DE19549118C2 - Hämostaseaktivierungs-Inhibitor und Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung in Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Hämostaseaktivierungs-Inhibitor und Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung in Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten

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Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Arginin, Guanidiniumsalz oder Guanidinoessigsäure als Inhibitor der Aktivierung der Hämostase und ein Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung im Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten.
Die Hämostase ist das System, welches die Fließbarkeit des Blutes reguliert. Sie ist gekoppelt mit Immunantwort und Ent­ zündung. Störungen der Hämostase gehen einher mit Fehlregula­ tionen des enzymatischen Gerinnungs- und/oder Fibrinolyse- Systems. Diese Störungen sind oft lebensbedrohlich.
Bei der Gewinnung und Vorbereitung von Blutproben für die Diagnose, im besonderen für die Diagnose von Gerinnungsstörun­ gen und Hämostaseaktivierung, ist zu beachten, daß es nicht in vitro zur Gerinnungsaktivität kommt, welche das Meßergebnis verfälschen würde. Wichtige diagnostische und therapeutische Entscheidungen werden auf der Basis der mit diesen Proben erzielten Ergebnisse getroffen. Die Art des verwendeten Hämo­ staseaktivierungs-Inhibitors, der als Antikoagulans und/oder Antifibrinolytikum wirkt, ist von äußerster Wichtigkeit, da er Einfluß auf das Analysenergebnis nimmt.
Im Stand der Technik (siehe z. B. DE 35 05 555 A1) sind verschiedene Verbindungen bekannt, die als Inhibitoren der Blutgerinnung wirken. Diese Inhibitoren haben verschiedene Nachteile: Beispielsweise antagonisiert das herkömmlich verwendete Citrat-Blut (Trinatriumcitrat in einer Konzentration von 0,11 Mol/l in H2O im Verhältnis von 1 Teil Citrat zu 9 Teilen Blut) nicht ausreichend die Kontaktphase der Hämostase. Es kommt trotz Calciumkomplexierung zu geringer Prothrombin- oder Plasminogen-Aktivierung. Die entstehende Thrombin- oder Plasmin-Aktivität ist als in vitro Artefakt anzusehen und verfälscht im besonderen die Meßergebnisse der hochsensitiven Hämostaseteste (wie z. B. der Nachweis von löslichem Fibrin oder von Thrombin-Antithrombin III (TAT)- oder Plasmin-Antiplasmin (PAP)-Komplexen). Besondere Schwierigkeiten ergeben sich bei der Untersuchung von eingefrorenen Proben, da das Kontaktsystem der Hämostase bei Temperaturen zwischen 0°C und 15°C aktiviert wird.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Inhibitor der Aktivierung der Hämostase (sog. Hämostaseaktivierungs-Inhibitor) bereitzustellen, der die Diagnose und Therapie von Hämostasestörungen, wie einer pathologisch erhöhten Hämostaseaktivierung, erlaubt und die Nachteile von Citrat überwindet.
Die Aufgabe wird durch die Verwendung von Arginin, Guanidiniumsalz oder Guanidinoessigsäure als Inhibitor der Aktivierung der Hämostase gelöst.
Der Ausdruck "Hämostaseaktivierungs-Inhibitor" bedeutet, wie er hierin verwendet wird, daß das Blutgerinnungs- und Fibrinolyse- System an mindestens einer Stelle unterbrochen wird, d. h. keine Aktivierung oder nur eine geringfügige Aktivierung der Hämo­ stase stattfindet. Die erfindungsgemäßen Hämostaseaktivierungs- Inhibitoren wirken anti-koagulierend, anti-fibrinolytisch und/oder als kompetitive Serinproteaseninhibitoren. Insbeson­ dere bindet der Serin-, Histidin- oder Asparaginsäurerest im aktiven Zentrum der Serinproteasen, zu denen verschiedene Hämo­ staseenzyme gehören, bestimmte Aminosäureseitenketten, vor allem von basischen Aminosäuren des Substratpolypeptids, und das Polypeptid wird an der entsprechenden Stelle geschnitten.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen ähneln den mit dem aktiven Zentrum der Serinproteasen interagierenden Gruppen und konkurrieren mit diesen um die Bindung am aktiven Zentrum, werden jedoch nicht umgesetzt.
Der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-Inhibitor kann auch für die Transfusion und/oder zum Behandeln von pathologischer Hämostaseaktivierung, wie die Verbrauchskoagulopathie oder die disseminierte, intravasale Gerinnung, verwendet werden, da die erfindungsgemäßen Plasmakonzentrationen beispielsweise von Arginin leicht auch therapeutisch erreicht werden können. Ins­ besondere wird erfindungsgemäß Arginin mit einem physiologi­ schen pH-Wert von 7,4 verwendet. Ferner kann der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor zur Diagnose einer Hämostase­ aktivierung verwendet werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Ver­ fahren bereitzustellen, durch welches eine Hämostaseaktivierung im Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten verhindert werden kann.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, in dem der vorste­ hend erwähnte Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in vitro in Mengen zu Blut oder Plasma zugegeben wird, daß Konzentrationen im Bereich von 1 bis 200 mMol/l, vorzugsweise 5 bis 150 mMol/l erhalten werden.
Dabei hat es sich bewährt, den Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in einer Menge vorzulegen, daß ein Mischungsverhältnis von 1 : 2 bis 1 : 20, vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 10, mit Blut eine Plasma­ konzentration von 100 bis 136 mMol/l (bei einem Hämatokrit von 35 bis 55%) ergibt. Besonders bevorzugt ist es, 685 mMol/l Hämostaseaktivierungs-Inhibitor, wie z. B. Arginin (pH 8,5) bei einem Mischungsverhältnis von 1 : 10 oder 367 mMol/l Hämostase­ aktivierungs-Inhibitor bei einem Mischungsverhältnis von 1 : 5 in einem Blutentnahmebehälter vorzulegen, wenn man einen Hämato­ krit von 35 bis 55% berücksichtigt.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn der Hämostase­ aktivierungs-Inhibitor in Kombination mit Calciumkomplex­ bildnern, vorzugsweise Ethylendiamintetraacetat (EDTA), einge­ setzt wird.
Der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor für die Behandlung von Blut oder Plasma sollte einen basischen pH-Wert, vorzugsweise im Bereich von pH 7,4 bis 9, besonders bevorzugt pH 8,5 bis 8,8, aufweisen. Beim diagnostischen Nachweisverfahren können auch noch alkalischere pH-Werte (bis zu pH 11) angewendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu­ tert.
Beispiel 1 Antikoagulation durch Arginin oder Guanidinium
1000 µl Proben menschlichen Citrat-Blutes wurden steigenden Konzentrationen an Argininhydrochlorid oder Guanidiniumcarbonat (pH 8,5) ausgesetzt. 25 µl 1000 mMol/l CaCl2 wurden hinzugefügt und die Gesamtblutgerinnungszeit bei Raumtemperatur bestimmt.
Ergebnis
Arginin- oder Guanidinium in Blut führt zu einer signifikanten Verlängerung der Gerinnungszeit. Konzentrationen über 100 mMol/l hemmen die Gerinnung vollständig.
Beispiel 2 Antikoagulation der Kontaktphase der Hämostase bei Einfrieren/­ Auftauen
1000 µl Proben von gepooltem normalem Citratplasma, welches steigende Konzentrationen an Arginin oder Guanidiniumcarbonat (pH 9) enthält, wurden bei -20°C eingefroren und anschließend bei 37°C im Wasserbad wiederaufgetaut. Die Proben wurden auf deren Gehalt an löslichem Fibrin getestet (®Coaset FM, Kabi Vitrum, Mölndal, Schweden).
Ergebnis
Einfrieren/Auftauen von herkömmlichem Plasma induziert Fibrin­ bildung, da das Kontaktsystem der Blutgerinnung aktiviert wird. Der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-Inhibitor verhindert dies in Konzentrationen < 100 mMol/l. Bereits Konzentrationen unter 50 mMol/l reduzieren die Fibrinbildung um mehr als 50%.
Beispiel 3 Diagnostik von Aktivierungsmarkern der Hämostase
Blut von n = 23 gesunden Blutspendern wurde
  • a) in herkömmlichen Citratröhrchen (ein Teil 0,11 mol/l Trinatriumcitrat zu 9 Teilen Blut)
  • b) in Arginin-EDTA Röhrchen (ein Teil 0,685 mol/l Arginin, pH 8.5, zu 9 Teilen Blut, 1,5 mg/ml EDTA)
aufgenommen, 15 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert und
  • a) sofort
  • b) nach 3 Stunden bei Raumtemperatur
  • c) nach Einfrieren und Wiederauftauen
auf die plasmatische Konzentration an Thrombin-Antithrombin III (TAT)-Komplexen (Behringwerke, Marburg, Deutschland), löslichem Fibrin [LF] (Kabi, Mölndal, Schweden), α2-Makroglobulin­ komplexiertes Thrombin und α2-Makroglobulin-komplexiertes Plasmin untersucht. Dazu wurden 50 µl Plasma, 50 µl Thrombin­ standard (0,01 NIH-Einheiten (10 mU)/ml in 150 mMol Tris, 120 mMol/l Arginin, 0,1% Triton X 100® pH 8,0), 50 µl Plasminstan­ dard (0,001 CTA-Einheiten (1 mU)/ml in 150 mMol Tris, 120 mMol/l Arginin, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0) mit 100 µl 75 mMol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, 600 mMol/l KCl, 150 mMol/l Arginin, pH 8.0, enthaltend
  • a) 1,5 mMol/l chromogenes Substrat für Thrombin HD-Phe-Pip-Arg­ pNA
  • b) 1,5 mMol/l chromogenes Substrat für Plasmin HD-Val-Leu-Lys­ pNA
35 Minuten bei 45°C (Erhitzungsblock für Mikrotiterplatten, Organon, Turnhout, Belgien) inkubiert. Daraufhin wurde die spe­ zifische Extinktionsänderung bei 405 nm (und gegebenenfalls ein Trübungsausgleich bei 490 nm) bestimmt. Als Nullwert diente die Messung nach 5 Minuten Inkubation. Standardisiert wurde durch den mitgeführten reinen Enzymwert. Alternativ dazu kann das Substrat-Reagenz in 50 µl 2x konzentriert und zusätzlich 50 µl 40 mMol/l Chloramin T® zugesetzt oder 600 mMol/l KCl, 150 mMol/l Arginin, pH 8, beispielsweise durch 300 mMol/l eines Guanidinogruppen-tragenden Hämostaseaktivierungs-Inhibitors, pH 7 bis 11, vorzugsweise pH 8 bis 10, ersetzt werden. Vorteil­ haft ist ein Reaktionsgemisch-Reagenz aus Hämostaseaktivie­ rungs-Inhibitor und Singulett-Sauerstoff-Erzeuger.
Ergebnis
Citrat-Plasma
Guanidino-Plasma
Man erkennt, daß Citrat ein ungenügendes Antikoagulans und Antifibrinolytikum ist. Sowohl Gerinnung als auch Fibrinolyse können noch aktiviert werden. Bereits wenige Stunden Inkuba­ tion bei Raumtemperatur führen zu artifiziell veränderten Meß­ werten.
Besonders schlecht ist die anti-hämostaseaktivierende Wirkung bei Einfrieren/Auftauen der Proben. Im Gegensatz dazu erweist sich der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-Inhibitor als sehr geeignet, um auch nach mehrstündiger Inkubation der Blut­ probe oder nach Einfrieren/Auftauen verläßliche Werte zu erhalten.
Beispiel 4 Stabilität der Leukozyten a) in Abhängigkeit der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor-Konzen­ tration
1000 µl Proben von 1. EDTA-Blut und 2. Citrat-Blut wurden mit ansteigenden Konzentrationen an a) Guanidiniumcarbonat, pH 9, oder b) Argininhydrochlorid, pH 9, versehen. Nach einer Inkuba­ tionszeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Blut­ zellen automatisch gezählt.
Ergebnis
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) sind stabil bei Hämostaseaktivierungs-Inhibitor-Konzentrationen bis zu etwa 150 mMol/l in EDTA-Blut und bis zu etwa 75 mMol/l in Citrat-Blut. Überraschenderweise erweist sich EDTA-Blut gegenüber dem für Gerinnungsuntersuchungen sonst üblichen Citrat-Blut als über­ legen mit Hinsicht auf eine Kombination mit einem kompetitiven Hämostaseaktivierungs-Inhibitor.
b) Leukozyten-Stabilität in Abhängigkeit des pH-Wertes
1000 µl Proben von Citrat-Blut wurden mit 100 mMol/l a) Guani­ diniumcarbonat oder b) Argininhydrochlorid unterschiedlichen pH-Wertes supplementiert. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Blutzellen automatisch gezählt.
Ergebnis
Thrombozyten und Lymphozyten sind relativ resistent gegenüber den hier untersuchten pH-Änderungen. Neutrophile Granulozyten sind bis zu einem pH-Wert des Hämostaseaktivierungs-Inhibitors von 8,5 stabil, pH 9 erzeugt einen etwa 7%-igen Verlust an Zellen. Die vermehrte Lyse von Granulozyten muß vermieden werden, da deren granuläre Enzyme zu einer artifiziellen Abänderung der zu messenden Hämostaseparameter führen würden. Daher sollte der erfindungsgemäße Hämastoseaktivierungs-Inhibi­ tor einen pH Wert ≦ 9 haben.
Erythrozyten sind bei Konzentrationen des Hämostaseaktivie­ rungs-Inhibitors (Antikoagulans/Antifibrinolytikums) bis zu 150 mMol/l Plasma stabil. Konzentrationen über 150 mMol/l können eine Hämolyse erzeugen.
Beispiel 5 Antifibrinolytische Wirkung von Arginin und Guanidinium
50 µl Guanidiniumcarbonat oder Argininhydrochlorid (pH 8) ansteigender Konzentration (0-1000 mMol/l) wurden mit 50 µl a) 5 IU Urokinase/ml, b) 1 µg Zwei-Ketten-t-PA/ml und 100 µg BrCN-Abbauprodukte des Fibrinogen, c) 1 µg Zwei-Ketten-t-PA/ml ohne t-PA-Stimulator, d) 0,1 CTA-Einheiten Plasmin/ml mit 50 µl 10 CTA-Einheiten Plasminogen/ml in Testpuffer (100 mMol/l Tris, 0,01% Triton X 100®, pH 8,5 und 50 µl 3 mMol HD-Val-Leu-Lys- pNA/ml 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Extinktionsänderung bei 405 nm bestimmt.
Ergebnis: Arginin und Guanidinium in Konzentrationen < 100 mMol/l inhibieren die Urokinase- oder t-PA vermittelte Fibrino­ lyse vollständig. 25 mMol/l Hämostasteaktivierungs-Inhibitor (Antikoagulans/Antifibrinolytikum) inhibieren die Fibrinolyse zu ca. 50%. Amidolytische Plasminaktivität wird bis zu 200 mMol/l Arginin nicht inhibiert.
Beispiel 6 Einfluß des Mischungsverhältnisses auf Erythrocytenstabilität
  • a) 500 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge­ legten 25 µl 1400 mMol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 20).
  • b) 450 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge­ legten 50 µl 685 mMol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 10).
  • c) 400 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge­ legten 100 µl 367 mMol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 5).
  • d) 250 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge­ legten 250 µl 179 mMol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 2).
  • e) 250 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge­ legten 250 µl 0,9% NaCl gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 2).
Daraufhin wurde 10 Minuten bei 2000 × g abzentrifugiert, und
  • a) 74 µl Überstand und 126 µl 0.9% NaCl (zum Volumenausgleich)
  • b) 81 µl Überstand und 119 µl 0.9% NaCl (zum Volumenausgleich)
  • c) 100 µl Überstand und 100 µl 0.9% NaCl (zum Volumenausgleich)
  • d) 200 µl Überstand
  • e) 200 µl Überstand
auf eine Mikrotiterplatte pipettiert und die Extinktion bei 405 nm bestimmt.
Ergebnis
  • a) 0,283
  • b) 0,322
  • c) 0,331
  • d) 0,342
  • e) 0,347
Man erkennt, daß auch hochkonzentrierter Hämostaseaktivierungs- Inhibitor in der Vorlage nicht zu einer verstärkten Hämolyse des Blutes führt. Eine Hämolyse würde von e) nach a) zunehmende Extinktionswerte verursachen.
Beispiel 7 Bestimmung der Kontaktaktivator-induzierten, fibrinolytischen Aktivität von Plasma
50 µl a) Arginin/EDTA-antikoaguliertes Plasma und b) Citrat- Plasma von n = 23 normalen Blutspendern wurde mit 50 µl 15 mMol/l Chloramin T® und 150 µl Testreagenz, bestehend aus 50 µg/ml Ellagsäure in 100 mMol/l Tris, 0,1% Triton X 100® pH 8,0, 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurden 50 µl 3 mMol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 2 mol/l KCl, 10 mMol/l Tranexamsäure, 300 mMol/l Arginin zugegeben, bei 45°C inkubiert und die Extink­ tionsänderung/15 Minuten bei 405 nm bestimmt. Als Nullwert dient eine Messung mit Zusatz des chromogenen Substrat-Reagen­ zes sofort nach dem Testreagenz.
Ergebnis: Der Normalbereich der Kontaktphasen-aktivierten, fibrinolytischen Aktivität liegt bei 100% ± 30% (Mittelwert ± Standardabweichung) (100% = ca. 0,100 Extinktionseinhei­ ten/15 Minuten). Die aktivierte fibrinolytische Aktivität läßt sich nur in Arginin- oder Guanidinium-antikoagulierten Proben bestimmen. Im CitratPlasma kommt es zu einer unspezifischen Aktivierung der Kontaktphase der Hämostase, Prourokinase wird vorzeitig, d. h. noch bevor das Plasma im Test eingesetzt werden kann, zu Urokinase aktiviert, und diese wird durch Plasminogen- Aktivator-Inhibitor inaktiviert. Daraus resultiert eine fälsch­ lich erniedrigte, Kontaktphasen-aktivierte, fibrinolytische Aktivität.
Beispiel 8 Antikoagulierende Wirkung von Arginin
Bei 50 µl normalem menschlichen Citrat-Plasma, welches 0 bis 140 mMol/l Arginin enthält, wurde die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) und die Thromboplastinzeit (PT) bestimmt.
Ergebnis
Zunehmende Konzentrationen an Arginin im Plasma führen zu einer verlängerten aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und Thromboplastinzeit.
Beispiel 9 Einfluß des pH-Wertes auf die antikoagulierende Wirkung von Arginin
50 µl normales menschliches Plasma wurden mit 50 µl einer a) 50 mMol/l b) 100 mMol/l Arginin-Lösung in aqua dest. unter­ schiedlichen pH-Wertes (Kontrolle: 50 µl aqua dest.) und 50 µl 25 mMol/l CaCl2 bei 37°C in einem Kugelkoagulometer (Amelung, Lemgo, Deutschland) inkubiert und die Gerinnungszeit doppelt bestimmt.
Ergebnis
Man erkennt, daß der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs- Inhibitor mit stärker alkalisch werdendem pH das Plasma besser antikoaguliert, daß aber auch bei physiologischem pH-Wert bereits eine deutliche antikoagulierende Wirkung von Arginin vorhanden ist (Verhältnis = 1,4 bei 16,7 mMol/l Endkonzentra­ tion).
Beispiel 10 Hämostaseaktivierungs-Inhibition bei Hämostasestörung wie bei Verbrauchkoagulopathie
50 µl a) normales, gepooltes Citrat-Plasma und b) Plasma mit 5,7 Urokinase-inhibierenden Einheiten Plasminogen-Aktivator- Inhibitor-1 (PAI-1)/ml wurden mit 10 µg löslichem Fibrin (Kabi, Möldal, Schweden) supplementiert. Daraufhin wurden 8 ng aktiver Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) zugesetzt, 15 Minuten bei 37°C und einem Endvolumen von 200 µl in An- und Abwesenheit von 20 mMol/l Arginin inkubiert, und die entstandene Plasminaktivität bestimmt, indem 50 µl 3 mMol/l HD-Val-Leu-Lys- pNA in 2 mol/l KCl zugesetzt wurden und die entstehende Absorptionsänderung/15 Minuten bei 405 nm doppelt ermittelt wurde.
Ergebnis
Man erkennt, daß der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs- Inhibitor die Fibrinolyseaktivierung durch lösliches Fibrin auf unter 50% des Ausgangswertes zu drücken vermag. Außerdem kommt es zu einer Neutralisierung des PAI-1 (Verhältnis b)/a): ohne Arginin = 0,59; mit Arginin = 0,93), welchem pathogenetische Bedeutung bei der disseminierten intravasalen Gerinnung und/oder bei septikämischen Krankheitszuständen zukommt.
Beispiel 11 Spezifischer Nachweis von löslichem Fibrin in Gegenwart eines Hämostaseaktivierungs-Inhibitors
  • 1. 25 µl a) normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 34 µg/ml löslichem Fibrin (Kabi, Mölndal, Schweden) supplemen­ tiert wurde, und
  • 2. normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 1000 µg/ml BrCN-Fibrinogenspaltprodukten (Boehringer Mannheim, Deutschland) supplementiert wurde,
    wurden inkubiert wie in folgender Aufstellung angegeben. Die zusammen mit dem t-PA-Substrat Plasminogen (oder alternativ dem t-PA) zugesetzte Konzentration an Arginin (oder Guanidinium) wurde variiert (13 bis 90 mMol/l Endkonzentration). Die erhaltenen Extinktionswerte für b) wurden durch die bei a) erhaltenen geteilt.
    25 µl Plasma (120 mMol/l Arginin, 7 mMol/l EDTA)
    + 100 µl 9 CTA-Einheiten Lys-Plasminogen/ml in 100 mMol/l Tris, 0,05% Triton X 100®, 125 mMol/l Arginin, pH 8
    + 50 µl 12 mMol/l Chloramin T®
    + 50 µl 2,5 µg t-PA/ml in 30 mMol/l Natriumacetat, pH 4,2, 0.05% Triton 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
    + 25 µl 3 mMol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 3,6 mol/l KCl delta A/min bei 405 nm ablesen
    Bestimmungen bei 0 mMol/l Arginin (Endkonz.) erfolgten ohne Zusatz von Arginin in Plasma und Test. Zur Nullwertkontrolle wird dem Plasminogen-Reagenz 10 mMol/l Tranexamsäure (Aminomethylcyclohexansäure → Inhibition der t-PA Stimulation durch lösliches Fibrin) zugesetzt. Der erhaltene Wert wird vom Hauptwert abgezogen.
Ergebnis
70 mMol/l (Endkonz.) Arginin
a) delta A/min = 0,053
b) delta A/min = 0,0036
Ein hoher Quotient zeigt hohe Spezifität für Fibrin an, ein tiefer Wert zeigt an, daß der Test nicht zwischen Fibrin und Fibrinogenspaltprodukten diskriminiert. Je höher die zugesetzte Argininkonzentration, desto spezifischer wird Fibrin nachgewie­ sen. Die t-PA-Stimulation durch Fibrinogenspaltprodukte wird durch Arginin unterdrückt. So kann zwischen Thrombin- und Plasmin-Wirkung auf Blut unterschieden werden. Kovalent ver­ netztes Fibrin wird vom Hämostaseaktivierungs-Inhibitor nicht entpolymerisiert, im Gegensatz zu polymerisiertem Fragment X. Arginin oder Guanidinium inhibiert allerdings auch die Plasminogen-Aktivierung des zugefügten t-PA. Deswegen ergibt sich beim enzymatischen Test ein Optimum an Arginin zwischen 50 und 100 mMol/l Endkonz. Lösliches Fibrin oder polymerisiertes Fragment X kann auch über Antikörper nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Agens würde die Antikörperspezifität beträcht­ lich erhöhen.

Claims (9)

1. Verwendung von Arginin, Guanidiniumsalz oder Guanidinoessigsäure als Inhibitor der Aktivierung der Hämostase.
2. Verwendung eines Hämostaseaktivierungs-Inhibitors nach Anspruch 1 zur Behandlung von pathologischer Hämostaseaktivierung.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pathologische Hämostaseaktivierung eine Verbrauchskoagulopathie oder eine disseminierte, intravasale Gerinnung ist.
4. Verwendung eines Hämostaseaktivierungs-Inhibitors nach Anspruch 1 zur Diagnose einer Hämostaseaktivierung.
5. Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung in Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hämostaseaktivierungs-Inhibitor nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 in vitro in Mengen zu Blut oder Plasma zugegeben wird, daß Konzentrationen im Bereich von 1 bis 200 mMol/l erhalten werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in Mengen zugegeben wird, das Konzentrationen im Bereich von 5 bis 150 mMol/l erhalten werden.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in einer Menge vorgelegt wird, das ein Mischungsverhältnis 1 : 2 bis 1 : 20, vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 10, mit Blut eine Plasmakonzentration von 100 bis 136 mMol/l (bei einem Hämotokrit von 35 bis 55%) ergibt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Ethylendiamintetraacetat (EDTA) eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor einen basischen pH-Wert, vorzugsweise 7,4 bis 9, bevorzugt pH 8,5 bis 8,8, insbesondere pH von 7,4 hat.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10116586B4 (de) * 2001-04-03 2005-07-21 Stief, Thomas, Dr.med. Testsystem zur Bestimmung der Hämostaseaktivierung von biologischen Flüssigkeiten
DE10222234A1 (de) * 2002-05-16 2003-11-27 Roche Diagnostics Gmbh Kontroll- und Kalibrationsmaterial für Blutgerinnungstests
KR20120024610A (ko) * 2009-05-20 2012-03-14 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 혈액응고시간 연장제

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0185390A2 (de) * 1984-12-21 1986-06-25 Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R.T. Tripeptidyl-argininaldehyde, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel sowie N-(Monoalkyl)- und N,N-Di-(alkyl)-Xxx-L-prolin-Dipeptide
EP0192135A2 (de) * 1985-02-18 1986-08-27 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Neue Oligopeptidylargininolderivate und deren Homologe, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel
WO1993011759A1 (en) * 1991-12-16 1993-06-24 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Antithrombotic diaminoalkanoic acid derivatives
WO1993018060A1 (en) * 1992-03-04 1993-09-16 Gyógyszerkutató Intézet Kft. New anticoagulant peptide derivatives and pharmaceutical compositions containing the same as well as a process for the preparation thereof
WO1994008941A1 (en) * 1992-10-16 1994-04-28 Corvas International, Inc. Arginine keto-amide enzyme inhibitors
EP0623595A1 (de) * 1993-05-03 1994-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Guanidinyl- oder Amidinyl-substituiertes heterocyclische Thrombinhemmer
US5416093A (en) * 1991-11-12 1995-05-16 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
WO1995013805A1 (en) * 1993-11-17 1995-05-26 Duke University Medical Center Use of nitric oxide synthase inhibitors in the treatment of autoimmune diseases
US5439888A (en) * 1994-03-04 1995-08-08 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
WO1995023608A1 (en) * 1994-03-04 1995-09-08 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
WO1995023809A1 (en) * 1994-03-04 1995-09-08 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
EP0671390A2 (de) * 1994-03-04 1995-09-13 Eli Lilly And Company Antithrombotische Mittel
EP0672665A1 (de) * 1994-03-04 1995-09-20 Eli Lilly And Company Verbindungen zur Hemmung der Thrombin
US5514409A (en) * 1989-08-18 1996-05-07 Biogen, Inc. Methods for coating invasive devices with inhibitors of thrombin

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0185390A2 (de) * 1984-12-21 1986-06-25 Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R.T. Tripeptidyl-argininaldehyde, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel sowie N-(Monoalkyl)- und N,N-Di-(alkyl)-Xxx-L-prolin-Dipeptide
EP0192135A2 (de) * 1985-02-18 1986-08-27 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Neue Oligopeptidylargininolderivate und deren Homologe, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel
DE3505555A1 (de) * 1985-02-18 1986-09-11 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neue oligopeptidylargininolderivate und deren homologe, verfahren zu deren herstellung, deren verwendung und diese enthaltende mittel
US5514409A (en) * 1989-08-18 1996-05-07 Biogen, Inc. Methods for coating invasive devices with inhibitors of thrombin
US5416093A (en) * 1991-11-12 1995-05-16 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
WO1993011759A1 (en) * 1991-12-16 1993-06-24 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Antithrombotic diaminoalkanoic acid derivatives
WO1993018060A1 (en) * 1992-03-04 1993-09-16 Gyógyszerkutató Intézet Kft. New anticoagulant peptide derivatives and pharmaceutical compositions containing the same as well as a process for the preparation thereof
WO1994008941A1 (en) * 1992-10-16 1994-04-28 Corvas International, Inc. Arginine keto-amide enzyme inhibitors
EP0623595A1 (de) * 1993-05-03 1994-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Guanidinyl- oder Amidinyl-substituiertes heterocyclische Thrombinhemmer
WO1995013805A1 (en) * 1993-11-17 1995-05-26 Duke University Medical Center Use of nitric oxide synthase inhibitors in the treatment of autoimmune diseases
US5439888A (en) * 1994-03-04 1995-08-08 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
WO1995023608A1 (en) * 1994-03-04 1995-09-08 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
WO1995023809A1 (en) * 1994-03-04 1995-09-08 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
EP0671390A2 (de) * 1994-03-04 1995-09-13 Eli Lilly And Company Antithrombotische Mittel
EP0672665A1 (de) * 1994-03-04 1995-09-20 Eli Lilly And Company Verbindungen zur Hemmung der Thrombin

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