FI120690B

FI120690B - Ei-terapeuttisesti käytettäviä trombiini-inhibiittoreita

Info

Publication number: FI120690B
Application number: FI20050027A
Authority: FI
Inventors: John M Maraganore; Jo-Ann M Jablonski; Paul R Bourdon
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1991-02-08
Filing date: 2005-01-11
Publication date: 2010-01-29
Also published as: KR100259759B1; GR3034257T3; NO315710B1; JPH05506252A; NO923889L; EP0529031B9; HU218831B; FI924503A0; CA2079778A1; EP0529031A1; CA2079778C; AU1362192A; HU9203500D0; US5514409A; WO1992013952A1; TW222642B; US5425936A; FI924503A; DK0529031T3; NZ241557A

Description

Ei-terapauttisesti käytettäviä trombiini-mhiblfttoreita Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI924503.

Keksinnön tekninen aihepiiri Tämä keksintö koskee uusia biologisesti aktiivisia molekyylejä, jotka S sitoutuvat trombiiniin ja inhiboivat sitä. Nämä molekyylit käsittävät katalyyttiseen keskukseen kohdistuvan ryhmän (GSDM), jonka kaava on: x-r2 -r3-r„ -r5-r6- y t R, jossa X on vety tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 -100 atomista; R1 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat ei-substituoidut, mo-10 nosubstituoidut, disubstituoidut ja trisubstituoidut tyydyttyneet rengasrakenteet; R2 on sidos tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 - 5 atomista; % on sidos tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 ~ 3 atomista; R4 on jokin aminohappo; R5 on jokin L-amiriohappo, joka käsittää guani-diniumin tai aminon sisältävän sivuketjuryhmäii; Re on ei-amidlsidos; ja Y on 15 sidos tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 - 9 atomista; tai jonka kaava on;

X-^-Rg-R^-Rs-Eg-Y

«·, | jossa R'i valitaan ryhmästä, jonka muodostavat ei-substituoidut, monosubstl- tuoidut, disubstituoidut ja trisubstituoidut rengasrakenteet; R4 on jokin amino-20 happo, joka käsittää sivuketjuryhmän, jolle on tunnusomaista kyky vastaanottaa vetysidos pH:ssa noin 5,5 - 9,5; ja X, R2, Ra, Rs, Re ja Y määritellään kuten edellä. Edullisille trombiini-inhibiittoreille on edelleen tunnusomainen anionin sitovaan eksosiittiln liittyvä alue (ABEAM) ja liitto-osa, jonka pituus on 18 Ä -42 Ä ja joka yhdistää Y:n ABEAM:ään. Tämä keksintö koskee myös koostu-25 muksia, yhdistelmiä ja menetelmiä, joissa käytetään näitä molekyylejä terapeuttisiin, ehkäiseviin ja diagnostisiin tarkoituksiin.

Alan tausta

Akuutit verisuonisairaudet kuten sydäninfarkti, halvauskohtaus, keuhkovaltimon veritulppa, syväsuoniverisuonitukos, ääreisvaltimotukkeuma ja 30 muut verisysteemin verisuonitukokset, ovat merkittäviä vaaroja terveydelle.

Tällaisia sairauksia aiheuttaa verisuonen joko osittainen tai täydellinen tukkeutuminen verihyytymän toimesta, joka sisältää fibriiniä ja verihiutaleita.

2

Trombiini on luonnollisesti esiintyvä proteiini, joka katalysoi fibrino-geenin muuttumista fibriiniksi, joka on viimeinen vaihe verihyytymän muodostuksessa. Sen lisäksi, että trombiini katalysoi fibriinihyytymln muodostusta, se niinikään aktivoi verihiutaleiden aggregaatio- ja vapautumisreaktioita. Tämä 5 merkitsee sitä, että trombiini esittää keskeistä osaa sekä akuutissa verihiuta-ieriippuvaisessa (valtimo-) verisuonitukoksessa (S. R. Hanson ja L A. Harker, "interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenyl-L-Prolyl-L-Arginyichioromethyikeione" (suom. "Akuutin verihiutale-riippuvaisen verisuonitukoksen keskeyttäminen synteettisellä trombiinivastai-10 sella D-fenyyiiaianyyii-L-prolyyli-L-arginyyiikloorimetyyliketonilia"), Proc.Natl. Acad.Sei. USA 85 (1988) 3184 - 3188), että fibriiniriippuvaisessa (laskimo-) verisuonitukoksessa.

Trombiinilia on useita muita biosäätelyroolejä (J. W. Fenton, II, "Thrombin Bioregulatory Functions" (suom. "Trombiinin biosäätelyfunktiot"), 15 Adv.Ciin.Bnzvmol. 6 (1988) 186 - 193). Esimerkiksi trombiini voi suoraan aktivoida tulehdusvasteen stimuloimalla verihiutaleita aktivoivan tekijän (PAF) synteesiä endoieeiisoluissa (S. Prescott et ah, "Human Endothelial Cells in Culture Produce Platelet-Activating Factor {1 -aikyl-2-acetyl-sn-g!ycero-3-phos-phocholine) when Stimulated with Thrombin” (suom. "Ihmisen endoteelisolut 20 tuottavat viljelmässä verihiutaleita aktivoivaa tekijää (1-afkyyli-2-asetyyli-sn-glysero-S-fosfokoliini) trombiinilia stimuloituina"), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81 (1984) 3534 - 3538). PAF on paljaana endoteelisoiujen pinnalla ja toimii ligan-dina neutrofiilien tarttumiselle ja sittemmälie solujyvästen häviämiselle (G.M. Vercolletti et ajL, "Platelet-Activating Factor Primes Neutrophil Responses to 25 Agonists: Role in Promoting Neutrophil-Mediated Endothelial Damage" (suom. "Verihiutaleita aktivoiva tekijä pohjustaa neutrofiiiivasteita agonisieille: rooli neutrofiiliväiitteisen endoteelivauriQn edistämisessä"), Blood 71 (1988) 1100 -1107). Vaihtoehtoisesti trombiini saattaa edistää tulehdusta nostamalla verisuonten läpäisevyyttää, mikä voi johtaa turvotukseen (P.J. Del Vecchio et ah, 30 "Endothelial Monolayer Permeability to Macromolecules" (suom. "Endotee-liyksisolukerroksen läpäisevyys makromolekyyleille"), Fed.Pröe. 46 (1987) 2511 - 2515). Reagenssit, jotka salpaavat trombiinin aktiivisen keskuksen, kuten hirudiini, keskeyttävät verihiutaleiden ja endoteelisoiujen aktivaation (C.L. Knupp, "Effect of Thrombin Inhibitors on Thrombin-Induced Release and 35 Aggregation” (suom. "Trombiini-inhiblittorien vaikutus trombiinin indusoimaan vapautumiseen ja aggregaatioon"), Thrombosis Res. 49 (1988) 23 - 26).

3

Trombiini on niinikään yhdistetty syövän edistämiseen sen natiivin piikkomistuötteen, fibrilnin, kyvyn perusteella toimia kasvainkasvun substraattina (A. Falanga et aL, "Isolation and Characterization of Cancer Proeoagulant: A Cysteine Proteinase from Malignant Tissue" (suom. "Syöpäprokoagulantin 5 eristys ja karakterisointi- kysteiiniproteinaasi pahanlaatuisesta kudoksesta'’), Biochemistry 24 (1985) 5558 - 5567; S.G. Gordon et ai., "Cysteine Proteinase Procoaguiant form Amnion-Chorion" (suom. "Kysteiiniproteinaasiprokoaguiantti vesikaivo-suonikaivosta"), Blood 66 (1985) 1261 - 1265; ja A. Falanga et aL, "A New Procoaguiant in Acute Leukemia" (suom. "Uusi prokoagulantti akuu-10 tissa leukemiassa"), Blood 71 (1988) 870 - 875). Lisäksi trombiini on yhdistetty hermoston rappeutumissairauksiin sen kyvyn nojalla aiheuttaa hermon viejä haa ra kkeen taaksepäin vetäytymistä (D. Gurwitz et ai., "Thrombin Modulates and Reverses Neuroblastoma Neurite Outgrowth" (suom. 'Trombiini moduloi ja kääntää hermosolun varhaismuodoista koostuvan kasvaimen hermon 15 viejähaarakkeiden kasvun"), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 (1988) 3440 -3444). Tämän vuoksi kyvyllä säätää trombiinin aktiivisuutta jn vivo on monia tärkeitä kliinisiä käyttöyhteyksiä.

Yksi tie akuutin verisuonisairauden menestyksekkääseen hoitoon tai ehkäisyyn on trombiinin inhibointi. Alalla tunnetaan jo monen tyyppisiä trorn-20 biini-inhibiiftoreita. Hepariinia, joka on trombiinin epäsuora inhibiittori, käytetään laajalti laskimoverisuonitukoksen hoitamiseksi. Vaikka hepariini on tehokas fibriinistä riippuvaista hyytymämuodqstusta vastaan, silla on vain vähän tehokkuutta verihiutaleiden trombiini-indusoidun aktivaation inhiboinnissa. Tämän vuoksi tätä lääkettä ei käytetä vaitimoverisuonitukosien hoidossa. Lisäk-25 si hepariini aiheuttaa monia epätoivottavia sivuvaikutuksia, mukaan lukien verenvuoto ja verihiutaleiden niukkuus veressä.

Hirudiini on luonnollisesti esiintyvä polypeptidi, jota tuottaa verta imevä iilimato Hirudo medicinalis. Tämä yhdiste, jota iilimato syntetisoi sylkirauhasessa, on tehokkain tunnettu koagulaation luonnollinen inhibiittori. Hi-30 rudiini estää veren koaguloitumisen sitoutumalla tiukasti trombiiniin (Kd = 2 x 10'11M) stoikiometnseksi 1:1-kompleksiksi (S.R. Stone ja J. Hofsieenge, "Kinetics of the Inhibition of Thrombin by Hirudin" (suom. "Trombiinin inhibition hiru-diinilla kinetiikka"), Biochemistry 25 (1986) 4622 - 4628), Tämä puolestaan estää trombiinia katalysoimasta fibrinogeenin muuttumista fibriiniksi (hyytymäksi) 35 sekä inhiboi kaikkia muita trombiiniväiitteisiä prosesseja (J. W. Fenton, il, "Regulation of Thrombin Generation and Functions" (suom. Trombiinimuo- 4 dostuksen ja -funktioiden säätely"), Semin. Thromb. Hernost. 14 (1988) 234 -240).

Hirudiini inhiboi trombiinia sitoutumalla viimemainittuun kahdessa erillisessä keskuksessa. Aluksi hirudiinin C-pää on vuorovaikutuksessa s "anionia sitovan eksosiitin" (ABE) kanssa trombiinissa (J.W. Fenton, II, et aL, "Thrombin Anion Binding Exosite interactions with Heparin and Various Po~ iyanions" (suom. Trombiinin anionia sitovan eksosiitin vuorovaikutukset hepa-riinin ja erilaisten poiyanionien kanssa"), Ann.New York Acad.Sd. 556 (1989) 158 - 165). Tämän sitoutumisen, jonka affiniteetti on alhainen, jälkeen hirudii-10 ni-trombiinikompieksissa tapahtuu konformaatiomuutos ja hirudiinin amino-pääosa kykenee sitoutumaan trombiinin katalyyttiseen keskukseen (S. Kono et aL, "Analysis of Secondary Structure of Hirudin and the Conformational Change Upon Interaction with Thrombin" (suom. "Hirudiinin sekundaariraken-teen analyysi sekä konformaatiomuutos vuorovaikutuksessa trombiinin kans-15 sa"), Arch.Biochem.Biophvs. 267 (1988) 158 -166),

Hirudiinin eristys, puhdistus ja aminohapposekvenssi tunnetaan alalia (P, Walsmann ja. F, Markwardt, "Biochemical and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibitor Hirudin" (suom. "Trombiinl-inhibiittorin hirudiini biokemiallisia ja farmakologisia näkökohtia"), Pharmazie 36 (1981) 653 -20 660; J. Dodt et aL, "The Complete Covalent Structure of Hirudin: Localization of the Disulfide Bonds'* (suom. "Hirudiinin täydellinen kovaienttinen rakenne: i disuifidisidosten sijainti"), BioLChem.Hoppe-Sevler 366 (1985) 379 - 385; S.J.T. Mao et aL, "Rapid Purification and Revised Amino Terminal Sequence of Hirudin; A Specific Thrombin inhibitor of the Blood Sucking Leech" (suom, 25 "Hirudiinin nopea puhdistus sekä tarkastettu aminopääsekvenssi: spesifinen trombiini-inhibiittori verHilimadosta"), AnaLBiochem. 161 (1987) 514 - 518; ja R.P. Harvey et aL, "Cloning and Expression of a cDNA Coding for the Anticoagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech. Hirudo medicinalis" (suom.

"cDNAm kloonaus ja ilmentäminen, joka koodittaa koagulaatiota vastustavaa 30 hirudiinia veri-iiiimadosta, Hirudo medicinaiiksesta"). Proc.Natl.Acad.ScL USA 83(1986) 1084-1088).

Eläinkokeissa iilimadoista puhdistettu hirudiini on osoittanut tehokkuutta iaskimoverisuonitukosten, verisuonten oikovirtauskanavien tukkeuman sekä trombiini-indusoidun laajalle alueelle levinneen verisuonten sisäisen 35 koagulaation estossa. Lisäksi hirudiinin myrkyllisyys on alhainen ja sen pois-tumisaika verenkierrosta on hyvin lyhyt (F. Markwardt et aL, "Pharmacological 5 5

Studies on the Antithrombotic Action of Hirudin in Experimental Animals" (suom. "Farmakologisia tutkimuksia hirudiinin verisuonitukosta vastustavasta vaikutuksesta koe-eläimissä”), Thromb.Haemost· 47 (1982) 226 - 229).

Hirudiini on sittemmin kloonattu ja ilmennetty E. colissa (EP-pa-5 ienttihakemusjulkaisut 158 564, 168 342 ja 171 024) ja hiivassa (EP-patentti-hakemusjulkaisu 200 655). Näistä edistysaskeleista huolimatta hirudiinin tuottaminen on yhä kohtuullisen Railista eikä sitä on laajalti saatavana kaupallisesti.

Vastikään on tehty yrityksiä natiivin hirudiinin peptidifragmenttien tai 10 sen johdannaisten identifioimiseksi, jotka myös ovat tehokkaita hyytymisaiko-jen pidentämisessä. Tällaisia yhdisteitä kuvataan EP-patenttihakemusjulkai-suissa nrot 276 014, 291 982, 333 356, 341 607 sekä 372 670. Näissä patent-tihakemusjulkaisuissa kuvatut molekyylit osoittivat vaihtelevaa tehokkuutta hyytymämuodostuksen inhiboinnissa, mutta olivat kaikki 2 - 4 suuruusluokkaa 15 vähemmän tehokkaita kuin hirudiini. Tällaiset peptidifragmentit eivät siksi voi olia täysin tyydyttäviä veiihyytymien liuottamiseksi meneillään olevissa tera-piaohjeimissa.

Sittemmin on kuvattu yhdisteitä, jotka jäljitteievät hirudiinin vaikutusta sitoutumalla trombiinin sekä anionia sitovaan eksosiittiin että sen katalyytti-20 seen keskukseen (avoinna olevat US-patenttihakemusjuikaisut sarjanrot 395 482 ja 549 388). Nämä yhdisteet osoittavat irombiinia inhiboivaa aktiivisuutta, joka on samankaltaista tai suurempaa kuin natiiviifa hirudiinilla. Ne ovat niinikään pienempiä kuin hirudiini ja sen vuoksi vähemmän antigeenisiä. Näitä inhibiittoreita tuotetaan niinikään synteettisesti, mikä mahdollistaa 25 kaupallisesti käyttökelpoisten määrien tuotannon kohtuullisilla kustannuksilla.

Huolimatta tähän mennessä tapahtuneista kehityksistä on olemassa jatkuva tarve saada vielä tehokkaampia tromblini-inhibiittoreita, joita voidaan tuottaa edullisin kustannuksin sekä kaupallisesti käyttökelpoisina 30 määrinä. Tällaiset inhibiittorit eivät ainoastaan olisi tehokkaita verisuonisairauden hoidossa ja ehkäisyssä, vaan ne saattavat samoin olla terapeuttisesti käyttökelpoisia syövän, hermoston rappeutumissairauksien ja tulehduksen hoidossa.

Yhteenveto keksinnöstä 35 Esillä oleva antaa käyttöön molekyylejä, jotka ovat tehokkaita trombiini-inhibiittoreita. Nämä molekyylit on suunniteltu ja rakennettu trombiini- :| 6

InhrbiittorikompleksIn kolmiulotteisen röntgensädekristailografiarakenteen perusteella, Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön mukaisten inhibiittorien ava-ruuskonfiguraatio on suunniteltu sellaiseksi, että se tarjoaa parhaan istumisen kolmiulotteisiin tiloihin trombiinin katalyyttisessä keskuksessa ja sen ympärillä.

5 Tällöin saadaan tuloksena molekyylejä, joilla on optimaalinen trombiinia inhiboiva aktiivisuus.

Keksintö antaa edelleen käyttöön trombilni-inhibiittoreita, jotka käsittävät lisäksi osan, joka sitoutuu trombiinin anionia sitovaan eksosiittiin. Nämä inhibiittorit jäljittelevät kvalitatiivisesti hirudiinin vaikutusta. Koska nämä mo-10 lekyylit on suunniteltu ja rakennettu optimaalisen avaruuskonfiguraation mukaisiksi, ne ovat tehokkaampia kuin hirudiini.

Tämän keksinnön mukaisia molekyylejä voidaan käyttää koostumuksissa ja menetelmissä minkä tahansa trombiinivalftteisen tai trombiiniiiittei-sen funktion tai prosessin inhiboimiseksi. Näitä molekyylejä voidaan samoin 15 käyttää koostumuksissa ja menetelmissä kuvannukseen ex vivo, ruumiin ulkopuolella olevan veren varastoinnissa sekä käsittelyssä sekä invasiivisten välineiden päällystykseen.

Sen johdosta, että esillä olevan keksinnön mukaisia molekyylejä voidaan valmistaa .kemiallisen, synteesin tekniikoilla, kaupallisesti käyttökel-20 poisia määriä voidaan tuottaa edullisin kustannuksin. Esillä olevan keksinnön mukaisia molekyylejä voidaan samoin käyttää lukuisissa muissa sovellutuksissa tunnettujen trambiini-inhibilttorien, etenkin hepariinin tai hirudiinin, tilalla.

Kuten ymmärrettäneen seuraavasta julkistuksesta, tämän keksinnön mukaiset molekyylit, koostumukset ja menetelmät ovat käyttökelpoisia 25 diagnostisiin tarkoituksiin,

Suppea kuvaus piirroksista

Kuviossa 1 esi tetää n ti ia täyttö malli hiruiogi-8-trombiinikompieksista.

Kuvio 2 on kaaviollinen esitys hirulogi-8;n 1-asemassa olevan D-Phe:n ja 2-asemassa olevan proliinin ja trombiinin katalyyttisen keskuksen 30 viereisen hydrofobisen taskun välisestä vuorovaikutuksesta.

Kuvio 3 esittää hirugeenin, yhdisielmä-DNA-hirudiinin, hlrulogi-8:n ja D-Cha-hirulogin vertailevaa hyytymistä vastustavaa aktiivisuutta.

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä

Seuraavia tavanomaisia lyhenteitä käytetään aminohapoista sekä 35 patenttiselityksessä että patenttivaatimuksissa: 7

Dm - omitiini Gly- giysiini

Ala - alaniini Va! - väliini

Leu - leusiini lie - isoleusiini

Pro - proiiini Phe - fenyylialaniim 5 Trp - tryptofaani Met- rnetioniini

Ser - seriini Thr - treoniini

Cys - kysteiini Tyr - tyrosiini

Asn - asparagiini Gin - glutarniini

Asp- asparagiinihappo Glu - giutamiinihappp 10 Lys - lysiini Arg-arginiini

His - histidiini Nle - norleusiini

Npa - naftyylialaniini Cha - sykloheksyyliaianiini

Hyp - hydroksiproliini TPro - tioproliini

Ac - asetyyii Sue - sukkinyyli 15 BOC - t-butoksikarbonyyli Tos - para-toiueenisuifonyyii

Cbz - karbobentsyyiioksi fnp - isonipekotiinihappo 3,4-dehydroPro - 3,4- Sar-sarkosiini dehyd ropro lii ni (N-metyyligiysiini)

Tyr(OS03H) - tyrosiini-O-suifaatti TyrtSOsH) - 3-suifotyrösiini 20 3,5-dijodiTyr - 3,5~di}odityrosiini ilmaisun '’jokin aminohappo" piiriin kuuluvat tässä käytettynä luonnollisesti esiintyvien aminohappojen L-isomeerit sekä muut "ei-proteiini"-a-aminohapöt, joita tavanomaisesti käyttävät peptidikemian alan ammattilaiset valmistaessaan synteettisiä analogeja luonnollisesti esiintyvistä aminopepti-25 deistä. Luonnollisesti· esiintyvät aminohapot ovat giysiini, alaniini, väliini, leusiini·, isoleusiini, seriini, rnetioniini, treoniini, lenyyliälaniini, tyrosiini, tryptofaani, kysteiini, proiiini, histidiini, asparagiinihappo, asparagiini, glutamjinihap-po, giutamiini, gamma-karboksigiutamitnihappo, arginiini, omitiini ja fysiini. Esimerkkejä "el-proteiinf'-a-aminohapoista ovat norleusiini, norvaliini, afioiso-30 leusiini, homoarginiini, tioproliini, dehydroproliini, hydroksiproliini (Hyp), isonipekotiinihappo (Inp), homoseriini, sykloheksyyiigfysiini (Chg), a-amino-n-voi-happo (Aba), sykloheksyyliaianiini (Cha), aminofenyyiivoihappo (Pba), fenyy-liaianiinit, jotka on substituoitu fenyyiiryhmän ortö-, meta- tai para-asemassa yhdellä tai kahdella seuraavalla: C-M-aikyyli-, Ci-4-alkoksi- halogeeni-ja nitro-35 ryhmät, tai substituoitu metyieenidiöksiryhmällä; β-2- ja β-3-tienyylial-alaniini, β- 2- ja β-3-furanyyliaianiini, β-2, β-3-ja p-4~pyridyy!iaianiini, p~(bentsotienyy!i-2» ja - 8 3-yyli)afaniini, β-(1- ja -2-naftyyli)aianiini, seriinin, treoniinin tai tyrosiinin O-aikyioidut johdannaiset, S-alkyioitu kysterini, S-alkyloitu homokysteiini, tyrosiinin O-sulfaatti-, O-fosfaatti- ja Okarboksyiaattiesterit, 3- ja 5-sulfotyrosiini, 3- ja 5-karboksiiyiOsiini, 3- ja 5-fosfotyrosiini, tyrasiinin 4-metaanisuifönihappoesteri, s tyrosiinin 4-metaanifosfonihappoesteri, 4-fenyylietikkahappo, 3,5-dijodityra-siini, 3“ ja 5-nitrotyrasiini, eeta-aikyyliiysiini, deita-aikyytiDmitiini ja jonkin edeltävän aminohapon D-isomeeri. Ellei spesifisesti toisin ole mainittu, kaikki aminohapot, joihin tässä hakemusjuikaisussa viitataan, ovat L-muodossa.

Yhdisteet, joita tässä kutsutaan tytosiini-O-suifaatiksi, Tyr(OSQ3H):ksi 10 ja tyrosiinin O-suifaattiesteriksi, ovat identtiset ja niiden rakennekaava on: ch-ch2-<^ Vo-so3“h+ NH2 v=/

Yhdisteet, jolta tässä kutustaan Tyr(SÖ3H):ksi, 3-suIfotyrosiiniksi ja 5-suifotyrosisniksi, ovat identtiset ja niiden rakennekaava on: COOK _________

/VoH

I 2 Yv // HH2 “ . ,

s03 H

15 Tässä patenttihakemuksessa käytettynä ilmaisu "potilas" viittaa mi hin tahansa nisäkkääseen, erityisesti ihmiseen.

Tässä käytettynä ilmaisulla "anioninen aminohappo'1 tarkoitetaan meta-, para- tai orto-, mono- tai disubstätuoitua fenyyliaianiinia, sykioheksyy-liaianiinia tai tyrosiinia, joka sisältää negatiivisesti varatun ryhmän, sekä 20 S-alkyloitua kysteiiniä, S-alky!oitua homokysteiiniä, gamma-karboksiglutamiini-happoa, eeta-alkyyiilysäiniä, delta-alkyyllornitiinia, giutamiinihappoa ja aspara-giinihappoa, Esimerkkejä anionisista aminohapoista ovat tyrosiinin O-sulfaatti-, O-fosfaatti-ja O-karboksylaattiesterit, 3- ja 5-suifotyrosiini, 3-ja 5-karbotyrosii-ni, 3- ja 5-fosfotyrosiini, tyrosiinin 4-metaanisulfqnihappoesteri, tyrosiinin 4-me-25 taanifosfonlhappoesteri, 4-fenyylietikkahappo, 3,5-drjödityrosiini ja 3- ja 5-nitro-tyrosiini.

Ilmaisuilla "katalyyttinen keskus", "aktiivinen keskus" ja "aktiivisen keskuksen tasku" kullakin tarkoitetaan tässä käytettyinä jotain tai jokaista seuraavaa keskusta trombiinissa: substraatin sitova eli "St’-keskus; hydrofobi 9 nen eli "öljyinen" keskus; seka keskus, jossa substraatin pilkkominen itseasiassa tapahtuu ("varausvaihtokeskus").

ilmaisulla "rUnkoketju" tarkoitetaan tässä käytettynä sitä osaa kemiallisesta rakenteesta, joka määrittelee pienimmän lukumäärään toisiaan seu-5 raavia sidoksia, jotka voidaan jäljittää tuon kemiallisen rakenteen yhdestä päästä toiseen. Atomirakenneosät, jotka muodostavat runkoketjun, voivat käsittää mitä tahansa atomeja, jotka kykenevät muodostamaan sidoksia ainakin kahden muun atomin kanssa.

Esimerkiksi kullekin seuraavaile kemialliselle rakenteelle on tunnus-ίο omainen 7 atomin runkoketju (runkoketjun muodostavat atomit on lihavoitu): ¥ H ¥ H * h Ϊ 0 a ? « * g H , H j H ^

H H H f Λ * I H

8 0 M 1 '

H Cl N

I L

H » 0

Ilmaisulla "laskettu pituus" tarkoitetaan tässä patenttihakemuksessa 15 käytettynä ennakoitua mittausta, joka on saatu laskemalla yhteen sidospituu-det runkoketjun muodostavien atomien välillä. Sido s pituudet minkä tahansa kahden tietyn atomin välillä ovat alalla hyvin tunnettuja (katso esimerkiksi "GRC Handbook of Chemistry and Physics", 65. painos, R,C". Weist, toim., GRC Press, inc., Boca Raton, FL, 1984, ss. F-166-70.

20 Hakijat ovat analysoineet trombiini-hirulogi-8-kompleksin rakennetta kolmiulotteisella röntgensädekristailögrafialla. Hirulogi-S on inhibiittori, joka sitoutuu trombiinin sekä anioniseen sitoutumiseksosiittiin että sen katalyyttiseen keskukseen. Sen kaava on: (D-Phe)-Pro~Arg-Pro-{G|y)~Asn~Giy~Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Giu-Tyr-Leu. Tämän yhdisteen synteesiä kuvataan 25 avoinna olevassa US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanro 395 482 sekä ta- 10 män hakemuksen esimerkissä 1. Nämä kristallografiset tulostiedot paljastivat trombiinin aktiivisesta keskuksesta sekä sen ympäriltä useita rakennepiirteitä, jotka olivat keskeisiä suunniteltaessa ja rakennettaessa tämän keksinnön mukaisia aiempaa parempia trombiinNrihibiittoreita.

5 Yksi näistä rakennepiirteistä on hydrofobinen tasku trombiinissa sen katalyyttisen keskuksen vieressä. Hirulogi-8:ssa N-pään D-Phe-tähde, spesifisesti aminohapon fenyyiirengas, täyttää tämän tilan. Korvaamana tyydyttynyt rengas tyydyttymättömällä renkaalla lisätään lipofiilisiä vuorovaikutuksia trombiinin kanssa, jolloin kohotetaan inhibitiotehoa. Tämän vuoksi tämän keksinnön 10 yhden suoritusmuodon mukaan trombiini-inhibiittorin kaava on: x~rz-r3-r4-r5-r6~y k jossa X on vety tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1-100 atomista; Ri valitaan ryhmästä, jonka muodostavat ei-substituoidut, mo-nosubstituoidut, disubstituoidut Ja trisubstituoidut tyydyttyneet homosykiiset tai 15 heterosykliset rengasrakenteet; R2 on sidos tai sille on tunnusomainen runko-ketju, joka koostuu 1-5 atomista; R3 on sidos tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 - 3 atomista; R4 on jokin aminohappo; R5 on L-amino-happo, joka käsittää guanidiniumin tai aminon sisältävän sivuketjuryhmän; R6 on ei-amidisidos; ja Y:iie on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1-9 20 atomista. Esimerkkejä L-aminOhapoista, jotka käsittävät guanidiniumin tai aminon sisältävän sivuketjun, ovat arginiini, lysiini ja ornitiini.

:

Edullisesti tyydyttyneen homosyklisen tai heterosyklisen rengas-rakenteen muodostaa D-sykioheksyyiiaianlinl- (D-Cha-), monosubstituoitu D-Cha-, disubstituoitu D-Cha- tai trisubstituoitu D-Cha-tähde (eli X on H2N; R1 va-25 Iitaan ryhmästä, jonka muodostavat ei-substituoitu, monosubstituoitu, disubsti-tuoitu ja trisubstituoitu heksaani; R2 on CHrCH; ja R3 on C=0). Edullisimmin X on H2N; Ri on heksaani; Rs on CMrCH; R3 on C=0; R4 on proliini; R5 on argi-niini ja Y on proliini.

Ei-amidisidoksen esiintyminen Reissä hidastaa inhibiittorin pilkko-3Q mistä trombiinilla tai estää sen, Ei-amidisidosrakenneosa voidaan muodostaa kemiallisesti modifioimaila amidisidosta. Tähän voidaan päästä alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä (M. Szeike et ai, "Potent New Inhibitors of Human Renin’’ (suom. "ihmisreniinin tehokkaita uusia inhibiittöreita"), Nature 299 (1982) 555 - 557; D.H. Coy et aL, "Facile Solid Phase Preparation of Proteins 35 Containing the CH2-NH Peptide Bond Isostere and Application to the Synthesis of 11

Somatostatin (SRIF) Octapeptide Analogues" (soom. "CFb-WH-peptidisidos-isosteerin sisäitävien proteiinien helppo valmistus kiinteässä faasissa sekä sovellutus somatosfatiinl- (SR1F-) oktapeptidianalogien synteesiin"), "Peptides 1988", P. Theodropouios, toim., Waiter Qruyter St Go,, Berliini, 1987, 5 ss. 143 -146). Kun ei-amidisidos muodostetaan tällä tavalla, kemiallinen modifiointi suoritetaan edullisesti ennen sen osan molekyylistä lisäämistä, joka sisältää tämän sidoksen, trombiini-inhibiittorin loppuosaan. Tällä tavalla tämän ei-amidisidoksen sisältävä osa voidaan lisätä ”en bloc", yhdessä synteesivai-heessa, inhibiittorin loppuosaan.

to Eduliisimmassa suoritusmuodossa R5 on Arg ja Y on Pro. Tässä suoritusmuodossa Re on luonnollisesti esiintyvä imidisidos, jonka trombiini pilkkoo hitaasti. Tällä vältetään tarve muodostaa ennalta ei-amidisidos ja mahdollistetaan Y:n ja Rem lisääminen inhibiittorin loppuosaan peräkkäin eikä "en bloc".

15 Hirulogi-8-trombijnin kristaliografisen rakenteen jatkoanalyysissä il meni, että hirulogi-8:n D-Phe:n sitoutunut proliini oli 3,46 A:n päässä trombiinin Tyr76:n hydroksyyiiryhmästä. Koska tämä välimatka oli tarpeeksi lyhyt vetysil-tojen muodostukseen, aminohapon, joka käsittää sivuketjuryhmän, jolle on tunnusomaista kyky Vastaanottaa vetysidos pH:ssa noin 5,5 - 9,5, substituutio 20 Pro:n tilalle tässä asemassa oletettavasti nostaisi inhibiittorin sitoutumisaffini-teettia. Täten tämän keksinnön toinen suoritusmuoto on trombiini-inhibiittori, jonka kaava on: x-r2 -r3-r ' 4-r5-r6-y R’i jossa R'i valitaan ryhmästä, jonka muodostavat ei-substituoidut, monosubsti-25 tuoidut, disubstituoidut ja trisubstituoidut rengasrakenteet; R2 on sidos tai siile on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 - 5 atomista; R3 on sidos tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 - 3 atomista; R'4 on jokin aminohappo, joka käsittää sivuketjuryhmän, jolle on tunnusomaista kyky vastaanottaa vetysidos pH:ssa noin 5,5 - 9,5; R5 on jokin L-aminohappo, joka käsittää 30 guanidiniumin tai aminon sisältävän sivuketjuryhmän; Rs on ei-amidisidos; ja Y:l!e on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1 - 9 atomista,

Alalla tunnetaan hyvin aminohappoja, jotka käsittävät sivuketjuryh- j man* jolle on tunnusomaista kyky vastaanottaa vetysidos pH:ssa noin 5,5 - j 9,5. Esimerkiksi histidiinin (joka sisältää imidatsoliurntypen), tioproliinin (joka 1 j ] 12 sisältää tioiiryhmän) ja isonipekotiinihapon (joka sisältää karboksylaatiisivu-ryhmän).'tiedetään jokaisen olevan vetysidosakseptori pH:ssa 5,5 - 9,5.

Tämän suoritusmuodon mukaiset edullisemmat trombiini-inhibiittorit käsittivät ei-substituoidun, monosubstituoidun, disubstituoidun ja trisubstituöi-S dun heksaanin RVasemassa. Edullisimmin X on H2N, on heksaani, R2 on GH2-GH ja R3 on C=0 ja X:n, RV n, R2:n ja R3:n muodostama saatava aminohappo on D-könfiguraatiossa (eli D-Cha).

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukainen trombiini-inhibiitton koostuu lisäksi anionin sitovaan eksosiittiin liittyvästä ryh-10 mästä (ABEAM) ja liittäjästä, joka on sitoutunut Y.hyn toisesta päästään ja ABEAMiiän toisesta. Samankaltaisia trombiini-inhibiittoreita on kuvattu avoinna olevissa US-patenttivaatimusjuikaisuissa sarjanro 549 388, joka jätettiin 6, heinäkuuta 1990, ja sarja nro 395 482, joka jätettiin 18. elokuuta 1989, jotka molemmat sisällytetään tähän viitteiksi, mutta nyt esillä olevat edulliset inhibiittorit 15 ovat yllättäen ja odottamatta tehokkaampia.

Tässä suoritusmuodossa inhibiittorin iiittoalue muodostaa sillan CSDM:n ja ABEAM:n välille. Täten tärkeintä ei ole liittäjän rakenne, vaan sen pituus. Runkoketjun, joka karakterisoi liittäjän, lasketun pituuden on oltava ainakin noin 18 A - trombiinin katalyyttisen keskuksen ja sen anionia sitovan 20 eksosiitin välinen välimatka - ja vähemmän kuin noin 42 A.

Liittäjän runkoketju voi käsittää mitä tahansa atomeja, jotka kykenevät sitoutumaan ainakin kahteen muuhun atomiin. Edullisesti runkoketju koostuu hapesta, hiilestä, typestä ja rikistä valittujen atomien mistä tahansa kemiallisesti toteuttamiskelpoisesta yhdistelmästä. Alan ammattilaiset tietävät, mikä 25 edeltävien runkoketjuatomien yhdistelmä on edellytetyn pituuden puitteissa, erilaisten sidosten välisten tunnettujen välimatkojen perusteella (katso esimerkiksi R.T. Morrison ja R.N. Boyd, 'Organic Chemistry", 3. painos, Aliyn ja Bacon, Inc., Boston, Massachusetts, 1977). Edullisen suoritusmuodon mukaan iiittäjä on peptidi, joka käsittää aminohapposekvenssin Giy-Gty-Gly-Asn-Gly-30 Asp-Phe. Edullisesti ABEAM-rakenneosaan sitoutunut aminohappo on Phe.

Näiden edullisten trombiinHnhibiittorien kolmas alue on ABEAM, joka sitoutuu trombiinin anionin sitovaan eksosiittiin. Edullisesti ABEAM:n kaava on: W-B1-B2-B3-B4-BS-B6-B7-B8-Z; 13 jossa W on sidos; Bi on anioninen aminohappo; B2 on jokin aminohappo; B3 on Ile, Val, Leu, Nle tai Phe; 84 on Pro, Hyp, 3,4-dehydroPro, tiatsol|diini‘4-karboksylaatti, Sar, jokin N-metyyliaminohappo tai D-Aia; B5 on anioninen aminohappo; B6 on anioninen aminohappo; B7 on lipofiilinen aminohappo, joka va-5 Iitaan ryhmästä, jonka muodostavat Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, lie, Vai, Cha, Pro, tai dipeptidi, joka koostuu yhdestä näistä iipofiiiisistä aminohapoista ja jostain aminohaposta; Bs on sidos tai peptidi, joka sisältää 1 - 5 jonkin aminohapon tähdettä; ja Z on OH tai sille on tunnusomainen runkoketju, joka koostuu 1-6 atomista.

10 Peptidien, jotka ovat homologisia hirudiinin karboksyylipääosaan nähden, on osoitettu sitoutuvan anionin sitovaan eksosiittiin trombiinissa (avoinna oleva US-patenttihakemusjulkaisu 314 756 ja J.M. Maraganore et aL, "Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides" (suom. "Synteettisten hi-rudiinipeptidien koaguiaatiota vastustava vaikutus"), J.Biol.Chem. 264 (1989) 15 8692 - 8698; jotka molemmat sisällytetään tähän viitteiksi).

Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan ABEAM on homologinen hirudiinin aminohappoihin 56 - 64 nähden, eli 81 on Glu; B2 on Glu; B3 on lie; 84 on Pro; 85 on Glu; 8e on Glu; B7 on Tyr-Leu, Tyr(S03H)-Leu tai Tyr(0SO3H)-Leu tai (3,5-dij0diTyr)-Leu; Bs on sidos; ja Z on OH. Huomatta-20 koon, että natiivi hirudiini sisältää Tyr(OSQ3H):n asemassa 63. Kuitenkin kar-boksyyiipäähirudiinipeptideiilä, jotka sisältävät Tyr(S03H);n, on identtinen koaguiaatiota vastustava vaikutus niihin nähden, jotka sisältävät natiivin Tyr(OSQ3H):n (katso avoinna oleva US-patenttihakemusjulkaisu 314 756).

Muut tämän keksinnön piiriin kuuluvat ABEAM-rakenneosat voivat 25 käsittää ne osat jostain molekyylistä, joiden tiedetään sitoutuvan trombiinin anionin sitovaan keskukseen. Näitä ovat tekijä-V:n aminohapot 1675 -1686, verihiutaieglykoprQteiini-ib:n aminohapot 272 - 285, trombomöduliinin aminohapot 415 - 428, protromb!inifragmentti-2:n aminohapot 245 - 259 ja fibrino-geenin Αα-ketjun aminohapot 30 - 44, Lisäksi ABEAM-rakenneosa voidaan vaso Iita jostain hirudiinipeptidianaiogista, joita kuvaavat J.L. Krstenansky et ak. "Development of MDL-28,Ö5Ö, A Small Stable Antithrombin Agent Based on A Functional Domain of the Leech Protein, Hirudin" (suom. "MDL-28,050:n kehittäminen, joka on pieni stabiili aniitrombiiniagentti, joka perustuu iiiimatoproteii-nin, hirudiinin, funktionaaliseen alueeseen”), Thromb.Haemostas. 63 (1990) 35 208 - 214, etenkin niistä, jotka käsittävät sekvenssin Asp-Tyr-Glu-Pro-lle-Pro-Glu-Glu-Aia-Cha-(D-Glu).

14

Esillä olevan keksinnön mukaiset trombiini-ίnhibiittorit voidaan syntetisoida erilaisilla alalla hyvin tunnetuilla tekniikoilla. Näitä ovat orgaanisen kemian synteesitekniikat peptidisynteesi kiinteässä faasissa, peptidisynteesi liukoisessa faasissa tai näiden tekniikoiden jokin yhdistelmä. Osia joistakin tä-5 män keksinnön mukaisista inhibiittoreista voidaan niinikään tuottaa muilla menetelmillä, kuten entsymaattisesti pilkkomalla luonnollista tai ybdisielrnä-DNA-hlrudilnia tai yhdisteimä-DNA-teknisesti. Nämä osat voidaan sitten sitoa inhibiittorin synteettisesti tuotettuihin osiin tämän keksinnön mukaisen lopputuotteen tuottamiseksi. Synteesitekniikan valinta riippuu luonnollisesti kyseisen ni-10 menomaisen inhibiittorin koostumuksesta.

Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa trombiini-inhibiittori syntetisoidaan käyttämällä heterologisen tekniikan ja kiinteäfaasitekniikan yhdistelmää, Tähän tekniikkaan liittyy molekyylin peptidiosan kokonaisuudessaan tai suurimman osan siitä synteesi kiinteässä faasissa, mitä seuraa et-amino-15 happorakenneosien lisääminen, jotka on syntetisoitu liuosfaasitekniikoilla. Ei-aminohappo voidaan kytkeä peptidiosaan käyttämällä kiinteäfaasi- tai liuos-faasimeneteimiä. Vastaavasti mahdollisesti jäljellä olevat peptidiosat voidaan samoin lisätä kiinteäfaasi- tai iiuosfaasimenetelmillä. Tämä muodostaa hinnaltaan edullisimmat menettelyt näiden molekyylien tuottamiseksi kaupallisina 20 määrinä.

Kun tämän keksinnön mukaiseen trombiini-inhibiittoriin sisältyy "ei-proteiini-aminohappoja, ne voidaan joko lisätä suoraan kasvavaan ketjuun peptidisynteesin aikana tai valmistaa kemiallisesti modifioimalla valmiiksi syntetisoitua peptidiä riippuen halutun '‘el-proteiinr-aminohapon luonteesta. Kemi-25 ailisen synteesin alan ammattilaiset tietävät hyvin, mitkä Mei-proteiini"-amino-hapot voidaan lisätä suoraan ja mitkä on syntetisoitava kemiaiiisesti modifioimalla täydellistä peptidiketjua peptidisynteesin jälkeen.

Esillä olevan keksinnön mukaiset molekyylit osoittavat tehokasta koagulaatiota vastustavaa aktiivisuutta. Tämä aktiivisuus voidaan määrittää in 30 vitro käyttäen mitä tahansa tavanomaista tekniikkaa. Edullisesti koagulaatiota vastustavan aktiivisuuden määrityksessä määritetään suoraan molekyylin trom-bliniä inhiboiva aktiivisuus. Tällaiset tekniikat mittaavat kolorimetristen substraattien trombiinikatalysoidun pilkkomisen inhibitiota tai edullisemmin trombiini-aikojen lisäystä tai lisäystä aktivoidun osatromboplastiinin ajoissa ihmispias-35 massa. Viimeksi mainitussa määrityksessä mitataan tekijöitä koagulaation ^sisäsyntyisellä··'· reitillä. Vaihtoehtoisesti käytetyssä määrityksessä voidaan |

S

s $ s 15 käyttää puhdistettua trombiinia ja fibrinogeenia fibrinopeptidien A tai B vapautumisen inhibition mittaamiseksi radioimmuunimääniykseilä tai ELISAla.

Tämän keksinnön mukaisten molekyylien verihiutaleita vastustava aktiivisuus voidaan myös mitata jollain lukuisista tavanomaisista verihiutaie-5 määrityksistä. Edullisesti määritys mittaa muutosta verihiutaleiden aggregaati-on asteessa tai muutosta verihiutale-eritysrakenneosan vapautumisessa from-biinin läsnä" ollessa. Edellinen voidaan mitata aggregometrillä. Jälkimmäinen voidaan mitata käyttäen eritysrakenneosaiie spesifisiä R1A- tai ELISA-teknjikoita.

Tämän keksinnön vaihtoehtoisen suoritusmuodon mukaan trombii-1.0 ni-inhibiittoreita voidaan käyttää koostuksissa ja menetelmissä invasiivisten välineiden pintojen päällystämiseksi, jolloin seurauksena saadaan alentunut vaara hyytymän muodostukselle tai verihiutaleiden aktivaatiolle tällaisia välineitä vastaanottavissa potilaissa, Pintoja, jotka voidaan päällystää tämän keksinnön mukaisia koostumuksilla, ovat esimerkiksi proteesit, keinotekoiset läpät, vets risuonisiirrännäiset, aineet, jotka pitävät kudosta paikoillaan paranemisen ajan, ja katetrit. Menetelmät ja koostumukset näiden välineiden päällystämiseksi ovat tuttuja alan ammattilaisille. Niitä ovat trombiini-inhibiittorin sisältävien koostumusten kemiallinen ristikytkeminen tai fysikaalinen adsorptio välineiden pinnalle.

20 Esillä olevan keksinnön seuraavan suoritusmuodon mukaan trom- biini-inhibiittoreita voidaan käyttää potilaan verisuonitukoksen kuvantamiseen ex vivo. Tässä suoritusmuodossa trombiini-inhibiittori leimataan radioisotoopil-la. Radioisotoopin valinta perustuu lukuisiin hyvin tunnettuihin tekijöihin, joita j ovat esimerkiksi myrkyllisyys, biologinen puoliintumisaika ja todettavuus. Edul-25 lisiä radioisotooppeja ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta 1251, 123i ja 111 In.

Tekniikat trombiini-inhibiittorin leimaamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Edullisimmin radioisotooppi on 123l ja leimaus suoritetaan käyttäen 123l-Boiton-Hunter-reagenssia. Leimattua trombiini-inhibiittoria annetaan potilaalle ja sen annetaan sitoutua hyytymän sisältämään trombilniin. Hyytymää havainnoi-30 daan sitten käyttäen hyvin tunnettuja toteamiskeinoja, kuten kameraa, joka kykenee toteamaan radioaktiivisuuden, kytkettynä tietokonekuvannussystee-miin. Tällä tekniikalla saadaan niinikään kuvia verihiutaleisiin sitoutuneesta trombiinista ja meitsotrombiinista.

16

Joita tässä kuvattu keksintö tuiisi täydellisemmin ymmärretyksi, esitetään seuraavat esimerkit. Huomattakoon, että nämä esimerkit ovat vain havainnollistaviin tarkoituksiin eikä niiden tule katsoa rajoittavan tätä keksintöä miliään tavalla.

5 Esimerkki 1

Trombiini-inhibiittorin suunnittelu ja rakentaminen, joka kykenee salpaankaan katalyyttisen keskuksen ja sitoutumaan anionin sitovaan ekso-siittiin

Karboksyylipäähirudiinipeptidit saipaavat tehokkaasti trombiinikata-10 lysoidun fibrinogeenihydroiyysin, mutta eivät kromogeenlsen substraatin hydro iyysiä (J.M. Maraganore et ai., J.Bioi.Chem. 264 (1989) 8692 - 8698). Lisäksi hirudiinipeptidit eivät neutraloi tekp-Vm ja tekp~Vill:n trombiinikatalysoltua aktivaatiota (J.W. Fenton, II, .et ai. "Hirudin Inhibition by Thrombin” (suom. "Hi-rudiini-inhibitio trombiinilla"), AnQio.ArchiY.Biol. 18 (1989) 27).

15 Hirudiinipeptidit, kuten Tyr63-0-su!faatti-N-asetyylihirudiini53-64 fhiru- geeni"), osoittavat tehokkaita inhibitiovaikutuksia vastaan trombiini-indusoitua verihiutaleaktivaatiota in vitro (J,A, Jakubowski ja J.M. Maraganore, ''Inhibition of Thrombin-Induced Platelet Activities by a Synthetic 12 Amino Acid Residue Sulfated Peptide (Hirugen)" (suom. ’Trombiini-indusoitujen verihiuta-20 leaktiivisuuksien inhibltio synteettisellä 12 aminohappotähteen suifatoidulla peptidillä (hirugeeni)”), Blood 1989 1213). Kuitenkin verihiutaieverisuonitu-koksen inhitooimiseksi jn vivo saatetaan tarvita trombiini-inhibiittori, joka kykeneesaipaamaan aktiivisen keskuksen, jos tekp-V:n ja tekijä-Vlli:n aktivaatio ovat kriittisiä ja nopeutta rajoittavia valheita. Tämän johtopäätöksen oikeutta-25 vat tulokset, jotka on saatu irreversiibelillä trombifni-inhiböttolilla (D-Phe)-Pro-Arg-CHgCI (S.R. Hanson ja L.A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenylaianyl-L-prolyl-L-Arginyl Chloromethyi Ketone" (suom. "Akuutin verihiutaleriippuvaisen verisuonitukoksen keskeyttäminen synteettisellä trombiinivastaisella D-fenyyli-30 alanyyli-L-prQlyyli-L-arginyylikioonmetyyiiketonilla"), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 (1988) 3184 - 3188) ja muiiia reverslibeleiilä trombiini-inhibiittoreilia (J.F. Eidt at aL, "Thrombin is an Important Mediator of Platelet Aggregation in Stenosed Canine Coronary Arteries with Endothelial Injury") (suom. "Trombiini on venhiutaleaggregaation tärkeä välittäjä endöteelivaurion käsittävissä ähtäu-35 tuneissa koiran sepelvaltimoissa"), J.CIin.Invest 84 (1989) 18 - 27).

17 Käyttämällä edeltävää tietoa, että hirudiinipeptidien NH2-pää on Lys-149:n vieressä, käytimme kolmiulotteista trombiinimallia (B. Furie et aL, "Computer-Generated Models of Blood Coagulation Factor Xa, Factor IXa, and Thrombin Based Upon Structural Homology with Other Serine Proteases" (suom.

5 “Tietokoneella luotuja malleja veren koagulaatiotekijästä Xa, tekijästä IXa, sekä trombiinista rakennehomologian muihin seriiniproteaaseihin perusteella"), J.Biol.Chem. 257 (1982) 3875 - 3882) vaikuttavan aineen suunnittelemiseksi ja rakentamiseksi, joka: 1) sitoutuu trombiinin anionin sitovaan eksosiittiin; ja 2) kykenee salpaamaan trombiinin aktiivisen keskuksen taskun ja inhiboimaan to sen sisältämien katalyyttisten tähteiden toiminnan.

Määritimme, että minimietäisyys Lys-149:n eetä-NH2:sta Ser-195:n β-hydroksylaattiin on 18 - 20 A. 3 Ä:n/aminohappo tähdepituuden perusteella laskimme, että ainakin noin 4- 7 aminohappoa tarvittaisiin hirudiinipeptidin, kuten Tyr63-0-sulfaattihirudiinig,3-G4:n, kytkemiseksi aktiivinen keskus -inhibiittori-15 rakenteen käsittävään alueeseen. Uittajan koostumukseksi valittiin glysiini. Gly-siint valittiin liittäjän suurimman joustavuuden rakentamiseksi näihin alustaviin tutkimuksiin. Huomattakoon kuitenkin, että muita, jäykempiä biopoly-meeriliittäjiä voidaan myös käyttää.

Valitsimme sekvenssin (D-Phe)-Pro-Arg-Pro aktiivisen keskuksen 20 inhibiittoriksi koska trombiini osoittaa spesifisyyttä Arg.lle Pi-aminohappona substraattien pilkkomisessa. Arg:iä seuraavafia Pro:lla (PVaminohappo) saadaan sidos, jonka trombiini pilkkoo hyvin hitaasti. Suunnitteiimme ja rakensimme vaihtoehtoisia peptidejä korvaamana tuon Pro:n sarkosyyli- tai N-metyyliaia-niiniaminohapolia tai kemiaiiisesti pelkistämällä Arg-Gly-leikkaussidosta.

25 Esimerkki 2

Hirulogi-8:n synteesi

Hirulogt-8:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn“Giy-Asp-Phe-Glu-Giu-l!e~Pro-Giu-Giu-Tyr-Leu-OH. Syntetisoimme hiru!ogi-8:n tavanomaisella kiinteäfaasipeptidisynteesiliä käyttäen Applied Biosystems 430 30 A-peptidisyntetisaättoria, Tämä peptidi syntetisoitiin käyttäen BOC-L-ieusiini- O-divinyylibentseenihartsia. Muut käytetyt t-BOC-aminohapot (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) olivat BÖC-0-2,6-diklooribentsyylityrosifni, BOC-L-giuta-miinihappo (gamma-bentsyyliesteri), BOC-L-proliini, BOC-L-isoleusiini, BOC-L-fenyylialanirni, BOC-L-asparagiinihappo (β-bentsyyiiesteri), BOC-glysiini, 35 BOC-L-asparagiini, BOC-D-fenyyiialaniini ja BOC-L-arginiini. Korkeiden saan- 18 tojen saamiseksi synteesissä (CSIyJrliittosegmentti kiinnitettiin kahdessa syklissä, jossa BOC-glysyyiiglysiini lisättiin käsin (Beckman Biosciences, Inc., Fila-delfia, PA). Synteesin päättämisen jälkeen peptidistä poistettiin kaikki suoja-ryhmät ja se irrotettiin divinyylibentseenihartsista käsittelemällä vedettömällä s HF:p-kresoli:etyylimetyylisulfaatilla (10:1:1, v/v/v). Hartsista poistamisen jälkeen peptidi kylmäkuivattiin kuivaksi.

Epäpuhdasta hiru!ogi-8:aa puhdistettiin käänieisfaasi-HPLGdiä käyttäen Applied Biosystems 151A -nestekromatografiasysteerniä ja Vydac Cie -kolonnia (2,2 x 25 cm). Koionni tasapainoitettiin 0,1 % TFA/vedessä ja kehitet-io tiin käyttäen lineaarista gradienttia, jossa asetonitriilipitoisuus kasvot D:sta 80 %:iin 45 minuutissa 0,1~%:isessa TFA:ssa virtausnopeuden ollessa 4,0 ml/min. Ulosvirtauksen absorbanssia tarkkailtiin 229 nm:ssa ja fraktioita kerättiin käsin. Puhdistimme 25 - 30 mg epäpuhdasta hiru!ogi~8:aa HPLC:llä ja saimme talteen 15 - 20 mg puhdasta peptidiä.

15 Vahvistimme puhdistetun hiruiogi~8:n rakenteen aminohappo- ja sekvenssianalyysillä. Aminohappohydrolysaatit valmistettiin käsittelemällä peptidiä 6 N HCkilä tyhjössä 110 °C:ssa 24 tunnin ajan. Sitten analysoimme hyd-rolysaatit ioninvaihtökromatografisesti ja sitten ninhydhinijohdannaismuo-dostus/detektoinnilia käyttäen Beckman 6300 -automaattlanalysaattoria. Suori-20 timme sekvenssianalyysin käyttäen automatisoitua Edman-pilkkomista Applied Biosystems 470A -kaasufaasisekventoijalia, joka oli varustettu malli 900A -tietosysteemillä. Fenyylitiohydantoiini- (PTH-) aminohapot analysoitiin "on line" käyttäen Applied Biosystems 120A -PTH-anaiysaattona ja PTH-Gi8-kolonniä (2,1 x 220 mm), 25 Esimerkki 3 1-ja 2-asemasubstituoitujen hirufogien suunnittelu ja rakentaminen

Saimme hiruiogi-8:trombiinikompleksin röntgensädekristaliografisen rakenteen seuraavilla vaiheilla. Ensiksi muodostimme hirulogi-8:trombiinikom-pleksikiteitä, joiden laatu oli sopiva korkean erotuskyvyn diffraktiokuvion saa-3ö miseksi. Sitten keräsimme diffraktometrisiä tietoja näitä kiteitä käyttäen. Lopuksi määritimme hirulogi-8:trombiinikompieksin kolmiulotteisen rakenteen käyttämällä molekyyiikorvausrotaatio/translaatiomenetelmiä käyttäen PPAGK:trom-biinikompleksin koordinaatteja (W. Bode et aL, "The Refined 1,9 Ä Crystal Structure of Human α-Thrombin: interaction with D-Phe-Pro-Arg-Chioro-35 methylketone and Significance of the Tyr-Pro-Pro-Trp Insertion Segment" 19 (suonri "Ihmis-a-trombiinin tarkka 1,9 A -kiderakenne: vuorovaikutus D-Phe-Pro-A rg-k loo ri metyyli keto n i n kanssa sekä Tyr-Pro-Pro-Trp-insertiQsegmentin merkitys"), EMBQ J, 8 (1989) 3467 - 3475) ja hirudiinhtrombiinikompieksin koordinaatteja (T.J. Rydei et aL "The Structure of a Complex of Recombinant 5 Hirudin and Human α-Thrombin" (suom. "Yhdistelma-DiSiA-hirudiinin ja ihmis-α-trombiinin kompleksin rakenne"), Science 249 (1990) 277 - 280). Kuten esitetään kuviossa 1, selvitettiin trombiiniin sitoutuneen hiru!ogi-8:n rakenne, mikä mahdollisti CSDM:n D-Phe~Pro~Arg-sekvenssin sekä ABEAM:n Asp-Phe-Glu-Giu-lle-segmentin selvittämisen.

10 Kuviossa 1 trombiini esitetään valkoisena sen aktiivista keskusta lu kuunottamatta, joka esitetään tiheillä pisteillä. Hiruiogi-8 esitetään harvoilla pisteillä. Vasemman puoleinen osa hirulogi-8:sta lähinnä trombiinin aktiivista keskusta on CSDM. Oikean puoleinen osa on ABEAM. Hirulogi~8:n muita aminohappoja ei esitetä kuviossa 1, koska niitä vastaavia elektronitiheyksiä ei pys-15 tytty määrittämään.

Hirulogi-8:trombiinirakenteen CSDM-osan tarkastelu osoitti 1-asema-aminohapon (P-Phe) sijainnin trombiinin His5?:n, Tyr6ÖA:n, Trp60D:n, Leu99m, Ije174:n ja Trp215:n muodostamassa hydrofobisessa taskussa. O-Phe-tähde muodosti likeisiä van der Waals -kontakteja Leu99:n, ile174:n ja Trp215;n 20 kanssa (kuvio 2). Kuviossa 2 trombiini esitetään jatkuvalla viivalla ja hirulogi-8 katkoviivalla. D-Phe-tähteen sijainti taskussa viittasi siihen, että substituutiot 1-asemassä, jotka tehostavat lipofUlisiä kontakteja, johtaisivat CSDM-osan tämän keksinnön mukaisissa trombiini-inhibiittoreissa lisääntyneeseen sitoutu-misaffiniteettiin. Siten korvasimme hirulogi-8:n D-Phe-tähteen joko D-naftyyli-25 aianiinla (D-NPA) tai D-sykioheksyyliaianiiniila (D-Cha) D-NPA-hirulogi-Sm ja vastaavasti D-Cha-hirulogi-8:n muodostamiseksi.

Hiruiogi-8:n CSDM:n sitoutumiseen trombiinin katalyyttiseen keskukseen todettiin myös sisältyvän apolaarisia vuorovaikutuksia inhibiittorin ensimmäisen proliinin (D-Phe;n vieressä) ja trombiinin His57:n, Tyr60A:n ja 30 Trp60D:n määrittelemän taskun välillä (kuvio 2). Lisäksi tuon proliinin todettiin olevan 3,46 A:n päässä trombiinin Tyr80A:n fenolisesta hydroksyyliryhmästä (kuvio 2). Kuviossa 2 trombiini on esitetty jatkuvalla viivalla ja hiruiogi-8 katkoviivalla.

Tämän proliinin likeisyys trombiinin Tyr60A:han viittasi vetysilta-35 muodostuksen mahdollisuuteen näiden kahden välillä. Substituoimalla proiiini aminohapolla, joka kykenee muodostamaan vetysiitoja, CSDM-sitoutumisen 20 trombiinin aktiiviseen keskukseen stabiilisuutta voidaan lisätä. Tämä puolestaan nostaisi tällaisen molekyylin inhifoitioaktiivisuutta. Tämän vuoksi korvasimme hiruiogi-8;n proiiinin joko L-histidiiniiiä (HiS2-hirulogi~8), L-tioproliinilla (TPros-hiruiogi-S) tai isonipekotiinihapoiia (inp2-hirulogi-8). Kukin näistä 5 substituutioista muodosti vetysiita-akseptorin 2-asemaan (RVrakenneosa) tämän keksinnön mukaisissa trombiini-inhibiittoreissa (eli imidatsoliumtypen, tio-Iin tai vastaavasti karboksylaatin).

Esimerkki 4 1 -asemasubstituoitujen hirulogien synteesi 10 D-Npa-hirulogä-8 syntetisoitiin samalla tavalla kuin himlogi-8 (esi merkki 2) lukuunottamatta, että Boc-D-naftyylialaniinia (Bachem Inc., Torrance, CA) käytettiin D-Phe:n tilalla synteesin viimeisessä syklissä. D-Cha-hirulogi-8 valmistettiin samalla tavalla käyttäen Boc-D-sykloheksyylialaniinia (Bachem Biosciences, Filadelfia, PA) synteesin viimeisessä syklissä.

15 Molemmat l-asemasubstituoidut peptidit puhdistettiin kuten kuvat tiin hirulogi-Silie esimerkissä 2. Puhdistettuja peptidejä karakterisoitiin amino-happoanalyysillä ja FAB-MS:i!ä.

Esimerkki 5 2-asemasubstituoitujen hirulogijohdannaisten synteesi 20 Suunniteltiin ja rakennettiin substituutioita 2-asemassa, joiden kaava oli; (D-Cha)-X-Arg-HPrO“(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Pbe-Giu-Giu-l!e-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu tai (D-Phe)-X-Arg-HPro-(Gly)4~Asn~G!y-Asp-Phe-Glu-Glu-iie-Pro-Giu-Giu-Tyr-Leu, joissa X on joko histidlini, tioproiiini tai isonipekotiini-happo. Nämä peptidit syntetisoidaan oleellisesti kuten kuvattiin esimerkissä 2 25 ja esimerkissä 4 lukuunottamatta Boc-L'*hydroksiproliinin (Bachem, Inc.) ottamista mukaan Boc-L-proliinin asemesta synteesin syklissä 16 ja joko Boc-N-im-CBZ-L-histidiinin, Boc-L-tioproliimn tai Boc-isonipekotiinihapon (jotka kaikki saatiin valmistajalta Bachem, Inc.) ottamista mukaan syklissä 18 Boc-L-proiiinin asemesta. HPröita käytetään asemassa 4 inhibiittorin pilkkomisen 30 trombiiniila nopeuden hidastamiseksi. Peptidit puhdistetaan ja karakterisoidaan kuten kuvattiin esimerkissä 2.

21

Esimerkki 6 1-asemasubstituoitujen hirulogien trombiinivastaisten aktiivisuuksien karakterisointi

Vertasimme Spectrozyme TH -valmisteen (tosyyli-Gly-Pro-Arg-p-nit-5 roanilidi; American Diagnostica, New York, NY) trombiinikatalysoidun hydro-lyysin inhibitiota hirulogi-8:lla, D-Cha-hirulogi-8:lia ja D-Npa~hirulogi-8:lia määrityksessä, Spesifisesti mittasimme lähtönopeuksia kunkin inhibiittorin joko läsnä ollessa tai puuttuessa substraattipitoisuuksina 2,2 - 22 μΜ. Trombiinikatalysoi-tua nopeutta tarkkaltiin Cary 19 -spektrofotometriilä 405 nm:ssä ja se rekiste-10 rottiin jatkuvasti ajan funktiona. Kinetiikka suoritettiin huoneenlämpötilassa (25 +/-1 °C) 0,05 M natriumboraattipuskurissa, pH 8,4, jossa oli pitoisuus 0,1 M NaCi.

Tyypillisessä entsyymireaktiossa 1,0 ml puskuria lisättiin sekä näyte- että verrokkikyvetteihin. Trombiini (3,2 x 10'9 M, loppupitoisuus} sekä hiru-15 logi (0 - 4 x 10's M) lisättiin näytekyvettiin ennen Spectrozyme TH -valmisteen lisäämistä (2,2 - 22 μΜ). Heti substraatin lisäämisen jälkeen näytekyvetin sisältö sekoitettiin käyttäen muovlpipettlä. Reaktiota tarkkailtiin spektrofötometri-sesti 5 -15 minuutin ajan.

Kunkin substraattipitoisuuden lähtönopeudet ilmaistiin mooleina hyd-20 rolysoitua Spectrozyme TH -valmistetta/sek/moolia trombiinia. Tämä määritettiin reaktion alussa olevassa lineaarisessa vaiheessa (substraatin kokonais-hydrölyysi <1= 15 %} mittaamalla hydrölyysireaktion kulmakerroin. Lineweaver-Burke-kuvaajat muodostettiin tämän mukaisesti esittämällä lähtönopeuden käänteisarvo substraattipitoisuuden käänteisarvon funktiona. Alla esitetään hiss rulogi-8:lie ja esillä olevan keksinnön mukaisille johdannaisille saadut inhibi-tiovakiot.

Johdannainen Kj, nM

Hirulogi-8 1,4 D-Cha-hirulogi-8 0,12 30 D-Npa-hiruiogi-8 4,3

Kuten näistä tuloksista voidaan nähdä, D-Phe:n korvaaminen D~Cha:jia hirulogi-8:ssa johtaa Kj.:n yllättävään ja odottamattomaan laskuun yhdellä suuruusluokalla. Tämä havainto osoittaa, että D-Phe:n korvaaminen D-Cha:lia nostaa CSDM:n sitoutumisaffiniteettia tämän keksinnön mukaisissa 35 inhibiittoreissa. Se, ettei D-Npa-hiruiogi laske Kiitä, osoittaa, että tyydytty- 22 neen rengasrakenteen läsnäolo iässä asemassa aiheuttaa kohonneen sitou-tumisaffmiteetin. D-Chä sisältää tällaisen tyydyttyneen renkaan, kun taas D-Npa sisältää tyydyttymättömän renkaan.

Esimerkissä 5 kuvatut 2~asemasubstituutioita sisältävät molekyylit 5 osoittavat samankaltaisia ja yllättäviä laskuja Kjissä.

Esimerkki 7

Arsubstituoitujen hirulogien koagulaatiota vastustava aktiivisuus

Vertaslmme Tyr63“0-suifaatti-N-asetyylihirudiini53-64*n ("hirugeeni"), yhdistelmä-DNA-hirudiinin (American Diagnostica), hirulogi-8:n ja esillä olevan 10 keksinnön mukaisten 1-asemasubstituoitujen hirulogien koagulaatiota vastustavaa aktiivisuutta käyttäen pooliksi yhdistettyä, normaalia ihmispiasmaa (George King Biomedical, Overland Park, KA) ja Coag-A-Mate-XC-instru-menttia (Genera! Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK). Aktiivisuutta tarkkailtiin käyttäen aktivoitu osatromboplastiini -aika- (APTT-) määritys-15 tä sekä valmistajalta saatuja CaCI2- ja fosfoiipidiiiuQksia. Yhdistelmä-QNA-hirudiini (American Diagnostica}, hirulogi-8, D-Cha-hirUlogi-S tai hirugeeni lisättiin sitten APTT-määrityskuoppnn loppupiioisuudeksi 10 - 32,300 ng/ml 25 μ!:η kokonaistilavuudessa ennen 100 μ!:η plasmaa lisäystä.

Kuten esitetään kuviossa 3, D-Cha-hirulogi-8 pidensi APTT:n 20 470 %:iin verrokkiarvoista pitoisuutena 1 μ^/πΊΐ, Tämä nousu oli merkittävästi suurempi kuin nousu, jonka APTT:ssä aiheutti hirugeeni, yhdisteimä-DNA-hiru-diini tai hirulogi-8 samana pitoisuutena. Täten sen lisäksi, että D-Cha-hiruiogi-8 osoitti hirulogi-8:aan verrattuna tehostuneita trombiinivastaisia aktiivisuuksia in vitro, se osoitti myös hirulogi-8:aan nähden merkittävästi kasvanutta koagulaa-25 tiovastaästa vaikutusta piasmamäärityksissä.

Esimerkissä 5 kuvatut 2-asemasubstituutioita sisältävät molekyylit ösoittahevat hirulogi-8:aan verrattuna suurempia kohoamisia APTTssä.

Vaikka olemme edellä esittäneet lukuisia tämän keksinnön suoritusmuotoja, on ilmeistä, että perusrakennettamme voidaan muuttaa muiden 30 suoritusmuotojen saamiseksi, joissa käytetään tämän keksinnön mukaisia molekyylejä, koostumuksia, yhdistelmiä ja menetelmiä. Tämän vuoksi ymmärrettäneen, että tämän keksinnön kattavuutta rajoittavat siihen liitetyt patenttivaatimukset eivätkä ne spesifiset suoritusmuodot, jotka edellä on esitetty esimerkkeinä.

l ! § j

Claims

1. Ei-terapeuttisesti käytettävä trombiini-inhibiittori, joka mahdollisesti lisäksi sisäliää radioisotoopin, mainitun trombiini-inhibiittorin käsittäessä: a) katalyyttiseen keskukseen kohdistuvan osan, jolla on kaava 5 X-R2-R3-R4-Rs-R6“Y Rt jossa X on vety tai runkoketju, joka koostuu 1 -100 atomista; Ri on ei-substituoitu, monosubstituoitu, disubstituoitu tai trisubstituoitu tyydyttynyt 1. homosyklinen tai heterosyklinen rengasrakenne, jossa on 6 atomia; R2 on runkoketju, joka koostuu 1-5 atomista; R3 on sidos tai runkoketju, joka koostuu 1 - 3 atomista; R4 on jokin aminohappo; Rs on jokin L-arninohappö, joka käsittää guanidinlum- tai aminosivuketjun; Re on ei-amidisidos; ja Y on runkoketju, joka koostuu 1 - 9 atomista; ja 15 b) liitto-osan, joka on runkoketju, jonka laskettu pituus on noin 18 A - noin 42 A; ja c) anionin sitovaan ulkokohtaan liittyvän osan, jolloin katalyyttiseen keskukseen kohdistuva osa on sidottu anionin sitovaan ulkokohtaan liittyvään osaan mainitun liitto-osan kautta; jolloin inhibiittori kykenee samanaikaisesti si- 20 toutumaan trombiinin katalyyttiseen kohtaan ja trombiinin anionin sitovaan ui-kokohtaan,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa X on H2N; Ri on ei-substituoitu, monosubstituoitu, disubstituoitu tai trisubstituoitu sykloheksyyli; R2 on CH2-CH; ja R3 on C-O.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa kata lyyttiseen keskukseen kohdistuvan osan aminohapposekvenssi on: D-Cha-Pro-Arg-Pro.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa R4 on jokin aminohappo, joka käsittää sivuketjuryhmän, joka on tunnettu kyvystään hyväksyä vetysidos, jonka pH on välillä noin 5,5 - 9,5.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa R4 on histidiini, tioproliini tai isonipekoottihappo.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa X on H2N; Ri on sykioheksyyli; R2 on CH2-CH; ja R3 on C=0.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen trömbiini-inhibiittori, jossa mainittu anionin sitovaan uikokohtaän liittyvä osa koostuu kaavasta: 5 W-B1-B2-B3-B4-B5-B6-B7-B8-Z; jossa W on sidos; B1 on anioniaminohappo; B2 on jokin aminohappo; B3 on Ile, Vai, Leu, Nle tai Phe; B4 on Pro, Hyp, 3,4-dehydroPro, tiatsolidii-10 ni-4-karboksylaatti, Sar, jokin N-metyyliaminohappo tai D-aia; B5 on aniontami-nohappo; Be on anioniaminohappo; 87 on lipofiiiinen aminohappo, joka on Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha, Pro tai dipeptidi, joka koostuu jostakin näistä lipqfi [lisistä aminohapoista ja jostakin aminohaposta; Bs on sidos tai peptidi, joka sisältää 1 - 5 jonkin aminohapon tähdettä; ja Z on OH tai runkoketju, joka 15 koostuu 1 - 6 atomista.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa Bi on Giu; 82 on Glu; B3 on He; B4 on Pro; Bg on Glu; Bg on Glu; B7 on Tyr-Leu, Tyr(S03H)-Leu, TyrfOSÖgHj-Leu tai (3-, 5-diiodoTyr}-Leu; Bgon sidos; ja Zon OH,

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen trombiini-inhibiitton, jossa maini tun liitto-osan runkoketju koostuu jostakin atomiyhdistelmästä, joita ovat hiili, typpi, rikki tai happi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa mainittu liitto-osa käsittää aminohapposekvenssin: Giy-Gly-Giy-Asn-Gly-Asp-Phe.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa mainittu trombiini-inhibiittori on H-D-Cha-Pro-Arg-Pro-{Gty)4-Asn-Giy-Asp-Phe- j Glu-Giu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH,

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen trombiini-inhibiittori, jossa mainittu radioisotooppi on 123i, 125l tai 1!1in. 30

13, Koostumus fibriini- tai venhlutaieverisuonitukoksen potilaassa kuvantamiseksi ex vivo, jolloin mainittu koostumus käsittää farmaseuttisesti hyväksyttävän puskurin sekä patenttivaatimuksen 1 mukaista trombiini-inhibiit-toria.

14. Menetelmä fibriini- tai verihiutaleverisuonitukoksen potilaassa 35 kuvantamiseksi ex vivo, käsittäen seuraavat vaiheet: (a) potilaalle annetaan patenttivaatimuksen 13 mukaista koostumusta; ja (b) käytetään toteamiskeinoja mainitun koostumuksen sisältämän trombiini-inhibiittorin havaitsemiseksi.

15. Koostumus potilaaseen vietävän invasiivisen välineen pinnan päällystämiseksi, jolloin mainittu koostumus käsittää sopivan puskurin ja ainakin yhtä jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista trambiini-inhibälitöria.

16. Menetelmä potilaaseen vietävän invasiivisen välineen pinnan päällystämiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheen, jossa mainittu pinta saatele taan kosketuksiin patenttivaatimuksen 15 mukaisen koostumuksen kanssa. i i