HUT57060A - Process for producing compositions for inhibiting blood platelet aggregation - Google Patents

Description

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US89/00849

A nemzetközi közzététel száma: WO 9θ/θό128

Ezen találmány olyan terápiás és profilaktikus célú antikoaguláns és trombocita gátló készítményekkel, összetételekkel és módszerekkel foglalkozik, amelyekre jellemző, hogy a hirudin vagy annak analógjainak antikoaguláns és trombocita gátló hatásával rendelkező biológiai aktivitású peptidek· A jelen találmány módszerei, készítményei és összetételei előnyösen alkalmazhatók betegekben vagy biológiai mintákban a trombociták aggregáoiójának és a trombociták aktiválódásának a csökkentésére vagy megelő· zésére· Ezen módszerek, készítmények és összetételek külö· nősen jól alkalmazhatók olyan betegek esetében, akik számára a szokásos heparin kezelés a heparin. által okozott trombocitopénia vagy antitrombin Ill-hiány miatt ellenjavalt. Ezen találmány továbbá olyan módszerekkel, készítményekkel és összetételekkel foglalkozik, amelyek alkalmasak a szervezeten kívül vér kezelésére és a trombociták eltarthatósági idejének a növelésére·

Az akut érrendszeri betegségek, mint a ntiLokardiális infarktus, szélütés, tüdőembólia, mélyvénás trombózis, perifériás artéria elzáródás és más vérrendszeri trombózisok nagy egészségi veszélyt jelentenek· Ezeket a betegségeket egy véredény véralvadékkal való részleges vagy teljes elzáródása okozza, amely alvadék fibrinből vagy aggregált trombooitákból vagy mindkettőből áll.

A vér trombocitái lényeges szerepet játszanak a normális vérzésosillapitásban· Ezek vérzéscsillapító és alvadást fokozó hatással egyaránt rendelkeznek. A vérzés** csillapítás a sérülés után néhány másodperc elteltével beindul, amikor a trombociták elkezdenek a lézíó széléhez tapadni. A trombociták kezdeti tapadását a véredény falának a sérülése helyén felszínre kerülő kollagén vagy frissen keletkező trombin közvetiti. A kollagénnel vagy trombinnal érintkezve a trombociták aktiválódnak (felszabadulási reakció) különböző kémiai anyagokat, beleértve ADP-t és tromboxán Ag-t felszabadítva. A felszabaduló ADP és tromboxán Ag hatására a kiáramló vérből további trombociták aggregálódnak az érfalhoz már korábban ódat apadtakhoz. Az újonnan odatapadt trombociták szintén átesnek a felszabadítás! reakción és a folyamat mindaddig folytatódik, mig egy vérzéscsillapító trombooita zárócsomó nem kép« ződik. Az ADP és tromboxán Ag felszabadításon kívül a trombociták szabaddá teszik a trombooita faktor 3-at, amely előmozdítja az alvadási kaszkádot, végül trombin képződést és fibrin lerakódást eredményez a sérülés helyén. A trombin kötődik a trombociták membránján lévő receptorokhoz, és további trombooita aggregációt és felszabadulást okoz. A végső eredmény egy kevert alvadék, amely aggregált trombooítákból és polimerizált fibrinből áll.

Bár a normális vérzéses!11aoltáshoz szükséges, de a trombooita aggregáció és a felszabadítás! reakció eredményeként létrejövő alvadékképződés felelős különböző ~ 4 életet Veszélyeztető érrendszeri betegségekért, így miokardiális infarktusért, szélütésért, perifériás artéria elzáródásért és más vérrendszeri trombózisért. Ezen betegségekben szenvedő betegek esetében a trombocita aggregáció nem kívánatos folyamat, amelyet gátolni szükséges. A trombocita aggregáció gátlása kívánatos lehet a vér szervező ten kívüli kezelésében, a trombocitáknak koncentrátumokban való tárolása esetében és bizonyos sebészeti eljárásokat követően, például sziv-tüdő bypass esetében.

Dialízis kezelések közben a trombociták hajlamosak a dialízis membránhoz való tapadásra és aggregációra. Ez a kezelés hatásosságának a csökkenésére, valamint a trombocitáknak a kezelt vérből való kiválására Vezet. A trombociták tárolása esetében a trombocita koncentrátumok gyakran ”tárolási lázion” mennek keresztül, amely egy degradativ folyamat, amely által a trombociták aktiválódhatnak vagy károsodhatnak. Ezen léziók gyakorlati eredménye a csökkent tárolhatóság. A trombin, amely ezen trombocita koncantrátűmokban keletkezik, felelős ezen degradációért [A..P. Bode és D.T.Miller: ”Generation and Degradation of Fibrinopeptide A in Stored Piatelet Concentrates”, Vox Sang. 51, 192-196 (1986)] . Az érsebészetben a véralvadás gátlása lényeges a kezelt véredények épségének a megtartásában. Ha az ilyen műtétek után túl korán képződik alva dék, az veszélyeztetheti a beteg életét·

Bár a trombin által indukált trombooita aktiválódás mechanizmusa kevéssé ismert, az a vélemény, hogy az két lépésből áll:

1/ a trombin kötődése a trombooita felületén lévő receptorhoz; és

2/ egy trombooita felületén lévő szubsztrátum trombin okozta proteolizise. A trombooita felületén egy nagy affinitásu trombin kötőhelyet és egy mérsékelt affinitása trombin kötőhelyet azonosítottak, és mindkettőnek biológiai fontosságot tulajdonítanak [J.T.Hármon és G.A.Jatnieson, '“Ihe Glycocalcin Portion of Piatelet Gylooprotein lb Expresses Both High and Moderato Affinity Receptor Sites fór Ihrombin”, J.Bioi.Chem., 26 1,3224-3229 (1986); J.T. Hármon és G.A. Jamieson, Platóiét Aotivation by Ihrombin in the Absence of the High-Affinity Ihrombin Receptor”, Biochemistry, 27, 2151-2157 (1988)] .

A kémiailag módosított és inhibitorral kezelt trombin alkalmazása azt mutatta, hogy úgy a kötődési lépés, mint a proteolitikus lépés a trombooita aktiválódásához tartozik. Például, noha akár hirudinnal, akár denzil-arginin-N-(3-etil-1,5“pentándiil)-amlddal (DAPA) kezelt trombin nem képes aktiválni a trombocitákat, csak a hirudin nal kezelt trombin nem képes kötődni a trombooita trombin receptorához/receptóraihoz (C.L.Knupp, Effect of Thrombin

Inhibitora on Thrombin-Induoed Platóiét Release and Aggregation”, Thrombosis Rés., 49» 23-36 (1983)] . A trombin trombocita receptorokhoz való kötődésének a gátlása nem bizonyult elegendőnek a trombin által indukált trombocita aktiválás blokkolásához. Tulajdonképpen, miközben a hirudin blokkolja a trombin kötődését a trombocita felülőtéhez, gátolja az enzim amidolitikus funkcióját is IP. Walsmann és F, Markwardt, BioohemLcal and Phannacological Aspets of the Thrombin Inhibitor Hirudin”, Pharmazie, 36, 653-660 (1981)] .

A trombotifcus betegségek kezelésének és megelőzésének elterjedt módszerei olyan szereket alkalmaznak, amelyek két különböző ut egyike szerint hatnak. A gyógyszerek egyik típusa gátolja a trombin aktivitást vagy a trombin képződést, igy megelőzik az alvadék képződést. Ezek a szerek gátolják a trombocita aktiválást és az aggrecációt is. A gyógyszerek másik csoportja gyorsítja a trowbolizist és feloldja a véralvadékot, ezáltal eltávolitva azt a véredényből, és igy lehetővé teszik a vér áramlását fJ.P. Cazenave és munkatársai, Agents Action, 15, Suppl., 24“49 (1984)] .

A heparint, amely az előbbi osoportba tartozik, széleskörűen alkalmazzák olyan állapotok kezelésére, mint a vénás tromboembólía, amelyben a trombin aktivitás a fe

- 7 lelős a trónbús kifejlődéséért vagy a kiterjedéséért. A heparin az antitrombin-III aktiválásán keresztül fejti ki a hatását, amely egy, a trombinnal komplexet képző és azt inaktiváló fehérje. A hatásmódja miatt a heparin csak a trombin által indukált tromboclta aggregáció megelőzésére alkalmazható. Azonban még ebben az alkalmazásban is kérdéses a heparin általános hatékonysága. Továbbá, a heparin több, nem kívánatos mellékhatást fejt ki, beleértve vérzést és heparin okozta trombocitopéniát. Ezenkívül a heparin okozta trombocitopéniában szenvedő betegekben, akikben végzetes trombotikus következményekkel járhat egy itnmun-közvetitett trombocitopénia, a heparin aktuálisan felgyorsítja a trombocita aggregációt, gyakran végzetes következményekkel. Más betegekben, mint amilyen egy antitrombin-III -hiány, a heparin egyszerűen kevéssé hatásos. Ennek megfelelően fennáll az igény a szokásos heparin**alapu kezelésektől eltérő más kezelések iránt.

A hirudin egy természetben előforduló polipeptid, amelyet a vérszivó pióca (Hirudo medicinalis) termel. Ez a vegyület, amely a pióca nyálmirigyében képződik, a leghatásosabb ismert természetes véralvádásgátló. A hirudin erősen kötődve a tromblnhoz (K_d~2 x 10 M) egy 1:1 arányú sztöbbiometrikus komplex képzésével meggátolja a véralvadást fS.R.Stone és J.Hofsteenge, Kinetics of the

Tnhibition of Thrombin by Hirudin, Biochemistry, 25, 4622-4628 (1986)1 · Ez viszont meggátolja, hogy a trombin katalizálja a fibrinogén fibrinné való átalakulását (alvadók képződését).

A hirudin és a trombin közötti kötődés két lépésből álló folyamat. Kezdetben a hirudin a trombin molekulán lévő ^Malaosony” affinttásu helyhez kötődik (K_d»N/1 x 10®M), amely külön helyezkedik el a katalitikus helytől. Az alacsony affinitásu kötődés után a hirudin egy konformációs változáson megy át, és ezután kötődik a nagy affinitásu helyhez a trombinon. Ez utóbbi hely a trombin aktiv helyének felel meg.

A hirudinról megállapították, hogy egyaránt gátolja a trombin kötődését a trombocitákhoz fP.Ganguly és W.J.Sonnichsen, Binding of Thrombin to Humán Platelets and its Possible Significance”, Br.J. Haematol., 34« 291-301 (1976); S.W. Thm és T.C. Detwiler, Binding of Thrombin. to Humán Platóiét Plasma Membráné, Biochim. Biophys. Acta, 543* 194-201 (1978)1 és a trombin által indukált trombocita aggregációt [S.W.Tam és munkatársai, Dissociation of Thrombin From Platelets by Hirudin: Evidenoe fór ReceptoxjPr ocessing” , J.Bioi.Chem., 254, 8723-8725 (1979)1 · Ezért a hirudint hatásos anti-trombocita szernek tekintik. Azonban, különböző hátrányai kapcsolódnak a heparin alkalmazással, beleértve a magas árat, a • · · · · ··* Μ* ·« * * · · · « ·· ··· ··· «·

- 9 potenciális antigenitást és vérzéseket·

A hirudin izolálása, tisztítása és kémiai összetétele a szakterületen ismert IP.Walsmann és F.Markwardt, Biochemioal and Pharmacological Aspects of the Ihrombin Inhibitor Hirudin”, Pharmazie, 36, 653-660 (1981)] . Az utóbbi időben felderítették a polipeptid teljes aminosav szekvenciáját is [J.Dodt és munkatársai, ”The Complete Covalent Structure of Hirudin: Localization of the Disulfide Bonds”, Bioi.Chem· Hoppe-Seyler, 336, 379-385 (1985); S. J.T. Mao és munkatársai, Rapid Purification and Revised Amino Terminál Sequence of Hirudin: A Specific Thrombin Inhibitor of the Blood-Sucking Leech, Anal· Biochem., 161, 514-518 (1987); R.P. Harvey és munkatársai, Cloning and Expresszon of a cDNA Coding fór the Antl-Coagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech, Hirudo medicináiig, Proo.Natl, Acad, Sci. USA, 83, 1084-1088 (1986)] .

A hirudin legalább két izospecifikus formájának, a HV-1-nek és HV-2-nek a szekvenciáját vizsgálták, és az aminosav szekvenciákat kis mértékben eltérőnek találták ER.P. Harvey és munkatársai, lásd fent] · A hirudin mind a két formája egy polipeptid szálból álló fehérje, amely 65 aminosavat tartalmaz, és amelyben az araino-terminális rész hidrofób aminosavakat foglal magában, a karboxi-terminálisra pedig jellemző a poláros aminosavak jelenléte. Még pontosabban, a hirudin mindkét formáját jellemzi egy N-ter— minális dómén (1-39 csoportok), amelyet három diszulfid-hid stabilizál az 1-2, 3-5 és 4-6 fél-ciszteinil csoporton keresztül, valamint egy nagymértékben savas C-terminális szegmentum (40-65 csoportok). Ezen kívül, a hirudin C-terminális szegmentumát a 63-as helyen lévő tirozin csoport jelenléte jellemzi, amely szulfatált.

Az állatkísérletekben a piócából nyert és tisztított hirudin hatásosnak bizonyult a vénás trombózis kivédésében, a vaszkuláris ”shunt” elzáródásában és a trorabin által indukált disszeminált intravaszkuláris koagulációban. Ezen kívül a hirudin toxicitása csekély, antigenitása kicsi vagy nincs, és a keringésből igen rövid idő alatt eltűnik [F.Markwardt és munkatársai, Pharmacological Studies on the Antithrombotic Action of Hirudin in Experimental Animals”, Ihromb. Haemostasis, 47, 226-229 (1982)] ,

A hirudin hatásossága ellenére azonban a vizsgálatok azt mutatták, hogy a hirudin dózistól függő mértékben meghosszabbítja a vérzés! időt, igy a megfelelő adagok meghatározása és adása igen lényeges* Továbbá, magas ára és a természetben előforduló termék csekély rendelkezésre álló mennyisége meggátolja széleskörű elterjedését*

A nagyobb mennyiségű hirudin előállítására irányuló törekvések során megkísérelték a polipeptid előállítását rekombináns DNS technikákkal elérni. A natív hiru• ·· «·· dinban lévő O-szulfatált tirozin csoport és az a tény, hogy a mikro organizmus ok hasonló fehérjét nem képesek képezni, az elvégzett módosítások a rekombináns, biológiailag aktiv hirudin termelésének a kilátását nagy mértékben kérdésessé tették· Az a megfigyelés, hogy a deszulfato-hirudin közel olyan hatásos, mint annak szulfátéit megfelelője (4 654 302 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) elvezetett a hirudin klónozásához és expressziójához E.coliban (158, 564; 168,342 és 171, 024 számú európai szabadalmi bejelentések) és élesztőben (200,655 számú európai szabadalmi bejelentés) ezen eredmények ellenére még mindig költséges a hirudin előállítása, és a kereskedelemben nem kiterjedt a beszerezhetősége·

Az utóbbi időben eredményeket értek el a nativ hirudin peptid fragmentumainak az azonosításában, amelyek szintén hatásosak az alvadási idő csökkentésében· A hirudinnak egy nem-szulfátált, 21 aminosavból álló C-terminális fragmentuma, az Ν-α-acetil-hirudin^^_g^, in vitro gátolja az alvadék képződését. Ezen kívül, több más kisebb, nem— -szulfátéit paptid, amelyek megfelelnek a hirudin C-terminális 11 vagy 12 aminosavának (az 55-65 és 54“ó5 csoportok) szintén hatásosak az alvadékképződés in vitro gátlásában fJ.L.Krstenansky és munkatársai, Antithrombin Properties of C-terminus of Hirudin Using Synthetic Unsulfa— ted Ν-α-acetil-hirudin^^’', FEBS Lett., 211, 10-16 (1987)1 .

Ezek a peptid fragmentumok azonban nem teljesen kielégi tÓ hatásúak a v éra Ivadék feloldásában folyamatos kezelési mód esetében.Például,

négy nagyságrenddel alacsonyabb a specifikus aktivitása, mint a nativ hlrudinnak.

Ennek megfelelően továbbra is fennáll az igény a véralvadékképződés és a trombocita aggregáció egy olyan hatásos inhibitora iránt, amelyre nem jellemzőek a szokásos szerek mellékhatásai, és amelyeket kereskedelmi mennyiségben lehet előállítani.

A jelen találmány megoldja a fenti problémákat, rendelkezésre bocsátva készítményeket, összetételeket és módszereket, amelyekre jellemző, hogy azok a nativ hirudin biológiai aktivitásával rendelkező peptidek, amelyek olyan hatásos antikoagulánsok, amelyek megnövelik a véralvadási időt és olyan anti-trombocita szerek, amelyek meggátolják a trombociták aggregációját és aktivitását (”anti-trombociták”)· Amint a következő leírásból megérthető lesz, a jelen találmány szerinti antitrombocita készítmények, ősz szetételek és módszerek hatásosak és biztonságosak a tromboclta aggregáció és szekréció megelőzésében a vaszkuláris betegségek kezelése során, a szervezed kívül vér kezelésekor és a tárolt koncentrált trombociták megvédésében.

A jelen találmány szerinti antitrombocita készít13 mények, összetételek és módszerek különösen előnyösek olyan betegek esetében, akiknél a szokásos hepárin-terápia ellenjavait. Például azon betegek esetében, akik heparin által indukált trombocitopéniában szenvednek, a jelen találmány szerinti készítmények plazma antikoagulánsként hatnak anélkül, hogy trombocita aktiválást okoznának· Az ezen készítményekre jellemző hirudin peptidek kis mérete csökkenti az ellentétes hatású antigén válaszreakció lehetségességét az ezzel kezelt betegekben· (Az ábrák rövid leírása)

1, ábra: A szulf o-Tyr^jhirudin^^»^ tisztítása fordított fázisú HPLC-vel.

2, ábra: táblázat, amely bemutatja a hirudin peptidek kovalens szerkezetét, valamint ezek antikoaguláns aktivitását. Ezen ábrában az aminosavakat a következő egybetüs kódokkal < jelöltük:

Phe:	F	Leu:	L	Ile:	I	Met:	M
Val:	V	Ser:	S	Pro:	P	Ihr:	T
Alá:	A	Tyr:	Y	His:	H	Gin:	Q
Asn:	N	Lys:	K	Asp:	D	Glu:	E
Cys:	C	Trp:	W	Arg:	R	Gly:	G

3A-3C ábrák: A hirulog-1, hirulog-2 és hirulog-3 peptidómimet ikus hirudin analógok szintézise.

4, ábra: A hirulog-4 , a hirudin peptid egy peptidomimetikus analógjának a szintézise.

5Α és 5B ábrák: A hirulog-5 és hirulog-6, a hirudin peptid peptidomimetikus analógjainak a szintézise.

6. ábra: A hirulog-7, a hirudin peptid egy peptidomimetikus analógjának a szintézise.

7. ábra: A szulfo-Tyr^hirudin^^g^ hatása a trombin által indukált trombocita aggregációra.

8. ábra: A szulf o-iyr^^hirudin^^.^ és a hirudin^^-64 trombin által indukált trombocita aggra gádora gyakorolt hatásainak az összehasonlítása.

9. ábra: A szulfo-Tyr^ghirudinj-^.,^ hatása a trombin által indukált trombocita felszabadulási reakcióra.

10. ábra: A szulfo-iyr^^hii?udin^^_i_g^“nek a trombin által indukált trombocitákból történő tromboxán Ag keletkezésére gyakorolt hatása.

11. ábra: A he parin és a szulf o-Tyr^hirudin^,,^ heparinnal indukált trombocitópéniában szenvedő betegekből nyert trombociták aggregációjára gyakorolt hatásának az összehasonlítása.

12. ábra: A ha parin és a szulf o-Tyr^hirudin^.,^ heparinnal indukált trombocitópéniában szenvedő betegekből nyert plazma aktivált parciális trombin idejére gyakorolt hatásának az összehasonlítása.

A jelen találmány tárgya a hirudin peptideket tartalmazó, gyógyászatilag megfelelő készítmények, összeté telek, valamint az ezeket alkalmazó módszerek a trombooita aggregáció és aktiválódás gátlására betegekben, szervezeten kívüli vér és tárolt trombociták esetében· A jelen találmány szerinti készítményekre, összetételekre és módszerekre jellemző, hogy azok olyan hirudin peptidek, amelyek megfelelnek a hirudin karboxi-terminális aminosav szekvenciájának és amelyek rendelkeznek a natív hirudin antikoaguláns és trombooita gátló aktivitásával. A hirudin peptidek legalább részben homológok a natív hirudin karboxi-terminális 26 aminosavával. Ezen peptideket az egyetlen tirozil csoport átalakításával lehet származtatni egy negatív töltésű csoport hozzáadásával.

A hirudin peptidek közé a következők tartoznak (de nem korlátozódnak csupán ezekre): lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó peptidek: Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-X, és ezek D-retro formái, ahol az X jelentése a következő lehet: -COOH, Leu és Leu-Gln, Ezen kivül a hirudin peptidek közé olyan peptidek is tartozhatnak, amelyekre jellemző, hogy lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazzák: Y-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Z és ezek D-retro formálj ahol az Y jelentése a következő csoportok valamelyike: aminocsoportot tartalmazó csoport, amino-védőcsöpört, a Val-Thr-Gly-Glu-Giy-Thr-Pro-Lys—pro-Gln—

-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp aminosav szekvenciának legalább a C-terminális része és a Val-Ihr-GLy-Glu-Gly-Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp aminosav szekvenciának legalább a C-terminális része; a Z jelentése a következő csoportok valamelyike: -COOH, Leu és Leu-Gln és a negatív töltésű csoportot tartalmazó tirozil-maradék. Ezekben a peptidekben a negatív töltésű csoportot a következő csoportból választjuk ki: szulfát, foszfát, karboxilát, szulfonát, foszfonát, karbonát, metilszulfonát, metil-foszfonát és ezek variánsai : A hírűd in peptidek közé olyanok is tartozhatnak, amelyekben Y jelentése Asn-Gly-Asp és Z jelentése Leu, és a tirozin maradék szulfatált. Ezen kívül a hirudin peptidekre jellemző lehet az amino-terminális aminosavon egy N-acetil csoport jelenléte.

A jelen találmány szerinti készítményekre, összetételekre és módszerekre jellemző hirudin peptidek előállítása a szakterületen ismert különböző módszerekkel valósítható meg. Például a peptideket származtathatjuk az ép hirudin molekulából proteolizissel speciális endopeptidázokat exopeptidázokkal kombinálva alkalmazva, Edman lebontással, vagy mindkettővel. Másfelől az ép hirudin molekulát ennek természetes forrásából, a H. medicináiigból tisztíthatjuk szokásos módszereket alkalmazva. Alternatív módon a hirudint elő lehet állítani ismert rekombináns DNS technikákkal cDNS-ek alkalmazásával [R.P. Harvey és munkatársai, Proo.Natl.Aoad.Sci. USA, 83, 1084-1088 (1986); J.Dodt és munkatársat Expression Seoretion and Processing of Hirudin in E.coli Using the Alkáli ne Phosphatase Signal Saquenoe” FEBS Lett., 202, 373-377 (1986)] vagy egy kémiai utón szintetizált génnel [C.Bergmann és munkatársai, Chemical Synthesis and Expression of a Oene Coding fór Hirudin, the Ihrombin-Speoific Inhibitor from the Leech, Hirudo raedioinalis, Bioi.Chem. Hoppe-Seyler, 3Ó7, 731-740 (1986)] · A hirudin peptideket elő lehet állítani rekombináns módon egy fúziós fehérje részeként. Ilyen fúziós fehérjét úgy lehet tervezni, hogy a kívánt peptid megfelelő enzimes hasítással felszabadítható legyen.

Előnyösen a hirudin peptideket közvetlenül állítjuk elő, Így kiküszöbölve a kiindulási anyagként szolgáló teljes hirudin molekula szükségességét. Ez elérhető a jól ismert rekombináns DNS technikákkal, amelyekben csak a kívánt peptidet kódoló DNS szekvenciák fejeződnek ki a transzformált gazdasejtben.

Alternatív módon a hirudin peptideket elő lehet állítani szokásos szintetikus technikákkal. Ezen peptidek relatív kis mérete (8 és 26 aminosav között) előnyösen lehetővé teszi szintetikus előállításukat. így ezek különlegesen jó hozammal állíthatók elő, és könnyen tisztithatók összehasonlítva akár a természetes hi rúd innal vagy annak teljes hosszúságú rekombináns DNS-sel előállított párjával.

A hirudin peptidek előnyösen szintetizálhatok szilárd fázisú peptid szintézissel vagy oldatban végrehajtott peptid szintézissel, és tetszés szerint emészthetőket karboxipeptidázzál (a C-temninális aminosavak eltávolítására), vagy manuális Edman-lebontással bonthatók le (az N-terminális aminosavak eltávolítására). A folyadék fázisban történő szintetikus módszerek előnye, hogy lehetővé teszik az aminosav-származékok közvetlen addioióját a peptid lánc hosszabitása során. Ez elkerülhetővé teszi a tirozin csoport módosítását szolgáló következő derivatizációs lépés szükségességét. Az ezen a módon előállított peptideket a szakterületen széles körben ismert elválasztási technikákkal lehet tisztítani, előnyösen fordított fázisú HPLC-vel.

Ezen specifikáció egészében és az igénypontokban az aminosavakra és csoportokra alkalmazott rövidítések megegyeznek az általánosan elfogadott nomenklatúra szabályaival, és az Lr-sorozat α-ami no savaira és ezek maradékaira vonatkoznak. Azonban a jelen találmány szerinti készítmények a leirt hirudin peptidek D-retro formáit is tartalmazhatják. Ezeket D-aminosavak szintézisével állítjuk elő ellentétes irányban, az Ir-forma karboxi-terminális aminosavból kiindulva.

A hirudin peptidek származékainak az előállítása magában foglalhatja negatív töltésű csoport hozzáadását az egyetlen tirozin csoportnak akár a szabad fenolos hidroxil jára, akár a benzolgyürü méta-szénatomjára. A származékok előállítása történhet különböző negatív töltésű csoportok hozzáadásával, amelyek a szakterületen ismertek. A származékok előállítása történhet szulfatálássál, metil-szulfonálássál, foszforilálással, metil-foszfonálással és a tirozin hidroxicsoportjának karboxílálásával, valamint a tirozín benzolgyürü meta-szénatomjának a szulfonálásával, foszfonálásával és karbonálásával. Ezen reakciók végrehajtására szolgáló technikák szintén jól ismertek a szakterületen.

A legelőnyösebb hirudin peptidszármazék előállítása szulfatálássál történik. Egy előnyös hirudin paptid, amely jellemző a jelen találmány készítményeire, összetételeire és módszereire a szulf o-Tyr^jhirudin^^gj^» 12 aminosavból álló peptid, amely egy szulfátéit tirozint tartalmaz és homológ a natív hirudin 53-64 csoport jaíval.* Egy másik előnyös peptid a szulfonil Tyr^^hirudin^,^^, amely egy szulfónált tirozin csoportot tartalmaz. Egy utóbbi peptid hosszabb biológiai felezési idejű, mint a szulfátéit megfelelője,

A hirudin peptidek szulfatálása megoldható biológiai (enzimatikus) vagy kémiai eljárással. Előnyösen, egy tisztított hirudin peptidet reagáltatunk dioiklohexil-karbodiimiddel és kénsavval egy szerves oldószerben. Ennek a szulfatálási eljárásnak a mellékreakciója a meta-szénatom szulfonálása·

Nagy mennyiségben történő szulfatálás esetén a szulfatálási eljárást módosítottuk olymódon, hogy a peptid grammnyi mennyiségeit először egy szerves oldószerben, előnyösen dimetilformamidban feloldjuk, ezután egy vizelvonó szerrel reagáltat juk, előnyösen diciklohexil-karbodiimiddel. A peptid dehidrált tirozin csoportját ezután kénsavval reagáltatva szulfátéijuk. A reakció egy oldhatatlan diclklohexil-karbamid-só képződésével megy végbe. Ez a módosítás a szulfátéit peptid magas hozamát eredményezi a nagyobb méretben történő előállítás során. Ez a szulfatálási technika előnyösen alkalmazható bármely, akár izolált és tisztított vagy nyers készítményben lévő peptid vagy polipeptid tirozil-csoportjainak a szulfatálására. Mindegyik szulfatálási reakciót követően a szulfatált peptidek elkülöníthetők a szulfonált peptidektől, valamint az el nem reagált peptidektől HPLC-vel, DEAE-kromatografálással vagy bármilyen más szokásos elválasztási technikával.

A szulfatálás elvégezhető a hirudin peptidnek kén-trioxid-trietil-amin-sóval pirá.dinben végzett reakciójával is. Ezen kívül a tirozil-szulfotranszferáz aktivitás, akár nyers készítményben, akár tisztított enzimként, szintén felhasználható a tirozil-csoport szulfatálására JR.W.H. Lee és W.B.Huttner, “Tyrosine O-Sulfated Proteins of PC-12 Pheo Chromo Cytorna Cells and Their Sulfation by a Tyrosyl

Protein Suliotransferase, J.Biol.Chem., 258, 11326-1133¾ (1983)] · A hirudin peptidek foszforiláoiója vagy karboxilációja elvégezhető a szulfatálás fentiekben leirt reakciójához hasonlóan, a kénsav helyett foszforsavat, illetve hangyasavat használva. Ezekben a reakciókban mellékreakcióként foszfonáoió, illetve karbonáció történik. Más megoldásként enzimatikus módszerek alkalmazhatók a hirudin peptidek karboxilátására vagy foszfor!látására.

A hirudin peptidek metil-szulfonálását és metil-foszfonálását a szakterületen jól ismert módszerekkel lehet elvégezni, beleértve - de nemcsak erre korlátozva - a klór-szulfonsavval, illetve klór-foszfonsavval történő alkilezést.

A szulfatálási reakció mértékét spektrofotometriásán lehet követni. A szulfátált peptidek abszorpciós spektrumában a maximális abszorpció eltolódik a közelítőleg 275 nm-ről közelítőleg 250-265 nm-re. A származék előállításának a bizonyítása történhet a peptid 30 %-os tri— fluor-eoetsavval (továbbiakban TFA) 6o°C-on 3θ percen át tartó deszulfatálásával. Ez az abszorpciós maximum 275 nm-re történő növekedését eredményezi.

A jelen találmány szerinti készítményekben, összetételekben és módszerekben alkalmazott hirudin peptideknek olyan származékai is előáll!thatók, amelyekben az antiLno-terminális származékát állítjuk elő egy l£-ace ti lesöpört

- 22 bevitelével. Az N-aoetilezés megoldható az ezen terület szakemberei számára ismert számos technika bármelyikével. Előnyösen az acetilezést úgy lehet megoldani, hogy a jelen találmány szerinti peptidek szintézisekor egy N-acetil-aminosav-származékot alkalmazunk. Egy másik megoldás szerint az N-aoetilezés elvégezhető a peptid ecetsavanhidriddel végzett reakciójával. Az N-acetilezett hirudin peptidek összehasonlítva a megfelelő nem-acetilezett peptiddel, előnyösen megnövekedett stabilitással rendelkeznek.

A jelen találmány szerinti készítményekben, össze' tételekben és módszerekben alkalmazott hirudin peptidek trombocita gátló képessége részben az in vivő felezési idejüktől függ. Ennek megfelelően a jelen találmány a gyógyszerkészítményekre is vonatkozik, amelyekben a hirudin peptid akár kovalensen, kár nem-kovalensen gyógyászatilag megfelelő polimerhez van kötve, amely megnöveli ezen peptidek biológiai felezési idejét. Például egy hirudin pepiidet szokásos technikákkal össze lehet kapcsolni polietilénglikol (PEG) egy aktivált származékával. Előnyösen egy PEG N-szukclnimidil-szukclnátot kaposolunk egy peptid α-amino részéhez. Ezt a kapcsolást a peptidet PEG-N-szukoimidil-szukcinát reagenssel (SS—PEG) egy szerves oldószerben vagy egy 7 körülinél magasabb pll-ra pufferolt oldatban reagáltatva végezzük. Legelőnyösebben az SS-PEG (átlagos molekulasúly s 5000 Dalton) 50-szeres moláris feleslegét

.... _r....... ..

• ·«· ·«· ··

- 23 reagáltatjuk egy peptid 20 mmólos nátrium-borát pufferes (pH=9,0) oldatában.

A hirudin peptideket önállóan, vagy készítményekben, összetételekben és módszerekben lehet felhasználni vérrendszeri trombózisnak tulajdonítható érrendszeri betegségek kezelésére és megelőzésére. Például a hirudin peptidek, valamint az ezeket tartalmazó készítmények összetételek alkalmazhatók profilaktikusan a heparin helyettesítésére, a trombocitopénia kezelésében a heparin helyettesítésére, disszeminált intravaszkuláris koaguláció kezelésére és a vaszkuláris trombusok kezelésére, amelyek több betegségből eredhetnek. A hirudin peptidek, valamint az ezeket tartalmazó készítmények és összetételek alkalmazhatók emlősök, különösen emberek érrendszeri betegségeinek a kezelésére és megelőzésére.

«

A hirudin peptidek vagy az ezeket tartalmazó készítmények felhasználhatók a szervezeten kívüli vérben a trombociták aggregációjának a meggátlására. Amint ezen leírásban alkalmazzuk, a szervezeten kívül vér kifejezés a betegből közvetlenül levett vérre vonatkozik, amelyet a szervezeten kívül kezelnek, majd visszaviszik a betegbe dialízis vagy vér szűrési eljárással vagy műtét során bypas-sal, A kifejezés azokra a vérkészítményekre is vonatkozik, amelyeket a szervezeten kívül tárolnak, a beteg eset—

- 24 leges kezelése céljából. Ezek a készítmények jelenthetik a teljes vért, plazmát vagy bármely vérfrakciót, amelyben kivánatos a trombociták aggregációjának a gátlása. Ezekben a készítményekben az aktiv peptid mennyisége vagy koncentrációja a kezelendő vér térfogatától vagy előnyösebben annak trombin tartalmától függ,

A jelen találmány szerinti készítmények, összetételek és módszerek a hirudin peptidek itt leirt peptidomimetikus analógjait is magukban foglalják, A peptidomimetikus analógok az eredeti peptid aktiv helyén lévő háromdimenziós szerkezetét utánozzák. Az analógok gátolják a fibrinogén trombin általi hidrolízisét, és antikoaguláns hatást fejtenek ki. A hirudin peptidek analógjai lehetnek félig-peptid vagy nem-peptid természetűek. Ezek a peptidomimetikus analógok a kiindulási anyaghoz viszonyítva előnyösen megnövelik a megengedett tárolási időtartamot és a biostabilitást. Azonkívül ezen peptidomimetikus analógok biológiai alkalmazhatósága nagyobb lehet, mint a megfelelő peptideké, ha azokat szájon át vagy helyileg alkalmazzuk. Továbbá, ezek az analógok nagyobb antitrombocita aktivitással rendelkezhetnek. Lényeges, hogy a jelen találmány peptidomimetikus analógjaira Jellemző az a biológiai aktivitás, amely hasonló az itt leirt nekik megfelelő hirudin peptidekéhez. Ennek megfelelően ezeket az analógokat a jelen találmány szerinti készítményekben, összetételekben és módszerekben azonos módon lehet alkalmazni, mint a hirudin peptideket.

A jelen találmány további megvalósitása szerint a trombociták eltarthatóságának a növelésére a gyógyászatilag megfelelő készítmények és módszerek magukban foglalhatnak más trombocita aggregációt vagy lebomlást gátló anyagot is. Ezek az összetételek fém-keIátképzőket, más trombocita felületi komponensek inhibitorait, trombooita felületi komponensek antitestjelt, a fenti vegyületek bármelyikének az analógjait vagy ezek kombinációit foglalják magukban, de nem korlátozódnak csupán ezekre. Ezek a hozzáadott komponensek előnyösen lehetnek citrát-foszfát, dextróz, prosztaglandin PGE^, a prosztaglandin E^ analógjai, a prosz taciklin vagy teofillin stabil analógjai. Az itt használt értelemben a kombináció'’ kifejezés jelenthet egyszeri, adagolási formát, amely legalább egy hirudin peptidet és a trombooita aggregáció más inhibitorát tartalmazza, egy olyan többszörös adagolási formát, amelyben a két szert külön, de egyidejűleg adagoljuk, vagy egy olyan többszörös adagolási formát, amelyben a két szert külön, de egymást követően adják be.

A jelen találmány egy másik megvalósitása szerint egy betegnek a trombooita aggregáció gátlása céljából adott gyógyászatilag megfelelő készítmények és módszerek tartalmazhatnak más trombooita gátlókat is, mint például prosztaί··· ι··· .·' * ··· .·· • · · · « ·· ··· ·,· »♦ glandinokat, teofillint, más trombocita gátló kis peptideket, oiklooxigenáz inhibitorokat, kis nem-peptidjellegű trombocita gátlókat, a trombooita felületi komponensek gátlóit, a trombocita felületi komponensek antitestjelt, hematopoietikus faktorokat, a fenti vegyületek bármelyikének az analógjait vagy ezek kombinációit. A legelőnyösebbek az aszpirin, tiklopidin, dipiridamol, szulfinpirazon, prosztaglandin E^, stabil prosztaoiklin származékok, a Ilb/lIIa glükoproteinekkel szembeni monoklonális antitestek vagy a Ilb/lIIa glükoprotein természetes inhibitorai, az Ib glükoproteinnel szembeni monoklonális antitestek, az Ib glükoprotein természetes inhibitorai, éritroprötéin, Arg-Gly-Asp tartalmú peptidek vagy Arg-Gly-Asp tartalmú peptidek származékai ,

A jelen találmány szerinti készítményekben és összetételekben alkalmazott hirudin peptidek szokásos módszerekkel formulázhatók gyógyászatilag alkalmazható antitrombocita készítmények és összetételek előállítása céljából. Ezek a készítmények előnyösen legalább egy gyógyászatilag megfelelő vivőanyagot tartalmaznak. Lásd például Remington’s Pharmaoeutioal Soiences” (E.W. Martin) leírásait. Ezen kívül a jelen találmány szerinti trombocita gátló készítmények előnyösen tartalmazhatnak egy gyógyászatilag megfelelő puffért, előnyösen foszfáttal pufferőit sóoldatot, egy megfelelő gyógyászatilag elfogadható olyan vegyülettel együtt, amely az izotóniás nyomás beállítását szolgálja, igy pél♦••t :·*· r·· .·· • ··» *·· * * · · · · · ··« ·«« «· “ 27 dául nátrium-kloridot, mannitot vagy szór bitót. A jelen találmány szerinti gyógyászatilag megfelelő készítményekre és módszerekre Jellemző, hogy azok a hirudin peptideknek gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazzák, olyan mennyiséget,amely hatékonyan gátolja vagy csökkenti a trombociták aggregációját egy biológiai mintában egy meghatározott időtartam alatt.

Ezek a készítmények megfelelően alkalmazhatók szájon át, parenterálisan és helyi kezelésben, azonban előnyös a parenterális felhasználásra alkalmas formulázásuk. A parenterális készítményeket legelőnyösebb intravénás bolusz formában alkalmazni. A helyi kezelések céljára fornrulázott készítmények például lehetnek vizes gélben, olajos szuszpenzióban vagy emulgeált kenőcs formában. Parenterális alkalmazás céljára szolgáló folyékony egységdózis adagolási formákat készíthetünk, amelyek egy jelen találmány szerinti készítményt és egy steril hordozót tartalmaznak. A gyógyászatilag megfelelő készítményekben lévő hirudin peptid lehet szuszpandáit vagy oldott formában, a vivőanyag és a peptid természetétől függően. A parenterális készítmények rendszerint apeptid és adott esetben más komponensek valamilyen vivőanyagban való oldásával készülnek, majd megfelelő üvegbe vagy ampullába való töltés előtt ezeket sterilre szűrjük és lezárjuk. Előnyösen adjuvánsokat, mint például helyi érzéstelenitőt, konzerválószereket ♦♦♦j $·♦· ·· • ··· ··* *« * ♦ · · · •· ·»· ··· ··

- 28 és pufféi· hatású anyagokat is oldunk a vivőanyagban. A készítményt ezután la lehat fagyasztani, és liofilizálni lehet a stabilitás fokozása céljából.

A páréntorális szuszpenziókat lényegében azonos módon készítjük, kivéve azt, hogy a hirudin peptidet a vivőanyagban nem oldjuk, hanem szuszpandáijuk. A peptid és más tetszőleges komponensek sterilizálása előnyösen azok etilén-oxidos kezelésével végezhető a steril vivőanyagban való szuszpendálás előtt. Előnyösen egy felületaktív anyag vagy egy nedves!tőszer is van a készítményekben, hogy megkönnyítse a hirudin peptid vagy más tetszőleges komponensek egyenletes eloszlását.

A szájon át való adagolásra szolgáló tabletták és kapszulák szokásos segédanyagokat tartalmaznak, például ilyenek a kötőanyagok, töltőanyagok, hígítók, tablettázó anyagok, sikositó anyagok, szétesést elősegítő anyagok és nedvesítő anyagok. A tablettákat a szakterületen jól ismert módszerek szerint bevonattal lehet ellátni. Megfelelően alkalmazható töltőanyagok cellulóz, mannit, laktóz és más hasonló szerek. A szétesést elősegítő megfelelő anyagok a keményítő, polivinilpirrolídon és keményítő származékok mint például a nátrium-keményttő-glikolát. Megfelelő sikositó anyagok például a magnézium-sztearát. Megfelelő nedvesítő szerként például nátrium-lauril-szulfátot alkalmaz hatunk ···· J··· _e·*

A szájon át adott folyékony készítmények lehetnek vizes vagy olajos szuszpenziók, oldatok, emulziók, szirupok vagy elixirek, vagy száraz készítmények is lehetnek, amelyeket vizzel vagy más alkalmas vivőanyaggal lehet a használat slőtt újra oldani. Az ilyen folyékony készítmények szokásos adalékanyagokat is tartalmazhatnak. Ezek közé számítjuk a szuszpendáló anyagokat, igy szorbitot, szirupot, metil-cellulózt, zselatint, (hidroxi-etil)-callu' lózt, (karboxi-metil)-cellulózt, aluminium-sztearát gélt vagy hidrogénezett étkezési zsírokat; emulgeáló szereket, például lecitint, szorbitán-monooleátot vagy gumiarábikumot; nem-vizes vivőanyagokat, mint például mandulaolajat, frakcionált kókusz olajat és olaj észtereket; konzerválószereket, mint például metil vagy propil-n-hidroxibenzoátot vagy szorblnsavat.

A jelen találmány foglalkozik a fent leirt gyógyásza tilag alkalmazható készítményeknek betegekben vagy biológiai anyagban a trombocita aggregáció és kiválasztás csökkentésére vagy megelőzésére történő felhasználásának a módszereivel is. Az adagolás módjai és az adagolás mértéke különböző tényezőktől függ, igy például a specifikus készítménytől, a kezelés céljától, azaz attól, hogy az terápia vagy megelőzés, és a kezelő orvos megítélésétől. A jelen találmány szerinti készítményekben a jellemző napi adagnak a mértéke a következő: az adott peptid koncentrá• ··· ··· ·· • · · · · · ·· ··· ··· ··

- 30 dója 1 mg/ml és 1000 mg/ml közötti, előnyösen közelítőleg 25 mg/ml és 50 mg/ml közötti· Ezen adagok esetében a kezelt betegben az in vivő végső koncentráció közelítőleg 0,1-10 mg peptid/testtömeg-kg lesz, még előnyösebben közelítőleg 0,2-2 mg/testtömeg-kg. A kezelés időtartama elegendő kell legyen a trombocita aggregáci6 kívánt gátlásának az elérésére· Minthogy a jelen találmány szerinti készítményekben alkalmazható PEG—szármázék hirudin peptidek a természetes hirudinhoz, valamint a nem-derivatizált péptidekhez viszonyítva hosszabb felezési idővel rendelkeznek, ezek adagolási mennyiségei előnyösen alatta vannak a fenti nem-derivatizált peptideknél javasolt értékeknél·

A jelen találmány egy előnyös megvalósítása a trombocita aggregáció gátlásának egy módszerére vonatkozik, amely az olyan betegek esetében alkalmazható, akiknél a heparin kezelés ellenjavait. Ezen módszerek különösen hatásosak azon betegek esetében, akik heparin által indukált trombocitopéniában szenvedtek vagy szenvednek· Annak meghatározása, hogy egy beteg szenved-e vagy szenvedett-e heparin által indukált trombocitopéniában, a beteg megkérdezésével, az orvosi előzményekből vagy még előnyösebben a heparin kezelés ideje alatt levett vérminta trombocita tartalmának a meghatározása alapján történhet. Ezen vizsgálatok, amelyek a szakterületen jól ismertek, felfedik a heparin által indukált trombocita aggregációt, a heparin által indukált ( ^C)-szerotonin felszabadulást vagy a he parin által indukált tromboxán Ag felszabadulást a trombocitákból [J.G. Fratantoni és munkatársai, “Heparin Induoed Ihrombooytopenia: Confirmation of Diagnosis with In Vitro Methods”, Blood, 45, 395-401 (1975); J.G« Keltőn és munkatársai Clinical Usefullness of Testing fór a hepárin Dependent Piatelet Aggregation Bactor in Patients with Suspacted Heparin Assooiated Thrombocytopenia”, J.Lab.Clin. Med., 103, 606-612 (1984); D.Sheridan és munkatársai, ”A Diagnostio Test fór Heparin Induoed Ihrcrabocytopenia, Blood, 67, 27-30 (1986)] .

A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a hirudin peptidet tartalmazó készítményeket fel lehet használni a trombociták eltarthatósági idejének a növelésére. Ezekben a készítményekben a peptid végső koncentrációja közelítőleg 0,5 /ug/ml és 1000 /ug/ml között van, előnyösebben közelítőleg 5 /ug/ml és 100 /ug/nil között. Egy másik megvalósítás szerint a PEG₁ vagy a teofillin végső koncentrációja a tárolt trombooita esetében a jelen találmány szerinti készítményben 1 nM és 10 yuM között van, előnyösen közelítőleg 100 nM és 750 nM közötti a PGE^ esetében, és közelítőleg 10 /uM és 10 nM közötti teofillin esetében.

A jelen találmány jobb megértése céljából megadjuk a következő példákat. Tekintetbe kell venni, hogy ezek a példák csak bemutatási célt szolgálnak, és semmi módon nem korlátozzák a jelen találmány oltalmi körét.

Az alábbiakban leirt peptid szintézisre vonatkozó példák mindegyikében elvégeztük a szintetizált peptidek aminosavanalizisét. A mintákat 6 N sósavban vákuumban 110°C-on 24 órán át kezelve aminosav hidrölizátumokat készítettünk, majd ioncserélő kromatográfiának vetettük alá Beckman System 63OO analizátort alkalmazva.

A szintetikus peptidek tisztaságát rutinszerűen analizáltuk fordított fázisú HPLC-vel. Ha másként nem említjük, a peptid mintákat (20-100 /Ug) Vydac oszlopra vittük fel (0,46 x 25 cm) vagy egy Aquapore RP-300 Cg oszlopra (0,46x3,0 cm) egy Backman Üquid Chromatographic System-at, illetve egy Applied Biosystems 150A Chromatographic System-at alkalmazva. A Vydac oszlopot 0, 1 % trifluor-ecetsavat (továbbiakban TFA) tartalmazó vízzel egyensúlyoztuk ki, és a kifejlesztést O-tól 80 % koncentrációig grandiensen növekvő acetonitril tartalmú azonos TFA tartalmú oldattal végeztük. A gradienst 30 perc alatt képeztük 1,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Az átfolyt oldat abszorpcióját 215 nm-en mértük. Az Aquapore Οθ oszlopot 0,1% TFA tartalmú vizzel egyensúlyoztuk ki, és a kifejlesztést O-tól 70 %-ig gradiensen növekvő koncentrációjú acetonitril tartalmú 0,085 %-os TFA oldattal végeztük. A gradienst 45 perc alatt képeztük, és az átfolyási sebes33 ség 0,5 ml/pero volt. Az átfolyt oldat abszorpcióját

214 nm-nél mértük.

1. példa

Hirudin^2-6h ^^^^49-64 ^szin'^fc6zise

A hirudin^^g^ képlete a következő:

HgN-Asn—Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH.

a hirudin^^^g/j képlete a következő:

Hg N-Glu-S er-Hi s-As n-As n-Gly - As ρ-Phe -Glu-Glu-I le-Pr o-G lu-G lu-Tyr-Leu-COOH. Ezeket a peptideket szilárd fázisú peptid szintézissel egy egyszeri szintézis részeként állítottuk elő Applíed Bíosystems 43θ A Peptide Synthetizer (Applied Biosystems, Foster City, CA.) segítségével.

Részletezve, 0,259 miIliekvivalens Boc-Leu-O-gyantát ( 1 % divinil-benzol (DVB) tartalmú gyanta) reagáltattunk egymást követően 2 mmólnyi mennyiségű védett atninosavalckal. A szintézis 11. ciklusát követően 0,42 g nedves gyantát elkülönítünk a reakclóelegyből. A nedves gyantának a maradék 0,43 g-os részét kétszer reagáltatjük 2 mmólnyi védett aminosav mennyiségekkel négy cikluson keresztül. Az igy szintetizált hirudin,-és hirudin^p_^^ védőcsoportjait teljesen eltávolítjuk, és a gyantáról vízmentes HF: p-krezol: :etil-metil-szulfát (10:1:1 térf.) elegyével kezelve hasítjuk le, A hozam 56 %, illetve 53 % a hirudin^p,.^, illetve a hirudin^gZj. esetében.

A peptidek külön-külön elvégzett HPLC analízise nagyfoka tisztaságo mutat, egyetlen eluoiós csúcsot találtunk 214 nm-nél a hirudin^^-g^ esetében 16, 1 percnél, a hirudin^®^set^^ben pedig 16,3 percnél.

2· példa

Dez(Tyr-Leu)hirudintj3„62 szintézise

A daz(Tyr-Leu)hirudin2^^2 képlete a következő:

HgN—Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Grlu-COOH. A dez(Tyr-Leujliirudin^^-62“^ ^a ^θ^ν9^^ΘΖ° módon állítjuk elő:

Először karboxipeptidáz A-t állítunk elő lényegében az R.P. Ambler által leirt módon P’Enzymatic Hydroliysis with Carboxypeptidase”, Methods Enzymol., 25, part B, 143-154)» Az enzimet (0,1 mg) 1,0 ml ionmentes vízben felszuszpendáljuk 40°C-on, és mikr00entrifugában centrifugáljuk. A felülúszót eldobjuk, és a csapadékhoz 100 yul t%-os nátrium-hídrogén-karbonát oldatot adunk. Ezt követően oseppenként 0, 1 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá, mig a csapadék fel nem oldódik. Ezután a pH-t 8,0-ra állítjuk 0, 1 n sósavoldat cseppenkénti adagolásával. Az enzim koncentrációját 1 mg/ml-re állítjuk 0,1 mólos N-acetil-morfolín-acetát oldat (ρΗ=8,25) hozzáadásával.

l&jd 1,3 mg hirudin^^g^-et, melyet az 1. példában lairt módon állítottunk elő, feloldunk 250 /ul N-etil-morfolin-acetát-oldatban (pH=8,25), amely 1,0M nátrium-kloridot tartalmaz.

ben leírt módon előállított karboxipeptidáz A-t adunk hozzá, és 2 órán át 37°θ-οη inkubáljuk.

A peptid fragmentumokat fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk Aquapore RP-300 Cg oszlopot (0,46x3,0 cm) és egy Applied Biosystem 150 A folyadék kromatográfiás rendszert alkalmazva. Az oszlopot 0,1 % TFA-t tartalmazó vízzel egyensúlyozzuk ki, és a kifejlesztést O-tól 35 %-ig gradiensen növekvő koncentrációjú acetonitril és 0,085 % TFA tartalmú oldattal végezzük 45 percen át 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel. Az átfolyt oldat abszorpcióját 214 nm-nél mérjük. A frakciókat manuálisan gyűjtjük, vákuumban megszáritjuk, és analizáljuk aminosav-összetételüket és humán plazma alvadási idejére kifejtett hatásukat. Megállapítottuk, hogy a dezCTyr-LauJhirudin^^,,^ ^a visszamaradó változatlan hirudin^,,^ előtt eluálódik.

3. példa

HgN-Glu—Glu—Ile—Phe-Glu—Glu—Tyr-Leu—COOH. A hirudin₅₇__6Zí szintézisét az 1. példában leírtak szerint végeztük, kivéve azt, hogy 0,55 mmól Boc-Leu-OCHg-PAM gyantát (1 % DVB) (Applied Biosystems) alkalmazunk a Boc-Lau-0—gyanta ( 1 % DVB) helyett. Ezután 2 ramólnyi védett aminosav mennyiségeket adunk hozzá minden kapcsolási ciklus esetében. A nyers peptid kitermelése 17,9 %.A HPLC analízis szerint egyetlen fó csúcs eluálódik 14,2 percnél a grandiensben.

4« példa

A hirudin^^^ szintézise

A hirudin^^^g^ képlete a következő:

Hg N-Thr-Pr o—As n—Pr o-Glu-S er—Ili s-As n-As η-Gly -Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH, A hirudin^ tj^g^-et 0,259 miIliekvivalens Boc-Leu-O-gyanta ( 1 % DVB) felhasználásával szintetizáljuk. Az 1. példában megadott eljárást követjük, kivéve, hogy 2 mmólnyi védett aminosav mennyiségeket használunk minden kapcsolási lépésben a szintézis első 13» ciklusában. A szintézis további 6. ciklusában kétszer 2 mmólnyi védett aminosav mennyiségeket alkalmazunk. A peptidről a védöcsoportokát teljesen eltávolítjuk, és a DVB gyantáról vízmentes HF : p-krezol : eti1-meti1-szulfát (10:1:1 térf.) eleggyel kezelve hasítjuk le. A gyantát 30 $-os ecetsavval extrahálva közelítőleg 100 mg peptidet nyerünk vissza. A hirudin^_m^ kitermelése: 17 $>·

A HPLG analízis szerint a termék magas tisztasági fokú (>90 ¢) és egyetlen fő, 214 nm-nél abszorbeáló anyagot tartalmaz 14,4 perces eluciós idővel az acetonitril gradiensben.

5. példa

A hirudin^..^ szintézise

A hirudin^^g^ képlete a következő:

- 37 HgN'-Asp-Plie-Glu-Glu-Ile-Pr o-Glu-Glu-Tyr-Leu-C OOH. A hirudin^^-g^*⁰^ ^az *· példában leirt eljárással állitjuk elő 0,0259 miIliekvivalens Boc-Leu-O-gyantát (1 % DVB) alkalmazva. Ezután 2 mmólnyi védett aminosav mennyiségeket adunk a növekvő peptidhez a kapcsolás minden egyes ciklusában, A védőcsoportok eltávolítása és a gyantáról történő lehasitása az előbbi példák szerint történik, A peptid kitermelése: 30

A HPLC analízis szerint a minta nagymértékben tiszta ( >95 %) és egyetlen, az aoetonitril gradiensben 16,1 percnél eluálódó csúcsot tartalmaz.

6.példa szintézise

A hirudin_6W5 képlete a következő:

HgN-Leu-Tyr-Glu-Glu-Pro-Ile-Glu-Glu-Phe-Asp—Gly-Asn-Asn*·

-Hls-Ser-Glu-Pro-Asn-Pro-'Ihr-COOH. A hiruding^^^-t az 1. példában leirt módon szintetizáljuk, kivéve, hogy 0,259 mi Ili ekvivalens Boc-O-benzil-L-'Ihr-O-gyantát ( 1 % DVB) al kalmazunk a Boc-Leu-O-gyanta (1 % DVB) helyett. Minden egyes kapcsolási lépésben 2 mmólnyi aminosav mennyiségeket használunk a szintézis első hat lépésében. A szintézis további lépéseiben kétszer 2 mmólnyi védett aminosav mennyiségeket alkalmazunk. A pepiidről a védőcsoportokat teljesen eltávolítjuk, és a DVB gyantáról vizmentes HF kezeléssel hasítjuk le. A 30 ^-os ecetsavas extrakció után 120 mg peptidet nyerünk, és a hirudin^^^ kitermelésé: 19,9 $·

A HPLC analízis szerint a peptid tisztasága a készítményben nagyfokú ( >9θ %), és egyetlen fő csúcsot tartalmaz, amely 13,7 percnél eluálódlk az acetonitril gradiensben.

Az antikoaguláns aktivitás mérésekben kontrollként hirudin^^^-t alkalmaztunk a különböző hirudin peptidek esetében (2. ábra).

7. példa

A hirudin^^.g^ szintézise

A hirudin^^_g^ képlete a következő: HgN-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH. A hirudin-g^-at ^aZ leírtakkal azonos eljárással szintetizáljuk, A szintézis minden egyes kapcsolási ciklusában 2 mmólnyi védett aminosav mennyiségeket alkalmazunk. A szintézis után a pepiidről a védőcsoportokat teljesen eltávolítjük, lehasitjuk a DVB gyantáról az előbbi példákban leírtak szerint.

A HPLC analízis szerint a termék tisztasága nagyfokú (yóO %) és egyetlen 214 nm-nél abszorbeáló csúcsot mutatott. ♦

8. példa

A hirudin peptidek további tisztítása HPLC-vei

Az aktivitás vizsgálata céljából a fentiekben

módon előállított

hirudin^2-64 P®Ptideket homogenitásig tisztítjuk fordított fázisú HPLC-vei egy Vaters Assooiates (Milford, Ma.) folya dék kromatográfiás rendszerben. A nyers peptid mintákat (a hirudin^bői és a hirudin^^^g^-ből 25-25 mg-ot, a hirudin^ 3^^-bői 30 mg-ot) feloldunk 2,0 ni 0,1 % TFA-t tartalmazó vízben. A nyers hirudin^^g^ és hirudin^^-g^ mintákhoz még 1,0 ml 6 mólos guanidinium-kloridot adunk az oldékonyság növelése céljából. A mintákat külön-külön injektáljuk egy Vydao oszlopra (22 mm x 25 cm), amelyet előzőleg 0,1% TFA tartalmú vízzel kiegyensúlyoztunk. A kromatogramm kifejlesztését O-tól 80 %-os konoentrációig li neáris gradiensen növekvő aoetonitril és a fentiekkel azonos TFA tartalmú oldattal 45 percen át végezzük 4,0 ml/perc átfolyási sebességgel. Az átfolyt lé abszorpcióját 229 nm-nél mérjük és a frakciókat manuálisan gyűjtjük.

Más hirudin peptidek is hasonló módon állíthatók elő, és tisztithatók.

9. példa

Az N-acetil-hirudin^^.g^ szintézise

A hirudin peptidek N-acetilezését közvetlenül a peptid szintézise során végezzük el. Például az N-acetil-hirudin^^g/j-et az 1. példában a hirudin^^-g^ szintézisére megadott alapeljárás szerint szintetizáljuk. Az N-acetilezés • · céljából azonban az eljárást úgy módosítjuk, hogy a peptidszlntézls utolsó lépésében a 2 mmólnyi aszparaglnt 2 mmólnyi N-acetil-aszparaginnel helyettesítjük. Más hirudin peptidek hasonló módon N-acetilezhetők az amino-terminális nem-acetilezett aminosavat az N-acetil formával helyettesítve a peptid szintézis utolsó lépésében.

10, példa

A hirudin peptidek szulfatálása

kémiai módosító eljárását alkalmazva (T.Nakahara és munkatársai, Prepáration of Tyrosine-O— (^S)Sulfated

Choleoystokinin Ootapeptide from a Non-Sulfated Precursor

Peptide” ,Anal,Biochem., 154, 194-199 (1986)1 ,1,5 mg hirudin^^„^-et, amelyet a 9· példa szerint állitottunk elő, oldunk 50 /ul dimetil-f ormamidban, és az oldatot nitrogéngáz

Ν, Ν» -diciklohexi1Ehhez 10 /ul oldatot adtunk, amely 50

25°C-on végbemegy, majd 750 /ul ionmentes vizet adunk az elegyhez, A nem oldódó reakció termékeket ctiLkrocentrifuga készülékben centrifugálással elkülönítjük a további tisztítás előtt, • · • ·· ·» «

peptid tői és reakció téma éktől való elválasztás céljából tovább tisztítjuk fordított fázisú HPLC-vel Vydac Ο^θ oszlopon (4,6x25 cm) és egy Applied Bíosystems, Inc. folyadék kromatográfiás rendszerben. Az oszlopot 0,1 % TFA tartalmú vízzel egyensúlyozzuk ki, és a kromatogrammot 0,085 % TFA tartalmú vizben lévő O-tól 35 $-ig lineáris grandiensen növekvő koncentrációjú acetonitrillái fejlesztjük ki 90 perc alatt, a folyadékáramlás sebessége 0,8 ml/pero. Frakciókat gyűjtünk, azokat gyors-vákuum szárítóban megszáritjuk, és ionmentes vizben ismét feloldjuk. Amint az 1. ábrában látható, számos 214 nm-en abszorbeáló anyagot különítettünk el.

Az egyes csúcsokat tartalmazó frakciók antikoa— guláns aktivitását analizálva két potenciálisan hatásos szulfo-Tyr^^hirudin^2«^4 ^^artalmu csúcsot azonosítottunk (A és B csúcsok, 1. ábra). Az A csúcsban lévő anyag ultraibolya spektrumát semleges pH-η megvizsgáltuk, és a maximális abszorpciót 258-264 nm-nél találtuk, amely a módosított tirozin csoport jelenlétére utal. Az A csúcsban lévő peptid aminosavanalizise megerősítette a hirudin^^-64 szerkezetet. Az adatok az mutatták, hogy az A csúcs szulfo— -Tyr^hirudin-^g^-et tartalmaz.

A szulfo-Tyr^^hirudin^^-g^ jelenlétét úgy is megerősítettük, hogy az A csúcsban lévő peptidet 30 %-os TFA-val 60^oC-on 1 órán át kezelve eltávolitottuk a szül• ««· 9·' • » · ·

9« ·Ι* ··♦

-42fáto-csoportról. Ezután raegszáritóttűk a pepiidet, ismét feloldottuk vizben, és fordított fázisú HPLC-vel vizsgáltuk· A szulfátmentesitett szulfo-Tyr^^hirudin^o_g^ HPLC analízisét Aquapore RP-300 Cg oszlopon (0,46 x 3,0 cm) és egy Applied Biosystems 15 OA HPLC rendszerben végeztük. Az oszlopot 0,1% TFA-t tartalmazó vízzel egyensúlyoztuk ki, és a kromatogrammot O-tól 70 %-ig gradiensen növekvő koncentrációjú acetonitril tartalmú 0,085 %-os TFA vizes oldattal fejlesztettük ki 45 percen, át 0,5 ml/pero átfolyási sebességgel. A peptid a nem szulf a iáit hirudin^^^-gy el azonos HPLC kromatogrammot adott. Ezenkívül a kezelt peptid abszorpciós maximuma ismét 275-280 nm-re tolódott el, amely jellemző a nem módosított tirozin csoportot tartalmazó pepiidre.

Ezután a fent leirt szulfatálási reakciót nagyobb mennyiségű megfelelő N-acetilezett pepiiddel végeztük el. A 9, példában leírtak szerint készített, 25 mg N-acetil-hirudin-Nakahara eljárása szerint kezelve 80,1 %-os hozammal előállítottuk a kívánt Tyr-szulfatált terméket. Azonban a reakció méretét arányosan 50 mg N-acetil-hirudin-o-g^“re növelve csak 48,5 % hozammal tudtunk Tyr-szulfatált származékot előállítani.

Ennek megfelelően jelentősen megváltoztattűk a Nakahara-féle eljárás kémiáját abból a célból, hogy a Tyr-szulfatált származékot nagyobb méretű szulfatálási

- 43 reakcióban magas hozammal állítsuk elő. Részletezve, 1 g N-acetil-hiruding^g^-et oldunk 40 ml dimetil-formamidban 5,0 ml N,N’-dioiklohexil-karbodiimid jelenlétében (0,2 g/ /0, 16 ml dimetil-formamid). Az elegyet 0°C-on kevertetjük, és 0,5 ml koncentrált kénsavat adunk hozzá cseppanként mindaddig, mig csapadék képződik. 5 perc múlva a reakciót 40 ml Viz hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegy fordított fázisú HPLC elválasztása a szulfatált peptid, a szulfo-Tyr^^-N-acetil-hirudin^^-g^ 81,7 ^*os hozamát mutatta.

A szulfatált hirudin peptid nagyobb léptékű, tisztítást egy-lépéses anioncserélő kromatografálássál végezzük el. Pontosabban, a nyers szulfo-Tyr^-N-acetil-hirudin,^..^ —et egy DEAE-Sepharose oszlopon tisztítjuk (250 ml nedves gyanta/5 g nyers peptid)· Az oszlopot előzetesen kiegyensulyzzuk és a mintát 20 mmólos nátriumaoetát oldatban (pH= 5,0) visszük fel. A kromatogrammot lineáris nátrium«

-klorid grandienssel (0-0,4 mól) fejlesztjük ki. A szulfo-Tyrgy’N-acetil-hirudinso-g^-et közelítőleg 0,2-0,3 mólos nátrium-klorid-oldat eluálja a nem-szulfatált peptid után, de a szulfonált melléktermék szulfo-iyr^yN-acetil-hirudilij-előtt.

Más hirudin peptidek a fent leírtak szerint szulf a tálhatók, tisztíthatok és analizálhatók.

11, példa

A hirudin paptidek szulfonálása

Az N-acetil-hirudin^^g^-et Tyr-szulfonált származékká módosítottuk, azaz szulfonil-Tyr^y-N-acetil-hírudin^^^^-et állítottunk elő a szulfo-Tyr^j-N-acéti1-hirudin^^g^ előállítása közben, amint azt a 10, példában leírtuk. A szulf onil-TyrgyN-aoetil-b.irudlnij^g^-et a példában leírt nagyobb léptékű szulfatálás melléktermékeként állítottuk elő, Ennek megfelelően a szulfonil-Tyr^^-N-acetil-hirudin^^g^^-9^ 30-40 ^-os hozammal nyertük, és a fordított fázisú IíPLC elválasztásnál a szulfo-Tyrg^hirudin^^__^^ előtt elváltuk, A hirudin^ ^g^-et hasonlóan módosítottuk annak Tyr-szulfonált származékává. Más hirudin. paptidek szintén szulfonálhatók hasonló eljárással.

12. példa

A szulfo-Tyrgjhirudin^polietilénglikol konjugátúrnának előállítása

Egy hirudin pepiidet kapcsolunk agy gyógyásza ti lag alkalmazható polimerhez a peptid felezési idejének a növelése céljából. Részletezve, a polietilénglikol egy származékát, a polietilénglikol-N-szukoinimidil-szukcinátot (továbbiakban SS-PEG) szokásos módszerekkel állítjuk elő (Abuchoiíski és munkatársai, Cancer Biochem, Blophys. 7, 175-186 (1984)1 , Ezután 100 /ug szulf o-Tyr^jhimadin^^g^·⁹*, amelyet a 10, példa szerint állítottunk elő, 200 /ul 20 mmólos nátrium-borátbán (pH=9,0) oldunk, és azt 50-szeres moláris feleslegben lévő SS—PEG—gél reagáltatjuk. A reak— oióelegyet szobahőmérsékleten éjjelen át állni hagyjuk, és ezután fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk, és jellemez zük.

A fordított fázisú HPLC-t Aquapore RP-300 ϋθ oszt lopon (0,46 x 3,0 om) végezzük egy Applied Biosystems 150A kromatográfiás rendszert alkalmazva. Az oszlopot 0, 1 % TFA-t tartalmazó vízzel egyensúlyozzuk ki, és a kromatogrammot O-tól 50 $-ig gradiensen növekvő koncentrációjú acetonitril tartalmú 0,085 % TFA vizes oldattal fejlesztjük ki 45 percen keresztül, az átfolyási sebesség 0,5 ml/perc. Az átfolyt oldat abszorpcióját 214 nm-nél mérjük. Megfigyeltük, hogy a szulfo-Tyrgjhirudin^2«6^ SS-PEG származéka korábban eluálódik, mint a nem-dárivátizált forma és egy szélesebb csúcsban található. Az eredeti és a származék szulf o-Tyr^hirudin^^gj^ antikoaguláns aktivitását összehasonlítva, azok APTT (Actívated Partial 'Ihrombolastin Time, aktivált parciális tromboplasztin idő, a továbbiakban APTT) növelő aktivitása azonos módon dózisfüggő. így az SS-PEG-szulfo-Tyr^üiirudin^o^g^ ^a hirudinnak aktiv peptid származéka, amely rendelkezik a várt, a megfelelő, nem-származék pepiiddel összehasonlítva megnövekedett keringési felezési idővel,

13. példa

A hirudin peptidek peptidomimetikus analógjai

A hirudin peptidek, előnyösen a szulf o-iyr^^hi— rudin^ falhasználhatók szemi-peptid vagy, nem-peptid peptidomimatikus analógok előállítására, olyan szintetikus molekulák előállítására, ars lyek antikoaguláns és antitrombooita aktivitással rendelkeznek. A hirudin peptidekhez hasonlóan, ezeket a paptidomimatikus analógokat az jellemzi, hogy gátolják a trombooiták aggragáoióját.

A hirudin paptidek paptidomimatikus analógjait itt ^rihirulogokⁿ-nak nevezzük, és ezeknek a következő kémiai szerkezetük van:

Hirulog-1:

Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ /

Gly Tyr(SO-) \ / ³ Asn-Cys-S-S-Cys-Leu

Hirulog-2:	Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ \ Gly Tyr(SO-) / / 3 Asn-Cys-S-S-(CH2)n-S-S-Cys-Leu
Hirulog-3:	Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ \ Gly Tyr(SO-) / / 3 Asn-Cys-S-CH-(CH-) -CH-S-Cys-Leu 1 n 1 COOH COOH
Hirulog-4:	AsD-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ \ Gly o Tyr(SO_) / H || / 3 Asn-Lys-N-C-(CH,) -C-N-Lys-Leu II 2 n H 0
Hirulog-5:	Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ala / \ 0 Pro 1 1 C=O Glu \ / Leu-(SO3)Tyr-Glu
Hirulog-6:	Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ala-Pro

Glu \ /

Leu-(SO₃)Tyr-Ser

Hirulog-7:

Cys-Gly-Asp-Cys-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO.j )-Leu \ 7 s-(ch₂)₂-s

A hirudin-peptidek szesi-paptid peptidomimetikus analógjait elő lehet állítani az eredeti peptidben lévő hurok, tekeredés vagy helikális konformáció megtartásával. Például, egy hurok szerkezetet lehet képezni a szulfo-

vagy lizil-csoportot kapcsolva. A terminális cisztein csoportot oxidációval kéresztkotésbe hozva állítjuk elő a hirulog-1-et (3A. ábra), alifás ditiollal oxidálva a lilrulog-2-t állítjuk elő (3B. ábra), vagy alifás dihaloacetáttal vagy propionáttal hirulog-3~at állítunk elő (3C. ábra). A terminális lizil-csoportot összekapcsolva számos imidáló szer bármelyikével, igy eltérő hosszúságú vagy dihidroxíszukcinimidil alifás reagensekkel hirulog-4 keletkezik (4A.ábra).

egy tekeredés létrehozása úgy történik, hogy az Ila-7-et klór-alaninnel helyettesitjük, akár a Glu-10 egyidejű Lvagy D-szerinnel való helyettesítésével. A csak klór-alanint tartalmazó peptidomimatikus analógokban a Glu-9 vagy • · ·

- 49 Glu-10-et az Ala-6-hoz egy keton kötéssel kapcsolva a hirulog-5 keletkezik (5A.ábra), a 9-es vagy 10-es helyzetben lévő szerin származékait éterkötéssel lehet kapcsolni, ős igy a hirulog-6 keletkezik (5B. ábra).

A peptidomimetikus analógokban a helikális szerkezetet úgy lehet megtartani, hogy a hirudin pepiidben az (n) és az (n+3) helyeken lévő ciszteinil csoportokat szubsztituáljuk, és akár közvetlen oxidációval alifás ditiollal oxidálva, vagy alifás dihalo-acetáttal alkilálva összekapcsoljuk. Például ha a szulf o-Tyr^^hirudin^^g^ Asn-1-ét és Phe-4~ét ciszteinekkel helyettesit; jük, és etánditiollal oxidáljuk (6. ábra), a származékban az NHg-terminálison megmarad a helikális tekeredés és a peptid származékban a stabil helikális szerkezet marad· Ezt példázza a hirulog-7· «

Teljesen nem-peptid peptidomimetikus analógokat lehet előállítani figyelembe véve a fenti peptid vegyületek megtartására irányuló stratégiákat,

14, példa

Trombocitákban gazdag és trombocitákban szegény plazma készítése

Trombocitákban gazdag és trombocitákban szegény plazmát készítünk Jakubowski módszerével fJ.A, Jakubowski és N,G, Ardlie, Modification of Humán Piatelet Function by a Diet Enriched in Saturated or Polyunsaturated Eat”, • ·

- 50 Atherosolerosis, 31, 335-344 (1978)3 . Pontosítva, önként jelentkező egészséges emberektől vért gyűjtünk 2 1-es pillangós csővel 3,8 %-os trinátrium-citrát 1/10-ed végső térfogatban, Minden donor a vérvétel előtt legalább két héten át semmi gyógyszert nem kapott. A trombocitákban gazdag plazmát a citrátos teljes vér szobahőmérsékleten történő 15 percen át 100 x g-vel Sorval rotorban végzett centrifu— gálásával nyerjük. A trombocitában szegény plazmát úgy állítjuk elő, hogy a citrátos teljes vért 15 percig 12,000 x g-vel centrifugáljuk·

15. példa

A szulfo-Tyrgjhirudin^^g^ antítrombocíta aktivitása

A hirudin^j_wg^-nek vagy a szulfo-Tyr^hirudin^,.^-nak különböző koncentrációjú trombín által okozott tromboci ta aggregációra gyakorolt hatását analizáltuk. Közelebbről, hirudin^^.g^ vagy szulf o-Tyr^^hirudin^^^ 0,5 ml vízben oldott különböző mennyiségeit 0,4 ml előre felmelegitett (37°θ) a 14, példa szerint előállított trombocitában gazdag plazmához adtuk 0-11 /ug/ml végső koncentrációkig.

A peptid-trombooita elegyet 1 percig 37°C-on tartottuk, ezután 0,05 ml humán a-trombint (Dr, J,Fonton ajándéka; New York Department of Health) adtunk hozzá 0,2, 0,25 vagy 0,5 E/ml végső vizsgálati oldat koncentrációig. Az (X-trombin ezen koncentrációit az in vivő koncentrációval azonos szintűnek tekintettük és olyannak, amely lehetővé teszi a trojnbocita aggregáció tanulmányozását plazmában az alvadók képződés nagyobb zavaró hatása nélkül,

A trombooita aggregáció mértékét tubidimetriásan követtük 4 percen át Biodate 4“Channel Platelet Aggregation Profiler (PAP-4; Biodata Corp, Hatboro, Pennsylvania) segitségével, A trombooita aggregációt jéghideg indometacin 10 /uM végkoncentrációig való hozzáadásával állítottuk le. Az első 4 percben észlelt maximális trombooita aggregációt grafikusan ábrázoltuk a vizsgálati elegyben lévő hirudin^^ők ^va27 szulfo-Tyr^^hirudin-^-g^ koncentrációval szemben.

A 7. ábra a szulfo-iyr^^hirudin^^g^-nek a 0,25 és 0,5 E/ml «-trombin által indukált trombooita aggregációra kifejtett hatását mutatja be. Amint az ábrán látható, a szulfo-iyr^j*-hirudin^_nwg^ dózistól függő mértékben gátolja a trombinnak a humán trombocitákat aggregáló képességét. A 7. ábra azt is mutatja, hogy ha a trombooita aggregációt magasabb koncentrációjú trombin indukálja, megfelelően magasabb koncentrációjú szulfo-iyrg^hirudin^,,,^ szükséges az aggregációs válaszreakció gátlására. Az Ιϋ^θ ^sna-^s^“ mális trombooita aggregáció 5θ Tra való csökkentéséhez szükséges szulfo-Tyr^ ^hirudin^^g^ koncentráció) 0,25 E/ml a-trombin esetében 0,72 /ug/ml és 0,5 E/ml a-trombin esetében pedig 2,2 /ug/ml. A 8. ábra mutatja, hogy a hirudin^^-^^ szintén dózistól függő mértékben gátolja a trombin által

tivitásra szerotonin felszabadulás és tromboxán Ag képződés vizsgálatával is. A szerotonin felszabadulás vizsgálatát a következők szerint végeztük: Közelítőleg 20 ml trombooitában gazdag plazmához, amelyet a 14. példában leírtak sze rint készítettünk, ^C-szerotonint adtunk a plazmát 27 nCi/ml 5-(2-^C)szerotonin-binoxaláttal (60 mCi/nimől;

DuPont-New England Nuolear, Boston, Massachusetts) 30 percig 37°θ*·οη inkubálva. Ilyen körülmények között a trombooi— tákba a hozzáadott szerotonin 90,1 + 1,3 (középérték + SD, n = 6) beépül, így a trombooitában gazdag plazmának közelítőleg 10 000 beütés/perc/ml specifikus aktivitása érhető el.

A

mazó 0,4 ml trombooitákban gazdag plazmát aggregométerbe vittük, és különböző koncentrációjú (0-11 teljes

hozzá, amely 0,05 ml sóoldatban volt. 1 percen át 37°C-on összekevertük. Ezután 0,05 ml humán cc-trombint adtunk hozzá 0,25 vagy 0,5 E/ml végső vizsgálati oldat térfogatra számítva, és 37°C-on még 4 percig inkubáltuk. A trombin által indukált szerotonin felszabadulást leállítottuk, és a trom* ·« «·· bociták általi újra falvételt megállapítottuk jéghideg olyan elegy 1/10 rész térfogatának a hozzáadásával, amely 3,3 % EDTA-t, 10 mM teofillint, 1 yug/ml prosztaglandin E^-et és 500 yuM imipramint tartalmazott (az oldatot a továbbiakban EPTI-Vel jelöljük). Az első három komponenst általánosan használják a trombocita felszabadulási reakció megelőzésére fJ.A. JakubOTíski és N.G. Ardlie, Further Observations on the Effeots of Dietary Fatty Acid

Composition on Piatelet Reactivíty and Blood Coagulation in Mán and the Influence of Methodology on Findings, Atherosclerosis, 41« 285-294 (1982)] , Az imipramin egy szerotonin receptorként hatóanyag, amely megelőzi az újra felvételt a minta kezelése során. Megállapítottuk, hogy az EPTI a szerotonin felvételt és felszabadulást 95 /a-ban gátolja.

Az ΕΡΊΊ-nek a trombocita mintához való adását követően a trombocitákat 12 000 x g—vei 2 peroig Sorval rotorral centrifugálva elkülönítettük. A szerotonin felszabadulást a felüluszó ^C-radioak ti vitásának a mérésével határoztuk meg folyadékszointilláoiós méréssel (Tri-Carb 1500; Packard Instruments) · A 9. ábra bemutatja, hogy a szulfo-Tyr^^hirudin^a szerotonin felszabadulást dózistól függő mértékben gátolja, hasonló módon, mint a trombocita aggregáoiót (lásd 7. ábra).

A trombocitákban gazdag plazmában lévő tromboci- 54 iákat trombinnal stimuláltuk növekvő koncentrációjú szulfo-Tyrg^hirudin^^.g^ jelenlétében (0-11 /ug/ml). A vizsgálatot a fent leírtak szerint végeztük. Részletezve, 0,5 ml sóoldatban lévő különböző koncentrációjú szulfo-Tyr^jhirudins^-g^-et adtunk 0,4 ml trombocitákban gazdag plazmához, és az elegyet 1 percig 37°C-on inkubáltuk. Ezután 0,05 ml sóoldatban lévő α-trombint adtunk hozzá 0,25 vagy 0,5 E/ml végső koncentrációig, és az elegyet további 4 percig inkubáltuk 37°C-on. A trombociták tromboxán A^ képzését jéghideg indometacin oldatnak 10 yuM koncentrációig való hozzáadásával állítottuk le, majd 12 000 x g-vel 2 percig centrifugáltuk. A felüluszó plazmát -20°C-on tároltuk a tromboxán Ag tartalom vizsgálata előtt. A tromboxán Ag-t radioimmunvizsgálattal mértük, amely a tromboxán B^-t detektálja, amely egy stabil hidrolitikus termék és a tromboxán A^ jelenlétének a jelzője [J.A. Jakubonski és munkatársai, Cumulative Antiplatelet Effeot of Lotí-Dose Enteric Coated Aspirin”, Br. J. Haematol., 60, 635-642, (1985)1 .

A 10, ábra szerint a szulfo-Tyr^^hi^udin^^-g^ dózistól függő mértékben gátolja a trombocitákban a tromboxán A^ képződést, hasonló módon, mint azt az előbbiekben a trombooita aggregáoiós és a szerotonin felszabadulás esetében megfigyeltük. A szulf onxl-Tyr^^hirudin^,.^ trombooita gátló aktivitása párhuzamos a szulfo-Tyr^^hirudin^^-g^ aktivi tásával.

« · « ««« »·· ν· « · « · * · · ··« ··· »«

- 55 16, példa

A szulfo-Tyr^^hirudin^^-6A a heparinnal indukált trombooitopéniás vérre

Különböző in vitro vizsgálatokat végeztünk annak bizonyítására, hogy a szulfo-Tyr^^himidin^^-őí; hatásos a haparin okozta trombooitopéniában szenvedő betegek kezelésére.

Az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott trombocitákban gazdag plazmát a betegekből nyertük a heparin kezelés leállítása és a heparin. okozta trombocitopéniából való felgyógyulás után.

A különböző betegkből levett és a 14. példa szerint elkészített trombooitákban gazdag plazmát különböző koncentrációjú sertéstüdőből előállított heparinnal (0,05-0,5 E/ml; Elkins-Sinn, Cherry Hill, New Yersey) vagy szulfo-Tyrg^hirudin^^g^-gyel (°»S-55 /ug/ml) inkubáltuk. Á trombocita aggregációt turbidimetriásan követtük a 15. példában leirt módon, A 11. ábra a heparin által indukált trombocita aggregációt mutatja be a betegek esetében, miután azok teljesen felépültek a heparin okozta trombocitopéniából, A szulfo-Tyrgjhixoidin^2«6^ az egész koncentrációtartományban nem okozott aggregációt.

Ezután meghatároztuk a tromboxán Ag képződésének a mértékét hasonló trombooiták esetében, amelyeket heparinnal vagy szulf o-Tyr^hirudin^^g^-gyel inku bál tünk.

• · · · ·«· ··· *« • « · · · » ·· ··· ··« ·4

A heparin által okozott trombocitopéniábÓl felgyógyult betegekből nyert trombocitákban gazdag plazmát heparinnal vagy szulf o~ Tyr ^hirudin^ gyei (1,7-55 yug/ml) inkubáltunk. A tromboxán Ag képződést indometacin hozzáadásával leállítottuk, majd azfe legyet centrifugáltuk, és meghatároztuk a tromboxán Bg mennyiségét a 15. példában leírtak szerint. Az alábbiakban közölt adatok megerősítik, hogy a heparin trombocita aggregációt és felszabadulást okoz hepárin által kiváltott trombooltopéniában szenvedő betegekben, míg a szulfo-Tyrg^hirudin^2_g^-nek ilyen hatása nincsen. Hatóanyag Tromboxán Ag o

(ng/10 trombocita) heparin (0,05 E/ml)3ó heparin (0,5 E/ml)123 szulf o-Tyr^ jhirudi n^ ^-64 (1,7 /ug/ml)< 1 szulf o-Tyr^ yiirudi n^ ^-64 (7 /ug/ml)< 1 s zu If o-iy r g jhirudi n^ 2-g/j (55 /ug/ml)< 1

Ezután megállapítottuk, hogy a heparin és a szulf o-Tyr^^hirudin^^g^ fenti kísérletekben alkalmazott koncentrációi elegendőek voltak az aktivált parciális trombin idő(APTT) növelésére. Teljes vért nyertünk olyan betegekből, akik felgyógyultak a heparinnal előidézett trowbocitopéniából. Ezután a vért 4°C-on 15 percig

2000 x g-vel Sorval rotorban lecentrifugáltuk plazma nyerése céljából. Ezután 0,05 ml heparint vagy szulfo-Tyrgj57

perccél 0,1 ml 0,3 mólos kalcium-klorid-oldattal való aktiválás előtt, majd 100 trombooita faktor 3 reagenst (Generál Díagnostios Organon Teknika, Durham, North Carollna) adtunk hozzá. Az APTT-t félautornatikusan mértük Coagamate XC (Generál Diagnostics Organon Teknika) segitségével. A 12. ábra bizonyítja, hogy a trombooita vizsgálatoknál alkalmazott heparin és szulf o-Tyr^^hirudin^^g^ koncentrációk elegendőek voltak az APTT meghosszabífására a kívánt terápiás mértékig.

Ezen vizsgálatok azt mutatják, hogy a heparinnal előidézett trombocitopéniában szenvedő betegek trombocifákban gazdag plazmájában az antikoaguláns hatás eléréséhez szükséges heparin adagok trombooita aktiválódáshoz vezetnek, amely a trombózis megnövekedett veszélyét jelenti. Ezzel éles ellentétben mi meglepő és nem várt módon azt bizonyítottuk, hogy a hirudin peptidek, előnyösen a szulfo-

anélkül, hogy az ebben az autoimmun betegségben szenvedő betegekben trombooita aktiválódást idéznének elő. Ezért heparin által előidézett trombocitopéniában szenvedő betegekben a hirudin peptidek és az azokat tartalmazó készítmények egy biztos és hatásos alternatívát jelentenek • ·

- 58 a heparinnal, mint antikoagulánssal szemben és olyan hatóanyagokat, amelyek gátolják a trombooita aggregációt.

Bár az előbbiekben a jelen találmány számos megvalósítási módját megadtuk, nyilvánvaló, hogy az alapelgondolásunkat meg lehet változtatni olyan más megvalósítások lehetővé tétele céljából, amelyek a jelen találmány eljárásait és termékeit alkalmazzák.Ezért, tekintetbe kell venni, hogy a jelen találmány tárgykörét az alább közölt igénypontok inkább meghatározzák, mint az ©lŐbbiakben a példákban magadott specifikus megvalósítások.

Claims (25)

1. Gyógyászatilag megfelelő készítmény a tromboclták aggregáclójának a gátlására a tárolt trombociták esetében, azzal jellemezve , hogy az adott összetétel magában foglal egy gyógyászatilag hatásos mennyiségű, az alábbiakból álló csoportból kiválasztott legalább egy peptldet:

(a) peptldek, melyekre lényegében a következő képletnem megfelelő aminosavszekvencia jellemző;

Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-X;

és (b) az (a) peptldek D-retro formái: amelyekben X jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport·

2· Gyógyászatilag megfelelő készítmény tromboctták .aggrégáoi ójának a gátlására a tárolt trombociták esetében, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény magában foglal egy gyógyászatilag hatásos mennyiségű, az alábbiakból álló csoportból kiválasztott legalább egy peptldet;

(a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosavszekvencia jellemző: Y-Phe-Glu-Glu-Tle-Pr o-Glu-Glu-Tyr-Z ;

és (b) az (a) peptldek D-retro formál;

amelyekben X jelentése aminocsoport, amlno—védőcsoport, a Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-Hls-Asn-Asp-Gly-Asp aminosavszekvencia legalább C-terminális része,

6ο és a

Val-Thr—Gly -Glu-Gly-Thr-Pr o-As n-Pr o—Glu- Ser-Hl s-Asn-As n-Gly—Asp aminosavszekvenciá legalább C-terminális része; és Z jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport; és a tirozil-csoport egy negatív töltésű csoportot tartalmaz·

3, A 2, igénypont szerinti készítmény, azzal peptid

4« A 2· igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adott peptid

5· Az 1· vagy 2, igénypontoknak megfelelő készítmény, azzal Jellemezve, hogy még magában foglal fém-kelátképzőkből, prosztaglandlnokból, teofllllnből, kis peptid trombocita inhibitorokból, trórabocita felületi komponensek inhibitoraiból, trombocita felületi komponensekkel szembeni antitestekből, ezek analógjaiból és ezek kombinációiból álló csoportból kiválasztott egy vegyületet·

6, Az 5· igénypontnak megfelelő összetétel, azzal jellemezve, hogy az adott vegyületet a prosztaoiklln ana lógjaiból, prosztaglandin E1-ből, prosztaglandin E1 analógokból, citrát-foszfát-dextrózból és teofllllnből álló csoportból választjuk ki.

7· Az 1· vagy 2, igénypontnak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy az adott peptid gyógyászatilag hatásos mennyisége közelítőleg 0,5 /ug/ml és 1000 /ug/ml között van.

• ·

A 7· igénypontnak megfelelő összetétel, azzal jellemezve, hogy az adott peptid gyógyászatilag hatásos mennyisége közelítőleg ml és 100 ml között van·

9· Módszer a trombociták aggregációjának a gát lására tárolt trombociták esetében, azzal jellemezve, hogy a trombociták tárolása az 1· vagy a 2. igénypontnak megfelelő készítmény jelenlétében történik·

10, Gyógyászatilag megfelelő készítmény a trom- bociták aggregácl ólnak a gátlására betegekben vagy a szerve zeten kívüli vérben, azzal jellemezve, hogy az adott összetétel magában foglalja egy gyógyászatilag hatásos mennyiségét a következőkből álló csoportból választott legalább egy peptldnek:

(a) peptldek, amelyekre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosavszökvenőia jellemző: Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-X;

és (b) az (a) peptldek retro formál, amelyekben X jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport,

11, Gyógyászatilag megfelelő készítmény a trombociták aggregácl ójának a gátlására betegekben vagy a szervezeten kívüli vérben, azzal jellemezve, hogy az adott összetétel magában foglalja egy gyógyászatilag hatásos mennyiségét a következőkből álló csoportból választott lega lább egy pepiidnek:

(a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosavszekvenola jellemző:

Υ-Phe—Glu-Glu“Ile-Pro—Glu-Glu-Tyr-Z;

és (b) az (a) peptidek D-retro formái, amelyekben Y jelentése amlnoosoport, ami no-véd öcs opor t, a következő aminosavszekvenciának legalább a C-terminális régiója:

Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-Hls-Asn-Asp-Gly-Asp; és a következő aminosavszekvenciának legalább a C-termlnális régiója:

Val—Lhr—Gly—Glu-Gly-lhr—Pr o-As n— Pr ο-Glu—Ser-Hls—As n—As n—Gly—Asp ; és Z jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport; és a tlrozil— -csoport egy negatív töltésű csoportot tartalmaz.

12, A 11, igénypontnak megfelelő készítmény, azzal jellemezve/ hogy az adott peptid szulfo-Tyr^^hirudln^’

13, A 11, igénypontnak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy az adott peptid szulfonil-Tyrgjhirudin^^.^·

14, A 10, vagy 11, igénypontoknak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy az magában foglal egy vegyületet az alábbiakból álló csoportból: clklooxiép náz inhibitorok, kis nam-peptid trombocita inhibitorok, prosztaglandinok, teofillln, kis peptid trombocita inhibitorok, hematοροίetikus faktorok, trombocita felületi komponensek inhibitorai, trombocita felületi komponensekkel szembeni antitestek, ezek analógjai és ezek kombinációi.

« «

15, A 14, Igénypontnak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy az adott vegyületet a következőkből álló osoportból választjuk ki: aszpirin, tiklopidin, dlpiridamol és szulf!npírazon, prosztaglandín E1, prosztaglandin E1 analógok, a prosztaoiklin stabil analógjai, a Ilb/nia glikoproteinnel szembeni monoklonálls antitestek, a Ilb/nia glikoprotein természetes inhibitorai, az lb glikoproteinnel szembeni monoklonálls antitestek, az lb glikoprotein természetes inhibitorai, éritropoiétin, Arg-Gly-Asp tartalmú peptidek és Arg-Gly-Asp tartalmú peptidek származékai.

16, A 10, vagy 11, igénypontoknak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid adott gyógyászatilag hatásos mennyiségének a végkoncentrációja az adott betegben közelítőleg 0,1 mg/kg testsúly és 10 mg/kg testsúly közötti értékeket ér el,

17, A 16, igénypontnak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid adott gyógyászatilag hatásos mennyisége 0,2 mg/kg testsúly és 2 mg/kg testsúly körüli értékek között van,

18, Módszer a trombociták aggregácíójának a gátlására betegekben, azzal jellemezve, hogy az adott módszer a beteg 10, vagy 11, igénypontoknak megfelelő készítménnyel gyógyászatilag megfelelő módon való kezeléséből áll,

19, A 18, igénypontnak megfelelő módszer, azzal jellemezve, hogy a kezelés idejekor az adott beteg heparin • · « · • *«« ··« ·« • · t · « ·· ·«* ··» «* által okozott trombooitopéniában szenved vagy szenvedett·

20, A 18, igénypontnak megfelelő módszer, azzal jellemezve, hogy a beteg ember·

2 1, Peptid alkalmazása a trombooiták aggregációjártak a gátlására egy betegben vagy szervezeten kívüli vérben, azzal jellemezve, hogy az adott péptidet a következőkből álló csoportból választjuk ki:

(a) peptidek, melyekre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav^szekvencia jellemző:

As n-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pr o-Glu-Glu-Tyr—X ;

és (b) az (a) peptidek D-retro formái, amelyekben X jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport,

22, Peptid alkalmazása a trombooiták aggregációjártak a gátlására egy betegben vagy szervezeten kívüli vérben, azzal jellemezve, hogy az adott peptídet a következőkből álló csoportból választjuk ki :

(a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosavszekvencia jellemző:

Y-Phe-Glu-Glu-Ile-Pr o-Glu-Glu-Tyr-Z f és (b) az (a) peptidek D-retro formái, amelyekben Y jelentése aminocsoport, amlno-védőcsoport és a következő aminosavszekvenciának legalább a C-termlnális része :

··9 ··«

-65Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-G ln-Sar-His-Asn-Asp-Gly-Asp;

Vagy a következő aminosav szekvenciának legalább a C-terminális része:

Va 1-Thr —Gly-Glu—Gly -Thr-Pro-As n-Pr o—Glu-S er-Hi s—As n-As n—Gly—As p ; és Z jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport; és a tlrozin csoport egy negatív töltésű csoportot tartalmaz·

23, Egy peptid alkalmazása a tromboolták aggregácíójának a gátlására tárolt tromboclták esetében, azzal jellemezve, hogy az adott peptidet a következőkből álló csoportból választjuk ki:

(a) péptidek, melyekre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosavszekvencia jellemző:

Asn-Gly—Asp—Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu—Glu-Tyr-X;

és (b) az (a) paptidek D-retro formái, amelyekben X jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport·

24· Egy peptid alkalmazása a tromboclták aggregácíójának a gátlására tárolt tromboclták esetében, azzal jellemezve, hogy az adott peptidet a következőkből álló csoportból választjuk ki:

(a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő ami no savszekvencia jellemző:

Y-Phe—Glu-Glu—Ile-Pr o—Glu-Glu—Tyr—Z ;

és (b) az (a) peptldek D-retro formál, κ

- 66 amelyekben Υ jelentése aminocsoport, amino-védőcsoport és a következő amínosavszekvenclának legalább Ó-terminális része:

Val-Uir-Gly-Glu-Gly-'nir-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-GlyAsp vagy a következő amínosavszekvenclának legalább a C— -terminális része: Val-Uxr-Gly-Glu-Gly-Ttir-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser—His-Asn-Asn—Gly-Asp; és Z jelentése COOH, Leu és Leu-Gln csoport; és a tirozil* -csoport egy negatív töltésű, csoportot tartalmaz.

25, Az 1, vagy 2, igénypontnak megfelelő összetétel alkalmazása a trombociták aggregációjának a gátlására tárolt trombociták esetében,

26, A 10, vagy 11. igénypontoknak megfelelő összetétel alkalmazása a trombociták aggregációjának a gátlására betegekben és szervezeten kívüli vérben.