JPH04503660A - 血小板凝集抑制の方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、治療と予防の目的の為に、ヒルジン、又はその類似物質の抗凝血物質 と血小板抑制的活性を発揮する生物学的活性ペプチドを特徴とする抗凝血物質及 び血小板抑制組成物３組み合わせ及び方法に関するものである。本発明の方法９ 組成物及び組み合わせは、患者又は生物学的標本における血小板凝集化及び血小 板活性化を減少又は防止するのに好都合に有用である。これらの方法１組成物及 び組み合わせは、ヘパリン誘導血小板減少症又は抗トロンビンＩＩＩ欠乏症の病 歴に基づき、標準的ヘパリン療法が禁忌される患者に特に有用である。本発明は また１体外血液の処理及び血小板保存寿命を増大する為の方法１組成物及び組み 合わせにも関するものである。 背景の技術 心筋梗塞、心筋発作、肺動脈塞栓症、深在静脈血栓症、抹消動脈閉塞及び他の血 液系血栓症の様な急性血管症は、主たる健康の危険を構成している。この様な疾 患は。 フィブリン及び凝集血小板の一つ又は両方がら成る血餅による血管の部分的又は 全面的閉塞により引き起こされる。 血小板は、普通の止血に本質的役割を演じる。血小板は、明確な止血機能及び血 栓形成機能の両機能を有する。 止血は、血小板が外傷縁部に付着し始める時に、数秒内に外傷部で開始される。 この血小板の最初の付着は、血管壁外傷部分に露呈されるコラーゲンにより、又 は新しく発生したトロンビンにより媒介されるだろう。コラーゲン又はトロンビ ンと一度接触すると、血小板は、入ＤＰ及びトロンボキサンＡ２を包含する各種 の化学物質を遊離する活性化（遊離反応）を行う。遊離されたＡＤＰ及びトロン ボキサンＡ２は、放出血液から追加的血小板を発生して、既に血管壁に付着した 血小板を凝集する。新しく付着した血小板はまた。遊離反応を行い、この過程は 、止血の血小板膜が形成されるまで継続する。遊離ＡＤＰ及びトロンボキサンＡ ２に加えて、血小板はまた。トロンビン発生及びフィブリン析出を最終的に生成 するところの血餅化多段階を促進する血小板因子３を、傷部分に露呈する。 トロンビンはまた。血小板膜のレセプタに結合し、かつ更に血小板凝集と遊離を 引き起こす。最終的に得られる結果は。 Ｗｉ集血小板と重合フィブリンから成る混合血餅である。 普通の止血に必要であるけれども、血小板Ｍ隼と遊離反応に起因する血餅形成は また。心筋梗塞、心筋発作、肺動脈塞栓症、深在静脈血栓症、抹消動脈閉塞及び 他の血液系血栓症の様な各種の生命を脅かす血管症の原因である。この様な病気 に苦しむ患者において、血小板凝集は、抑制されねばならない望ましからざるこ とである。血小板凝集の抑制はまた。透析の様な血液の体外処理、血小板濃度に おいて血小板の貯蔵、及び心臓−肺バイパスの様な外科的処置において望ましい ものである。 透析処置の間、血小板は、透析膜の壁に付着しかつ凝集する傾向がある。このこ とは、処置血液からの瀉血血小板のみならず処置の効率を減少する傾向がある。 血小板貯蔵の場合、血小板濃度は、しばしば、血小板が活性化又は損傷化のいず れかによる分解過程の「貯蔵損傷」を受ける。この様な損傷の実際的結果は、貯 蔵寿命を減少させることである。 血小板濃度で発生するトロンビンは、この分解の原因となる［＾、Ｐ、ボーデ及 びり、　Ｔ、ミラー（Ｂｏｄｅ、及びｉ［１ｌｌｅｒ）、　ｒ貯蔵血小板濃度に おけるフィブリンペプチドＡの発生及び分解」、ボックスサング（販り匝展）、 第５１巻、第１９２〜９６頁、　（１９８６年）］。 血管外科治療において、血液血餅化の抑制は、治療血管の一体保持に必須である 。若し血餅形成が、この様な外科治療の後にあまりに早く起こるならば、患者の 生命を脅かすだろう。 トロンビン誘導血小板の活性化の機構の理解は貧弱であるけれども、２段階を含 むと信じられている＝１）トロンビンの血小板表面のレセプタへの結合；及び２ ）血小板表面基質のトロンビン−触媒とするタンパク質分解。高親和性トロンビ ン結合部分及び適度の親和性トロンビン結合部分は。 血小板表面に確認され、かつ両方は生理学的に関連性があると４７Ｂしられる［ Ｊ、　Ｔ、　ハーモンとＧ、　Ａ、ジャミーソン（ＨａｒｍｏｎとＪａｍｉｅｓ ｏｎ）　ｒ血小板グリコタンパク質Ｉｂのグリコ石灰沈着部分は、トロンビンに 対して高い及び適度の親和性レセプタ部分人、「高親和性トロンビンレセプタの 存在しないトロンビンによる血小板の活性化」、バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉ■■）。 第２７巻、第２１５１〜２１５７頁（１９８８年）］。 化学的に修飾されかつ抑制剤処理されたトロンビンの使用は、結合段階とタンパ ク質分解段階の両方の段階が。 血小板活性化の成分であることを証明している。例えば、ヒルジン又はデンシル アルギニント（３−エチル−１−５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）のい ずれかで処理されたトロンビンは血小板を活性化出来ないけれども、ただヒルジ ン処理したトロンビンのみが、血小板トロンビンレセプタに結合出来ない［Ｃ， Ｌ、クナップ（Ｋｎｕｐｐ）、　ｒトロンビン誘導血小板の遊離と凝集に対する トロンビン抑制剤の効果」、トンボシス　リサーチ（Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ ｓ、）第４９巻、第２３−３６頁、　（１９８８年）］。然し乍ら。 血小板レセプタへのトロンビン結合の抑制が、トロンビン誘導血小板の活性化を 邪魔するのに充分であることは証明されていない。事実、ヒルジンは、血小板表 面へのトロンビンの結合を阻害するけれども、ヒルジンはまた。酵素のアミド分 解機能を抑制する［Ｐ、ワルスマンとＦ、マルクバルト（ＷａｌｓｍａｎｎとＭ ａｒｋｗａｒｄｔ）、　ｒ　ト（］ンビン抑制剤のヒルジンに関する生化学的及 び薬理学的見解」、ファルマジー（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ）。 第３６巻、第６５３〜６６０頁、　（１９８１年月。 血栓症の治療と予防に対する最新の方法は、一つ又は二つの異なる方法で作用す る治療を含む。第一のタイプの治療。 は、トロンビン活性又はトロンビン形成を抑制し、従って。 血餅形成を防ぐ。これらの薬はまた。血小板活性化と！Ｊｓを抑制する。第二の 治療範鴫は、血栓崩壊を促進しかつ血液血餅を溶解し、その際に血餅を血管から 除去し、かつ血液の流れを阻害しない［Ｊ、Ｐ、カゼナブ（Ｃａｚｅｎａｖｅ） 等、エイジェントアクション（知ヨぶし穎■亜）、第１５巻、補足、第２４〜４ ９頁、　（１９８４年）］。 前者のクラスの化合物のヘパリンは、静脈の血栓症の様な治療条件に広く使用さ れてきたが、この条件においてトロンビン活性は血栓の発達又は拡張に原因があ る。ヘパリンは、複合体を形成しかつトロンビンを不活性化するタンパク質であ る抗トロンビンＩＩＩを活性化することによりその効果を表す。その作用方式の 為に、ヘパリンは、トロンビン誘導血小板の凝集のみを防止するのに有用である 。この応用においてさえ、ヘパリンの総ての有効性は、疑問がある。更に、ヘパ リンは、出血とヘパリン誘導の血小板減少を含む多くの望ましくない副作用を生 成する。更に、恐ろしい血栓症の結果を有するであろう免疫媒体の血小板減少で あるところのヘパリン誘導血小板減少に苦しむ患者にとって、ヘパリンは、致命 的な結果をしばしば伴って、血小板凝集を真に促進する。抗トロンビンＩＩＩ欠 乏症を有する様な他の患者にとって、ヘパリンは、単に効果がないだけである。 従って、従来のヘパリンに基づく治療に代わる治療法の必要がある。 ヒルジンは、吸血ヒルである。ドイツヒル（Ｈｉｒｕｄ。 ａ＋ｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）により製造される天然起源のボッペプチドである。 ヒルの唾液腺に生成されるこの化合物は、既知の最も強力な天然の凝集抑制剤で ある。ヒルジンは、１：１の化学量論的な複合体でトロンビン（Ｌ〜２Ｘ１０− ”Ｍ）へ確りと結合することにより血液を凝集しないようにする［３．　Ｒ，ス トーンとＪ、ホフステテーンジ（ＳｔｏｎｅとＨｏｆｓｔｅｅｎｇｅ）、　ｒヒ ルジンによるトロンビンの抑制の速度論」、バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ）。 第２５巻、第４６２２〜２８頁、　（１９８６年］。このことは、即ち、フィブ リノーゲンのフィブリン（血餅）への転換に触媒作用することからトロンビンを 抑制する。 ヒルジンとトロンビンの間の真の結合は、２段階プロセスである。最初、ヒルジ ンは、トロンビン分子（Ｋ、〜ｌＸｌ０−’Ｍ）の「低い」關和性部分へ結合し 、これは触媒部分から分離される。低い親和性結合に続いて、ヒルジンは、立体 構造的変化を受け９次いでトロンビンの「高い」親和性部分へ結合する。この後 の部分は、トロンビンの活性部分に相当する。 ヒルジンは、トロンビンの血小板への結合［Ｐ、ガングリとＷ、　Ｊ、ソニック セン（Ｇａｎｇｕｌｙと５ｏｎｎｉｃｈｓｅｎ）　「ヒト血小板へのトロンビン の結合及びその可能な重要性」、プリティシュジャーナルへモトロギー（Ｂｒ、 　Ｊ、　Ｈａｅｍｏｔｏｌ、）、第３４巻、第２９１〜３０１頁、　（１９７６ 年）；Ｓ、Ｗ、タムとＴ、　Ｃ，ブトビラ−（ＴａｎとＤｅｔｗｉｌｅｒ）Ｊヒ ト血小板プラズマ膜へのトロンビンの結合」、旦土士ミカエト　ビオフィジカア クタ（Ｂｉｏｃｈｉｔ　Ｂｉｏ曲ＬＬ］旦膓）。 第５４３巻、第１９４〜２０１頁、　（１９７８年）］及びトロンビン誘導の血 小板凝ｓ　ｃｓ、　ｔタム（Ｔａｎ）等汗ヒルジンによるトロンビンの血小板か らの解離：レセプタプロセシングに対する証明」、乞工二ナルオブビオロジカル ケミストリ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、第２５４巻、第８７２３〜２５ 頁、　（１９７９年月の両方を抑制すると示されている。従って、ヒルジンは９ 強力な抗血小板剤として見なされている。然し乍ら、幾つかの欠点が、高いコス ト、強力な抗原性及び出血を含むヘパリンの使用に結び付いている。 ヒルジンの単離、精製及び化学的組成物は、この技術分野において公知である［ Ｐ、パルマンとＦ、マルクバルト（ＶａｌｓｍａｎｎとＭａｒｋｖａｒｄｔ）汀 トロンビン抑制ヒルジンの生化学的及び薬理学的見解上ファルマジ−（Ｐｈａｒ ｍａｚｉｅ）、第３６巻、第６５３〜６０頁、　（１９８１年）コ。更に最近、 ポリペプチドの完全なアミノ酸配列が解明されているＣＪ、ドツト等（Ｄｏｄｔ ）汀ヒルジンの完全な共有構造ニジサルファイド結合の局所化」、ビオロジカル ケミストリ　ホッペーセイラ−ＣＢｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　Ｈｏ　ｅ−３ｅ　１ ｅｒ）、第３６６巻、第３７９〜８５頁、　（１９８５年）；　Ｓ、Ｊ、Ｔ、７ オ等（夏ａｏ）汗ヒルジンの急速精製及び修正アミノ端未配列：吸血ヒルの特定 トロンビン抑制剤」、アナリティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第１６１巻、第５１４−１８頁、　（１９８７年）；及びＲ ，Ｐ、ハーベイ等（ｔｌａｒｖｅｙ）、　「吸血ヒル、ドイツヒルＱｌｉｒｕｄ ｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）からの抗凝集性ヒルジンをコードするｃＤＮＡの クローニングと形第１０８４〜８８頁、　（１９８６年）］。 ヒルジン、　ｆｌＶ−１及びＨＶ−２の少なくとも２つの異なる異性体特定型が 、配列決定されており、かつアミノ酸配列において僅かに異なることが分かって いる［Ｒ，Ｐ、ハーベイ等（Ｈａｒｖｅｙ）、上記コ。ヒルジンの両型は、６５ 個のアミノ酸を含む単一ポリペプチド鎖のタンパク質から成り、このアミノ酸末 端は１本質的に疎水性アミノ酸から成り、かつカルボン酸末端は典型的に極性ア ミノ酸から成る。更に特定的に、ヒルジンの総ての型は、　１−２．３−５及び ４−６位置の半分−システィン構造の３個のジサルファイド架橋と高度に酸性な Ｃ−末端断片（残部４’０−６５）により特徴づけられる。更に、ヒルジンのＣ −末端断片は、硫酸エステル化された６３３位置アミノ酸におけるチロシン残部 の存在により特徴づけられる。 動物研究において、ヒルから精製されたヒルジンは、静脈血栓症、血管シャント 閉塞及びトロンビン誘導散在性の曲管内凝集を防止する有効性を証明している。 更に、ヒルジンは、低い毒性、殆ど又は全く無い抗原性及び血液循環からの極め て短いクリアランス時間を現す［Ｆ、マルクバルト等（ｌ［ａｒｋｗａｒｄｔ） 汀実験動物におけるヒルジンの抗血栓作用に対する薬理学的研究上トロンビスイ スヘモスタシス（ＴｈｒｏｔＨａｅ＋＋＋ｏｓｔａ、５ｉｓ）、第４７巻、第２ ２６〜２９頁、　（１９８２年月。 ヒルジンの有効性にかかわらず、研究は、ヒルジンが１服用方法に左右されて出 血時間を長引かせ、これにより適切な服用の決定と許容を決定的に重要とするこ とを示している。更に、高いコストと天然起源生産物の低い供給は、その広範囲 の使用を制限している。 ヒルジンのより大きな供給を作り出す努力において１組換えＤＮＡ技術によりポ リペプチドを生産する試みがなされている。天然ヒルジンの橿硫酸エステル化千 ロジン残部の存在、及び微生物が類似タンパク質修飾を完成することの不可能は 、生物学的に活性なヒルジンの組換え生産の見込みを高度に特定的とした。硫酸 エステルを除去したヒルジンは、硫酸エステル化した複製物と殆ど同じく活性で ある観察された［米国特許第４．６５４．３０２号］、然し乍ら、大腸菌中にヒ ルジンのクローン化及び形質発現の方法を導いた［欧州特許出願筒１５８．５６ ４号、　１６８．３４２号、及び第１７１．、０２４号］及び酵母［欧州特許出 願筒２００．６５５号］。これらの発展にかかわらず、ヒルジンはまだ生産する には幾らか高価であり、商業的に広く入手出来ない。 最近、血餅生成時間を低めるのに有効な天然ヒルジンのペプチド断片を同定する 努力がなされている。ヒルジンの非硫酸エステル化２１アミノ酸Ｃ−末端断片の Ｎ“−アセチルヒルジン４６−６６は、試験管内で血餅形成を抑制する。更に、 ヒルジンのＣ−末端１１又は１２アミノ酸（残部５５−６５及び５４−６５）に 相当する幾つかの他の小さい非硫酸エステル化ペプチドもまた。試験管内で血餅 形成を抑制するのに有効であることが証明されている［Ｊ、Ｌ、クリステナンス キ等Ｑｒｓｔｅｎａｎｓｋｙ）、　ｒ合成非硫酸エステル化Ｎ゛−アセチルヒル ジン、ト、、を使用してヒルジンのＣ−末端の抗血栓性質」、フエブス　レター （ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ）。 第２１１巻、第１０〜１６頁、　（１，９８７年）］。この様なペプチド断片は 。 然し乍ら、進行中の治療養生において、血液血餅を溶解するには充分に満足なも のでない。例えば、に“−アセチルヒルジン４６−６６は、天然ヒルジンより低 い大きさの４つの度合いの特定活性を有する。 従って、血餅形成と血小板凝集の両方、及び従来の薬剤に結び付く副作用により 特徴づけられない分泌、及び工業的に実行可能な量で生産出来るに有効な抑制剤 の要望が依然として存在している。 発明の開示 本発明は、天然ヒルジンの生物学的な活性を有するペプチドにより特徴づけられ る組成物１組み合わせ及び方法を提供することにより上記問題を解決するもので あり、この゛天然ヒルジンは、血液血餅生成時間を増加させる抗凝集として、か つ血小板凝集と活性化（抗血小板）を抑制する抗血小板剤として有効なものであ る。次の開示から分かるであろう様に１本発明の抗血小板組成物１組み合わせ及 び方法は１体外血液の処理及び貯蔵血小板濃度の保存において、血管の病気の治 療と予防における血小板の凝集及び分泌を防止するのに効果的でかつ安全である 。 好都合に１本発明の抗血小板組成物１組み合わせ及び方法は、特に、標準ヘパリ ン治療が禁忌な患者に有用である。例えば、ヘパリン誘導の血小板減少の患者に おいて１本発明の組成物は、血小板活性化を引き起こさずに、プラズマに抗凝集 性である。これらの組成物を特徴とするヒルジンペプチドの大きさが小さいこと は、これらで治療する患者に逆抗原性応答の可能性を削減する。 図面の簡単な説明 第１図は、逆相■ＰＬＣによるスルホ−ＴＹｒａ３ヒルジン５．−６４の精製を 現す。 第２図は９　ヒルジンペプチドの抗凝集性活性のみならず、その共有構造を現す 表である。この第２図において。 アミノ酸は１次の単一アルファベットコードにより表現される。 Ｐｈｅ：　Ｆ　Ｌｅｕ：　Ｌ　Ｉｌｅ：　Ｔ　Ｙｅｔ：、ｉ［Ｖａｌ：　Ｖ　Ｓ ｅｒ：　Ｓ　Ｐｒｏ：　Ｐ　Ｔｈｒ：　Ｔ＾１ａ：　Ａ　Ｔｙｒ：　Ｙ　Ｈｉｓ ：　ＨＧｉｎ：　ＱＡｓｎ：　Ｎ　Ｌｙｓ：　Ｋ　Ａｓｐ：　Ｄ　Ｇｌｕ：　Ｅ Ｃｙｓ：　ＣＴｒｐ：　ｆ　Ａｒｇ：　ＲＧｌｙ：　Ｇ第３Ａ−３Ｃ図は、ヘパ リンペプチドのペプチド様類似体のヒルログ−１，ヒルログ−２及びヒルログ− ３の合成を現す。 第４λ図は、ヒルジンペプチドのペプチド様類似体のヒルログ−４の合成を現す 。 第５Ａ図と５Ｂ図は、ヒルジンペプチドのペプチド様類似体のヒルログ−５及び ヒルログ−６の合成を現す。 第６図は、ヒルジンペプチドのペプチド様類似体のヒルログ−７の合成を現す。 第７図は、トロンビン誘導血小板におけるスルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジン６３−６ ４の効果を現す。 第８図は、トロンビン誘導血小板凝集におけるスルホ−Ｔｙｒ６ｘヒルジン６３ −６４とヒルジン６３−４４の効果の比較を現す。 第９図は、トロンビン誘導血小板の遊離反応におけるスルホ−ＴＹｒｓｓヒルジ ン６１６（の効果を現す。 第１０図は、血小板からのトロンビン誘導トロンボキサンＡ２生成の効果を現す 。 第１１図は、ヘパリン誘導血小板減少に苦しむ患者から得られた血小板の１３に 対するヘパリンとスルホ−ＴＹｒｓｇヒルジン＆！−６４の効果の比較を現す。 第１２図は、ヘパリン誘導血小板減少に苦しむ患者から得られたプラズマの活性 化部分トロンビン時間に対するヘパリンとスルホ−ＴＹｒ６．ヒルジン６３−６ ４の効果の比較を現す。 ｇ豆ｑ拝槻μ星医 本発明は、薬学的に許容出来るヒルジンペプチド含有の組成物及び組み合わせ、 及びこれらを患者における１体外血液における。及び貯蔵血液における血小板凝 集と活性化を抑制する為に使用する方法に関するものである。本発明の組成物１ 組み合わせ及び方法は、ヒルジンのカルボン酸末端部分のアミノ酸配列に相当し 、かつ天然ヒルジンの抗凝集性と血小板抑制活性を現すヒルジンペプチドを特徴 とする。ヒルジンペプチドは、天然ヒルジンのカルボン酸末端２６アミノ酸の少 なくとも一部に同族体である。この様なペプチドは。 負電荷部位基を添加することにより単一チロジン残部において誘導されるもので あろう。 ヒルジンペプチドは１式：　Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｘ及びこのＤ−レトロ型から実質 的に成るアミノ酸配列を特徴とし１式中ＸはＣ０ＯＨ，Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｇｌ ｎから成る群から選択される。更に、ヒルジンペプチドは。 式：　Ｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ −Ｚ、及びこれらのＤ−レトロ型から実質的に成るアミノ酸配列を特徴とし９式 中Ｙは闘２．アミノ保護基、アミノ酸配列：　Ｙａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−■１ｓ−Ａｓｎ −Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの少なくともＣ−末端部分、アミノ酸配列：　Ｖａｌ −Ｔｈｒ−ＧＩＹ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　 ｎ−５ｅｒ−Ｂ　ｉ　５−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓ　ｐの少なくともＣ −末端部分から成る群から選択され、２は、　Ｃ０ＯＨ，Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｇ ｉｎから成る群から選択され；かっチロシン残部は、負電荷部分基の存在により 特徴付けられる。この様なペプチドにおいて、負電荷部分基は、硫酸塩、リン駿 塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、ホスホネート、炭酸塩、メチルスルホン酸塩 、メチルホスホネート及びこれらの変化物から成る群から選択されて良い。ヒル ジンペプチドはまた。Ｙが＾５ｎ−ＧＬｙ−Ａｓｐ及び２がＬｅｕ及びチロシン 残部が硫酸塩である物を含んでも長駆。更に、ヒルジンペプチドは、アミノ末端 アミノ酸にドアセチル基の存在により特徴付けられて良い。 本発明の組成物１組み合わせ及び方法を特徴付けするヒルジンペプチドの製造は 、この技術分野で公知の各種の方法により達成される。例えば、ペプチドは、エ キソペブチターゼ、エドマン分解又はこの両方と組み合わせられる特定エントペ ブチターゼを使用するタンパク質加水分解により。 無傷ヒルジン分子から誘導されて良い。無傷ヒルジン分子は、その天然源のり、 メゾシナリス（Ｈ，ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）’＃・ら従来の方法を使用して精 製されて良い。別案として、ヒルジンは、　ＣＤＮＡ、Ｓを使用する既知組換え ＤＮＡ技術により製造され得る［Ｒ，Ｐ、ハーベイ等（■ａｒｖｅｙ）　、プロ シーディングナショナルルカリホスファターゼシグナル配列を使用して大腸菌中 にヒルジンの形質発現分泌とプロセシング」、フエブス　レター（ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｆｔ、　）、第２０２＠、第３７３−７７頁（１９８６年月、又は化学的に合 成した遺伝子［Ｃ，ベルブマン等（Ｂｅｒｇｍａｎｎ）汀ヒルジンヲコードする 遺伝子形質発現、ヒル、ヒルトメディシナリスからトロンビン−特定抑制剤の化 学的合成上バイオロジカルケミストリ　ホッペーゼイラ−（Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　ｎｏ　ｅ−３ｅ　１ｅｒ）、第３６７巻、第７３１〜４０頁（１９８６年 ）］により製造され得る。更に。ヒルジンペプチドは、融合タンパク質の一部と して組換え的に製造され得る。この様な融合タンパク質は、望みのペプチドが適 切な酵素開裂により遊離される様に設計されて良い。 好適には、ヒルジンペプチドは、直接的に製造され、即ち、出発原料として全ヒ ルジン分子の必要性を無くすることである。このことは、望まれるペプチドを符 号化するこれらのＤＮＡ配列のみが、形質変換された宿主に形質発現される周知 の組換えＤＮＡ技術により達成され得る。 別案として、ヒルジンペプチドは、従来の化学的合成技術により製造され得る。 これらのペプチドの比較的に小さい大きさの物（約８と２６のアミノ酸の間）は 、好都合に合成的に製造され得る。従って、これらは、天然ヒルジン又はその全 長さ組換えＤＮＡ複製のいずれかと比較して、極めて高い収率で製造出来、かつ 容易に精製される。好適には、ヒルジンペプチドは、固体相ペプチド合成又は溶 液相ペプチド合成、かつ任意的にカルボキシペプチダーゼで消化しくＣ−末端ア ミノ酸を除去する為）又は手動によるエルドマン分解により分解する（Ｎ−末端 アミノ酸を除去する為）ことにより合成される。溶液相方法による合成は、好都 合に、増大するペプチド鎖への誘導されたアミノ酸の直接的な付加を許す。この ことは、チロシン残部を修飾する続（誘導化工程の必要を無くする。この方法で 製造したペプチドは９次いでこの技術分野で周知の分離技術、好適には逆相ＩＩ ＰＬＣを使用して、精製される。 この明細書を通して、かつ特許請求の範囲において、アミノ酸とこれらの残部に 使用される省略形は、一般的に受け入れられている命名法の規則に一致して、か っα−アミノ酸とこれらのし一系の残部に関係して使用される。然し５乍ら２本 発明の組成物はまた。明細書に記載されたヒルジンペプチドのＤ−レ１〜ロ型に より特徴付けされるものを含む。これらは、Ｌ型のカルボキシ末端アミノ酸から 出発して、対向配向のＤ−アミノ酸により合成して製造される。 ヒルジンペプチドの誘導化は、遊離フェノール性ヒドロキシル又は単一チロジン 残部の八ち／シイルーメタ炭素のいずれかに、負電荷部分基の添加を含む。この 誘導化は、この技術分野で公知の負電荷部分基の変形の添加を含む。誘導化方法 は、チロシンベンゾイルメタ炭酸のスルホン化、リン酸化、及び炭酸化のみなら ず、チロシンヒドロキシル基の硫酸化、メチルスルホン化、リン酸化、メチルリ ン酸化、及び炭酸化を含むが、これに限定されるものでない。これらの反応を達 成する技術は、この技術分野で周知である。 最も好適には、ヒルジンペプチドは、硫酸化により誘導される。本発明の組成物 １組み合わせ及び方法を特徴付ける好適なヒルジンペプチドは、スルホ−ＴＹｒ ａｓヒルジン６３−６４であり、これは１２個のアミノ酸ペプチドで、硫酸化チ ロシン残部を有し、天然ヒルジンの残部５３−６４と同族体である。他の好適な ペプチドは、スルホニル−Ｔｙｒ６！ヒルジン６３−６４であり、こりはスルホ ン化チロシン残部を有する。 この後者のペプチドは、硫酸化の物よりも長い生物学的半減期を有する。 ヒルジンペプチドの硫酸化は、生物学的（酵素的）又は化学的方法のいずれかに より達成される。好適には、精製ヒルジンペプチドを、有機溶剤中にてジシクロ へキシル−カルボジイミドと硫酸とに並流的に反応させる。メタ炭素のスルホン 化は、この硫酸化方法の副反応を来す。 大規模の硫酸化に対して、ダラム量のペプチドを７先ず有機溶剤、好適にはジメ チルホルムアミドに溶解し１次いで脱水剤、好適にはジシクロヘキシル−カルボ ンイミドと反応させる様にして、硫酸化方法を改善する１、次いでペプチドの脱 水チロシン残部を、硫酸と反応させることにより硫酸化する。反応は、不溶性ジ シクロヘキシル尿素塩の生成により完結する。この改善方法は、大規模における 硫酸化ペプチドの収率を高める。好都合には、この硫酸化技術は、単離されかつ 精製された又は粗製物中の存在のいずれかのペプチド又はポリペプチドのチロシ ン残部の硫酸塩化に使用されて良い。硫酸化反応に続いて、硫酸化ペプチドは、 　ｎＰＬｃ、　ＤＥＡＥクロマトグラフィー、又は幾つかの他の従来の分離技術 のどれかにより、未反応ペプチドからのみならず、とのスルホン化ペプチドから も分離され得る。 硫酸化はまた。ヒルジンペプチドをピリジン中で三酸化硫黄−トリメチルアミン 塩と反応させることにより達成され得る。更に、チロシルスルホトランスフェラ ーセ活性は、粗製製造として又は精製酵素として、チロシン残部を硫酸塩化する のに使用出来る［Ｒ，Ｖ、　Ｈ，リーとＶ、　Ｂ、ハッテナー（ＬｅｅとＨｕｔ ｔｎｅｒ）、ｒＰＣ−１２フエノ　りロモシストマセルズのチロシン０硫酸化タ ンパク質、及びこれらのチロシルタン第１．１３２６〜３４頁（１９８３年）］ 。ヒルジンペプチドのリン酸化又はカルボキシ化は、上記硫酸化と類似反応によ り、硫酸の代わりにリン酸又は蟻酸を夫々置換して達成され得る。これらの反応 において、リン酸化又は炭酸化は、夫々、副反応として起こるだろう。別案とし て、酵素的方法が、ヒルジンペプチドのカルボキシ化又はリン酸化に使用出来る 。 ヒルジンペプチドのメチルスルホン化及びメチルリン酸塩化は、クロロスルホン 酸又はクロロリン酸でアルキル化を含むこの技術分野で周知の方法により、夫々 、達成出来るが、これに限定されるものでない。 硫酸化反応の程度は１分光光度計的に実行出来る。 硫酸化ペプチドの吸光度スペクトルは、約２７５ｎｍ〜約２５０〜２６５ｎｍの 最大吸光度におけるシフトを明らかにする。誘導化の確認は、３０％のトリフル オロ酢酸により６０℃３０分にて脱硫酸塩により得ることが出来る。このことは 、最大吸光度の２７５ｎｍに戻る増加を来すだろう。 本発明の組成物９組み合わせ及び方法に有用なヒルジンペプチドはまた。そのア ミノ末端にドアセチル基の付加により誘導され得る。Ｎ−アセチル化は、この技 術分野の当業者に公知の幾つかの技術のどれによっても達成出来る。好適には、 アセチル化は１本発明のペプチドの合成において。 Ｎ−アセチルアミノ酸誘導体を使用することにより達成される。別案として、ド アセチル化は、ペプチドを無水酢酸と反応することにより達成され得る。Ｎ−ア セチル化ヒルジンペプチドは、これらの対応する未アセチル化ペプチドに比較し て増加した生物学的安定性を好都合に証明している。 本発明の組成物１組み合わせ及び方法に使用されるヒルジンペプチドの血小板抑 制能力は、生体内半減期に一部左右される。従って１本発明はまた。ペプチドの 生物学的半減期を増加する薬学的に許容の重合体に結合するヒルジンペプチドか ら成る。共有又は非共有の、薬学的組成物にも関係する。例えば、ヒルジンペプ チドは、従来の技術を使用して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性誘導 体へ結合され得る。好適には、　ＰＥＧＮ−スクシンイミジル琥珀酸塩が、ペプ チドのα−アミノ部分へ結合される。この様な結合は、ペプチドを、有機溶剤又 は約７．０を越えるｐｔｌを有する緩衝液中にて、　ＰＥＧＩｆ−スクシンイミ ジル琥珀酸塩試薬（５Ｓ−ＰＥＧ）と反応させることにより実施される。最も好 適には、約５０倍モル過剰の５Ｓ−ＰＥＧ（平均１［ｆ＝５．０００ダルトン） が、ｐＨ９，０の２軸蓋のホウ酸ナトリウム緩衝液中でペプチドと反応させる。 ヒルジンペプチドは、単独で有用であり、又は血液システムの血栓症に起因する 血管の病気の治療と予防に対する組成物１組み合わせ及び方法に有用である。例 えば、ヒルジンペプチドを含む組成物と組み合わせのみならずヒルジンペプチド そのものは、予防目的にヘパリンの代わり、血小板減少の治療、散在性の血管的 凝集の治療及びどの病気状態にも起こる血管内トロンビイの治療にヘパリンの代 わりに使用されて良い。ヒルジンペプチドを含むＮＭ成物及び組の合わせのみな らずヒルジンペプチドそのものは、咽乳動物を含む。 特にヒトの患者の血管の病気の治療と予防に使用され°Ｃ良い。 ヒルジンペプチド又はこれを含む組成物はまた７体外血液における血小板凝集を 抑制するのに使用して良い。この応用に使用する場合、「体外血液」の用語は、 患者から直接に取り出され１体外治療に供し９次いで透析法又は血液濾過又は外 科の間の血液バイパスの様な処置において患者に戻す血液を含む。この用語はま た。患者へ起こり得る投与の為に１体外的に保存される血液製剤を含む。この様 な製剤は。 全血液、プラズマ又は血小板凝集の抑制が望まれるどの血液部分をも含む。これ らの組成物の型における活性ペプチドの量と濃度は、治療されるべき血液の量、 又は更に好適にはそのトロンビン含有量に基づくであろう。 本発明のＩＪＩｆｆ物０組み合わせ及び方法はまた。前記ヒルジンペプチドのペ プチド様類似体により特徴付けられるものも含む。ペプチド様類似体は、親ペプ チドに含まれる活性部分の三次元構造を真似るものである。この類似体は。 フィブリノーゲンのトロンビン含有量を抑制し、かつ抗凝集活性を示す。例えば 、ヒルジンペプチドの類似体は、天然の半ペプチド又は非ペプチドのいずれかで あり得る。これらのペプチド様類似体は、好都合にも、観化合物に比較して増加 した半減期と生物学的安定性を現す。更に、これらのペプチド様類似体の生物学 的入手可能性は、経口的又は局所的ルートにより投与する時に、対応するペプチ ドよりも大きい。更に、これらの類似体は、増加した抗血小板活性を現す。本発 明のペプチド様類似体は、前記ヒルジンペプチドに類似の生物学的活性により特 徴付けられることを理解されるべきである。従って、これらの類似体は、ヒルジ ンペプチドと同様の方法で１本発明の組成物１組み合わせ及び方法において使用 出来る。 本発明の別の実施態様によると、血小板の貯蔵寿命を増加する為の薬学的に許容 出来る組成物と方法は、血小板凝集と崩壊の他の抑制剤を更に含んでも良い。こ れらの組み合わせは、金属キレート剤、プロスタグランジン、テオフィリン、他 の小さい血小板抑制性ペプチド、他の血小板表面成分の抑制剤、血小板表面成分 の抗体、前記化合物のいずれかの類似体又はこれらの組み合わせを含むが、しか しこれに限定されるものでない。好適には、これらの追加的成分は、デキトロー ズ・クエン酸−リン酸エステル、プロスタグランジンＰＧＥ　Ｉ　、プロスタグ ランジンＥ、の類似体、プロスタサイクリン又はテオフィリンの安定類似体であ る。この明細書に定義する様に、「組み合わせ」の用語は、少なくとも一つのヒ ルジンペプチドと他の血小板凝集抑制剤を含む単一服用形態、２つの薬剤が分離 しで投与されるが、しかし協力的な多様服用形態、又は２つの薬剤が分離して投 与されるが、しかし連続的である多様服用形態を包含する。 本発明のもう一つの実施態様によると、治療される患者の血小板凝集を抑制する 為の薬学的に許容出来る組成物と方法は、更に、プロスタグランジン、テオフィ リン、他の小さい血小板抑制性ペプチド、シクロオキシゲナーゼ抑制剤、小さい 非ペプチド血小板抑制剤、血小板表面成分の抑制剤、血小板表面成分に体する抗 体、造血因子、前記化合物のいずれかの類似体又はこれらの組み合わせを、更に 含んで良い。最も好適なものは、アスピリン、チクロピジン、ジビリダモール、 スルフィンピラゾン、プロスタグランジンＥＩ、安定プロスタサイクリン誘導体 、グリコプロティンＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクロナール抗体又はグリコプ ロティンＩＩｂ／ＩＩＩａの天然抑制剤、グリコプロティンＩｂに対するモノク ロナール抗体、グリコプロティンＩＢの天然抑制剤、エリスロプロテイン、　ａ ｒｇ−ｇｔｙ−ａｓｐ含有ペプチド又はａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ含有ペプチドの 誘導体である。 本発明の組成物及び組み合わせに有用なヒルジンペプチドは、薬学的に有用な抗 血小板組成物と組み合わせを製造する為の従来の方法を使用して配合され得る。 好適には。 この様な組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容出来る担体を含む。例えば、 レミングトンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎ　ｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、　Ｅ、Ｗ、マルチン著（ｌｉａｒｔｉｎ）参照のこ と。更に、好適には１本発明の抗血小板組成物は、塩化ナトリウム、マンニトー ル又はソルビトールの様な等優性圧力を調節する為の薬学的に許容出来る化合物 と共に、薬学的に許容出来る緩衝剤、好適にはリン酸緩衝食塩を含む。本発明の 薬学的に許容出来る組成物と方法は、薬学的に有効量のヒルジンペプチド−〜生 物学的試料に幾らかの時間、血小板凝集を抑制する又は減少する為の有効量によ り特徴付けられる。 この様な組成物は、経口的、非経口的及び局所的投与に適合されるが、しかし好 適には非経口的投与に配合される。非経口的組成物は、最も好適には静脈内用の 濃縮塊形態で投与される。局所的投与用に配合した組成物は１例えば。 シェリ一様水溶液、油性懸濁物又は乳化油性形態であるのが良い。非経口的投与 に対して、流体ユニット服用形態は９本発明の組成物と滅菌媒体液を含んで調製 される。薬学的に許容出来る組成物に含まれるヒルジンペプチドは、媒体の性質 とペプチドの性質に左右されて、懸濁される又は溶解されるのいずれかである。 非経口的組成物は、任意的に他の成分と共に、ペプチドを媒体液に溶解し、滅菌 的に濾過した後に。 適切なバイアル又はアンプルに充填し１次いで封止する。好適には１局所麻酔剤 、保存剤及び緩衝剤の様な補助剤もまた。媒体液に溶解される。次いで組成物は 、安定性を促進する為に凍結されかつ凍結乾燥される。 非経口的懸濁物は、ヒルジンペプチドが媒体液に溶解されずに懸濁される以外は 、実質的に同じ方法で調製される。ペプチドと他の任意的な成分の滅菌は、好適 には、滅菌媒体液に懸濁する前にエチレンオキシドに露呈して達成される。好都 合には９表面活性剤又は湿潤剤を１組成物に含め゛て、ヒルジンペプチド又は他 の任意的成分の均一分布を促進する。 経口的投与の為の錠剤とカプセルは、結合剤９充填剤、希釈剤９錠剤化剤、潤滑 剤、崩壊剤、及び湿潤剤の様な従来の賦形剤を包含する。錠剤は、この技術分野 で周知の方法により被覆されて良い。使用して良い適切な充填剤は、セルロース 、マノニトール、ラクトース及び他の類似剤を包含する。適切な崩壊剤は、澱粉 、ポリビニルピロリドン及び澱粉グルコン酸ナトリウムの様な澱粉誘導体を包含 するが、これに限定されるものでない。適切な潤滑剤は１例えば、ステアリン酸 マグネシウムを包含する。適切な有用湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムである 。 経口的液体製剤は、水溶液懸濁又は油間濁、溶液。 乳化液、シロップ又はエリキシルの形態であって良く、又は水又は他の適切な媒 体液で使用前に整える乾燥品として提供されても良い。この様な液体製剤は、従 来の添加物を含んで良い。この添加物は、ソルビトール、シロップ、メチルセル ロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース 、ステアリン酸アルミニウムゲル又は水素化食用油、レシチン、ソルビタンモノ オリエート又はアカシアを包含する乳化剤、アーモンド油の様な非水溶液媒体。 分留ココナツト油、及び油性エステル、及びメチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ ベンゾエート又はソルビン酸の様な保存剤を包含する。 本発明はまた。患者における又は生物学的試料における血小板凝集と分泌を減少 又は防止する為の前記薬学的に許容出来る組成物を使用する方法にも関係する。 服用と服用割合は、特定組成物、治療目的、即ち治療又は予防６及び治療する医 者の診断の様な各種の因子に左右されるだろう。本発明の組成物に対する代表的 な毎日の服用範囲は、投与したペプチドの濃度が、約１ｍｇ／ｍｌ〜１．００軸 ｇ／ｍｌの間、好適には。 約２５ｍｇ／ｍｌ〜５軸ｇ／＋＋＋１の間にある範囲を包含する。この様な服用 は、好適には１体重に対して約０．１〜ｌｈｇペプチド／ｋｇの間。 最も好適には約０．２〜２ｍｇ／ｋｇ体重の最終体内濃度を治療患者に生成すべ きである。治療期間は、血小板凝集の望みの抑制が生成するのに充分な時間であ ろう。本発明の組成物に使用されて良いＰＥＧ誘導ヒルジンペプチドが、非誘導 ペプチドのみならず天然ヒルジンに比較してより長い半減期を表すので。 服用量は、好都合には非誘導ペプチドに対して推奨される量より充分に低い。 本発明の好適な実施態様は、ヘパリン治療が禁忌される患者において血小板凝集 を抑制する方法に関係する。特定的に、これらの方法は、ヘパリン誘導の血小板 減少に苦しでいる又は現在苦しむ患者に特に有効である。 患者がヘパリン誘導血小板減少に苦しむ又は苦しんでいることの診断は、患者面 接、投薬歴により、更に好適にはヘパリン治療の間の血液試料に含まれる血小板 の直接的定量により成されのが良い。この様な定量は、これはこの技術分野で周 知であるが、ヘパリン誘導血小板凝集、血小板からのヘパリン誘導「目Ｃ］セロ トニンの遊離又はヘパリン誘導トロンボキサンＡ、の遊離を検出することである ［Ｊ、Ｃ，フラタントニー等（Ｆｒａｔａｎｔｎｉ）、　ｒヘパリン誘導血小板 減少：試験管内の方法で又はにおける診断の立証」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、 第４５巻。 第３９５−４０１頁（１９７５年）；Ｊ、Ｇ、ケルトン等（にｅｌｔｏｎ）汀患 者のヘパリン依存の血小板凝集因子を、推測されるヘパリン会合の血小板減少に よる試験の臨床的有用性」、ジャーナルオブ（Ｓｈｅｒｉｄａｎ）汗ヘパリン誘 導血小板減少の診断的試験」、ブラフ上（里旦星）、第６７巻、第２７〜３０頁 （１９８６年）］。 本発明の別の実施態様によると、ヒルジンペプチド含有組成物は、血小板貯蔵寿 命を増大するのに使用されて良い。こりらの組成物のペプチドの最終濃度は、約 ０．５μｇ／ｍｌ〜１、０００μｇ／ａ＋１．好適には約５μｇ／鳳１〜１００ μｇ／■ｌの範囲に亙る。更に別の実施態様によると、　ＰＧＥ＋の最終濃度、 即ち本発明の血小板貯蔵組成物中のテオフィリンは、　ＰＧＥ、に対して約１ｎ ｌ−１０ｕＬ好適には約１００ｎドア５０ｎＭ、かつ約１ｈト１０ｍＭの間の範 囲に亙るだろう。 本発明を更に充分に理解させる為に１次の実施例を説明する。これらの実施例は 、説明の目的だけの為であって如何なる方法においても本発明を制限するものに 解釈されるべきでないことを理解すべきである。 下記ペプチド合成の実施例の総てにおいて１本発明者等は９合成ペプチドのアミ ノ酸分析を実施した。アミノ酸加水分解物は、　６Ｎ塩酸中、減圧で、１１０℃ ２４時間の試料の処理により１次いでベックマンシステム６３００分析機を使用 して、イオン交換クロマトグラフィーにより調製した。 本発明者等は、逆相ＨＰＬＣにより合成ペプチドの純度を日常的に分析した。特 定しない限り、ペプチド試料（２０〜１００μｇ）を、ベックマン液体クロマト グラフィーシステム又はアプライドバイオシステム１５０Ａクロマトグラフイー システムを夫々使用して、バイダック（Ｊｙｄａｃ）Ｃ４カラム（０，４６Ｘ２ ５ｃｍ）又はアクアポール（Ａｑｕａｐｏｒｅ）ＲＰ−３００Ｃ８カラム（０， ４６Ｘ３．０ｃｍ）に適用した。バイダックＣイカラムは、ｏ、１％トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水で平衡化させ３次いて同じＴＦ＾含有溶剤中で０〜８ ０％の増大するアセトニトリル濃度の勾配で展開した。 勾配を、　１．０ｍｌ／分の流速で３０分に亙り展開した。流出流れを、吸光度 ２１５ｎｍで監視した。アクアポ・−ルｃ８カラムを。 ０．１ｘＴＦＡを含む水で平衡化させ１次いで０．０８５％ＴＦＡ溶剤中で０〜 ７０％の増大するアセトニトリル濃度の勾配で展開した。勾配を、　０．５ｍｌ ／分の流速で４５分間展開した。次いで流出流れを。 吸光度２］、４ｎｍで監視した。 実施例１ ヒルジン５３−６４及びヒルジン４９−８４の合成ヒルジン５．−６４は１式： ％式％ Ｃ００■のアミノ酸を有する。ヒルジン４９−１は１式：ＨＪ−Ｇｌｕ−３ｅｒ −Ｈｉｓ−λ５ｎ−Ａｓｎ−Ｇ］、ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＧＬｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨのアミノ酸をＥ有する 。本発明者等は。 アプライドバイオシステム４３０＾ペプチド合成物（アブライドバイオシステム ズ社、ホスター市、カルホニア州）を使用して固体相ペプチド合成により単一合 成の一部としてこれらのペプチドを調製した。 特定的に１本発明物等は、　０．２５９ｍｅｇのＢｏｃ−Ｌｅｕ一種樹脂［１％ ジビニルベンゼン樹脂（ＤＶＢ）］を２ミリモルの保護アミノ酸と連続して反応 させた。１１回の合成に続いて、　０．４２ｇの湿った樹脂を反応器から取り出 した。湿った樹脂の残留０．４３ｇアリコートを、２倍の２ミリモルの保護アミ ノ酸と４回反応させた。この様にして合成したヒルジンＳ！−６４とヒルジン２ ．−６゜を、無水■Ｆｐ−クレゾール・エチルメチル硫酸（１，０・１：１゜ｖ ／ｖ／ｖ）と処理することにより樹脂から充分に脱保護しがっ開裂させた。ペプ チドの収率は、ヒルジン４９−６４及びヒルジン５３−６４の夫々に対して５６ ％と５３％であった。 ペプチドの個々のＦ［ＰＬＣ分析は、高純度を示し、かつヒルジン４９−６４及 びヒルジン５３−６４に対して、　１６．１ｍ１ｎと１６．３ｏ＋ｉｎで夫々溶 離する２Ｌ４．ｎｍ−吸光物貿の単−主ピークを示した。 実施例２ 脱（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン５Ｎ−６２の合成脱（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン ５１６２は１式　Ｈ２Ｎ−人５ｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ− １１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＣＯＯＨのアミノ酸を有する。本発明者等は １次ぎの様にして脱（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン６３−６２を調製した 先ず、Ｒ，Ｐアンブラー（Ａｍｂｌｅｒ）汀カルボキシペプチダーゼによる酵素 的加水分解上メリーズエンチモロギー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　） 、第２５巻、第Ｂ号、第１４３−５４百に本質的に記載の通りにして、カルボキ シペプチダーゼ＾を調製した。酵素（１，Ｏｍｇ）を、４°Ｃで脱イオン水１． ０ｍｌに懸濁し１次いでマイクロハアージ装置中で遠心分離した。上ａ液を捨て 、沈殿物に１００μｍの１％重炭酸ナトリウムを添加した。次いで０．１ＮＮａ ＯＨを滴下し、沈殿物を溶解した。次いで、　０．１ＮＩＩＣ１を滴下添加して ｐＨを８．０に調節した。次いでｐｕｓ、　２５で０．１１のＮ−エチルモルホ リン酢酸を添加して酵素の濃度を１ｍｇ／ｍｌへ調節した。 次いで実施例１に調製した様にして、　ＬＯ］［ＮａＣ１を含むｐＨ８，２５の トエチルモルホリン酢酸２５０μｍ中にヒルジン５１６４１、、３ｍｇを溶解し た。次いで前記調製したカルボキシペプチダーゼＡ、３０μｍ（３０ｇｇ）を添 加し１次いで３７°Ｃで２時間反応物を培養した。 ペプチド部分をアクアボールＲＰ−３００Ｃｇカラム（０，４６Ｘ３．　Ｏｃｍ ）とアプライドバイオシステム１５０Ａ　Ｍ体りロマトグラフィーシステムを使 用して逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムを０．１ｘＴＦＡを含む水に平衡化 し３次いで０．０８５％ＴＦＡ含有溶剤中で０．５ｍｌ／分の流速で４５分に亙 り０〜３５％の増大するアセトニトリル濃度の勾配で展開した。流出流れを、吸 光度２１．４ｎｍで監視した。両分を手動で集め、真空下に乾燥し、アミノ酸組 成物を分析し１次いでヒトプラズマの血餅時間をめた。脱（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒ ルジン５．−６゜は、どの残留無傷ヒルジン６３−６４の前に溶出することが観 察された。 ヒルジン６７−６４は１式：　Ｈ２Ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｃ００１１のアミノ酸を有する。ヒルジン６７− ６４を合成する為に、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＹＢ）の代わりに０ ．５５ミリモルのＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＩＩ２−ＰＡＷ樹脂（１％ＤＶＢ）　（ アプライドバイオシステムズ）を使用した以外は、実施例１に記載の方法を実施 した。次いで各々の結合サイクルにおいて、保護アミノ酸２ミリモルを添加した 。粗製ペプチドの収率は、１７．９％であった。ＨＰＬＣ分析は、勾配において １４．２ｍ１ｎで溶離する単−主ピークを示した。 ヒルジン４５−６４は１式：　Ｈ２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−人５ｎ−Ｇｌ　ｙ−４ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ− Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯｆｌのアミノ酸 を有する。本発明者等は、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＹＢ）０．２５ ９ｍｅｇを使用してヒルジン、ト。４を合成した。合成の最初の１３サイクルに 対して各々の結合段階において保護アミノ酸２ミリモルを使用する以外は、実施 例１に記載の方法に従った。合成の残りの６サイクルに対して、２倍の２ミリモ ルの保護アミノ酸を使用した。ペプチドは、無水■Ｆｐ−クレゾール　エチルメ チル硫酸（１０・１：１．　ｖ／ｖ／ｖ）と処理することによりＤｖＢ樹脂から 充分に脱保護されかつ未結合化された。 約１００ｍｇのペプチドを、３０％の酢酸で樹脂の抽出により回収した。ヒルジ ン４５−８４の収率は、　１７％であった。 ■ＰＬＣ分析は、生成物において高純度（〉９０％）を示し。 かつアセトニトリル勾配において１４．４＠ｉｎで２１４ｎｍ吸光度物質の単− 主ピークを示した。 ヒルジン５Ｇ−６４は１式：■２ト＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨのアミノ酸を有する。Ｂｏ ｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）０．０２５９ｍｅｇを使用してヒルジン６ ５−６４を調製した。結合の各々のサイクルにおいて成長ペプチドに対して保護 アミノ酸２ミリモルを添加した。樹脂からの保護と開裂を。 前の実施例に従って達成した。このペプチドの回収は、３０％であった。 ＨＰＬＣ分析は、試料において高純度（〉９５％）を示し、かつアセトニトリル 勾配において１６．１ｍ１ｎで単−主ピークを示した。 ヒルジン６゜４５は１式：　Ｈ２Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ −Ｉ　１ｅ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　１　ｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｎ−Ａｓ ｎ４ｉｓ−３ｅ　ｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ＣＯＯＨのア ミノ酸を有する。本発明者等は、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−〇−樹脂（１％ＤｖＢ）の 代わりにＢｏｃ−０−ペンシル−Ｌ−Ｔｈｒ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）０．２５ ９ｍｅｇを使用する以外は、実施例１記載の方法によりヒルジン６４−４６を合 成した。合成の最初の６サイクルに対して各々の結合段階において保護アミノ酸 ２ミリモルを使用した。合成の残りの６サイクルに対して１２倍の２ミリモルの 保護アミノ酸を使用した。ペプチドは、無水ｆｌＦと処理することによりＤｖＢ 樹脂から充分に脱保護されかつ未結合化された。 ３０％の酢酸で抽出の後、１２ｈｇのペプチドを回収した。ヒルジン６４−４６ の収率は、１９．９％であった。 ペプチドのＨＰＬＣ分析は、生成物において高純度（〉９０％）を示し、かつア セトニトリル勾配において１３．７ｍ１ｎで溶離する単−主ピークを示した。 このヒルジン６４−４６を、各種のヒルジンペプチドの抗凝集活性の測定におい て、コントロールとして使用した。 ヒルジン６４−６４は９式：　Ｈ２トＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＧＬｕ−Ｇｌｕ −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨのアミノ酸を 有する。実施例１に記載と同じ方法によりヒルジン６４−６４を合成した。合成 の各々の結合サイクルにおいて保護アミノ酸２ミリモルを使用した。合成後、ペ プチドは、前の実施例におけると同じく。 ＤｖＢ樹脂からの充分な脱保護と未結合化された。 ＨＰＬＣ分析は、生成物において高純度（〉６０％）を示し。 かつ２１４ｎｍ吸光度物質の単−主ピークを示した。 実施例８ ＨＰＬＣによるヒルジンペプチドのより以上の精製活性分析の目的の為に、前記 Ｆｌ製のヒルジン４５−６４゜ヒルジン４９−６４及びヒルジン５３−６４を、 ウオータアソーシェイト社（マサチューセッツ州、ミルホード）の液体クロマト グラフィーシステムを使用して、調製用逆相ＨＰＬＣにより均質に精製した。粗 製ペプチドの試料（ヒルジン４６−６４とヒルジン４９−６４の各々２５ｍｇ及 びヒルジン５　ｓ　−６４３０ｍｇ）を、水中０．１％ＴＦＡの２．０ｗｌ中に 溶解した。追加的の６にの塩化グアニジウム１．０ｍｌを、溶解性を増大する為 に、ヒルジン４６−６４＋ヒルジン４９−６４及びヒルジン６３−６４の粗製試 料へ添加した。試料を、予め水中０．１％のＴＦＡに平衡化したバイダックｃｏ ｇカラム（２２ｍｍｘ２５ｃｎ＋）に別々に注射した。カラムを、　４．０ｍｌ ／分の流速で、同じＴＦＡ含有溶剤中にて４５分に亙り０〜８０％の増大するア セトニトリル濃度の直線的勾配で展開した。流出流れを、　２１４ｎｍで監視し 。 画分を手動で集めた。 他のヒルジンペプチドも、類似にしてＫＩｉＪｕかつ精製されて良い。 実施例９ ドアセチルヒルジン！１３−６４の合成ヒルジンペプチドのドアセチル化を、ペ プチド合成の間に直接的に達成した。例えば、ドアセチルヒルジン６３−６４を 、実施例１に記載したヒルジン５３−６４の合成に使用した基本的方法により合 成した。然し乍ら、Ｎ−アセチル化を実施する為に９本発明者等は、ペプチド合 成の最終サイクルにおいて、２ミリモルのアスパラギンの代わりに、２ミリモル のＮ−アセチル−アスパラギンを使用することにより、方法を改良した。他のヒ ルジンペプチドも、ペプチド合成の最終サイクルにおける未アセチル化形態の代 わりに、アミノ末端アミノ酸のドアセチル形態を使用することにより、類似ドア セチル化されて良い。 実施例１０ ヒルジンペプチドの硫酸化 ヒルジン６３−６４を、Ｔ、中原等、［未硫酸化先駆物質ペプチドからチロシン −Ｑ−［３Ｓｓ］硫酸化コレシストキンオクタペプチドの調製」、アナリティ力 ルバイオケミストリ（Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、第１５４巻、第１９４−９９頁（１９８６年）に記載の 化学的に改良した方法を使用して、チロシン残部の〇−硫酸化によりスルホ−Ｔ ｙｒｓ３ヒルジン６３−６４を調製した。５０μｍのジメチルスルホナミド中に 、実施例９で調製した様にして、　１．５ｍｇのヒルジン６３−８４を溶解し１ 次いでＮ２下に溶液を乾燥した。次いでペプチドへ、　２Ｘ１０−’モルの硫酸 を含むジメチルスルホチミド（ＤＭＦ）４０μｍに再溶解した。この溶液に、４ ０μｍのＤＩｌ［Ｆ中の５０μｍのＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミドを 含む溶ｇＬ（７，０ＸＩＯ−’モル）を添加した。２５℃で約５〜１０分反応さ せた後７７５０μｍの脱イオン水を添加した。更に精製する前に、マイクロハア ージ装置中で遠心分離機によりどの不溶解性反応生成物も除去した。 硫酸化−Ｔｙｒ６ｓヒルジン５３−６４を、他のペプチドと反応成分から、バイ ダックＣ１８カラム（４，６Ｘ２５Ｃ１）とアプライドバイオシステム社の液体 クロマトグラフィーシステムを使用して、逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラム を、０．１％ＴＦＡ−水溶剤中で平衡化させ、０〜３５％の増大するアセトニト リル濃度の直線的勾配で、　０．０８５％ＴＦＡ含有溶剤を使用して、　０．ｈ Ｌ／分の流速で、９０分に亙り展開した。画分を集め、高速真空装置で乾燥し１ 次いで脱イオン水に再溶解した。第１図に示される様に、　２１４ｎｍ吸光物質 の多数のピークが分解された。 抗凝集活性に対するピーク画分の検定により、２個の強力なスルホ−Ｔｙｒｓｓ ヒルジン６３−８４含有画分（第１図のピークＡとＢ）を確認した。中性ｐｎに おけるピークＡの紫外線スペクトル分析は、２５８〜２６４ｎｍで最大吸光度を 示し、修飾チロシン残部の存在を示した。ピークＡにおけるペプチドのアミノ酸 分析は、ヒルジン６３−６４構造を確証した。これらのデータは。 ビークλが、スルホ−ＴＹｒ６３ヒルジン５３−６４を含むことを立証した。 本発明者等は、ビーク＾のペプチドを、３０％ＴＦ＾で１時間６０℃で処理して 、硫酸塩基を除去することにより、スルホ−Ｔｙｒｇ　ｓヒルジン５トロ４の存 在を確証した。次いでペプチドを乾燥し、水に再溶解し１次いで逆相ＨＰＬＣに 付した。アクアポーレＲＰ−３００Ｃｇカラム（０，４Ｘ６３．　Ｏｃｍ）とア プライドバイオシステム１５０Ａ　ＨＰＬＣシステムを使用して、脱硫酸化スル ホ−ＴＹｒｓｓヒルジン６３−６４のＨＰＬＣ分析を実施した。カラムを、０． １％ＴＦＡを含む水中で平衡化させ、０〜７０％の増大するアセトニトリル濃度 の勾配で、　０．０８５％ＴＦＡ含有溶剤中にて、　０．５ｍＬ／分の流速で、 ４５分に亙り展開した。ペプチドは、未硫酸化ヒルジン６３−６４のペプチドと 同一のｔｌＰＬｃクロマトグラフィー挙動を示した。更に、処理したペプチドの ピーク吸光度は、非修飾チロシン残部を含むペプチドに典型的な２７５〜２８０ ｏｍに戻った。 次いで、前記硫酸化方法を１対応するドアセチルペプチドの多量に応用した。中 原の方法によりＮ−アセチル−ヒルジン５３−ａ＋（実施例９において調製）の ２５ｍｇの処理は、望みのＴｙｒ−硫酸化生成物を８０．１％の収率で与えた。 然し乍ら、ドアセチル−ヒルジン６３−６４の５０ｍｇに比例して反応を合わせ る努力をしたが、Ｔｙｒ−硫酸化誘導体を４８．５％の収率で得たにすぎなかっ た。 従って１本発明者等は、中原の方法の化学反応を大いに改良して、大規模の硫酸 化反応におけるＴｙｒ−硫酸化誘導体を高い収率で得ることを達成した。更に特 定的に１本発明者等は、　４０ｍ１のジメチルホルムアミド中で、　５．０ｍｌ のＮ、に°−ジシクロへキシルカルボジイミド（０，２ｇ１０．１６＠ｌジメチ ルホルムアミド）の存在下に、　Ｉｇのドアセチル−ヒルジン５ト、、を溶解し た。混合物を、０℃で撹拌し９次いで反応混合物中へ０．５ｍｌの濃厚硫酸を滴 下して沈殿を形成させた。５分後、４抛ｌの水を添加して反応を停止させた。反 応混合物の逆相ＴＩＰＬＣ分離により、硫酸化ペプチド、スルホ−ＴＹｒｓｓ− ドアセチル−ヒルジン５３−６４を８１．７％の収率で得たことを示した。 次いで硫酸化ヒルジンペプチドの大規模精製を、一度のアニオン交換樹脂クロマ トグラフィーにより達成した。 特定的に、粗製スルホ−ＴＹｒｓｓ−ドアセチル−ヒルジン５トロ４を。 ＤＥλＥ−セファローズカラム（２５０ｍｌ湿樹脂１５ｇ粗製ペプチド）で精製 した。カラムを、予備平衡化し１次いで試料を、ｐ■５．０の酢酸ナトリウム２ ０ＩＩＩｌｌ［中に負荷した。カラムを、直線的ＮａＣ１勾配（０〜０．４１［ ）で展開した。スルホ−ＴＹｒｉ３−Ｎ−アセチル−ヒルジンＳ３−６４を、未 硫酸化ペプチドの後、然し乍らスルホン化副産物のスルホニル−７’ｙｒ６３Ｎ −アセチル−ヒルジン５トロ４の前に。 約０．２−０．３１［のＮａＣ１で溶出した。 他のヒルジンペプチドも、硫酸化され、精製され。 次いで上記と同じ方法により分析されて良い。 実施例１０に記載した様にして、スルホ−ＴＹｒｓｓ−Ｎ−アセチル−ヒルジン Ｓ！−６４の調製中に、ドアセチル−ヒルジン５３−６４を、そのＴｙｒ−スル ホン化誘導体のスルホニル−ＴＹｒｓｓ−ドアセチル−ヒルジン６３−６４へ修 飾した。スルホニル−Ｔｙｒｇｓ−ドアセチル−ヒルジンＳ３−６４は、実施例 １０に記載した大規模スルホン化反応中に得られた副産反応生成物であった。従 って、スルホニル−Ｔｙｒ６３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３−６４を３０−４ ０％収率で得、かつ逆相ｆ［ＰＬｃ分離において、スルホ−ＴＹｒ６ｓ−ヒルジ ン６３−６４の前に溶出することが分かった。ヒルジン＆！−６４は同様に、　 Ｔｙｒ−スルホン化誘導体へ修飾された。他のヒルジンペプチドも、同様の方法 によりスルホン化されて良い。 本発明者等は、ペプチドの半減期を増大する為に。 ヒルジンペプチドを薬学的に許容出来る重合体へ結合した。 更に特定的に３本発明者等は、従来の方法により、ポリエチレングリコールの誘 導体のポリエチレングリコールドスクシンイミジル琥珀酸塩（ＳＳ−ＰＥＧ、平 均分子量＝５．０００）を調製した［アブコブスキー等、カンサーバイオケミス トリーバイオフィズイオロギ−（Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ 　ｓ）、第７巻、第１７５〜８６頁（１９８４年）コ。実施例１０で調製したス ルホ−ＴＹｒｓ３ヒルジン５．−６，１００μｇをｐ１１９．　Ｏの２０ｍ

【ホ ウ酸ナトリウム２００μｇ中に溶解し、５０倍モル過剰の５Ｓ−ＰＥＧと反応さ せた。反応を、−晩室温でＴＪ！ｉ置して実施し１次いで精製の為に逆相ＨＰＬ Ｃに適用し１次いで特徴決定した。 逆相ＨＰＬＣを、アプライドバイオシステム１５０にクロマトグラフィーシステ ムを使用するアクアボールＲＰ−３００Ｃ８カラム（０，４Ｘ６３．　Ｏｃ＋ｎ ）を使用して達成した。カラムを、０．１％ＴＦＡを含む水中で平衡化させ、０ 〜５０％の増大するアセトニトリル濃度の勾配で、　０．０８５％ＴＦＡ含有溶 剤中にて、　０．５ｍｌ／分の流速で、４５分に亙り展開した。流出流れを２１ ４μｍ吸光度で監視した。スルホ−ＴＹｒａｓヒルジン５３−８４の５Ｓ−ＰＥ Ｇ誘導体は、非誘導化形態より速く溶出し、かつより広いピーク内に含まれるこ とが観察された。スルホ−ＴＹｒｓｓヒルジン６３−６４の誘導化形態と非誘導 化形態の両方の抗凝集活性を比較すると、　ＡＰＴＴにおける増大に対して、同 じ服用量依存性を現した。従って。 ５Ｓ−ＰＥＧ−スルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジン５１６４は、ヒルジンペプチドの活 性誘導体であり、これは、好都合には、その非誘導化対応物と比較する時に、循 環半減期の期待される増大を現す。 ヒルジンペプチド、好適には、スルホ−ＴＹｒｓｓヒルジン５３−６４は、半ペ プチド様又は非ペプチド的ペプチド様類似体の製造に使用されて良く、これは、 抗凝集性と抗血小板活性を現す合成的分子である。ヒルジンペプチドと同じく、 これらのペプチド様類似体は、血小板凝集に対する抑制的活性により特徴付けら れる。 以下［ヒルログ（ス）［ｈｉｒｕｌｏｇ（ｓ）月と称する。ヒルジンペプチドの ペプチド様類似体は１次の化学的構造により示ヒルログ−３ ヒルジンペプチドの半ペプチドペプチド様類似体は、観ペプチドのループ、ター ン、又は螺旋配座を安定化して調製される。例えば、ループ構造は、スルホ−Ｔ Ｙｒ６ｓヒルジン６３−６４のＮ−及びＣ−末端端部の両方にシステニル基又は リジル基を添加することにより構成される。末端システニル基残部は、酸化によ り架橋してヒルログ−１（第３Ａ［ｆｆ１）を生成し、脂肪族ジチオールで酸化 してヒルログ−１（第３Ｂ図）を生成し、又は脂肪族ジクロロアセテート又はプ ロピオネートでアルキル化してヒルログ−３（第３Ｃ図）を生成する。末端リジ ル残部は。 空間長さの異なる多数のイミデート化剤のどれかにより架橋するか、又はジヒト ロキシスクシンイニディル脂肪族試薬で架橋してヒルログ−４（第４Ａ図）を生 成する。 スルホ−ＴＹｒ６ｓヒルジン５３−６４のＰｒｏ−８の周りのターニノ構造は、 　Ｇ１１−９又はＧｌｕ−１０の（Ｌ）又はＣＤ）−ゼリンで付随する置換を伴 って又は伴わないで、　１１．ｅ−７をクロロアラニンで置換することにより構 成される。クロロアラニンのみを含むペプチド様類似体は、ケトン結合により＾ １ａ−７へＧｌｕ−９又はＧ１．ｕ−１０の架橋を生成してヒルログ−５（第５ Ａ図）を生成する。位置９又は１０にゼリンとの誘導体は、エーテル結合を介し て架橋を生成してヒルフグ−６（第５Ｂ）を生成する。 ペプチド様類似体の螺旋構造は、ヒルジンペプチドの（ｎ）及び（ｎ＋３）位置 にシステニル残部を置換しかつ、直接的“醸化、脂肪族ジチオールによる酸化、 又は脂肪族ジハロオアセテートによるアルキル化のいずれかにより強制的に構成 される。例えば、スルホ−ＴＹｒａｘヒルジン、トロ、のＡｓｎ１とＰｈｅ−４ をシスティンと置換し次いでエタンジチオールを介して酸化することにより（第 ６図）、誘導体のＮ１１２−末端部に螺旋ターンを強制的に構成し、従って、ペ プチド誘導体に安定な螺旋構造を散在させる。このことは、ヒルログ−７により 例証される。 充分な未−ペプチド的ペプチド様類似体もまた１強制的に構成されたペプチド化 合物に関して前記記載された方策を考慮して製造され得る。 血小板−豊富及び血小板−不足なプラズマの調製本発明者等は、１１人、シャク ボブスキー及びＮ、　Ｇ、アルトリー（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ、＾ｒｄｌｉｅ） 汀飽和又はポリ不飽和脂肪に富む治療食によるヒト血小板機能の改善」、アテロ ーム性動脈硬化症（＾ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第３１巻、第３３５− ４４頁（１９７８年）の方法により、血小板−豊富及び血小板−不足なプラズマ を調製した。特定的には、２１ゲージ蝶型排管を介して、健康なヒトポランチャ ーから、血液を３．８％クエン酸トリナトリウムの１７１０最終容量中へ集めた 。血小板−豊富プラズマを、ツルパルローター中で、　１１００Ｘにて１５分間 クエン酸化全血液を室温で遠心分離して調製した。血小板−不足プラズマを、　 １２．０００Ｘｇにて１５分間クエン酸化全血液を遠心分離することにより調製 した。 実施例１５ スルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４の抗血小板活性トロンビンの各種濃度に より引き起こされる血小板凝集の抑制に対して、ヒルジン５３−６４又はスルホ −ＴＹｒ　６３ヒルジン６３−６４の効果を分析した。特定的に、　０．０５ｍ １の水に含まれた。各秤量のヒルジン５３−６４又はスルホ−ＴＹｒ６３ヒルジ ン５３−６４を、実施例１４により調製した予め暖めた（３７°Ｃ）血小板−豊 富プラズマの０．４ｍｌへ、０〜１１μｇ／ｍｌ最終検定量の最終濃度まで添加 した。ペプチド／血小板混合物を、３７℃で１分間培養した。次いで０．０５ｍ １のヒトα−トロンビン（Ｊ、フェントンＩＩ博士の贈り物、ニューヨーク健康 法）を、　０．２０．０．２５又は０．５Ｕ／ｍｌ全検定容量のいずれかの最終 濃度まで添加した。これらのα−トロンビンの濃度は、生体内で達成されたレベ ルに等しいと信じられ、かっ血餅形成の主たる妨害無しに、プラズマ中で達成さ れるべき血小板凝集の研究を可能とする。 本発明者等は、バイオデータ４−チャンネル血小板凝集プロフィラー（ＰＡＰ− ４；バイオデータ祉、ペンシルバニア州、ハツトボロー）を使用して、４分間血 小板凝集の程度を濁度的に監視（、た。血小板凝集を、最終濃度１０μｍまで添 加した水冷イ：ノドメタシンの添加により停止させた。４分間の間に観察された 最大血小板凝集を、検定混合物中に存在するヒルジン５３６４又はスルホ−Ｔｙ ｒｓ３ヒルジン６！−６４の濃度に対してプロットした。 第７図は、０．２５及び０．５Ｕ／ｍｌのα−トロンビンにより誘導された血小 板凝集の最大度合に対する。スルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジン５３−６４の効果を証 明（−でいる。この第７図に示される様に、スルホ−ＴＹｒ６３ヒルジン５．− ６４は３服用量依存的にヒト血小板を凝集するトロンビン能力を抑制した。第７ 図はまた。 血小板凝集がα−トロンビンの高濃度により誘導された時に。 対応的に高濃度のスルホ−ＴＹｒｓｓヒルジン５３−８４が、凝集応答を抑制す るのに必要であることを証明している。０．２５Ｕ／ｍｌのα−トロンビンに対 するＩＣ５ｏ（最大の５０％まで血小板凝集を削減するのに必要とするスルホ− ＴＹｒ６３ヒルジンＳ！−６４の濃度）は０．７２μｇ／ｍｌであり、かつり、 　５Ｕ／ｍｌのα−トロンビンに対しては２．２μｇ／ｍｌであった。第８図は 、ヒルジン＆！−６４がまた９服用量依存型でトロンビン−誘導血小板凝集を抑 制するが、しかしスルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４より約３０倍弱いこと を示している。 本発明者等は更に、セロトニン遊離とトロンポンＡ２生成を検定することにより 、トロンビン−誘導血小板活性に対するスルホ−ＴＹｒａ３ヒルジン６３−６４ の効果を検定した。 実施例１４に記載の様にして調製した血小板−豊富プラズマの約２０ｍ１を、　 ２７ｎＣｉ／ｍｌの５−［２−Ｉ４Ｃコセロトニン　ビン−シュウ酸塩（６０ｎ ＋Ｃｉ／ミリモル、デュポン一二ューイミグランドニュークレア、ボストンマサ チューセッツ）で３７℃にて３０分負荷した。この条件下に、添加したセロトニ ンの９０．１±１．３％（平均十ＳＤ、　ｎ＝６）を結合した血小板は、血小板 −豊富プラズマの約１０、０００カウント７分／ａｌｌの特定活性を来した。 本発明者等は、凝集検出計中の血小板負荷１４Ｃ・−セロトニンを含む血小板− 豊富プラズマの０．４ｍｌを、　０．０５ｍ１食塩水中に含まれるスルホ−ＴＹ ｒｓｓヒルジン６３−８４の各種濃度（０〜１１μｇ／ｍ）、総検定容量）と、 ３７°Ｃにて１分間混合した。次いで、総検定容量の０．２５又は０．５Ｕ／ｎ ｉ１のいずれかの最終濃度に対してヒトα−トロンビン０．０５ｍ１を添加し１ 次いで３７℃で更に４分間培養した。トロンビン−誘導セロトニン遊離反応を停 止し。 次いで血小板による再取り込みを、３．３％ＥＤＴＡを含む水冷カクテル】／１ ０容量の添加により保持した。最初の３つの成分を、血小板遊離反応を防止する 為に普通に使用した［Ｊ、λ、ジアクボブスキイ及びＮ、　Ｇ、アルトリー、「 成人における血小板再活性と血液凝集に対する食用脂肪酸組成物の効果の再観察 と結果に対する方法学」、アテローム性動脈硬化症（＾ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏ ｓｉｓ）、第４１巻、第２８５〜９４頁（Ｌ９８２年）〕。イミブラミンは、試 料取り扱いの間に、取り込みを防止するセロトニン受容体作動物質である。本発 明者等は、　ＥＰＴＩがセロトニン取り込みと遊離を血小板試料へＥＰＴＩの添 加に続いて、血小板を、ツルパルロータ中で２分間１２．０００Ｘｇにて遠心分 離するめことにより除去した。セロトニン遊離を、液体シンチレーションカウン ティング（トリーカーブ１５００；パッカードインスッルメント社）を使用して 上澄液中の１４Ｃ−放射能を測定することにより、除去した。第９図は、血小板 凝集の抑制に対して観察されたと同じに（第７図参照）、スルホ−ＴＹｒｓｓヒ ルジン５トロ４が１服用依存型でセロトニン遊離を抑制することを示す。 血小板−豊富プラズマ中に含まれる血小板は、スルホ−Ｔｙｒ　ｓ　ｓヒルジン ６３−６４の増大する濃度の存在において、トロンビンにより刺激される。検定 は前記した様にして実施した。特定的に、　０．５＠Ｌの食塩水中のスルホ−Ｔ Ｙｒａｓヒルジン６３−６４の変化する濃度を、　０．４ｍｌの血小板−豊富プ ラズマへ添加し９次いで混合物を３７℃で１分間培養した。次いで０．０５ｍ１ の食塩水中に含まれるα−トロンビンを、０．５又は０．２５０／ｍｌのいずれ かの最終濃度へ添加し１次いで混合物を３７℃にて４分間培養した。血小板トロ ンビンＡ２生成を、１０μ夏の最終濃度へ水冷インドメタシンの添加し、続いて ２分間１２．　ｏｏｏｘｇで遠心分離することにより抑えた。上澄液プラズマを 、（・ロンビンＡ２含有を検定する前に一２０℃で保存した。トロンビン＾２を 、安定加水分解生成物でありかつトロンボキサンＡ２のインジケーターであるト ロンボキサンＢ２を検出する放射免疫定量により検定した［Ｊ、λ、ジアクボブ スキイ等汀低服用量の小腸用被覆アスピリンの蓄積性抗血小板効果」、ブリティ シュジャーナルオブヘマトロギ−（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａ、ｔｏｌ、）、第 ６０巻。 第６３５〜４２頁、　（１９８５年）コ。 第１０図は、血小板凝集とセロトニン遊離の抑制に対し２て前に観察したと同じ に、スルホ−ＴＹｒ＋；ｓヒルジン、３□、が。 服用依存型における血小板中にトロンビン誘導トロンボキサンＡ２分泌を抑制す ることを証明している。スルホニル−Ｔｙｒ　６　ｓヒルジン６３−６４は、ス ルホ−ＴＹｒ＊ｓヒルジ：ノ５３−６＜の抑制活性に対応する血小板抑制活性を 証明している。 本発明者等は、ヘパリン誘導血小板減少に苦しむ患者の治療におけるスルホ−Ｔ Ｙｒａｓヒルジン６３−６４の有効性を説明する為に、各種の生体内検定を実施 した。 これらの検定に使用した血小板−豊富プラズマを。 ヘパリン治療の中止とヘパリン誘導血小板減少の回復の後。 患者から得た。 本発明者等は、各種の患者から得られかつ実施例１４に記載の方法により調製し た血小板−豊富プラズマを、各種濃度のブタの肺のヘパリンナトリウム（０，０ ５〜０．５０／ｍｌ　；エルキンズージン、チェリー　ヒル、ニューシャーシー 州）又はスルホ−ＴＹｒｅｓヒルジンｓ　ｓ　−６４（０，８〜５５μｇ／ｍｌ ）と共に培養した。血小板凝集を、実施例１５に記載の様にして、濁度計的に監 視した。第１１図は、患者がヘパリン誘導血小板減少から充分に回復した後の患 者の血小板後のヘパリン誘導凝集を証明している。スルホ−ＴＹｒｓｓヒルジン ６３−６４は、全濃度節回に互り、血小板凝集を誘導しなかった。 次に９本発明者等は、ヘパリン又はスルホ−ＴＹｒｓｘヒルジン、３−６４のい ずれかと共に培養した類似血小板からのトロンボキサンＡ２の生成程度を測定し た。ヘパリン誘導血小板減少から回復した患者の血小板−豊富プラズマを、ヘパ リン又はスルホ−ＴＹｒｅｓヒルジンｓ　ｓ　−８４（Ｌ　７〜５５Ｒ／＋＋１ ）のいずれかと共に培養した。トロンボキサンＡ２分泌は、インドメタシンの添 加に続く遠心分離により停止し９次いで実施例１５に記載の様にしてトロンボキ サンＢ２の検定により測定した。下記データは、ヘパリンが、ヘパリン誘導血小 板減少の患者の血小板凝集と遊離を引き起こし２一方スルホーＴｙｇ３ヒルジン ６３−８４はそうならないことを立証している。 星回　トロンボキサン＆！ （ｎ１１０血小板） ヘパリン（０，０５Ｕ／ｍ１．）　３６ヘパリン（０，５Ｕ／ｍｌ）　１２３ スルホ−ＴＹｒｆｓヒルジン５５−ｇ、（１，７μｇ／ｍｉ）　（１スルホ−Ｔ Ｙｒ６ｓヒルジンｂｓ−ａ＜ＣＴｕｇ／ｍＬ）　（１スルホ−ＴＹｒｓｓヒルジ ンｓ　ｓ　−４（５５μｇ／ｍａｔ）　０次に本発明者等は、前記検定に使用し たヘパリンとスルホ−Ｔｙｒｓａヒルジン６　Ｍ　−６４の両方の濃度が、活性 化部分トロンビン時間（ＡＰＴＴ）における増大を引き起こすのに充分であった ことを立証した。本発明者等は、ヘパリン誘導血小板減少から回復した患者から 全血液を単離（７た。次いでこの血。 液をツルパルロータ中で２．　ｏｏｏｘｇにて１５分間４℃で遠心分離した。次 いで０．１ｍｌの０．３１［ｋｃａｃｌ、の添加１次いでｔｏｏｐｔの血小板因 子３試藁（ジエネラルダイアゴノスティックオルガノテクニカ、デユーラム、ノ ースカロライナ州）の添加により活性化する約２分間前に、　０．１ｍｌのプラ ズマへにヘパリン又はスルホ−ＴＹｒｇｓヒルジン５！−６４のいずれかの０． ０５耐を添加した。 コアガメートＸＣ（シエネラルダイアゴノスティックオルガノテクニカ）を使用 して、半自動的にＡＰＴＴを測定した。第１２図は、血小板研究中に使用したヘ パリン又はスルホ−Ｔｙｒ６ｇヒルジンＳ！！−６４の濃度が、望みの治療範囲 中にＡＰＴＴを長引かすのに充分であったことを立証している。 これらの検定は、ヘパリン誘導血小板減少の患者の血小板−豊富プラズマにおい て、抗凝集効果達成に必要とするヘパリンの服用は、血小板活性化へ導き１従っ て、血栓症の危険を増大させることを説明している。鋭く対照して１本発明者等 は、ヒルジンペプチド、好適には、スルホ−ＴＹｒ６ｓヒルジン５３−６４は、 この自己免疫性の障害に苦しむ患者において血小板活性化を引き起こさずにプラ ズマを抗凝集化する驚くべきかつ予期しない結果を立証するに至った。従って、 ヘパリン誘導血小板減少の患者において、ヒルジンペプチドとこれらを含む組成 物は、抗凝集剤及び血小板凝集を抑制する薬剤として、ヘパリンに対して、安全 かつ効果的代案物を構成する。 本発明者等は、これまでに本発明に関する多くの実施態様を示して来たが、この 基本的構成を変更して１本発明の方法と製品を使用する他の実施態様を提供出来 ることは明らかである。従って１本発明の範囲は、実施例によりこれまでに示さ れた特定実施態様よりも、ここに添付した特許請求の範囲により定義されるべき であることが理解されよう。 ＦＩＧ、　／ 時間（分） ＦＩＧ、３ 養醸化 番アルキル化 Ｌｙｓ−＾１ｎ−Ｇｌｙ−人５ｐ−Ｐｈ＠−に１ｕ−Ｇｌｕ−Ｚｌｅ−Ｐｒｏ− Ｇｌｕ−Ｃ１ｕ−ＴｙｒｌＳｏ３１−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ入１ｎ−Ｇｌｙ−人＄ｐ４ ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−人１ａ（Ｃ１）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ｓ ｏ、１−Ｌｅｕ＾ａｎ−ａｌｙ−人５ｐ−Ｐｈ＠−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−人１ａ（Ｃ １１４ｒｏ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｙｒ（Ｓｏ、１−ＬｅｕＣｙｓ−Ｃ１ｙ−＾５ ｐ−Ｃｙｓ　−ＧＬｕ−ＧＬｕ−Ｘ　Ｌｅ　−Ｐｒｏ−に１ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ 　Ｉ　５ｏＪｌ　−ＬｅｕＦｌθ７ ０　ｆ　２３４５　Ｇ　７　Ｂ　９１０１１スルネーＴｙｒ６３−ヒルジン５３ −６４　（μｇ／ｍｌ）［ド　デ　コ　ベ　１　チ　ド　］、μｇ／ｍ１０　１ ２３４５　ζ；　７　１３　り　グθ　ｌ！スルホ−Ｔｙｒ６ｓ−ヒルジンｓ　 ３−　ｅ　４　（μｇ／ｍｌ）スルネーＴＹｒｓｓ−ヒルジンｓ　ｓ　−６４（ μｇ／ｍ１）Ｆ／θ〃 分 Ｆｌθ θ、θＯθ、０５　θ、ｌθ　θ１５ ヘパリン（Ｕ／ｍｌ） ：１２ スルホ−Ｔｙｒ６３−ヒルジン５３−ｓ４（μｇ／ｍｌ）国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．貯蔵された血小板における血小板凝集を抑制する為の薬学的に許容出来る組 成物において，前記組成物は：（ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型；（式中，ＸはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及び Ｌｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択される）から実質的に成るアミノ酸の配列に より特徴付けされるペプチド類 から成る群から選択される少なくとも一つのペプチドの薬学的に効果的量から成 るを特徴とする組成物。
2. ２．貯蔵された血小板における血小板凝集を抑制する為の薬学的に許容出来る組 成物において，前記組成物は：（ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型；（式中，ＹはＮＨ２，アミノ保護基 ，アミノ酸配列のＣ−末端部分が少なくとも： 【配列があります】． 及びアミノ酸配列のＣ−末端部分が少なくとも：【配列があります】 から成る群から選択され； ＺはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択され；かつチロシ ン残部は負電荷側基を含む）から実質的に成るアミノ酸の配列により特徴付けさ れるペプチド類から成る群から選択される少なくとも一つのペプチドの薬学的に 効果的量から成るを特徴とする組成物。
3. ３．前記ペプチドが，スルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４である請求項２記 載の組成物。
4. ４．前記ペプチドが，スルホニル−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４である請求項 ２記載の組成物。
5. ５．金属キレート．プロスタグランジン，テオフィリン，小ペプチド血小板抑制 剤，血小板表面成分の抑制剤，血小板表面成分に対する抗体，これらの類似体及 びこれらの組み合わせ物から成る群から選択される化合物から更に成る請求項１ 又は２記載の組成物。
6. ６．前記化合物が，プロスタシリンの安定類似体，プロスタグランジンＥ１，プ ロスタグランジンＥ１の類似体，デキストロースクエン酸エステル−リン酸エス テル，及びテオフィリンから成る群から選択される請求項５記載の組成物。
7. ７．前記ペプチドの薬学的に効果的な量が，約０．５μｇ／ｍｌ１と約１，００ ０μｇ／ｍｌの間にある請求項１又は２記載の組成物。
8. ８．前記ペプチドの薬学的に効果的な量が，約５μｇ／ｍｌと約１００μｇ／ｍ ｌの間にある請求項７記載の組成物。
9. ９．請求項１又は２記載の組成物の存在下に血小板を貯蔵する工程を含む，貯蔵 した血小板の血小板凝集を抑制する方法。
10. １０．患者の又は体外の血小板凝集を抑制する為の薬学的に許容出来る組成物に おいて，前記組成物は：（ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型：（式中，ｘはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及び Ｌｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択される）から実質的に成るアミノ酸の配列に より特徴付けされるペプチド類 から成る群から選択される少なくとも一つのペプチドの薬学的に効果的量から成 るを特徴とする組成物。
11. １１．患者の又は体外の血小板凝集を抑制する為の薬学的に許容出来る組成物に おいて，前記組成物は：（ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型；（式中．ＹはＮＨ２，アミノ保護基 ，アミノ酸配列のＣ−末端部分が少なくとも： 【配列があります】 ．及びアミノ酸配列のＣ−末端部分 が少なくとも： 【配列があります】 から成る群から選択され； ＺはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択され；かつチロシ ン残部は負電荷側基を含む）から実質的に成るアミノ酸の配列により特徴付けさ れるペプチド類から成る群から選択される少なくとも一つのペプチドの薬学的に 効果的量から成るを特徴とする組成物。
12. １２．前記ペプチドが，スルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４である請求項１ １載の組成物。
13. １３．前記ペプチドが，スルホニル−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４である請求 項１１記載の組成物。
14. １４．シクロオキシゲナーゼ抑制剤，小非ペプチド血小板抑制剤，プロスタグラ ンジン，テオフィリン，小ペプチド血小板抑制剤，造血因子，血小板表面成分の 抑制剤，血小板表面成分に対する抗体，これらの類似体及びこれらの組み合わせ 物から成る群から選択される化合物から更に成る請求項１０又は１１記載の組成 物。
15. １５．前記化合物が，アスピリン，チクロピジン，ジピリグモーレ，及びスルフ ィンビラゾン，プロスタグランジンＥ１，プロスタグランジンＥ１の類似体，プ ロスタシリンの安定類似体，グリコプロテインＩＩＢ／ＩＩＩａに対するモノク ローン抗体，グリコプロテインＩＩＢ／ＩＩＩａの天然抑制剤，グリコプロテイ ンＩｂに対するモノクローン抗体，グリコプロテインＩｂの天然抑制剤，エリス ロポエチン，ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−含有ペプチド．及びａｒｇ−ｇｌｙ−ａ ｓｐ−含有ペプチドの誘導体から成る群から選択される請求項１４記載の組成物 。
16. １６．前記ペプチドの薬学的に効果的な量が，約０．１ｍｇ／ｋｇ体重と約１０ ｍｇ／ｋｇ体重の間の前記患者中に最終濃度を生成する請求項１０又は１１記載 の組成物。
17. １７．前記ペプチドの薬学的に効果的な量が，約０．２ｍｇ／ｋｇ体重と約２ｍ ｇ／ｋｇ体重の間である請求項１６記載の組成物。
18. １８．患者における血小板凝集を抑制する方法において，前記方法が，請求項１ ０又は１１記載の組成物で，薬学的に許容出来る方法において前記患者を治療す る工程を含むことを特徴とする方法。
19. １９．治療の時に，前記愚者が，ヘパリン−誘導血小板減少に苦しみつつある又 は苦しんでいる請求項１８記載の方法。
20. ２０．前記患者がヒトである請求項１８記載の方法。
21. ２１．患者の又は体外の血小板凝集を抑制する為のペプチドの使用において，前 記ペプチドは：（ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）ペプチドのＤ−レトロ型；（式中，ＸはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及びＬ ｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択される）から実質的に成るアミノ酸の配列によ り特徴付けされるペプチド類 から成る群から選択されることを特徴とするペプチドの使用。
22. ２２．患者の又は体外の血小板凝集を抑制する為のペプチドの使用において，前 記ペプチドは：（ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型；（式中，ＹはＮＨ２，アミノ保護基 ，アミノ酸配列のＣ−末端部分が少なくとも： 【配列があります】 ．及びアミノ酸配列のＣ−末端部分 が少なくとも： 【配列があります】 から成る群から選択され， ＺはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択され；かつチロシ ン残部は負電荷側基を含む）から実質的に成るアミノ酸の配列により特徴付けさ れるペプチド類から成る群から選択されることを特徴とするペプチドの使用。
23. ２３．貯蔵血小板の血小板凝集を抑制する為のペプチドの使用において，前記ペ プチドは： （ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型；（式中，ＸはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及び ＬｅｕＧｌｎから成る群から選択される）から実質的に成るアミノ酸の配列によ り特徴付けされるペプチド類 から成る群から選択されることを特徴とするペプチドの使用。
24. ２４．貯蔵血小板の血小板凝集を抑制する為のペプチドの使用において，前記ペ プチドは： （ａ）式： 【配列があります】； 及び （ｂ）式（ａ）のペプチドのＤ−レトロ型；（式中，ＹはＮＨ２，アミノ保護基 ，アミノ酸配列のＣ−末端部分が少なくとも： 【配列があります】 ．及びアミノ酸配列のＣ−末端部分 が少なくとも： 【配列があります】 から成る群から選択され， ＺはＣＯＯＨ，Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｇｌｎから成る群から選択され；かつチロシ ン残部は負電荷側基を含む）から実質的に成るアミノ酸の配列により特徴付けさ れるペプチド類から成る群から選択されることを特徴とするペプチドの使用。
25. ２５．貯蔵血小板の血小板凝集を抑制する為の請求項１又は２記載の組成物の使 用。
26. ２６．患者又は体外血液の血小板凝集を抑制する為の請求項１０又は１１記載の 組成物の使用。