JPS63159396A - 新規なポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は凝固因子（ｃｌｏｔｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）　
■ａの新規なポリペプチド拮抗薬に関する。凝固因子■
ａの細胞レセプター（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ）へのこれら拮抗薬の結合は、保護的脈管性凝固を
そこなうことなく、脈管血栓症を選択的に予防すること
ができ、これによって血栓症疾患の処置に対する新規な
アプローチが提供される。

因子１ｘは４１６個のアミノ酸を含むビタミンに一依存
性血漿糖蛋白質であり、このものは血液凝固機構に中心
的な役割を果たしている［フジカワ（ｐ＋、ｊｉｋａｗ
ａ）等、バイオケミストリイ（［ｌｉｏｃｈｅｍ、）、
１２：４９３８（１９７３）：カタヤマ（Ｋａｔａｙａ
ｍａ）等、プロシーディング・サブ・ナショナル・アカ
デミイ・サブ・サイエンス・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾）、
７６　：　４９９０（１９７９）　ニチュー（Ｃｈｏｏ
）等、ネイチャー（Ｈａｔｕｒｅ）、２９９　：１７８
　（１９８２）：クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）等、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９
　：　６４６１　（１９８２）ニジエイ（Ｊａｙｅ）等
、ヌクリア・＋　２３２５　（１９８３）］。ヒト及び
ウシの分子の完全なアミノ酸配列が発表されている（Ｋ
ａｔａｙａｍａ）等、Ｃｈｏｏ等、Ｋｕｒａｃｈｉ等及
びＪａｙｅ等、上記）。

活性化によって、因子ＩＸａ　［Ｆｕｊｉｋａｗａ等、
Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１３　：４５０８　（１９７４）］または因子■ａ−組
織因子［オスチルド（Ｏｓｔｅｒｕｄ）等、Ｐｒｏｃ、
　ＮａＬＩ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４　：　５２６０　（
１９７７）］による限定された蛋白質分解のために、酵
素型、因子■ａは因子■、カルシウム及び適当な細胞ま
たはリン脂質表面の存在下において、因子Ｘの活性化を
促進する［ファン・ディエイジエン（ＶａｎＤｉｃｉｊ
ｅｎ）等、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミス
トリイ（ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ＋１．）、２５６
　：　３４３３　　（１９８１）　　コ　。

因子■は止血（出血の予防）において重要な凝固蛋白質
であるが、また該因子は血栓症、血管を閉鎖する脈管内
凝塊の病理学的形成、結果として起こる心筋層破壊（ｍ
ｙｏｃａｒｄｉａｌ　１ｎｆｒａｃｔｉｏｎ）、発作及
び血栓塞栓症機構に含まれる他の疾患に関係している。

かくして、因子■ａのウサギへの注入はウエツセラー（
Ｗｅｓｓｌｅｒ）静脈うっ血モデルにおいて、局在性血
栓症を引き起こす［ジチル（Ｇｉｔｅｌ）等、　Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ
ＳＡ　　７　４　−３　０　２８（１９７７）］、他の
凝固蛋白質と比較して。

因子［ａは最も有効なトロンボゲン形成剤（ｔｈｒｏｍ
ｂｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）である。

最近の研究は、局在性凝塊形成に基づき、因子ＩＸ及び
内皮性細胞間の相互作用に集中されている［スターン（
Ｓｔｅｒｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　
Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　８０：４１１９　（１９８３）：ハイマーク
（Ｉｌｅｉｍａｒｋ）等、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミユニケイジョン（Ｂｉ
。

ｅｂｃｍ、　［１ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋
＊、）　１１１　：　７２３　（１９８３）：５ｔｅｒ
ｎ等、ジャーナル・サブ・クリニカル・インベステイゲ
イション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

ヱ４　：　１９１０　（１９８４）　　；　５ｔｅｒｎ
等、Ｐｒｏｃ　。

Ｎ１１．＾ｅｎｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　：　９
１３　（１９８４）：　５ｔｅｒｎ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、２６０：６７１７　（１９８５）：ナラ
ロス（Ｎａｗｒｏｔｈ）等、プリティッシュ・ジャーナ
ル・サブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔ、　Ｊ。

Ｈａｅｍａｔｏｌ、）　６３　：　３０９　（１９８’
６）コ。内皮、血管を内張すする細胞は広く分布する（
ｕｂｉｑｕｉｔｏｕＳ）血管表面を与えるために、これ
は、因子ＩＸａとその内皮性細胞表面結合部位との相互
作用が因子ＩＸａのトロンボゲン形成性に基づいて与え
られ得ることを示唆するものである。

本発明は血液凝塊因子■及びその活性化された形態（因
子ｆｆａ）の脈管内皮におけるその細胞レセプターへの
結合を選択的に抑制する方法及び組成物を提供するもの
である。因子ＩＸ　／　Ｉ’Ｘ　ａの結合抑制は因子Ｉ
Ｘ蛋白質の特定の領域から誘導された新規なポリペプチ
ドの使用によって達成される。

因子１分子の表面増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、または
そのサブシーケンス（Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）からな
るペプチドはその細胞レセプターに結合するために因子
ＩＸ　／　ＩＸ　ａと特異的に競合し、これによって因
子ｆＸ／ＩＭａの結合を抑制することができる。かかる
結合を抑制することによって、脈管血栓症を予防するこ
とができる０本発明のペプチドによる特異的作用は脈管
内皮に局在するために、脈管血栓症を、損傷に対する防
御に必須である正常な脈管外凝塊に影響を及ぼすことな
く、予防することができる。

因子■分子におけるＥＧＦドメインの機能は未知である
。その名称はＥＧＦ、即ち細胞レセプターを有すること
が知られているポリペプチドホルモンと若干の相同を示
すことに由来する。ＥＧＦドメインは因子■分子におい
てアミノ酸残基４７〜１３６個からなる。

他の抗凝固剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子
（ＴＰＡ）と対比して、本発明のペプチドは試験管内に
おいて血液の凝塊に影響を及ぼさない。かくして、すで
に生じた凝塊を溶解しようとする線維製溶解治療（例え
ばＴＰＡによる）と対比して、本発明の化合物をまず第
一に危険な脈管凝塊の形成を予防するために用いること
ができる。また、本発明の方法及び組成物は、すでに存
在する凝塊を外科的に除去した後の凝塊再発を予防する
ために、線維製溶解治療（ＴＰＡによる如く）または他
の方法によって再検査または維持治療に用いることがで
きる。

従って、本発明はペプチドが因子ＩＸ　／　ＩＸ　ａの
細胞レセプターに選択的に結合し得る因子ＩＸのＥＧＦ
ドメインまたはそのサブシーケンスからなる新規なペプ
チドを提供するものである０本発明の典型的なペプチド
は、ヒト及びウシの因子１Ｍ分子のそれぞれアミノ酸残
基４７−５１．４Ｂ−５１，４１−５０，４３−５４，
４３−５０に対応する次のアミノ酸配列からなる。

Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ。

Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Δ
５ｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ。

Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｎｌ（２、Ｌｙｓ
−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＩＩ２、 及び Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｎ−ＮＨ２゜更に本発明の目的は、ペプチド
が因子Ｉ）（／ＩＸａの細胞レセプターに選択的に結合
し得る因子ＩＸのＥ　Ｇ　Ｆドメインまたはそのサブシ
ーケンスからなるペプチド及び製薬学的に許容し得る担
体からなる製薬学的組成物を提供することである。

更に本発明の目的は、ペプチドが因子１’！／［Ｘａの
細胞レセプターに選択的に結合し得る因子ＩＸのＥＧＰ
ドメインまたはそのサブシーケンスからなるペプチドの
治療的有効址及び製薬学的に許容し得る担体を動物また
は人間に投与し、因子ＩＸ／ＩＸａの結合を抑制し、そ
して脈管血栓症を予防することからなる脈管血栓症を予
防するための本発明のペプチドの使用方法を提供する。

本発明のペプチドは溶液または、好ましくは同相、例え
ばメリフィールドの方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）［ジ
ャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ン゛ナエ
テイ　（Ｊ、　　八ｍ、　　ＣＩ＋ｅｍ、　　Ｓｏｃ、
）８　！シー：２１４９（１９６３）］または当該分野
において既知の同等の方法において、通常のペプチド合
成法によって製造することができる。

固相合成は、保護されたアミノ酸を適当な樹脂にカップ
リングさせることによって、ペプチドのＣ−末端から開
始される。出発物質は保護されたアミノ酸をベンジルエ
ステル連鎖を介してクロロメチル化された樹脂またはヒ
ドロキシルメチル樹脂に、或いはアミド結合を介してベ
ンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはメチルベンズ
ヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）Ｉ脂に結合させることによ
って製造することができる。これらの樹脂は市販品であ
り、その製造及び用途はよく知られている。

本発明に使用し得るアミノ酸の保護及び保護基の除去に
対する一般的な方法は「ザ・ペプチドＪ（“ゴｈｅ　Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ”）、第２巻、１〜２８４頁（１９７９
）［グロス（Ｅ、ＧｒｏｓＳ）及びメインホツファ−（
Ｊ、　Ｍｃｉｅｎｈｏｆｅｒ）編集、アカデミツク・プ
レス、ニューヨーク（＾ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ
、　Ｎｅｔｏ　Ｙｏｒｋ）］に記載されている。保護基
には例えばＬｅｒｔ、−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏ
ａ）　、ベンジル（Ｂｚ　Ｉ　）、２−クロロベンジル
オキシカルボニル（２（Ｊ−ｚ）及び３゜４−ジメチル
ペンシル（Ｄｍｂ）基が含まれる。

最初の（Ｃ−末端）アミノ酸からα−アミン保護基を除
去した後、残りの保護されたアミノ酸を所望の順序で段
階的にカップリングさせる。この方法で全体のペプチド
を合成することができる。

また、最終ペプチド生成物を得るために、後に結合させ
る小さなポリペプチドを構成させることもできる。３［
Ｉ当なカップリング試薬は当該分野において既知であり
、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が殊に適
している。

各保護されたアミノ酸またはペプチドを過剰址において
同相反応器に導入し、カップリングをジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）または塩化メチレン（ＣＨ２Ｃ１２）　
、或いはその混合物の媒コ中で行なうことができる。不
完全なカップリングが起こる場合、カップリング操作を
、次のアミノ酸のカップリング前に、Ｎａ−アミン保護
基を除去する前にくり返し行う０合成の各に階でのカッ
プリング反応の結果を監視することができる。合成を監
視する好ましい方法はニンヒドリン反応による方法であ
る。カップリング反応及び洗浄は自動化された装置を用
いて行うことができる。

樹脂からペプチドの開裂はペプチド化学においてよく知
られた方法を用いて行うことができる。

例えばｐ−クレゾール及びジメチルスルファイドの存在
下において０℃で１時間、フッ化水素との反応に続いて
、ｐ−クレゾールの存在下において０℃で２時間、フッ
化水素との第二の反応を行うことができる。クロロメチ
ル化されたまたはヒドロキシメチル樹脂担体からペプチ
ドの開裂により、Ｃ−末端でカルボニル基を有する完成
ペプチドを生ずる。ベンズヒドリルアミンまたはメチル
ベンズヒドリルアミン樹脂からペプチドの開裂により、
Ｃ−末端アミド基を有するペプチドを生ずる。かかる基
を本明細書において−Ｘ−ＮＨ２、但し、ＸはＣ−末端
アミノ酸残基である、として表わｒ。

また、本発明のペプチドは組換えＤ　Ｎ　Ａ技術の当該
分野において既知の方法を用いて製造することができる
。

本発明のポリペプチドの精製は、これに限定するもので
はないが、ゲル浸透（濾過）等電点電気泳動、イオン交
換及び分配クロマトグラフィーまたは向流分配を含む方
法を用いて行うことができる。分取ＨＰＬＣが特に好ま
しい。

本発明のペプチドは、通常の製薬学的調製物化法によっ
て製造することができる医薬または獣医薬組成物の形態
で投与することができる。経口、静脈内、皮下、肛門内
、筋肉内または腹腔内投与に適する組成物を用いること
ができる。患者を線維製溶解治療（例えばＴＰＡを使用
）のために入院させた場合、静脈内注入を投与径路とし
て選ぶ。

夕景のペプチドを用いる場合、腸溶被覆したまたは重合
体液のうした経口用調ｒＲ物を用いることができる。

本発明のペプチドを無菌の水または塩水による還元のた
めに凍結９２燥することができる。当業者によっては明
らかな如く、適当な投与形態は個々の患者及び使用条件
に応じて変わるであろう。動物または人間の患者に対す
る適当なレベルを決定するために、単なる常用実験を必
要とするのみである。

Ｆ、　ＯＦドメインの最初の１５残基（因子ＩＸの残基
４６〜６０に対応する）はウシ及びヒト因子ＩＸ分子と
同一である。２つの分子において対応する残基間にある
差異があっても、これらのものは密接な同族体である。

ＥＧＦドメインのより多くまたはすべてを包含する大き
なペプチド、或いは可変性がある領域からのアミノ酸の
サブシーケンスに基づく小さなペプチドに対して、ヒト
配列に基づくペプチド［Ｋｕｒａｃｈｉ等、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳ＾７９：６４
６１　（１９８２）］が人間の治療に好ましい。

それにもかかわらず、種々の哺乳動物種からの因子■分
子間の近い相同は、次の実施例において知り得る如く、
ウシ及びヒトＥＧＦ配列に基づく本発明の例証するペプ
チドがウシ及びウサギの双方の血管組織において活性で
あることである。

本発明の組成物及び方法を次の非限定実施例によって例
証することができる。

］１」Ｌニヘズチ上圓介暖交囚症１ 以下の記述において次の略号を用いた：ＢＨＡ＝ベンズ
ヒドリルアミン Ｂｏｃ＝　ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルＢ　７．
　Ｉ　＝　ベンジル ２Ｃ１−Ｚ＝２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｄｃｂ−　ジクロロベンジル Ｄｍｂ＝　　３．４−ジメチルベンジル、ヒトまたはウ
シ因子■分子のそれぞれ残基４７〜５１及び４３〜５１
に対応するペンタペプチド及びノナペプチドを、ライル
ナ−（Ｗｉｌｎｃｒ）等、ｎｉｏｃｈｅｍ．　１　５　
：　１　２０９　（１　９７６）に記載されたメリフィ
ールドの固相法の改変によって合成した．合成をマイク
ロコンピュータ−規制ベガ（Ｖｃｇａ）モデル１０００
自動合成機によって行った。十分に保護されたペプチド
樹脂の開裂及び脱保護はタム（Ｔａ＋ｅ）等、Ｊ．八ｍ
．　Ｃｈｅ＋ａ．　Ｓｏｅ．　１　０　５　：　６　４
４２　（１９８３）に記載の二段階法を用いて、無水フ
ッ化水素によって行った。

粗製の脱保護されたペプチドの精製を、スフエリソルブ
（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ）　ＯＤＳ−１　（　２　、　
５　Ｘ　２　５　ｅ＋ａ）カラムを用いて高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰｔ，Ｃ）によって行い、該カラム
を０．０２５％トリフルオロ酢ｉ（ＴＦＡ）水−アセト
ニトリルグラジェントで溶離した．生成物の純度は分析
用高速液体クロマトグラフィーによって〉９５％である
ことがわかり、アミノ酸組成はアミノ酸分析計によって
確認した。

更に上記のペプチドの均質性にする精製はヌクレオシル
（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　Ｃ　＋ｓ　（　５）ｌ）カラ
ム（１×５０ｃｍ）を用いて行い、該カラムを水及びＣ
Ｈ３ＣＮ（双方０．０２５％ＴＦＡ含有）からなる溶媒
によって、１４０分にわたりＣＨ３ＣＮ５〜２５％の直
線グラジェント範囲で、流速３ｔｓ１／分で溶離した。

３ｍｉフラクションを捕集し、被検体を分析用Ｈ　Ｐ　
Ｌ　Ｃ系で分析した。ペプチドを含むフラクションをプ
ールし、蒸発させ、そして凍結乾燥した。

精製したペプチドのアミノ酸配列は＾ｓｐーＧｌｙー＾
ｓｐーＧｌｎーＣｙｓ及びＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖ
ａｌ−＾ｓｐーＧｌｙー八ｓｐ−ＧｌｒへＣｙｓであっ
た。

ヒト及びウシ因子■分子の残基３４〜５４に対応するド
デカペプチドを次の如くして製造した。

Ｂｏｃ−＾ｓｎーＢｌｌ＾ー樹脂（５ｇ、０　、　２　
０　ｍｅｇ／ｇ−樹脂）をベガ・カップラー・モデル１
０００ペプチド・シンセサイザー（Ｖｃｇａ　Ｃｏｕｐ
ｌｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　１０００　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙ
ｎｔｂｅｓｉｚｅｒ）の反応容器に充填し、同相合成を
、バラニイ（Ｄａｒａｎｙ）等により、［ザ・ペプチド
・分析、合成、生物学Ｊ　　（　”Ｔｈｅ　）’ｅｐｔ
ｉｄｅｓ：＾ｎａｌｙｓｉｓ，　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
　Ｂｉｏｌｏｇｙ”）、第２巻、１〜２８４頁（１９７
９）、グロス（Ｅ．　Ｇｒｏｓｓ）及びＪ．Ｍｅｉｃｎ
ｈｏｆｅｒ編集、＾ｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、に記載された方法を用いる対称性
無水物によって行った。合計１１循環を次のＮα−Ｂｏ
ａアミノ酸：Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）
、　Ｃｙｓ（Ｄｎ＋ｂ）、　Ｇｌｎ，＾ｓｐ（ＯＢｚｌ
）。

Ｇｌｙ，＾ｓｐ（Ｏ１３ｚｌ）、　Ｖｎｌ，　Ｔｙｒ（
Ｄｃｂ）、　にＩｎ及びＬｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）によって
行い、十分にアッセンブリーされた保護されたペプチド
樹脂を得た。

保護されたペプチド充填の一部（０．４０ｇ＞を０℃で
１時間、１０％ジチオエタンを含む無水液体ＨＦで処理
した。Ｈ　Ｆを０℃で蒸発させ（高真空下、Ｃａｂトラ
ップ）、４１１Ｍのペプチド及び樹脂混合物をＦ．　ｔ
　Ｏ　Ａ　ｃと共に破解し、Ｔ　Ｉ”　Ａで抽出し、蒸
発させ、残渣なエーテルと共に破解し、そして乾燥した
。収量は０．１９ｇであった。

粗製の物質を、０．０２５％ＴＦＡを含有する水１０社
に溶解し、０．４５μミリボアタイプ（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ　Ｔｙｐｅ）　ＨＡフィルターを通して濾過し、前
記の如く、ヌクレオシリＣｌｌカラムで精製した。

最終収量は１２ｍｇであった。生成物は分析用）ＩＰＬ
　Ｃによって均等であることがわかり、次の予想したア
ミノ酸組成を有することがわかった。（６Ｎ　ＩＩｃＩ
，　１１　ＴＦＡ、１５０℃、時間）：＾ｓｐ，２。

９３　　二　Ｓｅｒ，　　０．９５　　；Ｇｌｕ，　　
　３．０３　　；Ｇｌｙ，　　　１．１０　；Ｖａｌ，
　１．０５　；Ｔｙｒ，　０．９　１　；Ｌｙｓ，　　
１．００。

配列分析により正確なアミノ酸配列が確証され、高速原
子衝撃質量スペクトル分析は１３８４．２７　（ＭＨ”
　＞［計算値：　１　３８４．５８　（ＭＨ”　）］で
分子イオンを示した。

このペプチドのアミノ酸配列はＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ
−Ｖａｌ−＾ｓｐーＧｌｙー＾ｓｐ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ
−Ｇ　ｌｕ−Ｓｅｒ−ＡＳｎ−Ｎ！１７であった。

同様の方法を用いて、ウシ因子ＴＩの残基４３〜５０、
９１〜１０６及び１１３〜１２４に対応するアミノ酸配
列を有するペプチドの酸アミドを製造した。これらのペ
プチドのアミノ酸配列は次の通りであった； Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｎ−ＮＩＩ２、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｎ−ＮＨ２、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ｃｙ、
５−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｃ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−＾ｒ
ｇ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−＾ｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｎｌｌ
□及び＾ｓｐ−にＩｙ−Ｔｙｒ−＾ｒＨ−Ｌｅｕ−＾１
ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ
−ＮＨ２゜ オクタペプチドは、大きなペプチドのＣ−末端システィ
ンがないことを除いて、上記のノナペプチドと同様であ
ることを注意すべきである。デカペプチドはオクタペプ
チドに加えて２つの追加のアミノ−末端アミノ酸残基が
らなっていた。

ドデカペプチド及びヘキサデカペプチドを因子■配列の
コンピューター解析による査定に基づいて製造し、これ
らのものは分子の表面に露出された因子ＩＸの領域に対
応する。コンピューター解析をホップ（Ｈｏｏｐ）等［
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾
７８：３８２４　（１９８１）］、ガーニア（Ｇａｒｎ
ｉｅｒ）等［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｉ）ｉｏｌ、　１２０　
：　９７　（１９７８Ｌ］及びカイテ（にｙｔｅ）等（
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１５７　：　１０５（
１９８２）］の研究に基づくプログラムを用いて行った
。

これら４種のアミノ酸組成分析により予想された組成が
確証され、全てのペプチドは分析用ＨＰＬＣによって均
等であることがわかった。

火範」３−ペプチドのパ−性 試験管内結合実＠：精製したペプチドをウシ因子ＩＸ及
び■ａの培養したウシ大動脈内皮細胞への結合を阻止す
るその能力を試験した。これらの試験に体するウシ因子
■及びＩＸａはスターン（Ｓｔｅｒｎ）等によって［Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、　２６０　：　６７１７
（１９８５）］に記載された方法を用いて、精製し、そ
して放射性ヨウ素化した（Ｎａ１２Ｊ及び固体状態ラク
トパーオキシダーゼ法を用いた）。ウシ大動脈内皮細胞
はスターン等によってＩ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ８０：４１１９（１９８３）に記載
された如くして、生まれたばかりの子牛の大動脈から得
られ、そして培養血中で増殖させて集密化した＜１．３
ＸＩＯ’細胞／ｃＩ１１２）。結合アッセイは、ペプチ
ドの１つの変化する濃度の存在下において、１′■−因
子ＩＸまたは＋２５）−因子ＩＸａを内皮細胞単分子層
と共に培養することによって行った。

この実験に用いた緩衝剤はトランスフェリン０゜５ｖａ
ｇ／ｍｌを含む最小必須培地（ＭＥＭ＞であり、培養時
間は４℃で４〜５時間であった。培養時間の終了時に培
養液の洗浄を行い、未結合の物質を除去し、特異的に結
合した［＋２５Ｉ］−因子■または［１２５Ｉ］−因子
ＩＸａを、スターン等によりＰｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８０：４１１
９（１９８３）に記載された如くして、ＥＤＴＡ−含有
緩衝剤にさらしながら溶離した　［＋２５１］−因子Ｉ
Ｋの結合抑制か認められた（第１表）。

因子　［Ｘ　　　　　　　　　　　　　　３ｎＭ因子　
ＩＸａ　　　　　　　　　　　　　２．５　ｎＭＡｓｐ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ　　　　　　　　　
　　　９０　ｐＨＬｙａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　　１００　ｐ
ＭＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙ９−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−ＮＩＩ２　　　　　
　　　　　　　　　　　１１０１１ＭＬｙｓ−Ｇｌｎ−
Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−ＮＩＩ２　　　　　　
　　　　　　９０　ｐＨＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙ’ｒ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−ＮＨ２１０５
　ｐＭＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−＾ｒＦ１−Ｌｅｕ−＾
１ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙ
ｓ−Ｎ！１２　　　　　　　　　　　　　　：＞　１　
ｍＭＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｇｉｎ−Ｐｈｃ−Ｃｙｓ」ｖ遍≠１＾ｒｇ−＾ｓ　ｐ
　−Ｔ　ｂ　ｒ−＾ｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＮＨ２　＞
　１　ｍＭ競争的結合試験を本明ｍＷに述べた如くして
行い、抑制定数は実験値の平均である。平均値の扛１」
墾１区＾」イＬ（よ　２０％ｌンＪ］巳二（１１シユコ
し！≧４□ドデカペプチド（ウシ因子ＩＸの残基４３〜
５４に対する）の１つ、デカペプチド、ノナペプチド、
オクタペプチド及びペンタペプチドはほぼ同等の有効性
であると思われるが、これらのものは因子ＩＫ／Ｈａよ
りもかなり効力が劣る。他のドデカペプチド及びヘキサ
デカペプチドは１ｍＭまでの濃度で完全に無効であった
６ 活性ＥＧＦドメインペプチドによる［１２５Ｊ］−因子
■結合の抑制の特異性は線維系ペプチドＡ（八ｌａ−Ａ
ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−八ｒｇ）、線維系ペプチドＦ３　（ＰＧ＾−Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−＾ｑｎ−＾ｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−八１ａ−＾ｒｇ）及
びアンジオテンシン■（＾ｓｐ−Δｒｇ−ＶａｌＴｙｒ
−１１ｃｍ１！１ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−１１ｉｓ−Ｌｅ
ｕ）を用いる試験において示された。後者の３種のペプ
チドの１　ｍＭＩ、までによって、［１５１］−因子■
−内皮細胞結合の抑制が認められなかった。同様に、ま
た最初の配列においてアスパラギン酸残基がグルタミン
酸残基で置換されたペンタペプチドＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｃ１ｎ−Ｃｙｓは抑制剤として無効であった。

これらのデータは、本発明のペプチドによる因子ＩＸ／
ＩＸａ−内皮細胞結合の抑制が特異作用であることを示
している。因子■結合の抑制と対比して、本ペプチドは
放射性標識因子Ｘのその内皮細胞部位への結合において
抑制効果をもっていなかった。因子Ｘの内皮細胞表面へ
の結合はすでに立証されている［ハイマーり（ｔｌｅｉ
ｍａｒｋ）等、Ｂｉｏｃｂｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＋ｍ、１１１　　
：　７２３（１９８３）：５ｔｅｒｎ等、Ｐｒｏａ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８１　
：　９１３　（１９８４）参照］、因子Ｘは他のビタミ
ンに一依存性凝固因子であるために、本発明のペプチド
の作用の特異性が強調される。

舌２　　パ：　　：因子ＩＸ／ＩＸａ結合試験に加えて
、因子Ｘの内皮細胞−依存性因子■ａ−■−調停された
（ｍｅｄｉａｔｅｄ）活性化におけるペプチドの効果を
評価するために動力学的実験を行った。

これらの実験のために、因子ｒＫａ及びＸを標準法によ
って精製した。因子■（１９８５年１１月６日発行のヨ
ーロッパ特許出願公告明細書第１６０４５７号）はゲネ
ンテック（ＧｅｎｅｎＬｅｃｈ）　［南すンフランシス
コ（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ＣＡ
］によって豊富に提供された。

内皮細胞単分子層を混合し、因子Ｈａ、■及びＸの存在
下において、ペプチドの１つの濃度を増加させながら培
養した。生成物の生成速度（因子Ｘａ生成）を、ファン
・ディエイジエン等により、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
Ｉｌｌ、　　２５６　：　３４３３　　（１９８１）に
記載された如くして、色原物質分析法を用いて測定し、
その結果を第１Ｉ表に示した。

第■表本 Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　　　　　　
　　　　１０５　ｐＨＬｙｓ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　　１０８
　ｐＨＩ、ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−＾ｓ
ｒ＋−Ｎｔ１２１００　ｐＭＬｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｙｒ
−Ｖａ　ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−八５ｐ−Ｇｌｎ−ＮＨ２
　１１５　　ｐＨＡｓｐ−Ｃ＋Ｉｙ−Ｔｙｒ−へｒｇ−
ｌ、ｅｕ−へＩｎ−Ｇｌｕ−八５ｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｎｌｌｚ　　　　　　　　　　　＞２
　ｄＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ」Ｌじ＾ｒｇ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−＾ｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−８１１２＞２　ｍＭ車
ペプチドによる内皮細胞単分子層上の因子Ｘ活性化の抑
制を本明細書に述べた如くして行い、抑制定数は実ｙ！
Ｒｖｉの平均値である。平均値の標が差は２０％ｒ　で
＝λ力よ 第１表におけるデータは、ペプチドの全てがドデカペプ
チド（ウシ因子ＩＭの残基９１〜１０６に相当する）の
１つ及びヘキサデカペプチドを除いて、因子Ｘの活性を
抑制することを示している。

これらのペプチドは１ｍＨの濃度まで因子ＸＩＬ生成に
効果を有していなかった。またデカペプチドは因子Ｘの
活性化の抑制剤としても作用した（データは示していな
い）。結合（第１表）及び動力学内実＠（第■表）に対
する抑制定数値の類似は、因子ＩＸ／［Ｘａ−内皮細胞
結合の抑制がペプチドの作用のあり方であると言う仮定
を支持するものである。この推測との一致は改質したペ
ンタペプチドＣ１ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ
に見られる因子Ｘ活性化の抑制の欠乏である（データは
示していない）６生潜」ｌ糺皇−：ＥＧＰドメインペプ
チドのあるものが因子ＩＸ　／　ＩＸ　ａ−内皮細胞の
相互作用を阻止し得ることを立証する上記の試験管内実
験の結果に基づき、これらの活性ペプチドを用いて生体
内実験を行った。選んだ生体内モデルはベスラー（Ｍｅ
ｓｓ　１ｅｒ）静脈うっ血血栓症モデルであり［ＧｉＬ
ｃｌ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　［ＪＳＡ　７土：３０２８（１９７７）］、用いた凝
血促進剤は因子ＩＸａ（６００ｎｇ）であった。この方
法をナトリウムベンドパルビタールで麻酔したウサギに
ウシ因子ｎ（ａのみ、またはペンタペプチドＡｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　１０＋ｓｇと共に注射
することによって行った。あらかじめ露出した対側頚静
脈のセグメントを１０秒後に結紮縫合によって単離した
１次に、１６秒後、単離した血管を５％（重壁／容量）
クエン酸すｌ・リウム中に入れ、そして開いた。

血栓を上記のジチルによる文献に記載された如くしてＯ
〜４の段１１ｊＪ標準に採点した。因子ＩＭａのみを注
射した動物は度合３の血栓を示し、一方、ペプチド及び
因子ｆｆａを注射した動物は度合１の血栓のみを示した
。因子ＩＸａを用いずに、ペンタペプチド８■をウサギ
に注射した１つの実験においては、クエン酸塩加血液試
料（ペプチド注射後、１．３．５及び１０分目に捕集）
のプロトロンビン時間及び活性化された部分トロンボプ
ラスチン時間は変化しなかった。

活性ドデカペプチドを用いる同様な実験においては、１
００．７０及び５０ｍｇのペプチドレベルはそれぞれ度
合０．１及び１の血栓を生じた。７０ＩＩ１ｇのデカペ
プチドのみを与えた動物から取ったクエン酸塩加血液試
料のプロトロンビン時間及び活性化された部分トロンボ
プラスチン時間は変化しなかった。

これらの結果は、本発明のＥＧＦドメインペプチドが特
異的なアンチトロンビン剖の新規なタイプであること；
これらのものは試験管内において血液の凝塊を変えるこ
となく、脈管的血栓症を阻止し得ることを示唆している
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチドが因子IXのＥＧＦドメインまたはそのサブ
   シーケンスを含むことを特徴とする因子IX／IXａの細胞
   レセプターに選択的に結合し得るペプチド。 ２、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃ
   ｙｓを有する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 ３、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａ
   ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓを有する特許請
   求の範囲第１項記載のペプチド。 ４、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａ
   ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅ
   ｒ−Ａｓｎ−ＮＨ＿２を有する特許請求の範囲第１項記
   載のペプチド。 ５、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａ
   ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−ＮＨ＿２を有する特許
   請求の範囲第１項記載のペプチド。 ６、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔ
   ｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−ＮＨ
   ＿２を有する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 ７、血栓症疾患の処置のための特許請求の範囲第１〜６
   項のいずれかに記載のペプチド。 ８、通常のペプチド合成法を用いる特許請求の範囲第１
   〜６項のいずれかに記載のペプチドの製造方法。 ９、固相合成法を用いる特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 １０、特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペ
   プチド及び製薬学的に許容し得る担体からなる製薬学的
   組成物。 １１、血栓症疾患の処置のための特許請求の範囲第１〜
   ６項のいずれかに記載のペプチドの使用。 １２、特許請求の範囲第１０項記載の製薬学的組成物の
   製造のための特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記
   載のペプチドの使用。 １３、特許請求の範囲第８項または第９項記載の方法で
   製造した特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の
   ペプチド。