nle-Pro-(D)Cys(Mbz)-Gly-Asp(Chx)¹⁵-Tyr(Brz)-Glu(Bzl)-Pro-Ile-Pro²⁰-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-(D)Glu(Bzl)-Pam-Harz (19.4 g Peptidharz). Die folgenden Aminosäuren erfordern eine zweite Kopplung mit einem Mol Äquivalent ihrer symmetrischen Anhydride: Boc-Cha²⁴, Boc-Glu(Bzl)²¹, Boc-Tyr(Brz)¹⁶, Boc-Asp(Chx)^15, Boc-(D)Cys(Mbz)⁶, Boc-Pro⁴, Boc-Pro² und Boc-(D)Phe¹. Die Kopplung von Boc-Arg(Tos)² wird zweimal mit einem zweifachen seines HOBt-Esters wiederholt und ist anschließend mit Essigsäureanhydrid : DIEA : DCM (10 : 5 : 85) versehen.
Das vorstehend hergestellte Peptidharz (D)Phe¹-Pro-Arg(Tos)-Pro-Gly⁵-(D)Cys(Mbz)-Gly-Arg(Tos)-Gly-Asp(Chx)¹⁰-Nle-Pro-(D)Cys(Mbz)-Gly-Asp(Chx)¹⁵-Tyr(Brz)-Glu(Bzl)-Pro-Ile-Pro²⁰-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-(D)Glu(Bzl)-Pam-Harz wird in 5 Teile geteilt. Jeder Teil wird gespalten, entschützt und unter den folgenden Bedingungen zyklisiert. Suspendiere das Peptidharz (3.88 g) in wasserfreier Hydrofluorsäure (20 mL) in Anwesenheit von Anisol (5%). Rühre die Reaktion bei etwa 0°C für etwa 30 Minuten. Dann entferne die Hydrofluorsäure unter Vakuum und extrahiere den Rest mit 50% Essigsäure (2 × 5 mL), Essigsäure (2 × 10 mL) und Wasser (3 × 10 mL). Verdünne die vereinten Extrakte auf 1 Liter mit Wasser und stelle den pH-Wert auf 8.5 mit Ammoniumhydroxid ein. Gib K₃Fe(CN)₆ (1.0 M, etwa 55 mL) über 15 Minuten zu, bis eine gelbe Farbe bleibt, und rühre bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Stelle den pH-Wert auf 4.0 mit Essigsäure ein. Gib Anionenaustauscherharz (AG3 × 4A, Bio-Rad) zu und rühre, bis die gelbe Farbe entfernt ist. Sammle das Harz durch Filtration und lyophilisiere das Filtrat, um das Rohpeptid bereitzustellen.
Löse das Rohpeptid in 50% Essigsäure und gib es auf eine Sephadex G-10-Säule (2.5 × 70 cm). Eluiere mit 50% Essigsäure bei etwa 10.5 mL/Stunde. Das Peptid eluiert bei etwa 70–150 mL. Verdünne dieses Eluat mit Wasser und lyophilisiere es, um eine Gesamtmenge von 6.17 g zu ergeben. Das entsalzte Material wird weiter durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Dynamax C₁₈, 21.4 × 250 mm, Rainin) bei etwa 40 mL/min mit Gradienten von 0.1% wässriger TFA/Acetonitril mittels einem Beckman Prep 350-System gereinigt, um das reine Peptid (1.3 g) bereitzustellen.
Das Peptid der folgenden Beispiele kann mittels dem gleichen oder analoger Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 2
Beispiel 3
Beispiel 4
Das Referenz Beispiel 5 ist nicht länger in der vorliegenden Erfindung enthalten.
Beispiel 6
Beispiel 7
Beispiel 8
Beispiel 9
Beispiel 10
Beispiel 11
Beispiel 12
BIOLOGISCH
Wie vorstehend gesagt, besitzen die Verbindungen dieser Erfindung die Eigenschaft, eine signifikante Hemmung von Thrombin auszuüben, was anzeigt, dass sie wirksame Antikoagulanzien sind, die zur Vorbeugung sowohl venöser und arterieller Thrombosekrankheiten als auch unstabiler Angina, zur Vorbeugung plötzlichen Verschlusses von Gefäßen nach koronarer Angioplastie, als Zusatztherapie zur Thrombolyse und schwerer Venenthrombose nach orthopädischer Chirurgie nützlich sind. Da die Verbindungen dieser Erfindung auch cyclische RGD-X-Sequenzen enthalten, die in der Verbindungseinheit von Teil B lokalisiert sind, dienen sie auch als die Plättchen GP IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten.
Antikoagulans- und Antithrombose-Wirkungen des Peptids von Beispiel 2
Das Peptid von Beispiel 2 (Peptid 2) (SEQ ID Nr.: 2), zusammengesetzt aus einem Thrombininhibitor der katalytischen Stelle (fPR), gekoppelt an Hirudinss_55–66-Analogon über einen cyclischen Plättchen GP IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten (RGD-X), wird mit seinen einzelnen Teilpeptiden verglichen. Beachte, dass die nachstehend erwähnte experimentelle Ausstattung nur ein Vorschlag ist und nicht beabsichtigt, die Erfindung irgendwie zu binden oder einzuschränken.
Experimentelle Tiere
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (300–400 g) können von Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN 46229) gekauft und in diesen Studien verwendet werden.
Blutprobennahme
Blutproben können in Plastikspritzen, enthaltend 3.8% Trinatriumcitrat (1 : 10) genommen werden. Plasma wurde mittels Zentrifugation bei 2,000 g für 10 min hergestellt. Venöses Blut für in vitro-Studien wird aus gesunden, Drogen-freien, männlichen Freiwilligen gesammelt.
Koagulationstests
Die Bestimmungen der Zeit der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) werden unter Verwendung der Reagenzien und Verfahren von Dade Diagnostics, Inc. (Aguada, Puerto Rico 00602) durchgeführt. Die Thrombingerinnungszeiten werden durch Inkubation von 0.1 ml Rattenplasma bei 37°C mit 0.1 ml 0.1 M Tris-Puffer, pH 7.5, für 30 Sekunden bestimmt. Die Koagulation wird mit 0.1 ml Rinderthrombin (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO 63178)-Lösung (12 NIH Einheiten/ml) gestartet. Alle Gerinnungszeiten werden halbautomatisch mit einem MLA-Electra 750 automatischen Koagulationszeitgerät, MLA, Inc. (Pleasantville, NY 10570) gemessen. Die zur Verdopplung der Gerinnungszeit (ID₂) erforderliche Konzentration wird mittels einfacher linearer Regression berechnet.
Plättchenaggregation in vitro
Menschliches Plättchen-reiches Plasma (PRP) wird durch Zentrifugation bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur hergestellt. Plättchen-armes Plasma (PPP) wird durch Zentrifugation bei 2,000 g für 10 Minuten hergestellt. PRP wird nur Labormaterialien aus Plastik ausgesetzt. Alle Experimente werden innerhalb von 3 Stunden nach Blutentnahme vollendet. Die Plättchenaggregation wird photometrisch mit einem Zweikanalaggregometer (Chrono-log Corp., Haverstown, PA 19083) gemessen. 100 Prozent Lichttransmission wird mit autologem PPP bestimmt. Der Prozentsatz maximaler Veränderung der Lichttransmission wird aus PRP nach Zugabe von ADP (1 μm) oder Thrombin bestimmt. Thrombin (0.2–2.0 Einheiten/ml)-induzierte Plättchenaggregation ist konzentrationsabhängig, und die halbmaximale Konzentration wird für Inhibitionsstudien verwendet. Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) wird mit PRP (0.45 ml) für 30 Sekunden vor der Zugabe von ADP oder Thrombin inkubiert. Die Aggregation wird in einem Gesamtvolumen von 0.5 ml gemessen. Inhibitorische Antworten werden als % Hemmung ausgedrückt, verglichen mit einem Kontrollwert. Die Konzentration, die zu 50% Hemmung der Aggregation (IC₅₀) führt, wird durch einfache lineare Regression berechnet.
FeCl₃ arterielles Thrombose-Modell in Ratten (in vivo)
Antithrombotische Wirkungen in vivo von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) in Ratten werden auch bewertet. Zum Beispiel wird Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) auf antithrombotische Aktivität in einem Plättchen-abhängigen Thrombin-vermittelten FeCl₃-induzierten Ratten-Aorta-Thrombosemodell nach R. J. Broersma, et al., Thromb. Res. 64, 405–412 (1991) eingeschätzt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse aus dieser Studie zeigen, dass Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) wirksamer als seine einzelnen Bestandteile, als ein Antikoagulans und Antithrombin in Piasmakoagulations- und Plättchenaggregationstests ist.
Im Hinblick auf die Tabellen werden die Aminosäurereste in den Peptidsequenzen mittels des Ein-Buchstaben-Benennungssystems benannt, mit Ausnahme einiger der modifizierten Aminosäuren und/oder Schutzgruppen, die mittels des Drei-Buchstaben-Benennungssystems bezeichnet und in Klammern eingeschlossen sein können. Auch wird die Disulfidbrücke, die die (D)Cys'-Reste verbindet, durch eine unter den zwei (D)Cys'-Resten und allen Resten, die im Schleifenteil von Teil B sind, gezeichnete Linie dargestellt werden.
TABELLE I ANITKOAGULANS-AKTIVITÄT VON PEPTID 2 IN MENSCHLICHEM PLASMA, VERGLICHEN MIT SEINEN BESTANDTEILEN
Der ID₂-Wert ist die Konzentration, die zur Verdopplung der Blutgerinnungszeiten von der Kontrolle in Triplikaten notwendig ist. aPTT, aktivierte partielle Thromboplastinzeit.
In Bezug auf Tabelle I wird die Antikoagulans-Aktivität von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) mit seinen Bestandteilen verglichen – Peptid 2a (SEQ ID Nr.: 3), Peptid 2b (SEQ ID Nr.: 4), Peptid 2c (SEQ ID Nr.: 5) und Peptid 2d (SEQ ID Nr.: 6) – in Tests der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) und Thrombinzeit in normalem menschlichem Plasma. Die Peptide 2a–2d (SEQ ID Nr.: 3–6) kommen nicht von dieser Erfindung. Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) verdoppelt (ID₂) die aPTT und Thrombinzeiten bei etwa 60 beziehungsweise 24 nM. Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) ist mindestens 20fach aktiver als entweder 2b (SEQ ID Nr.: 4) oder 2d (SEQ ID Nr.: 6) (der stabile Inhibitor Me-fPR der katalytischen Stelle), während 2c (SEQ ID Nr.: 5) (das fPRPG-Pentapeptid) Antikoagulansaktivität nut bei viel höheren Konzentrationen besitzt. Peptid 2a (SEQ ID Nr.: 3) (das cyclische RGD-X-Peptid) ist als Antikoagulans inaktiv.
TABELLE II WIRKUNG VON PEPTID 2 AUF DIE KOAGULATION IN RATTE UND MENSCH UND PLÄTTCHENTESTS
Der ID₂-Wert ist die Konzentration, die zur Verdopplung der Gerinnungszeit von der Kontrolle in Triplikaten notwendig ist. aPTT, aktivierte partielle Thromboplastinzeit.
In Bezug auf Tabelle II werden Antikoagulans-Studien von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) in Rattenplasma durchgeführt. Der ID₂ für die aPTT und die Thrombinzeit beträgt etwa 181 beziehungsweise 116 nM. Folglich ist Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) 3–5 mal weniger aktiv als ein Antikoagulans in Rattenplasma verglichen mit menschlichem Plasma.
TABELLE III HEMMUNG DER MENSCHLICHEN PLÄTTCHENAGGREGATION
Der ID₅₀-Wert ist die Konzentration, die notwendig ist, um die Plättchenaggregation in PRP auf 50% der Kontrollaggregation im Duplikat zu hemmen.
Wie in Tabelle III veranschaulicht wird die Aggregation von menschlichen Plättchen, induziert durch ADP und Thrombin, durch Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) gehemmt. Die Konzentration, die ADP-induzierte Plättchenaggregation um 50% (IC₅₀) hemmt, beträgt etwa 19 μM. Das ist ähnlich zum cyclischen RGD-X-Peptid (IC₅₀ = 20 μM), Peptid 2a (SEQ ID Nr.: 3). Die Antithrombinpeptide 2b (SEQ ID Nr.: 4) und 2d (SEQ ID Nr.6) sind im wesentlichen inaktive Inhibitoren der ADP-induzierten Plättchenaggregation (IC₅₀ = 895 beziehungsweise > 1,000 μM). Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) hemmt die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation mit einem IC₅₀-Wert von 60 nM und ist aktiver als seine Bestandteile – Peptid 2b (SEQ ID Nr.: 4) (IC₅₀ = 2 μM), Peptid 2d (SEQ ID Nr.: 6) (IC₅₀ = 200 nM) und Peptid 2a (SEQ ID Nr.: 3) (IC₅₀ = 13 μM).
Im Gegensatz dazu wird die Aggregation von Rattenplättchen, induziert durch ADP und Thrombin, durch Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) bei IC₅₀ = 65 μM beziehungsweise 14 nM gehemmt (siehe Tabelle II). Folglich ist Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) 3–4 mal weniger aktiv in Rattenplasma verglichen mit menschlichem Plättchen-reichem Plasma.
TABELLE IV WIRKUNG VON PEPTID 2 AUF ARTERIELLE THROMBOSE IN RATTEN
Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) wird auf antithrombotische Aktivität im FeCl₃-induzierten Ratten-Aorta-Modell der Thrombose untersucht. Thrombotischer Verschluss wird dosisabhängig durch fortlaufende intravenöse Infusion von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) für 1 h, beginnend 15 min vor Verabreichung von FeCl₃ zur Arterie, in Mengen von 10, 25 und 50 nmol/kg/min verringert (siehe 1). Der Verschluss wird in vier von fünf Ratten bei einer Dosis von 50 nmol/kg/min verhindert. Bei Mengen von 25 und 10 nmol/kg/min wird der Verschluss in drei von fünf beziehungsweise einer von sechs Ratten verhindert. Das Antithrombin der katalytischen Stelle (Peptid 2d) (SEQ ID Nr.: 6) verlängert dosisabhängig die Verschlusszeit bei Infusionsraten von 50, 100 und 200 nmol/kg/min (siehe 2).
TABELLE V WIRKUNG VON PEPTID 2 UND BESTANDTEILEN AUF ARTERIELLE
Der Verschluss wird in vier von fünf Ratten bei einer Dosismenge von 50 nmol/kg/min verhindert. Weder das Hirudin-Analogon (Peptid 2b) (SEQ ID Nr.: 4) bei 500 nmol/kg/min noch das cyclische RGD-X-Peptid (Peptid 2a) (SEQ ID Nr.: 3) bei 100 nmol/kg/min verhindert den Verschluss bei diesen Mengen in diesem Modell.
TABELLE VI DIE WIRKUNG VON INTRAVENÖSEM PEPTID 2 AUFKOAGULATIONSTESTS^a
Antikoagulans- und Antithrombotische Wirkungen des Peptids von Beispiel 1
Das Peptid von Beispiel 1 (Peptid 1) (SEQ ID Nr.: 1) bestehend aus einem Thrombininhibitor (fPR) der katalytischen Stelle gekoppelt an ein Hirudinss_55–65-Analogon durch einen cyclischen Plättchen GP IIb/IIIa Rezeptorantagonisten (RGD-X), wird, wie Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2), mit seinen einzelnen Bestandteilpeptiden verglichen. Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) ist jedoch ein Analogon von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2), wobei Phenylalanin (Phe) in der cyclischen RGD-X-Sequenz von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) durch Norleucin (Nle) ersetzt ist. In dieser Studie wird Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) mit Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2), Peptid 3 (SEQ ID Nr.: 7) – ein Analogon von Peptid 1, wobei die Anion-bindende ausserhalb assoziierende Einheit (Teil C) verkürzt ist – und Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8) – ein Analogon von Peptid 1, das nur natürliche L-Aminosäuren enthält, verglichen. Zusätzlich wird Peptid 5 (SEQ ID Nr.: 9) – ein Analogon von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), das eine RGD-X-Schleife aus 10 Aminosäuren und nur natürliche L-Aminosäuren besitzt – mit Peptid 6 (das Peptid des Beispiels 12} (SEQ ID Nr.: 10) – ein Analogon von Peptid 1, das eine RGD-Schleife aus 10 Aminosäuren besitzt – verglichen, um die Wirkungen der Orientierung der RGD-X-Schleife auf die Aktivität der Peptide dieser Erfindung zu veranschaulichen. Die Peptide 1, 2 und 6 (SEQ ID Nr.: 1, 2 und 10) gehören zu dieser Erfindung, während die Peptide 3–5 (SEQ ID Nr.: 7–9) nicht zu dieser Erfindung gehören. Man beachte, dass die Verwendung der nachstehend erwähnten experimentellen Ausrüstung nur ein Vorschlag ist und nicht beabsichtigt, die Erfindung auf irgendeine An zu binden oder einzuschränken.
Experimentelle Tiere
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (300–400 g) können von Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN 46229) gekauft werden, und gemischte Züchtungshunde beider Geschlechter (6–11 kg) werden in diesen Studien verwendet.
Die Hunde werden mit Natriumpentobarbital (30 mg/kg, i. v.) betäubt. Die Arterie des Oberschenkels und beide Venen des Oberschenkels werden isoliert und für die Aufzeichnung des Blutdrucks (Gould P23ID, Gould Inc., Medical Products Division, Oxnard, CA 93030), zur Blutentnahme und Arzneimittelverabreichung kanuliert. Gliedmaßen-Leitungen werden subkutan zur Aufnahme der Leitung II ECG plaziert. Blutdruck- und ECG-Messungen werden aufgenommen (Gould 440 Aufnahmegerät, Gould Inc., Instrument Systems Division, Cleveland, OH 44114).
Blutprobennahme
Blutproben können in Plastikspritzen, enthaltend 3.8% Trinatriumcitrat (1 : 10) genommen werden. Plasma wird mittels Zentrifugation bei 2,000 g für 10 min hergestellt. Venöses Blut für in vitro-Studien wird aus gesunden, Drogen-freien, männlichen Freiwilligen gesammelt.
Koagulationstests, Gerinnungszeiten ohne Behandlung und Hämatologie
Die Bestimmungen der Zeit der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) werden unter Verwendung der Reagenzien und Verfahren von Dade Diagnostics, Inc. (Aguada, Puerto Rico 00602) durchgeführt. Die Thrombingerinnungszeiten werden durch Inkubation von 0.1 ml Rattenplasma bei 37°C mit 0.1 ml 0.1 M Tris-Puffer, pH 7.5 für 30 Sekunden bestimmt. Die Koagulation wird mit 0.1 ml Rinderthrombin (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO 63178)-Lösung (12 NIH Einheiten/ml) gestartet. Alle Gerinnungszeiten werden halbautomatisch mit einem MLA-Electra 750 automatischen Koagulationszeitgerät, MLA, Inc. (Pleasantville, NY 10570) gemessen. Die zur Verdopplung der Gerinnungszeit (ID₂) erforderliche Konzentration wird mittels einfacher linearer Regression berechnet. Die Bestimmung von t_1/2 wird für die Antithrombinaktivität (Thrombinzeit) nach Infusion von Peptid 1 (SEQ ID Nr.1) in Mengen von 1 und 5 nmol/kg/min bestimmt. Die Bestimmung von t_1/2 wird mittels linearer Regression der Antwortdaten über die Zeit gemacht.
Gerinnungszeiten ohne Behandlung werden auf der mittleren Oberfläche des linken Fußes durchgeführt, nachdem das Haar entfernt wurde (Nair, Carter-Wallace, Inc., New York, NY 10105), mittels eines Surgicutt^® Gerinnungszeitgeräts (International Technidyne Corp., Edison, NJ 08820). Gerinnungszeiten ohne Behandlung werden 60 und 30 min vor Verabreichung des Arzneimittels, 15, 30, 60, 120, 180 und 240 min nach Arzneimittelverabreichung bestimmt.
Gesamtblutzellzahlen und Analyse des Hämoglobingehalts werden in einer 140 μL Blutprobe, antikoaguliert mit EDTA, bestimmt, durchgeführt mit einem Hämatologieanalysegerät (Technicon Hl, Miles Technicon, Tarrytown, NY 10591). Proben werden 60 und 30 min vor Verabreichung des Arzneinttels genommen, 15, 30, 60, 120, 180 und 240 min nach Arzneimittelverabreichung.
Plättchenaggregationstests
Menschliches Plättchen-reiches Plasma (PRP) wird durch Zentrifugation bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur hergestellt. Plättchen-armes Plasma (PPP) wird durch Zentrifugation bei 2,000 g für 10 Minuten hergestellt. PRP wird nur Labormaterialien aus Plastik ausgesetzt. Alle Experimente werden innerhalb von 3 Stunden nach Blutentnahme vollendet. Die Plättchenaggregation wird photometrisch mit einem Chrono-log Zweikanalaggregometer (Chrono-log Corp., Haverstown, PA 19083) gemessen. 100 Prozent Lichttransmission wird mit autologem PPP bestimmt. Der Prozentsatz maximaler Veränderung der Lichttransmission wird von PRP nach Zugabe von ADP (1 μm) oder Thrombin bestimmt. Thrombin (0.2–2.0 Einheiten/ml)-induzierte Plättchenaggregation ist konzentrationsabhängig, und die halbmaximale Konzentration wird für Inhibitionsstudien verwendet. Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) wird mit PRP (0.45 ml) für 30 Sekunden vor der Zugabe von ADP oder Thrombin inkubiert. Die Aggregation wird in einem Gesamtvolumen von 0.5 ml gemessen. Inhibitorische Antworten werden als % Hemmung ausgedrückt, verglichen mit einem Kontrollwert. Die Konzentration, die zu 50% Hemmung der Aggregation (IC₅₀) führt, wird durch einfache lineare Regression berechnet.
Plättchenaggregation im Blut wird in Kochsalzlösung-verdünntem (1 : 2), mit Zitronensäure angesäuertem Blut mittels eines Gesamtblutaggregometers (Chrono-log, Modell 540-VS) durchgeführt. Aliquots von verdünntem Blut werden in Plastikküvetten gegeben und bei 37°C für 15 min inkubiert. Zugabe von ADP (2 μM) oder Thrombin (0.4 U/ml) wird verwendet, um die Aggregation zu induzieren, und die Veränderung des elektrischen Widerstands wird auf einem Streifendiagrammaufnahmegerät aufgenommen. Die Aggregation wird in einem Gesamtblutvolumen von 1.0 ml gemessen. Inhibitorische Antworten werden als % Hemmung ausgedrückt, verglichen mit einem Kontrollwert. Die Konzentration, die in 50% Hemmung der Aggregation (IC₅₀) resultiert, wird mittels einfacher linearer Regression berechnet.
FeCl₃ arterielles Thrombose-Modell in Ratten (in vivo)
Antithrombotische Wirkungen in vivo von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) in Ratten werden auch bewertet. Zum Beispiel wird Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) auf antithrombotische Aktivität in einem Plättchen-abhängigen Thrombin-vermittelten FeCl₃-induzierten Ratten-Aorta-Thrombosemodell nach R. J. Broersma, et al., Thromb. Res. 64, 405–412 (1991) eingeschätzt.
Eregbnisse
Die Ergebnisse aus dieser Studie zeigen, dass Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) unerwarteterweise viel wirksamer als Peptid 3 (SEQ ID Nr.: 7), Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8) oder sogar Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) als ein Inhibitor der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation ist.
TABELLE VII ANTIKOAGULANSAKTIVITÄT IN MENSCHLICHEM PLASMA VON PEPTID 1 VERGLICHEN MIT PEPTIDEN 2, 3 UND 4
In Bezug auf Tabelle VII ist Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) ein Analogon von Peptid 2 (SEQ ID Nr.2), wobei Phenylalanin (Phe) in der cyclischen RGD-X-Sequenz von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) durch Norleucin (Nle) ersetzt ist. Peptid 3 (SEQ ID Nr.: 7) ist ein Analogon von Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2), wobei die Anion-bindende ausserhalb assoziierende Einheit (Teil C) verkürzt ist. Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8) ist ein Analogon von Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 4), das nur natürliche L-Aminosäuren enthält. Während die Peptide 1 (SEQ ID Nr.: 1) und 2 (SEQ ID Nr.: 2) zu dieser Erfindung gehören, sind die Peptide 3 (SEQ ID Nr.: 7) und 4 (SEQ ID Nr.: 8) nicht von dieser Erfindung.
Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) verdoppelt (ID₂) die aPTT und die Thrombinzeit in Konzentrationen von 12 beziehungsweise 5 nM. Das entspricht einer fünffachen Erhöhung in Werten der Antikoagulansaktivität verglichen mit Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2). Tabelle VII veranschaulicht, dass die Peptide 3 (SEQ ID Nr.: 7) und 4 (SEQ ID Nr.: 8) eine geringere Antikoagulansaktivität als Peptid 2 besitzen.
TABELLE VIII HEMMUNG DER MENSCHLICHEN PLÄTTCHENAGGREGATION DURCH PEPTID 1 VERGLICHEN MIT DEN PEPTIDEN 2, 3 UND 4
Thrombin-induzierte Plättchenaggrregtion
Die dosisabhängige Hemmung von menschlicher Plättchenaggregation durch die Peptide 1–4 (SEQ ID Nr.: 1, 2, 7 und 8) wird in Tabelle VIII dargestellt. Thrombin-induzierte Plättchenaggregation wird am wirksamsten durch Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) mit einem IC₅₀-Wert von 399±76 pM, ein 150facher Überschuss über Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) (IC50 = 60±26 nM) gehemmt.
Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8), das Analogon mit allen natürlichen L-Aminosäuren, und Peptid 3 (SEQ ID Nr.: 7), das Analogon mit dem verkürzten COOH-Terminus, sind etwa 1,000fach weniger aktiv als Peptid 1.
ADP-induzierte Plättchenaggregation
Disintegrinaktivität wird durch dosisabhängige Hemmung von ADP-induzierter Aggregation von menschlichen Plättchen gemessen und ist in Tabelle VIII dargestellt. Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) (IC₅₀ = 32 μM) und Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) (IC₅₀ = 19 μM) besitzen ähnliche Aktivität. Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8), das Analogon mit allen natürlichen L-Aminosäwen, und Peptid 3 (SEQ ID Nr.: 7), das Analogon mit dem verkürzten COOH-Terminus, sind etwa äquivalent zu Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1 in der Disintegrinaktivität.
Gesamtblut-Plättchenaggregation
Gesamtblut-Plättchenaggregation von Mensch und Ratte, induziert durch eine Kombination von ADP (0.5 μM) und Thrombin (0.025 U/ml), wird durch Peptid 1 mit einer IC₅₀ von 2.9 beziehungsweise 42.5 nM gehemmt (siehe 3). Folglich ist Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) etwa 15 mal aktiver in menschlichem Blut verglichen mit Rattenblut. Darüber hinaus hemmt Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) die Aggregation in menschlichem Blut vollständig im Gegensatz zu einem Plateau der Hemmung in Rattenblut von etwa 50%.
Intravenöse Verabreichun von Peptid 1 in Hunden
Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) zeigt eine Hemmug von Thrombin und Plättchenaggregation, wenn es für 1 h in betäubte Hunde infundiert wird. Darüber hinaus ist die Wirkung von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) von kurzer Dauer, nachdem die Infusion gestoppt wurde. Thrombinzeiten (4) und aPTT (5) werden dosisabhängig durch Infusionsmengen von 1 und 5 nmol/kg/min verlängert. Die Thrombinzeiten sind sensitiver gegen Hemmung durch die Infusion von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) als es die aPTT-Tests sind. Die zusammengefassten Daten in 2 zeigen, das maximale Hemmung innerhalb von 15-30 min vollständig ist. Nachdem die Infusion gestoppt wurde (60 min), wurde die Thrombinaktivität wiederhergestellt, mit einer pharmakodynamischen t_1/2 von 17 ± 0.1 beziehungsweise 26 ± 3.2 min für die Infusion von 1 und 5 nmol/kg/min.
Die Hemmung der Plättchenaggregation bestätigt die Wirkung von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) in Koagulationstests. Die Infusion von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) hemmt die Thrombininduzierte Plättchenaggregation in 15 min (6). Die Hemmung wird für die Dauer von 1 h Infusionszeit in 2 von 3 Hunden aufrechterhalten. Die Plättchenaktivität wird wiederhergestellt, mit einer pharmakodynamischen t_1/2 von 12.8 ± 1.1 min, nachdem die Infusion von 1 nmol/kg/min gestoppt wurde.
ADP-induzierte Plättchenaggregation wird in 1 von 3 Hunden bei jeder Dosismenge gehemmt. In vitro wird ADP-induzierte Plättchenaggregation bei μM-Mengen gehemmt. Es wird geglaubt, aber diese Erfindung ist nicht durch diesen Glauben gebunden, dass die 1 : 2-Verdünnung von Blut mit Kochsalz in Gesamtblut-Plättchenaggregation die Konzentration von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) verringert, die für die wirksame Hemmung von ADP-induzierter Plättchenaggregation notwendig ist. Die Gerinnungszeiten (7) und Plättchenzahlen ( 8) bleiben in Hunden, die Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) erhalten, stabil. Blutdruck (9) und Puls (10) sind geringfügig auf eine dosisabhängige Weise erhöht. Diese Parameter fallen 2 h nach Infusionsende auf Grundkontrollwerte zurück.
TABELLE IX WIRKUNG VON PEPTID 1 AUF ARTERIELLE THROMBOSE IN RATTEN
Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) wird im FeCl₃-induzierten Ratten-Aorta-Thrombosemodell auf antithrombotische Aktivität untersucht. Thrombotischer Verschluss wird dosisabhängig durch fortlaufende intravenöse Infusion für 1 h, beginnend 15 min vor Gabe von FeCl₃ in Mengen von 5, 10 und 25 nmol/kg/min verlängert (siehe Tabelle IX und 11). Der Verschluss wird während der Infusion in 4 von 5 Ratten bei einer Menge von 25 nmol/kg/min verhindert. Bei Mengen von 10 und 5 nmol/kg/min wird der Verschluss in 4 von 7 beziehungsweise 0 von 6 Ratten verhindert. Die Dosismenge von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), die zur Verdopplung der Verschlusszeit nach FeCl₃-Gabe erforderlich ist, beträgt 19.3 nmol/kg/min verglichen mit 33.7 nmol/kg/min, was früher für Peptid 2 (SEQ ID Nr.: 2) beobachtet wurde.
TABELLE X HEMMUNG VON MENSCHLICHER PLÄTTCHENAGGREGATION: „(L)CYS-SCHLEIFE" VERSUS „(D)CYS-SCHLEIFE"
Tabelle X zeigt den Unterschied zwischen den zwei Stereoisomeren, der aus der Substitution von (D)Cys- durch (L)Cys-Reste in der verbindenden „Brücke" zwischen dem Inhibitor der katalytischen Stelle und der Anion-bindenden Erkennungssequenz ausserhalb resultiert. Peptide 5 (SEQ ID Nr.: 9) und 6 (SEQ ID Nr.: 10) repräsentieren Analoga von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), die zusätzliche Reste in der cyclischen RGD-Sequenz enthalten. Peptid 5 (SEQ ID Nr.: 9) unterscheidet sich auch darin, dass es (L)Cys-Reste in der verbindenden „Brücke" im Gegensatz zu (D)Cys besitzt. Die unterschiedliche räumliche Orientierung der cyclischen RGD-Sequenz resultiert in stärkerer Hemmung der Thrombininduzierten Plättchenaggregation menschlicher Plättchen durch das (D)Cys-Analogon, Peptid 6 (SEQ ID Nr.: 10). Ein 10facher Unterschied in der Thrombinaktivität wird zwischen den zwei Stereoisomeren bemerkt. Es gibt jedoch keine Unterschiede in der Hemmung der ADPinduzierten Plättchenaggregation und Antikoagulans-Aktivität. Man beachte, dass die Modifikation von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), um ein Analogon, das nur natürliche L-Aminosäuren enthält, herzustellen – Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8) – den Unterschied zwischen den zwei Stereoisomeren vergrößert. Tatsächlich besitzt Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) eine etwa 1,000fach stärkere Hemmung der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation als Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8) (siehe Tabelle VIII). Es gibt keinen Unterschied zwischen diesen zwei Stereoisomeren auf die Hemmung der ADP-induzierten Plättchenaggregation. Die Antikoagulansaktivität ist jedoch größer für das (D)Cys-enthaltende Analogon – Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) – als das Analogon nur mit natürlichen Aminosäuren – Peptid 4 (SEQ ID Nr.: 8).
Relative Aktivität von Peptid 1 versus Analoga von Peptid 1
Tabellen XI–XIV zeigen die Verhältnisse der Analoga von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) zu etablierten IC₅₀-Plättchenhemmungs- und ID₂-Antikoagulationsdaten. Für diese Vergleiche besitzt Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1)-Probe die folgende Aktivität: Koagulation – ID₂ (aPTT = 27.9 nM; Thrombinzeit = 15 nM); Aggregation – IC₅₀ (Thrombin = 5.8 nM; ADP = 11.4 μM). Die Werte für aPTT, Thrombinzeit, Thrombin und ADP für die Peptide 7–18 (SEQ ID Nr.: 11–22) in den Tabellen XI–XIV stellen nur Vergleichswerte dar und beabsichtigen nicht, aktuelle Konzentrationen von Peptiden darzustellen – daher werden keine Einheiten gegeben. Zum Beispiel bedeutet ein aPTT-Wert von 0.99 für Peptid 7 (SEQ ID Nr.: 11), dass Peptid 7 (SEQ ID Nr.: 11) 99% so aktiv ist wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) in Tests der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) in normalem menschlichem Plasma.
TABELLE XI RELATIVE AKTIVITÄT: PEPTID 1 VERSUS B₄-SUBSTITUIERTE ANALOGA
Tabelle XI zeigt die Unterschiede zwischen zwei Analoga von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) – Peptide 7 (SEQ ID Nr.: 11) und 8 (SEQ ID Nr.: 12). Peptid 7 (SEQ ID Nr.: 11) ist ein Analogon von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), in dem Nle an der B₄-Einheit durch Met ersetzt wurde, und Peptid 8 (SEQ ID Nr.: 12) ist ein Analogon von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), in dem Nle in der B₄-Einheit durch Cha ersetzt wurde. Peptid 8 (SEQ ID Nr.: 12) ist etwa 1/3 weniger aktiv als Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) in Tests der aPTT, aber der aPTT-Wert von Peptid 7 (SEQ ID Nr.: 11) ist im wesentlichen der gleiche wie der von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1). Wie für die Thrombinzeitwerte variieren diese Werte mit jedem Peptid – wobei Peptid 7 (SEQ ID Nr.: 11) nur 19% so aktiv wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) ist, während Peptid 8 (SEQ ID Nr.: 12) sogar aktiver als Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) ist. Ein 10facher Unterschied in der Thrombinaktivität wird zwischen Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) und jedem der Analoga bemerkt. Wie für die ADP-Aktivität ist Peptid 8 (SEQ ID Nr.: 12) ungefähr 1/2 mal so wirksam wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), während Peptid 7 (SEQ ID Nr.: 11) etwa 3/4 so wirksam wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) ist.
TABELLE XII RELATIVE AKTIVITÄT: PEPTID 1 VERSUS B₃-SUBSTITUIERTE PENICILLAMIN-ANALOGA
Tabelle XII zeigt die Unterschiede zwischen zwei Penicillamin-Analoga von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) – Peptide 9 (SEQ ID Nr.: 13) und 10 (SEQ ID Nr.: 14), beide keine Peptide dieser Erfindung. Diese Tabelle ist eingefügt, um die Austauschbarkeit von Arg in der B₃-Einheit mit Me-Arg zu zeigen. Die Einführung der Penicülamin-Einheit erniedrigt die Aktivität von Peptid 9 (SEQ ID Nr.: 13) in allen Kategorien stark. Wie für Peptid 10 (SEQ II) Nr.: 14) wird die gleiche Abnahme der Thrombinaktivität bemerkt wie in Peptid 9 (SEQ ID Nr.: 13). Es gibt jedoch nur eine geringe Abnahme der Thrombinzeit, während die ADP-Aktivität 6fach erhöht ist verglichen mit Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1).
TABELLE XIII RELATIVE AKTIVITÄT: PEPTID 1 VERSUS B₂-SUBSTITUIERTE ANALOGA
Tabelle XIII zeigt die Austauschbarkeit des Gly-Rests an B₂ durch verschiedene D-Aminosäurereste. Peptide 11 (SEQ ID Nr.: 15), 12 (SEQ ID Nr.: 16), 14 (SEQ ID Nr.: l8) und 15 (SEQ ID Nr.: 19) sind Analoga von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), in dem die B₂-Einheit durch verschiedene D-Aminosäuren ersetzt wurde und sind Peptide dieser Erfindung. Peptid 13 (SEQ ID Nr.: 17), das kein Peptid dieser Erfindung ist, ist ein Analogon von Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), in dem der Gly-Rest an B₂ deletiert ist.
TABELLE XIV RELATIVE AKTIVITÄT: PEPTID 1 VERSUS A₁-SUBSTITUIERTE ANALOGA
Tabelle XIV zeigt die Austauschbarkeit des (D)Phe-Restes an der A₁-Einheit. Peptide 16–18 (SEQ ID Nr.: 20–22) sind alle Peptide dieser Erfindung. Peptid 16 (SEQ ID Nr.: 20) weist im wesentlichen die gleiche Thrombinaktivität und Thrombinzeit wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) auf. Peptid 17 (SEQ ID Nr.: 21) weist im wesentlichen den gleichen Thrombinzeitwert wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) auf und besitzt einen größeren ADP-Wert, aber es ist 10fach weniger aktiv in seinem Thrombinwert. Im Vergleich weist Peptid 18 (SEQ ID Nr.: 22) eine deutliche Erhöhung der aPTT-Werte verglichen mit Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) auf, aber zeigt eine nur 77% aktive Thrombinzeit wie Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1), während die Thrombin- und die ADP-Werte nur halb so aktiv wie die für Peptid 1 (SEQ ID Nr.: 1) sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verbindung der Formel X-A-B-C-Y (1),wobei X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder eine t-Butyloxycarbonylgruppe ist; A ein Peptidanalogon der Formel A1-A2-A3 (2)ist, wobei A₁ (D) Phe, (D) Phg, (D) 3-Tiq, N-Me-(D) Phe ist; A₂ Pro ist; A₃ Arg ist; B ein Peptidanalogon der Formel
oder
wobei B₁ Gly ist; B₂ Gly, (D) Tyr, (D) Val, (D) Thr oder (D) Pro ist; B_2' Arg-Ile-Pro ist; B₃ Arg oder N-Me-Arg ist; B₄ Nle oder Phe ist; C ein Peptidanalogon der Formel Asp-C₁-C₂-C₃-C₄-C₅-C₆-C₇-C₈-C₉ (5) ist; wobei C₁ Phe oder Tyr ist; C₂ Glu ist; C₃ Glu oder Pro ist; C₄ Ile ist; C₅ Pro oder (D) Ala ist; C₆ Glu oder Ala ist; C₇ Glu ist; C₈ Tyr, Tyr-Leu, Tyr-Cha oder Ala-Cha ist; C₉ eine Bindung oder (D) Glu ist; und Y eine Hydroxygruppe, ein C₁-C₆-Alkoxyrest oder ein mono- oder di-(C₁-C₄)alkylsubstituierter Aminorest ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei B ein Peptid der Formel (3) ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei B ein Peptid der Formel (4) ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei B₄ Nle ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y eine Hydroxygruppe oder ein C₁-C₆-Alkoxyrest ist.
Verbindung nach Anspruch 1, welche
Verbindung nach Anspruch 1, welche
Verbindung nach Anspruch 1, welche
Verbindung nach Anspruch 1, welche
Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als pharmazeutischer Wirkstoff.
Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von venösem oder arteriellem Thromboseleiden.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von nach einer Angioplastie auftretender Koronarthrombose.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von akutem postangioplastischem Verschluß.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Zytopenie, die von extrakorporaler Zirkulation verursacht wird.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines sich entwickelnden Myocardinfarkts.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von nach fibrinolytischer Therapie auftretendem Verschluß.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Thrombozytopenie während extrakorporaler Zirkulation.