DE19549118A1 - Hämostaseaktivierungs-Inhibitor und Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung in Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten - Google Patents
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor und Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung in Blut oder anderen biologischen FlüssigkeitenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Guanidinogruppen-
enthaltenden Verbindung oder eines Derivats davon als
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor, ein Verfahren zum Hemmen der
Hämostaseaktivierung im Blut oder anderen biologischen
Flüssigkeiten sowie die Verwendung einer Guanidinogruppen
enthaltenden Verbindung zum Behandeln pathologischer
Hämostaseaktivierung, wie Verbrauchskoagulopathie.
Die Hämostase ist das System, welches die Fließbarkeit des
Blutes reguliert. Sie ist gekoppelt mit Immunantwort und Ent
zündung. Störungen der Hämostase gehen einher mit Fehlregula
tionen des enzymatischen Gerinnungs- und/oder Fibrinolyse-
Systems. Diese Störungen sind oft lebensbedrohlich.
Bei der Gewinnung und Vorbereitung von Blutproben für die
Diagnose, im besonderen für die Diagnose von Gerinnungsstörun
gen und Hämostaseaktivierung, ist zu beachten, daß es nicht in
vitro zur Gerinnungsaktivität kommt, welche das Meßergebnis
verfälschen würde. Wichtige diagnostische und therapeutische
Entscheidungen werden auf der Basis der mit diesen Proben
erzielten Ergebnisse getroffen. Die Art des verwendeten Hämo
staseaktivierungs-Inhibitors, der als Antikoagulans und/oder
Antifibrinolytikum wirkt, ist von äußerster Wichtigkeit, da er
Einfluß auf das Analysenergebnis nimmt.
Das herkömmlich verwendete Citrat-Blut (Trinatriumcitrat in
einer Konzentration von 0,11 mol/l in H₂O im Verhältnis von
1 Teil Citrat zu 9 Teilen Blut) antagonisiert nicht ausreichend
die Kontaktphase der Hämostase. Es kommt trotz Calciumkomple
xierung zu geringer Prothrombin- oder Plasminogen-Aktivierung.
Die entstehende Thrombin- oder Plasmin-Aktivität ist als in
vitro Artefakt anzusehen und verfälscht im besonderen die
Meßergebnisse der hochsensitiven Hämostaseteste (wie z. B. der
Nachweis von löslichem Fibrin oder von Thrombin-Antithrombin
III (TAT)- oder Plasmin-Antiplasmin (PAP)-Komplexen). Besondere
Schwierigkeiten ergeben sich bei der Untersuchung von eingefro
renen Proben, da das Kontaktsystem der Hämostase bei Temperatu
ren zwischen 0°C und 15°C aktiviert wird.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor bereitzustellen, der die
Diagnose und Therapie von Hämostasestörungen, wie einer
pathologisch erhöhten Hämostaseaktivierung, erlaubt und die
Nachteile von Citrat überwindet.
Die Aufgabe wird durch die Verwendung einer mindestens eine
Guanidinogruppe der Formel -NH-C(NH₂)=NH oder eines Derivats
davon enthaltenden Verbindung als Hämostaseaktivierungs-
Inhibitor gelöst.
Als Derivate kommen Substitutionen am Stickstoffatom der Guani
dinogruppe in Frage. So kann das Wasserstoffatom beispielsweise
durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie eine
Methylgruppe, substituiert werden.
Der Ausdruck "Hämostaseaktivierungs-Inhibitor" bedeutet, wie er
hierin verwendet wird, daß das Blutgerinnungs- und Fibrinolyse-
System an mindestens einer Stelle unterbrochen wird, d. h. keine
Aktivierung oder nur eine geringfügige Aktivierung der Hämo
stase stattfindet. Die erfindungsgemäßen Hämostaseaktivierungs-
Inhibitoren wirken anti-koagulierend, anti-fibrinolytisch
und/oder als kompetitive Serinproteaseninhibitoren. Insbeson
dere bindet der Serin-, Histidin- oder Asparaginsäurerest im
aktiven Zentrum der Serinproteasen, zu denen verschiedene Hämo
staseenzyme gehören, bestimmte Aminosäureseitenketten, vor
allem von basischen Aminosäuren des Substratpolypeptids, und
das Polypeptid wird an der entsprechenden Stelle geschnitten.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen ähneln den mit dem
aktiven Zentrum der Serinproteasen interagierenden Gruppen und
konkurrieren mit diesen um die Bindung am aktiven Zentrum,
werden jedoch nicht umgesetzt.
Insbesondere kann Guanidinocarbonsäure, wie Guanidinoessig
säure, vorzugsweise mit Glycin oder Natriumhydrogencarbonat auf
pH 7 bis 11, vorzugsweise 8 bis 10, gepuffert, oder Guanidin
verwendet werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Ver
fahren bereitzustellen, durch welches eine Hämostaseaktivierung
im Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten verhindert
werden kann.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, in dem der vorste
hend erwähnte Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in Mengen zu Blut
oder Plasma zugegeben wird, daß Konzentrationen im Bereich von
1 bis 200 mmol/l, vorzugsweise 5 bis 150 mmol/l erhalten
werden.
Dabei hat es sich bewährt, den Hämostaseaktivierungs-Inhibitor
in einer Menge vorzulegen, daß ein Mischungsverhältnis von 1 : 2
bis 1 : 20, vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 10, mit Blut eine Plasma
konzentration von 100 bis 136 mmol/l (bei einem Hämatokrit von
35 bis 55%) ergibt. Besonders bevorzugt ist es, 685 mmol/l
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor, wie z. B. Arginin (pH 8,5) bei
einem Mischungsverhältnis von 1 : 10 oder 367 mmol/l Hämostase
aktivierungs-Inhibitor bei einem Mischungsverhältnis von 1 : 5 in
einem Blutentnahmebehälter vorzulegen, wenn man einen Hämato
krit von 35 bis 55% berücksichtigt.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn der Hämostase
aktivierungs-Inhibitor in Kombination mit Calciumkomplex
bildnern, vorzugsweise EDTA, eingesetzt wird.
Der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor für die Behandlung von Blut
oder Plasma sollte einen basischen pH-Wert, vorzugsweise im
Bereich von pH 7,4 bis 9, besonders bevorzugt pH 8,5 bis 8,8,
aufweisen. Beim diagnostischen Nachweisverfahren können auch
noch alkalischere pH-Werte (bis zu pH 11) angewendet werden.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelte Blut oder
Plasma eignet sich für die Diagnose, insbesondere für die
Diagnose von Hämostasestörungen, wie pathologischer Hämostase
aktivierung.
Der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-Inhibitor kann auch
für die Transfusion und/oder zum Behandeln von pathologischer
Hämostaseaktivierung, wie die Verbrauchskoagulopathie oder die
disseminierte, intravasale Gerinnung, verwendet werden, da die
erfindungsgemäßen Plasmakonzentrationen beispielsweise von
Arginin leicht auch therapeutisch erreicht werden können. Ins
besondere wird erfindungsgemäß Arginin mit einem physiologi
schen pH-Wert von 7,4 verwendet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu
tert.
1000 µl Proben menschlichen Citrat-Blutes wurden steigenden
Konzentrationen an Argininhydrochlorid oder Guanidiniumcarbonat
(pH 8,5) ausgesetzt. 25 µl 1000 mmol/l Cacl₂ wurden hinzugefügt
und die Gesamtblutgerinnungszeit bei Raumtemperatur bestimmt.
Arginin- oder Guanidinium in Blut führt zu einer signifikanten
Verlängerung der Gerinnungszeit. Konzentrationen über
100 mmol/l hemmen die Gerinnung vollständig.
1000 µl Proben von gepooltem normalem Citratplasma, welches
steigende Konzentrationen an Arginin oder Guanidiniumcarbonat
(pH 9) enthält, wurden bei -20°C eingefroren und anschließend
bei 37°C im Wasserbad wiederaufgetaut. Die Proben wurden auf
deren Gehalt an löslichem Fibrin getestet (®Coaset FM, Kabi
Vitrum, Mölndal, Schweden).
Einfrieren/Auftauen von herkömmlichem Plasma induziert Fibrin
bildung, da das Kontaktsystem der Blutgerinnung aktiviert wird.
Der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-Inhibitor verhindert
dies in Konzentrationen <100 mmol/l. Bereits Konzentrationen
unter 50 mmol/l reduzieren die Fibrinbildung um mehr als 50%.
Blut von n = 23 gesunden Blutspendern wurde
- a) in herkömmlichen Citratröhrchen (ein Teil 0,11 mol/l Trinatriumcitrat zu 9 Teilen Blut)
- b) in Arginin-EDTA Röhrchen (ein Teil 0,685 mol/l Arginin, pH 8.5, zu 9 Teilen Blut, 1,5 mg/ml EDTA)
aufgenommen, 15 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert und
- 1. sofort
- 2. nach 3 Stunden bei Raumtemperatur
- 3. nach Einfrieren und Wiederauftauen
auf die plasmatische Konzentration an Thrombin-Antithrombin III
(TAT)-Komplexen (Behringwerke, Marburg, Deutschland), löslichem
Fibrin [LF] (Kabi, Mölndal, Schweden), α2-Makroglobulin
komplexiertes Thrombin und α2-Makroglobulin-komplexiertes
Plasmin untersucht. Dazu wurden 50 µl Plasma, 50 µl Thrombin
standard (0,01 NIH-Einheiten (10 mU)/ml in 150 mmol Tris, 120
mmol/l Arginin, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0), 50 µl Plasminstan
dard (0,001 CTA-Einheiten (1 mU)/ml in 150 mmol Tris, 120
mmol/l Arginin, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0) mit 100 µl 75
mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, 600 mmol/l KCl, 150 mmol/l
Arginin, pH 8.0, enthaltend
- a) 1,5 mmol/l chromogenes Substrat für Thrombin HD-Phe-Pip-Arg- pNA
- b) 1,5 mmol/l chromogenes Substrat für Plasmin HD-Val-Leu-Lys- pNA
35 Minuten bei 45°C (Erhitzungsblock für Mikrotiterplatten,
Organon, Turnhout, Belgien) inkubiert. Daraufhin wurde die spe
zifische Extinktionsänderung bei 405 nm (und gegebenenfalls ein
Trübungsausgleich bei 490 nm) bestimmt. Als Nullwert diente die
Messung nach 5 Minuten Inkubation. Standardisiert wurde durch
den mitgeführten reinen Enzymwert. Alternativ dazu kann das
Substrat-Reagenz in 50 µl 2× konzentriert und zusätzlich 50 µl
40 mmol/l Chloramin T® zugesetzt oder 600 mmol/l KCl,
150 mmol/l Arginin, pH 8, beispielsweise durch 300 mmol/l eines
Guanidinogruppen-tragenden Hämostaseaktivierungs-Inhibitors,
pH 7 bis 11, vorzugsweise pH 8 bis 10, ersetzt werden. Vorteil
haft ist ein Reaktionsgemisch-Reagenz aus Hämostaseaktivie
rungs-Inhibitor und Singulett-Sauerstoff-Erzeuger.
Man erkennt, daß Citrat ein ungenügendes Antikoagulans und
Antifibrinolytikum ist. Sowohl Gerinnung als auch Fibrinolyse
können noch aktiviert werden. Bereits wenige Stunden Inkuba
tion bei Raumtemperatur führen zu artifiziell veränderten Meß
werten.
Besonders schlecht ist die anti-hämostaseaktivierende Wirkung
bei Einfrieren/Auftauen der Proben. Im Gegensatz dazu erweist
sich der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-Inhibitor als
sehr geeignet, um auch nach mehrstündiger Inkubation der Blut
probe oder nach Einfrieren/Auftauen verläßliche Werte zu
erhalten.
1000 µl Proben von 1. EDTA-Blut und 2. Citrat-Blut wurden mit
ansteigenden Konzentrationen an a) Guanidiniumcarbonat, pH 9,
oder b) Argininhydrochlorid, pH 9, versehen. Nach einer Inkuba
tionszeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Blut
zellen automatisch gezählt.
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) sind stabil bei
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor-Konzentrationen bis zu etwa 150
mmol/l in EDTA-Blut und bis zu etwa 75 mmol/l in Citrat-Blut.
Überraschenderweise erweist sich EDTA-Blut gegenüber dem für
Gerinnungsuntersuchungen sonst üblichen Citrat-Blut als über
legen mit Hinsicht auf eine Kombination mit einem kompetitiven
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor.
1000 µl Proben von Citrat-Blut wurden mit 100 mmol/l a) Guani
diniumcarbonat oder b) Argininhydrochlorid unterschiedlichen
pH-Wertes supplementiert. Nach einer Inkubationszeit von
2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Blutzellen automatisch
gezählt.
Thrombozyten und Lymphozyten sind relativ resistent gegenüber
den hier untersuchten pH-Änderungen. Neutrophile Granulozyten
sind bis zu einem pH-Wert des Hämostaseaktivierungs-Inhibitors
von 8,5 stabil, pH 9 erzeugt einen etwa 7%-igen Verlust an
Zellen. Die vermehrte Lyse von Granulozyten muß vermieden
werden, da deren granuläre Enzyme zu einer artifiziellen
Abänderung der zu messenden Hämostaseparameter führen würden.
Daher sollte der erfindungsgemäße Hämastoseaktivierungs-Inhibi
tor einen pH Wert 9 haben.
Erythrozyten sind bei Konzentrationen des Hämostaseaktivie
rungs-Inhibitors (Antikoagulans/Antifibrinolytikums) bis zu
150 mmol/l Plasma stabil. Konzentrationen über 150 mmol/l
können eine Hämolyse erzeugen.
50 µl Guanidiniumcarbonat oder Argininhydrochlorid (pH 8)
ansteigender Konzentration (0-1000 mmol/l) wurden mit 50 µl a)
5 IU Urokinase/ml, b) 1 µg Zwei-Ketten-t-PA/ ml und 100 µg
BrCN-Abbauprodukte des Fibrinogen, c) 1 µg Zwei-Ketten-t-PA/ml
ohne t-PA-Stimulator, d) 0,1 CTA-Einheiten Plasmin/ml mit 50 µl
10 CTA-Einheiten Plasminogen/ml in Testpuffer (100 mmol/l Tris,
0,01% Triton X 100®, pH 8,5 und 50 µl 3 mmol HD-Val-Leu-Lys-
pNA/ml 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde
die Extinktionsänderung bei 405 nm bestimmt.
Ergebnis: Arginin und Guanidinium in Konzentrationen <100
mmol/l inhibieren die Urokinase- oder t-PA vermittelte Fibrino
lyse vollständig. 25 mmol/l Hämostasteaktivierungs-Inhibitor
(Antikoagulans/Antifibrinolytikum) inhibieren die Fibrinolyse
zu ca. 50%. Amidolytische Plasminaktivität wird bis zu 200
mmol/l Arginin nicht inhibiert.
- a) 500 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge legten 25 µl 1400 mmol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 20).
- b) 450 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge legten 50 µl 685 mmol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 10).
- c) 400 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge legten 100 µl 367 mmol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 5).
- d) 250 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge legten 250 µl 179 mmol/l Arginin, pH 8,5, gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 2).
- e) 250 µl EDTA-Blut wurden mit einer 50 µl Pipette zu vorge legten 250 µl 0,9% NaCl gegeben (Mischungsverhältnis 1 : 2).
Daraufhin wurde 10 Minuten bei 2000 × g abzentrifugiert, und
- a) 74 µl Überstand und 126 µl 0.9% NaCl (zum Volumenausgleich)
- b) 81 µl Überstand und 119 µl 0.9% NaCl
- c) 100 µl Überstand und 100 µl 0.9% NaCl
- d) 200 µl Überstand
- e) 200 µl Überstand
auf eine Mikrotiterplatte pipettiert und die Extinktion bei
405 nm bestimmt.
Ergebnis:
- a) 0,283
- b) 0,322
- c) 0,331
- d) 0,342
- e) 0,347
Man erkennt, daß auch hochkonzentrierter Hämostaseaktivierungs-
Inhibitor in der Vorlage nicht zu einer verstärkten Hämolyse
des Blutes führt. Eine Hämolyse würde von e) nach a) zunehmende
Extinktionswerte verursachen.
50 µl a) Arginin/EDTA-antikoaguliertes Plasma und b) Citrat-
Plasma von n = 23 normalen Blutspendern wurde mit 50 µl
15 mmol/l Chloramin T® und 150 µl Testreagenz, bestehend aus
50 µg /ml Ellagsäure in 100 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH
8,0, 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurden 50 µl 3 mmol/l
HD-Val-Leu-Lys-pNA in 2 mol/l KCl, 10 mmol/l Tranexamsäure, 300
mmol/l Arginin zugegeben, bei 45°C inkubiert und die Extink
tionsänderung/15 Minuten bei 405 nm bestimmt. Als Nullwert
dient eine Messung mit Zusatz des chromogenen Substrat-Reagen
zes sofort nach dem Testreagenz.
Ergebnis: Der Normalbereich der Kontaktphasen-aktivierten,
fibrinolytischen Aktivität liegt bei 100% ± 30% (Mittelwert ±
Standardabweichung) (100% = ca. 0,100 Extinktionseinhei
ten/15 Minuten). Die aktivierte fibrinolytische Aktivität läßt
sich nur in Arginin- oder Guanidinium-antikoagulierten Proben
bestimmen. Im CitratPlasma kommt es zu einer unspezifischen
Aktivierung der Kontaktphase der Hämostase, Prourokinase wird
vorzeitig, d. h. noch bevor das Plasma im Test eingesetzt werden
kann, zu Urokinase aktiviert, und diese wird durch Plasminogen-
Aktivator-Inhibitor inaktiviert. Daraus resultiert eine fälsch
lich erniedrigte, Kontaktphasen-aktivierte, fibrinolytische
Aktivität.
Bei 50 µl normalem menschlichen Citrat-Plasma, welches 0 bis
140 mmol/l Arginin enthält, wurde die aktivierte partielle
Thromboplastinzeit (APTT) und die Thromboplastinzeit (PT)
bestimmt.
Zunehmende Konzentrationen an Arginin im Plasma führen zu
einer verlängerten aktivierten partiellen Thromboplastinzeit
und Thromboplastinzeit.
50 µl normales menschliches Plasma wurden mit 50 µl einer a)
50 mmol/l b) 100 mmol/l Arginin-Lösung in aqua dest. unter
schiedlichen pH-Wertes (Kontrolle: 50 µl aqua dest.) und 50 µl
25 mmol/l CaCl₂ bei 37°C in einem Kugelkoagulometer (Amelung,
Lemgo, Deutschland) inkubiert und die Gerinnungszeit doppelt
bestimmt.
Man erkennt, daß der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-
Inhibitor mit stärker alkalisch werdendem pH das Plasma besser
antikoaguliert, daß aber auch bei physiologischem pH-Wert
bereits eine deutliche antikoagulierende Wirkung von Arginin
vorhanden ist (Verhältnis = 1,4 bei 16,7 mmol/l Endkonzentra
tion).
50 µl a) normales, gepooltes Citrat-Plasma und b) Plasma mit
5,7 Urokinase-inhibierenden Einheiten Plasminogen-Aktivator-
Inhibitor-1 (PAI-1)/ml wurden mit 10 µg löslichem Fibrin (Kabi,
Möldal, Schweden) supplementiert. Daraufhin wurden 8 ng aktiver
Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) zugesetzt, 15 Minuten bei
37°C und einem Endvolumen von 200 µl in An- und Abwesenheit von
20 mmol/l Arginin inkubiert, und die entstandene
Plasminaktivität bestimmt, indem 50 µl 3 mmol/l HD-Val-Leu-Lys-
pNA in 2 mol/l KCl zugesetzt wurden und die entstehende
Absorptionsänderung/15 Minuten bei 405 nm doppelt ermittelt
wurde.
Man erkennt, daß der erfindungsgemäße Hämostaseaktivierungs-
Inhibitor die Fibrinolyseaktivierung durch lösliches Fibrin auf
unter 50% des Ausgangswertes zu drücken vermag. Außerdem kommt
es zu einer Neutralisierung des PAI-1 (Verhältnis b)/a): ohne
Arginin = 0,59; mit Arginin = 0,93), welchem pathogenetische
Bedeutung bei der disseminierten intravasalen Gerinnung
und/oder bei septikämischen Krankheitszuständen zukommt.
25 µl a) normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 34 µg/ml
löslichem Fibrin (Kabi, Mölndal, Schweden) supplemen
tiert wurde, und
b) normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 1000 µg/ml BrCN-Fibrinogenspaltprodukten (Boehringer Mannheim, Deutschland) supplementiert wurde,
b) normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 1000 µg/ml BrCN-Fibrinogenspaltprodukten (Boehringer Mannheim, Deutschland) supplementiert wurde,
wurden inkubiert wie in folgender Aufstellung angegeben. Die
zusammen mit dem t-PA-Substrat Plasminogen (oder alternativ dem
t-PA) zugesetzte Konzentration an Arginin (oder Guanidinium)
wurde variiert (13 bis 90 mmol/l Endkonzentration). Die
erhaltenen Extinktionswerte für b) wurden durch die bei a)
erhaltenen geteilt.
25 µl Plasma (120 mmol/l Arginin, 7 mmol/l EDTA)
+ 100 µl 9 CTA-Einheiten Lys-Plasminogen/ml in 100 mmol/l Tris, 0,05% Triton X 100®, 125 mmol/l Arginin, pH 8
+ 50 µl 12 mmol/l Chloramin T®
+ 50 µl 2,5 µg t-PA/ml in 30 mmol/l Natriumacetat, pH 4,2, 0.05% Triton 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
+ 25 µl 3 mmol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 3,6 mol/l KCl delta A/ min bei 405 nm ablesen
+ 100 µl 9 CTA-Einheiten Lys-Plasminogen/ml in 100 mmol/l Tris, 0,05% Triton X 100®, 125 mmol/l Arginin, pH 8
+ 50 µl 12 mmol/l Chloramin T®
+ 50 µl 2,5 µg t-PA/ml in 30 mmol/l Natriumacetat, pH 4,2, 0.05% Triton 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
+ 25 µl 3 mmol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 3,6 mol/l KCl delta A/ min bei 405 nm ablesen
Bestimmungen bei 0 mmol/l Arginin (Endkonz.) erfolgten ohne
Zusatz von Arginin in Plasma und Test. Zur Nullwertkontrolle
wird dem Plasminogen-Reagenz 10 mmol/l Tranexamsäure
(Aminomethylcyclohexansäure → Inhibition der t-PA Stimulation
durch lösliches Fibrin) zugesetzt. Der erhaltene Wert wird vom
Hauptwert abgezogen.
Ergebnis:
70 mmol/l (Endkonz.) Arginin
70 mmol/l (Endkonz.) Arginin
- a) delta A/ min = 0,053
- b) delta A/ min = 0,0036
Ein hoher Quotient zeigt hohe Spezifität für Fibrin an, ein
tiefer Wert zeigt an, daß der Test nicht zwischen Fibrin und
Fibrinogenspaltprodukten diskriminiert. Je höher die zugesetzte
Argininkonzentration, desto spezifischer wird Fibrin nachgewie
sen. Die t-PA-Stimulation durch Fibrinogenspaltprodukte wird
durch Arginin unterdrückt. So kann zwischen Thrombin- und
Plasmin-Wirkung auf Blut unterschieden werden. Kovalent ver
netztes Fibrin wird vom Hämostaseaktivierungs-Inhibitor nicht
entpolymerisiert, im Gegensatz zu polymerisiertem Fragment X.
Arginin oder Guanidinium inhibiert allerdings auch die
Plasminogen-Aktivierung des zugefügten t-PA. Deswegen ergibt
sich beim enzymatischen Test ein Optimum an Arginin zwischen 50
und 100 mmol/l Endkonz. Lösliches Fibrin oder polymerisiertes
Fragment X kann auch über Antikörper nachgewiesen werden. Das
erfindungsgemäße Agens würde die Antikörperspezifität beträcht
lich erhöhen.
Claims (14)
1. Verwendung einer mindestens eine Guanidinogruppe der
Formel -NH-C(NH₂)=NH oder eines Derivats davon ent
haltenden Verbindung als Hämostaseaktivierungs-Inhibitor.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Verbindung Guanidinocarbonsäure oder Guanidin ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Guanidinocarbonsäure Guanidinoessigsäure und das
Guanidin Guanidiniumcarbonat ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
die Guanidinoessigsäure vorzugsweise mit Glycin oder
Natriumhydrogencarbonat auf pH 7 bis 11, vorzugsweise pH 8
bis 10, gepuffert ist.
5. Verfahren zum Hemmen der Hämostaseaktivierung in Blut oder
anderen biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeich
net, daß ein Hämostaseaktivierungs-Inhibitor nach einem
der Ansprüche 1 bis 4 in Mengen zu Blut oder Plasma zuge
geben wird, daß Konzentrationen im Bereich von 1 bis
200 mmol/l erhalten werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der
Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in Mengen zugegeben wird,
daß Konzentrationen im Bereich von 5 bis 150 mmol/l erhal
ten werden.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet,
daß der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor in einer Menge
vorgelegt wird, daß ein Mischungsverhältnis von 1 : 2 bis
1 : 20, vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 10, mit Blut eine Plasma
konzentration von 100 bis 136 mmol/l (bei einem Hämatokrit
von 35 bis 55%) ergibt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor
einen basischen pH-Wert, vorzugsweise pH 7,4 bis 9, beson
ders bevorzugt pH 8,5 bis 8,8, hat.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß zusätzlich Ethylendiamintetraacetat
(EDTA) eingesetzt wird.
10. Verwendung des durch das Verfahren nach einem der Ansprü
che 5 bis 9 behandelten Bluts oder Plasmas für die
Diagnose oder für die Transfusion.
11. Verwendung nach Anspruch 10 für die Diagnose von Hämo
staseaktivierung.
12. Verwendung eines Hämostaseaktivierungs-Inhibitors nach
einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Behandeln von pathologi
scher Hämostaseaktivierung.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die pathologische Hämostaseaktivierung eine Verbrauchs
koagulopathie oder eine disseminierte, intravasale Gerin
nung ist.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Hämostaseaktivierungs-Inhibitor einen
pH-Wert von 7,4 hat.
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