FI102183B - Menetelmä uusien trombiini-inhibiittoreiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

χ 102183

Menetelmä uusien trombiini-inhibi ittoreiden valmistami-seksi

Keksinnön tekninen alue 5 Tämä keksintö koskee uusia biologisesti aktiivisia molekyylejä, jotka sitoutuvat trombiiniin ja inhiboivat sen. Näille molekyyleille on erikoisen ominaista trombii-nin anionia sitovaan rajakohtaan liittyvä osa (ABEAM); ainakin 18Ä pituinen linkkeriosa; ja trombiinin katalyytit) tiseen kohtaan suunnattu osa (CSDM). Tämä keksintö koskee myös kokoonpanoja, yhdistelmiä ja menetelmiä, jotka käyttävät näitä molekyylejä terapeuttisiin, profylaktisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin.

Alan taustaa 15 Akuutit verisuonitaudit, kuten sydänlihaksen in farkti, sydänkohtaus, keuhkoveritulppa, syvällä laskimossa oleva verisuonitukos, perifeerisen valtimon tukkeutuminen ja muut verisysteemin tukokset muodostavat suuria terveysriskejä. Sellaiset taudit aiheutuvat verisuonen joko osit-20 täisestä tai täydellisestä tukkeutumisesta verihyytymän, joka sisältää fibriiniä ja verihiutaleita, vaikutuksesta.

Verisuonitukostautien nykyiset hoito- ja profylaktiset menetelmät käyttävät terapeuttisia aineita, jotka toimivat yhdellä kahdesta tavasta. Ensimmäinen terapeut-25 tinen ainetyyppi inhiboi trombiinin aktiivisuuden tai trombiinin muodostumisen estäen näin hyytymän muodostumisen. Nämä lääkkeet inhiboivat myös verihiutaleiden aktivaation ja aggregoitumisen. Toinen terapeuttisten aineiden ryhmä kiihdyttää veritulpan liukenemista ja liuottaa veri-30 hyytymän näin poistaen sen verisuonesta ja päästää veren virtaamaan (J.P. Cazenave et ai., Agents Action. 15, Suppl.. sivut 24 - 49 (1984)).

Hepariinia, joka on ensimmäiseen ryhmään kuuluva yhdiste, on käytetty laajasti sellaisten tilojen, kuten 35 laskimon veritukostulppauman, hoitamiseen, joissa trombii-niaktiivisuus on vastuussa verihyytymän kehittymisestä tai 102183 2 laajenemisesta. Vaikka se on tehokas, hepariini aiheuttaa epätoivottavia sivuvaikutuksia sisältäen verenvuodon ja verihiutaleiden niukkuuden. Tämä on johtanut spesifisem-pien ja vähemmän myrkyllisten hyytymisen vastaisten ainei-5 den etsintään.

Hirudiini on luonnossa esiintyvä polypeptidi, jota verta imevä iilimato Hirudo medicinalis tuottaa. Tämä yhdiste, jota muodostuu iilimadon sylkirauhasessa, on vahvin luonnollinen tunnettu veren hyytymisen inhibiittori. Hiru-10 diini estää veren hyytymisen sitoutumalla tiukasti trom biinkin (Kd = 2 x 10*11 M) stoikiometriseksi 1:1 -kompleksiksi (S.R. Stone ja J. Hofsteenge, "Kinetics of the Inhibition of Thrombin by Hirudin", Biochemistry, 25, sivut 4622 - 28 (1986)). Tämä puolestaan inhiboi trombiinin 15 niin, että se ei katalysoi fibrinogeenin muutosta fibrii-niksi (verihyytymä) inhiboiden myös kaikki muut trombiini-välitteiset prosessit (J.W. Fenton, II, "Regulation of Thrombin Generation and Functions", Semin. Thromb.

, Hemost., 14, sivut 234 - 40 (1988)).

20 Todellinen hirudiinin ja trombiinin välinen sitou tuminen on kaksivaiheinen prosessi. Hirudiini sitoutuu aluksi trombiinimolekyylissä olevaan "matalan" affiniteetin (Kd = 1 x 10‘8 M) sisältävään kohtaan, joka on erillään katalyyttisestä kohdasta. Tämä sitoutuminen pitää sisäl-25 lään hirudiinin C-pään rakenteen interaktion trombiinin "anionia sitovan rajakohdan" (ABE) kanssa (J.W. Fenton, II et ai., "Thrombin Anion Binding Exosite Interactions with Heparin and Various Polyanions", Ann. New York Acad. Sci., 556, sivut 158 - 65 (1989)). Matala-affiniteettisen sitou-30 tumisen jälkeen hirudiini-trombiinikompleksissa tapahtuu konformaation muutos ja sitten hirudiini sitoutuu trombiinin "korkean" affiniteetin sisältävään kohtaan (S. Kono et ai., "Analysis of Secondary Structure of Hirudin and the Conformational Change Upon Interaction with Thrombin", 3 102183

Arch. Biochem. Biophys♦, 267, sivut 158 - 66 (1988)). Tämä jälkimmäinen kohta vastaa trombiinin aktiivista kohtaa.

Hirudiinin eristys, puhdistus ja kemiallinen koostumus ovat alalla tunnettuja (P. Walsmann ja F. Markwardt, 5 "Biochemical and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibitor Hirudin", Pharmazie, 36, sivut 653 - 60 (1981)). Sen jälkeen on polypeptidin täydellinen aminohapposekvenssi määritetty (J. Dodt et al., "The Complete Covalent Structure of Hirudin: Localization of the Disulfide 10 Bonds", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 366, sivut 379 - 85 (1985); S.J.T. Mao et al., "Rapid Purification and Revised Amino Terminal Sequence of Hirudin: A Specific Thrombin Inhibitor of the Blood-Sucking Leech", Anal. Biochem., 161, sivut 514 - 18 (1987) ja R.P. Harvey et al., "Cloning 15 and Expression of a cDNA Coding for the Anti-Coagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech, Hirudo medicinalis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, sivut 1084 - 88 (1986)).

Ainakin kymmenen hirudiinin erilaista isomorfista . muotoa on sekvensoitu ja niiden on osoitettu eroavan hiu-

20 kan aminohapposekvenssiltään (D. Tripier, "Hirudin: A

Family of Iso-Proteins. Isolation and Sequence Determination of New Hirudins", Folia Haematol., 115, sivut 30 - 35 (1988)). Kaikki hirudiinimuodot sisältävät yhden polypep-tidiketjun sisältävän proteiinin, joka sisältää 65 tai 66 / ' 25 aminohappoa, joissa aminopää sisältää pääasiassa hydrofo bisia aminohappoja ja karboksipää sisältää tyypillisesti polaarisia aminohappoja. Erikoisemmin, kaikille hirudiini-muodoille on ominaista N-pään domeeni (jäännökset 1 - 39), jota stabiloi kolme disulfidisiltaa 1-2, 3 - 5 ja 4 - 6 30 -puolikysteiinirakenteena ja erittäin hapan C-pään alue ·. (jäännökset 40 - 65). Lisäksi hirudiinin C-pään alueelle on ominaista sulfonoidun tyrosiinijäännöksen läsnäolo ami-nohappokohdalla 63.

Eläinkokeissa iilimadoista puhdistettu hirudiini on 35 osoittanut tehokkuutta laskimon verisuonitukoksen, suonen 4 102183 sivukanavan tukkeuman ja trombiinin indusoiman hajapesäk-keisen suonensisäisen hyytymisen estämisessä. Lisäksi hi-rudiinilla on matala myrkyllisyystaso, vähän antigeeni-suutta ja hyvin lyhyt poistumisaika verenkierrosta (F.

5 Markwardt et ai., "Pharmacological Studies on the Antithrombotic Action of Hirudin in Experimental Animals", Thromb. Haemost., 47, sivut 226 - 29 (1982)).

Yritettäessä muodostaa suurempia hirudiinimääriä on tehty yrityksiä tuottaa polypeptidiä yhdistelmä-DNA-mene-10 telmillä. O-sulfonoidun tyrosiinin läsnäolo luonnollisessa hirudiinissa ja mikro-organismien kyvyttömyys muodostaa samanlainen proteiinimodifikaatio tekivät toiveet biologisesti aktiivisen hirudiinin tuotosta yhdistelmä-DNA-menetelmillä erittäin teoreettisiksi. Havainto, että de-15 sulfonoidut hirudiinit olivat lähes yhtä aktiivisia kuin niiden sulfonoidut vastineet (US-patentti 4 654 302) johti kuitenkin hirudiinin kloonaukseen ja ekspressioon E. coli -bakteerissa (EP-patenttihakemukset 158 564, 168 342 ja 171 024) ja hiivassa (EP-patenttihakemus 200 655). Huoli-20 matta näistä edistysaskeleista hirudiinia on yhä suhteellisen kallis tuottaa ja sitä ei ole laajasti saatavissa kaupallisesti.

Äskettäin on tehty yrityksiä tunnistaa ne luonnollisen hirudiinin peptidifragmentit, jotka ovat tehokkaita 25 myös hyytymisaikojen pidentämisessä. Hirudiinin sulfonoi-maton 21 aminohapon pituinen C-pään fragmentti N-asetyy-lihirudiini45_65 inhiboi hyytymän muodostusta in vitro. Lisäksi monet muut pienemmät sulfonoimattomat peptidit, jotka vastaavat hirudiinin C-pään 11 tai 12 aminohappoa 30 (jäännökset 55 - 65 ja 54 - 65), ovat osoittaneet myös . tehokkuutta hyytymän muodostuksen inhiboimisessa in vitro (J.L. Krstenansky et ai., "Antithrombin Properties of C-terminus of Hirudin Using Synthetic Unsulfated N-acetyl-hirudin45.65", FEBS Lett♦, 211, sivut 10 - 16 (1987)). Sel-35 laiset peptidifragmentit eivät kuitenkaan ehkä ole täysin 5 102183 tyydyttäviä verihyytymien liuottamisessa meneillään olevissa hoito-ohjelmissa matalan aktiivisuuden johdosta. N-asetyylihirudiini45_65:lla on esimerkiksi neljä suuruusluokkaa matalampi spesifinen aktiivisuus kuin luonnollisella 5 hirudiinilla.

Fibriinihyytymän muodostuksen katalysoimisen lisäksi trombiinilla on useita muita bioregulatiivisia tehtäviä (J.W. Fenton, II, "Thrombin Bioregulatory Functions", Adv. Clin. Enxymol., 6, sivut 186 - 93 (1988)). Trombiini esi-10 merkiksi aktivoi suoraan verihiutaleiden aggregaatio- ja vapautusreaktioita. Tämä tarkoittaa, että trombiinilla on keskeinen tehtävä akuutissa verihiutaleista riippuvaisessa verisuonitukoksessa (S.R. Hanson ja L.A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synt-15 hetic Antithrombin D-Phenylalanyl-L-Propyl-L-Arginylchlo- romethylketone", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, sivut 3184 - 88 (1988)). Trombiini voi aktivoida myös suoraan tulehdusreaktion stimuloimalla verihiutaleita aktivoivan faktorin (PAF) synteesiä endoteelisoluissa (S. Prescott et 20 ai., "Human Endothelial Cells in Culture Produce Platelet-

Activating Factor (l-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phospho-choline) When Stimulated With Thrombin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, sivut 3534 - 38 (1984)). PAF sijaitsee endo-teelisolujen pinnalla ja toimii ligandina neutrofiilien • 25 kiinnittymiselle ja sitä seuraavalle degranulaatiolle (G.M. Vercolletti et ai., "Platelet-Activating Factor Primes Neutrophil Responses to Agonists: Role in Promoting Neutrophil-Mediated Endothelial Damage", Blood, 71, sivut 1100 - 07 (1988)). Trombiini voi vaihtoehtoisesti edistää 30 tulehdusta kohottamalla verisuonten läpäisevyyttä, joka voi johtaa turvotukseen (P.J. Del Vecchio et ai., "Endothelial Monolayer Permeability to Macromolecules", Fed. Proc., 46, sivut 2511 - 15 (1987)). Reagenssit, jotka blo-keeraavat trombiinin aktiivisen kohdan, kuten hirudiini, 35 keskeyttävät verihiutaleiden ja endoteelisolujen aktivaa- 6 102183 tion (C.L. Knupp, "Effect of Thrombin Inhibitors on Thrombin-Induced Release and Aggregation", Thrombosis Res., 49, sivut 23 -36 (1988)).

Trombiinin on ajateltu myös ottavan osaa syövän 5 muodostukseen perustuen sen luonnollisen digestiotuotteen fibriinin kykyyn toimia substraattina kasvaimen kasvulle (A. Falanga et ai., "Isolation and Characterization of Cancer Procoagulant: A Cysteine Proteinase from Malignant Tissue", Biochemistry, 24, sivut 5558 - 67 (1985); S.G. 10 Gordon et al., "Cysteine Proteinase Procoagulant from Amnion-Chorion", Blood, 66, sivut 1261 - 65 (1985) ja A. Falanga et al., "A New Procoagulant In Acute Leukemia", Blood, 71, sivut 870 - 75 (1988)). Ja trombiinin on ajateltu ottavan osaa hermojen rappeumatauteihin perustuen 15 sen kykyyn aiheuttaa hermosolun viejähaaran kutistumista (D. Gurwitz et al., "Thrombin Modulates and Reverses Neuroblastoma Neurite Outgrowth", Proc. natl. Acad. Sci. USA, 85, sivut 3440 - 44 (1988)). Sen vuoksi, kyvyllä säädellä trombiinin aktiivisuutta in vivo on monia tärkeitä kliini-20 siä merkityksiä.

Huolimatta tähän mennessä tapahtuneesta kehityksestä on edelleen olemassa tarve molekyylistä, joka inhiboi tehokkaasti trombiinin toimintaa hyytymän muodostuksessa, verihiutaleiden aktivaatiossa ja useissa muissa trombii-• 25 nivälitteisissä prosesseissa ja jota voidaan tuottaa hal valla ja kaupallisesti järkevinä määrinä.

Keksinnön yhteenveto

Esillä oleva keksintö ratkaisee ylläluetellut ongelmat esittämällä molekyylit, jotka matkivat hirudiinin 30 toimintaa sitoutumalla sekä matalan affiniteetin sisältä vään anionia sitovaan rajakohtaan (ABE) että a-trombiinin katalyyttiseen kohtaan. Nämä molekyylit ovat vahvempia kuin hirudiini ja sen vuoksi niitä voidaan antaa potilaille annoksina, jotka ovat suhteellisesti matalampia kuin 35 ne, joita tarvitaan hirudiiniin perustuvissa hoito-ohjel- 7 10.2183 missä. Tämän keksinnön mukaisia molekyylejä voidaan käyttää kokoonpanoissa ja menetelmissä minkä tahansa trombii-nivälitteisen tai trombiiniin liittyvän toiminnan tai prosessin inhiboimiseen. Näitä molekyylejä sisältävät farma-5 seuttiset kokoonpanot kuin myös niitä käyttävät verisuonitautien, tulehdusresponssien, karsinoomien ja hermojen rappeumatautien hoito- tai profylaktiset menetelmät ovat myös osa esillä olevaa keksintöä. Näitä molekyylejä voidaan myös käyttää kokoonpanoissa ja menetelmissä ex vivo 10 kuvausta varten, kehon ulkopuolisen veren varastointia ja käsittelyä varten ja kehon sisään vietävien laitteiden päällystystä varten. Ja tämän keksinnön mukaisia molekyylejä voidaan antaa potilaalle yhdessä fibrinolyyttisen aineen kanssa sen aineen annetun annoksen tehokkuuden ko-15 hottamiseksi tai alentamiseksi, joka annos tarvitaan tiettyä vaikutusta, kuten verihyytymän liuottamista, varten.

Johtuen korkeasta vahvuudesta ja siitä tosiseikasta, että niitä voidaan valmistaa kemiallisilla synteesi-menetelmillä, esillä olevan keksinnön mukaiset molekyylit 20 voidaan valmistaa halvalla kaupallisesti järkevinä määrinä. Lisäksi, koska esillä olevan keksinnön mukaiset molekyylit ovat merkittävästi pienempiä kuin hirudiini, ne stimuloivat epätodennäköisemmin epätoivottavan immuunires-ponssin potilaissa, joita on hoidettu niillä. Sen mukai-25 sesti näiden trombiini-inhibiittoreiden käyttö ei ole rajoitettu akuutin taudin hoitoon. Näitä molekyylejä voidaan käyttää myös kroonisten veritukkotulppaumatautien, kuten ateroskleroosin ja uuden ahtauman, hoitoon. Esillä olevan keksinnön mukaisia molekyylejä voidaan myös käyttää useis-30 sa muissa sovellutuksissa luonnollisen tai rekombinantti-hirudiinin sijasta.

Kuten seuraavasta kuvauksesta voidaan ymmärtää, tämän keksinnön mukaiset molekyylit, kokoonpanot ja menetelmät ovat käyttökelpoisia hoidettaessa ja ehkäistäessä 35 erilaisia tauteja, jotka johtuvat trombiinin epätoivotta- β 102183 vista vaikutuksista kuin myös diagnostisissa tarkoituksissa.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 kuvaa SDS-polyakryyliamidigeelin autoradio-5 grafian, joka osoittaa DNFB-(35S)-Sulfo-Tyr63hirudiini54_64:n sitoutumisen ihmisen α-trombiiniin Sulfo-Tyr63-N-asetyyli-hirudiini53.64:n läsnä ollessa.

Kuvio 2 kuvaa ihmisen α-trombiinin kolmiulotteisen mallin.

10 Kuvion 3 paneeli A kuvaa Hirulog-8:n ja Sulfo-Tyr63- hirudiini53.64: n vaikutukset ihmisen α-trombiinin aiheuttamaan Spectrozyme TH:n katkaisuun.

Kuvion 3 paneeli B kuvaa ihmisen α-trombiinin aiheuttaman Spectrozyme TH:n katkaisun Lineweaver-Burke-15 käyrän joko Hirulog-8:n tai Sulfo-Tyr63hirudiini53.64 :n läsnä- tai poissaollessa.

Kuvio 4 kuvaa Hirulog-8:n, hirudiinin tai Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64:n eri konsentraatioiden vaiku-• tukset ihmisen normaalin seerumin aktivoituun osittaiseen 20 tromboplastiiniaikaan.

Kuvion 5 paneeli A kuvaa ihmisen α-trombiinin aiheuttaman Hirulog-8:n eri konsentraatioiden katkaisun ai-kakäyrän.

Kuvion 5 paneeli B kuvaa suhteen Hirulog-8:n kon-25 sentraation ja ihmisen α-trombiinin aiheuttaman Spectro zyme TH:n hydrolyysin inhibition keston välillä.

Kuvio 6 kuvaa tämän keksinnön mukaisten trombiini-inhibiittorien linkkerin pituuden vaikutuksen trombiinin katalysoiman Spectrozyme TH:n hydrolyysin inhibitioon.

30 Kuvio 7 kuvaa Hirulog-8:n tai Sulfo-Tyr63-N-asetyy- lihirudiini53.64 : n eri konsentraatioiden inhibitoriset vaikutukset 14C-DFB:n aiheuttamaan trombiinin modifikaatioon.

Kuvio 8 kuvaa Hirulog-8:n eri annosten in vivo vaikutuksen APTT:hen paviaanilla.

9 1C'2 Ϊ83

Kuvio 9 kuvaa Hirulog-8:n tai hepariinin suhteelliset inhibitoriset vaikutukset liukoisen tai hyytymään sitoutuneen trombiinin aiheuttamaan fibrinogeenin hydro-lyysiin.

5 Kuvio 10 kuvaa Hirulog-8:n eri annosten in vivo vaikutukset verihiutaleiden kerääntymiseen paviaanin aortan sellaiselle alueelle, josta on poistettu valtimon sisäkalvon pehmentymät.

Kuvio 11 kuvaa Hirulog-8:n eri annosten in vivo 10 vaikutukset verihiutaleiden kerääntymiseen paviaanin sisään viedyn kollageenilla päällystetyn letkun alueelle.

Kuvio 12 kuvaa hepariinin, hirudiinin ja Hirulog-8:n suhteelliset in vivo vaikutukset verihiutaleiden kerääntymiseen paviaanin eteis-kammiosivukytkentään sisään 15 viedyn kollageenilla päällystetyn letkun alueelle.

Kuvio 13 kuvaa Hirulog-8:n eri annosten in vivo vaikutukset fibriinin kerääntymiseen paviaanin eteis-kammiosivukytkentään sisään viedyn kollageenilla päällystetyn letkun alueelle.

20 Kuvio 14 kuvaa muutosta APTTrssa ajan funktiona sen jälkeen, kun paviaaneille on annettu laskimonsisäinen ker-tainjektio Hirulog-8:aa.

Kuvio 15 kuvaa muutosta APTTissa ajan funktiona sen jälkeen, kun paviaaneille on annettu ihonalainen injektio 25 Hirulog-8:aa.

Kuvio 16 kuvaa kudoksen plasminogeeniaktivaattorin suhteellisia in vivo vaikutuksia yhdessä joko suolaliuoksen, hepariinin, hirudiinin tai Hirulog-8:n kanssa uuteen perfuusioon kuluneeseen aikaan rottamallissa.

30 Kuvio 17 kuvaa kudoksen plasminogeeniaktivaattorin *' suhteellisia in vivo vaikutuksia yhdessä joko suolaliuok sen, hepariinin, hirudiinin tai Hirulog-8:n kanssa uuteen tukkeutumiseen kuluneeseen aikaan rottamallissa.

Kuvio 18 kuvaa kudoksen plasminogeeniaktivaattorin 35 suhteellisia in vivo vaikutuksia yhdessä joko suolaliu- 10 102183 oksen, hepariinin, hirudiinin tai Hirulog-8:n kanssa APTT:hen rottamallissa.

Kuvio 19 kuvaa kudoksen plasminogeeniaktivaattorin suhteellisia in vivo vaikutuksia yhdessä joko suolaliuok-5 sen, hepariinin, hirudiinin tai Hirulog-8:n kanssa suonen avautumiseen rottamallissa.

Kuvio 20 kuvaa Hirulog-8:n eri annosten vaikutuksen verenvuotoaikoihin paviaanimallissa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 10 Seuraavia yleisiä aminohappolyhennyksiä on käytetty läpi koko patenttihakemuksen ja patenttivaatimuksissa:

Orn - ornitiini Ala - alaniini Leu - leusiini 15 Pro - proliini

Trp - tryptofaani Ser - seriini Cys - kysteiini . Asn - asparagiini 20 Asp - asparagiinihappo

Lys - lysiini His - histidiini Hyp - hydroksiproliini Ac - asetyyli 25 BOC - tert-butoksikarbonyyli

Cbz - karboksibentsyylioksi 3,4-dehydroPro - 3,4-dehydroproliini Tyr(0S03H) - tyrosiinisulfaatti 3-,5-dijodiTyr - 3-,5-dijodityrosiini 30 Gly - glysiini .. Vai - väliini

Ile - isoleusiini Phe - fenyylialaniini Met - metioniini 35 Thr - treoniini 11 102183

Tyr - tyrosiini Gin - glutamiini Glu - glutamiinihappo Arg - arginiini 5 Nle - norleusiini

Pgl - fenyyliglysiini

Sue - sukkinyyli

Tos - para-tolueenisulfonyyli D-Ala - D-alaniini 10 Sar - sarkosiini (N-metyyliglysiini)

Tyr(S03H) - tyrosiinisulfonaatti

Termi "mikä tahansa aminohappo" tässä käytettynä sisältää luonnollisesti esiintyvien aminohappojen L-iso-meerit kuin myös muut "ei-proteiini" -α-aminohapot, joita 15 yleisesti käytetään peptidikemian alalla valmistettaessa luonnollisesti esiintyvien aminopeptidien synteettisiä analogeja. Luonnollisesti esiintyvät aminohapot ovat gly-siini, alaniini, väliini, leusiini, isoleusiini, seriini, metioniini, treoniini, fenyylialaniini, tyrosiini, trypto-20 faani, kysteiini, proliini, histidiini, asparagiinihappo, asparagiini, glutamiinihappo, glutamiini, gamma-karboksi-glutamiinihappo, arginiini, ornitiini ja lysiini. Esimerkit "ei-proteiini" α-aminohapoista sisältävät norleusii-nin, norvaliinin, alloisoleusiinin, homoarginiinin, tia-25 proliinin, dehydroproliinin, hydroksiproliinin (Hyp), hom-oseriinin, sykloheksyyliglysiinin (Chg), a-amino-n-voiha-pon (Aba), sykloheksyylialaniinin (Cha), aminofenyylivoi-hapon (Pba), fenyylialaniinit, jotka on substituoitu fe-nyyliosan orto-, meta- tai para-asemaan yhdellä tai kah-30 della seuraavista: (Ci-C^-alkyyli-, (C1-C4)-alkoksi-, halo-• geeni- tai nitroryhmällä tai substituoitu metyleenidioksi- ryhmällä; β-2- ja 3-tienylal-alaniinin, β-2- ja 3-furanyy-lialaniinin, β-2-, 3- ja 4-pyridyylialaniinin, B-(bentso-tienyl-2- ja 3-yyli)alaniinin, β-(1- ja 2-naftyyliJalanii-35 nin, O-alkyloidut seriinin, treoniinin tai tyrosiinin joh- 12 102183 dannaiset, S-alkyloidun kysteiinin, S-alkyloidun homokys-teiinin, tyrosiinin Ο-sulfaatti-, O-fosfaatti- ja 0-kar-boksylaattiesterit, 3- ja 5-sulfonyylityrosiinin, 3-ja 5-karbonyylityrosiinin, 3- ja 5-fosfonyylityrosiinin, 4-me-5 tyylisulfonyylityrosiinin, 4-metyylifosfonyylityrosiinin, 4-fenyylietikkahapon, 3,5-dijodityrosiinin, 3- ja 5-nitro-tyrosiinin, epsilon-alkyylilysiinin, delta-alkyyliorni-tiinin ja luonnollisesti esiintyvien aminohappojen D-iso-meerit.

10 Yhdisteet, joihin tässä viitataan tyrosiinisulfaat- tina, Tyr(OSOaH): ina ja tyrosiinin O-sulfaattiesterinä ovat identtisiä ja niiden rakennekaava on:

COOH

15 Ih-ch.-Q-0-sq^ NH,

Yhdisteet, joihin tässä viitataan tyrosiinisulfo-20 naattina, Tyr(S03H):ina, 3-sulfonyylityrosiinina ja 5-sul-fonyylityrosiinina ovat identtisiä ja niiden rakennekaava on:

COOH

25 <!:Η-0Η,-^”"^>-0Η NH,

Termi "potilas" tässä patenttihakemuksessa käytet-30 tynä viittaa mihin tahansa nisäkkääseen, erikoisesti ihmiseen.

Termi "anioninen aminohappo" tässä käytettynä tar koittaa meta-, para- tai orto-, mono- tai disubstituoitua fenyylialaniinia, sykloheksyylialaniinia tai tyrosiinia, 35 joka sisältää karboksyyli-, fosforyyli- tai sulfonyyliosan 13 102183 kuin myös S-alkyloitua kysteiiniä, S-alkyloitua homokys-teiiniä, gamma-karboksyyliglutamiinihappoa, epsilon-alkyy-lilysiiniä, delta-alkyyliornitiinia, glutamiinihappoa ja asparagiinihappoa. Esimerkit anionisista aminohapoista 5 ovat fosfotreoniini, fosfoseriini, fosfotyrosiini, 3-, 4-tai 5-sulfotyrosiini, 3-metyyli£osfonyylityrosiini ja 3-metyylisulfonyylityrosiini.

Termit "katalyyttinen kohta", "aktiivinen kohta" ja "aktiivisen kohdan tasku" tässä käytettyinä kukin viittaa 10 mihin tahansa tai kaikkiin seuraaviin trombiinin kohtiin: substraattia sitovaan tai "Sj"-kohtaan; hydrofobiseen sito-mis- tai "öljyiseen" kohtaan ja kohtaan, jossa substraatin katkaisu todellisuudessa suoritetaan ("varauksen siirto-kohta" ).

15 Termi «n0"1" tässä käytettynä viittaa ornitiinin sivuketjun typpeen. Termi "N9" viittaa mihin tahansa argi-niinin sivuketjun typpeen. Termi "Na" viittaa aminohapon a-aminoryhmään. Ja termi "psi" patenttihakemuksessa ja pa-* tenttivaatimuksissa käytettynä viittaa amidisidoksen kor- 20 vaukseen suluissa merkityillä atomeilla seuraten nimistöä, jonka on kuvannut J. Rudinger teoksessa Drug Design, osa II, E.J. Ariens, toim., Academic Press, New York, sivu 319 (1971).

Termi "runkoketju" tässä käytettynä viittaa kemial-25 lisen rakenteen osaan, joka määrittää pienimmän määrän peräkkäisiä sidoksia, jotka voidaan löytää sen kemiallisen rakenteen yhdestä päästä toiseen päähän. Atomiosat, jotka muodostavat runkoketjun, voivat sisältää mitkä tahansa atomit, jotka kykenevät muodostamaan sidoksia ainakin kah-30 den muun atomin kanssa.

.. Esimerkiksi kullekin seuraavista kemiallisista ra kenteista on ominaista 7 atomin pituinen runkoketju (atomit, jotka muodostavat runkoketjun, on merkitty lihavoituina ): 14 10.2183 Η η ί ϊ

I H Η 1 H

5 R H O

H H ? H

'H 'H * H I

"H i H Y H | H H

10 H H H

! ! F i < r M ' 1

M Cl H

Termi "laskettu pituus" tässä patenttihakemuksessa 25 käytettynä viittaa ennustettuun mittaukseen, joka on peräisin runkoketjun muodostavien atomien yhteenlasketuista sidospituuksista. Minkä tahansa kahden annetun atomin välisen sidoksen pituus on alalla hyvin tunnettu (katso esimerkiksi CRC Handbook of Chemistry and Physics, 65. pai-30 nos, R.C. Weist, toim., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, sivut F-166 - 70 (1984)).

Esillä oleva keksintö koskee molekyylejä, jotka sitoutuvat trombiiniin ja inhiboivat sen. Näille molekyyleille on ominaista kolme domeenia: katalyyttiseen kohtaan 15 102185 suunnattu osa ("CSDM"), linkkeriosa ja anionia sitovaan rajakohtaan liittyvä osa ("ABEAM").

Esillä olevan keksinnön mukaisesti ensimmäinen do-meeni CSDM sitoutuu trombiinin katalyyttiseen kohtaan, 5 joka sijaitsee suunnilleen aminohapon Ser-195 kohdalla tai sen lähellä ja inhiboi tai hidastaa trombiinin amidolyyt-tistä tai esterolyyttistä aktiivisuutta. Esillä olevan keksinnön CSDM:t valitaan suositeltavasti yhdestä kolmesta yleisestä ryhmästä: niistä, jotka sitoutuvat reversiibe-10 listi trombiiniin ja jotka katkaistaan hitaasti; niistä, jotka sitoutuvat reversiibelisti trombiiniin ja joita ei voida katkaista ja niistä, jotka sitoutuvat irreversiibe-listi trombiiniin. Reversiibelit inhibiittorit sitoutuvat trombiinin aktiiviseen kohtaan ei-kovalenttisin interak-15 tioin, kuten ionisidoksilla, hydrofobisilla interaktioilla tai vetysidoksilla. Irreversiibelit CSDM:t muodostavat kovalenttiset sidokset trombiinin kanssa.

Suositeltavan suoritustavan mukaisesti CSDMillä, joka sitoutuu reversiibelisti trombiiniin ja joka katkais-20 taan hitaasti, on kaava: Χ-Α,-Α^-Υ, jossa X on vety tai jolle on ominaista runkoketju, jossa 25 on 1 - 35 atomia; Ax on Arg, Lys tai Orn; A2 on ei-amidi-sidos; A3:lle on ominaista runkoketju, joka sisältää 1 -9 atomia ja Y on sidos.

Tämän suoritustavan mukainen ei-amidisidososa voidaan muodostaa amidisidoksen kemiallisella modifikaatiol-30 la. Tämä voidaan suorittaa menetelmillä, jotka ovat alalla hyvin tunnettuja (M. Szelke et ai., "Potent New Inhibitors of Human Renin", Nature, 299, sivut 555 - 57 (1982); D.H. Coy et al., "Facile Solid Phase Preparation of Proteins Containing the CH2-NH Peptide Bond Isostere and Application 35 to the Synthesis of Somatostatin (SRIF) Octapeptide Analo- 102183 16 gues", Peptides 1986, D. Theodoropoulos, toim., Walter DeGruyter & Co., Berliini, sivut 143 - 46 (1987)). Kun ei-amidisidos muodostetaan tällä tavalla on suositeltavaa, että kemiallinen modifikaatio suoritetaan ennen tämän si-5 doksen sisältävän dipeptidin lisäämistä muihin CSDM:n osiin tai loppuosaan trombiini-inhibiittorimolekyyliä. Tällä tavalla dipeptidi A1-A2-A3 lisätään kokonaisuutena yhdessä synteesivaiheessa molekyylin loppuosaan.

Vielä suositeltavamman suoritustavan mukaisesti A3 10 on Arg ja A3 on Pro, D-Pro tai Sar. Tässä suoritustavassa A2 on luonnollisesti esiintyvä imidisidos, jonka trombiini katkaisee hitaasti. Tällä tavoin vältetään tarve esimuo-dostaa ei-amidisidos ja tämä sallii A3:n ja A3:n lisäyksen molekyylin loppuosaan peräkkäin mieluummin kuin yhtenä 15 kokonaisuutena.

Kuten yllä on kuvattu, tämän keksinnön mukaiset CSDM:t voivat sitoutua irreversiibelisti trombiiniin. Esimerkit irreversiibeleistä CSDM:stä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, yleiset seriiniproteaasi-inhibiittorit, 20 kuten fenyylimetyylisulfonyylifluoridin (PMSF), di-isopro-pyylifluorifosfaatin (DFP), tosyylipropyylikloorimetyyli-ketonin (TPCK) ja tosyylilysyylikloorimetyyliketonin (TLCK); heterosykliset proteaasi-inhibiittorit, kuten iso-kumariinit; trombiinispesifiset inhibiittorit, kuten D-25 Phe-Pro-Arg-CHCl2:n (PPACK) ja transitiotila-analogit, ku ten difluoriketometyleenin.

Esillä olevan keksinnön toisen suositeltavan suoritustavan mukaisesti ei-katkaistavat reversiibelit CSDM:t sisältävät kaavan: 30 : x-c1-c2-a3-y, jossa C3 on Arg:n, Lys:n tai Orn:n johdannainen, jolle on ominaista pelkistynyt karboksylaattiosa tai karboksylaat-35 tiosa, joka on syrjäytetty α-hiilestä kemiallisella raken- 17 102'TE3 teella, jolle on ominaista 1-10 atomin pituinen runko-ketju, C2 on ei-katkaistava sidos ja X, Y ja A3 ovat, kuten on määritelty aiemmin. Esimerkit C2 osista ovat S-homoargi-niini; arginiini, joka sisältää pelkistetyn karboksylaat-5 tiosan, kuten Arg(psiCH,NH); β-homolysiini ja β-homo-orni-tiini.

Muut ei-katkaistavat reversiibelit CSDM:t, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisina trombiini-inhi-biittoreina, ovat bentsamidiini, DAPA, NAPAP ja argatro-10 baani (argipidiini).

Niille tämän keksinnön mukaisille trombiini-inhi-biittoreille, joiden CSDM-alueille on ominaista A2- tai C2-sidos, termi "Pj-Pj ' "-sekvenssi tässä käytettynä viittaa mainitun sidoksen yhteen liittämiin kahteen kemialliseen 15 rakenteeseen.

CSDM:n X-osa, joka ei ota osaa varsinaiseen sitoutumiseen katalyyttiseen kohtaan, voi olla pituudeltaan rajoittamaton ja koostumukseltaan vaihteleva. Käytännön tarkoituksia ja synteesin hinnan alentumista varten X:lle 20 on kuitenkin ominaista 1-35 atomin pituinen runkoketju ja se, että se ei ylitä 36A laskettua pituutta. On suositeltavaa, että X on peptidi, suositeltavimmin D-Phe-Pro. Tämä suositeltavin suoritustapa sallii sen, että X-osa sopii trombiinin siihen kuoppaan, joka on aktiivisen koh-25 dan vieressä (S. Bajusz et ai., "Inhibition of Thrombin and Trypsin by Tripeptide Aldehydes", Int. J. Peptide Protein Res., 12, sivut 217 - 21 (1978); C. Kettner et al., "D-Phe-Pro-Arg-CH2Cl - A Selective Affinity Label for Thrombin", Thromb. Res., 14, sivut 969 - 73 (1979)). Tämä 30 sallii CSDM-osan ja sen vuoksi esillä olevan keksinnön • · mukaisten molekyylien sitoutumisen trombiiniin edullisen korkealla affiniteettitasolla ja optimaalisella spesifisyydellä.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tämän keksinnön 35 mukaisten trombiini-inhibiittorien toinen osa on linkkeri- 1β 102183 alue. Koska molekyylin tämän osan tehtävä on muodostaa silta CSDM- ja ABEAM-osien välille, linkkerin pituus mieluummin kuin sen rakenne, on ensisijaisen tärkeä. Linkke-rille ominaisen runkoketjun laskettu pituus täytyy olla 5 ainakin noin 18 A — trombiinin katalyyttisen kohdan ja anionia sitovan rajakohdan etäisyys — ja vähemmän kuin noin 42 A.

Linkkerin runkoketju voi sisältää mitä tahansa atomeja, jotka kykenevät sitoutumaan ainakin kahteen muuhun 10 atomiin. Runkoketju sisältää suositeltavasti sellaisten atomien mitkä tahansa kemiallisesti toteutettavissa olevat yhdistelmät, jotka atomit valitaan hapesta, hiilestä, ty-pestä ja rikistä. Alan asiantuntijat tietävät, mitkä yllä olevan runkoketjun atomien yhdistelmät muodostavat tarvit-15 tavan pituuden perustuen eri sidosten tunnettuihin etäisyyksiin (katso esimerkiksi R.T. Morrison ja R.N. Boyd, Organic Chemistry, 3. painos, Allyn ja Bacon, Inc., Boston, Massachusetts (1977)). Suositeltavan suoritustavan mukaisesti linkkeri on peptidi, joka sisältää aminohappo-20 sekvenssin Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe. ABEAM-osaan sitou tunut aminohappo on suositeltavasti Phe.

Tämän keksinnön mukaisten trombiini-inhibiittorien kolmas domeeni on ABEAM, joka sitoutuu trombiinin anionia sitovaan rajakohtaan. ABEAM-osan kaava on suositeltavasti: 25 W—Bx—b2-B3-B4—b5—b6—B7-B8—z, jossa W on sidos; B7 on anioninen aminohappo; B2 on mikä tahansa aminohappo; B3 on Ile, Vai, Leu, Nle tai Phe; B4 30 on Pro, Hyp, 3,4-dehydroPro, tiatsolidiini-4-karboksilaat-• ti, Sar, mikä tahansa N-metyyliaminohappo tai D-Ala; B5 on anioninen aminohappo; B6 on anioninen aminohappo; B7 on lipofiilinen aminohappo, joka valitaan ryhmästä, jossa on Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha, Pro, tai dipep-35 tidi, joka sisältää yhden näistä lipofiilisistä aminoha- 19 102183 poista ja minkä tahansa muun aminohapon; B8 on sidos tai peptidi, joka sisältää yksi - viisi mitä tahansa aminohappotähdettä ja Z on karboksipään jäännös, joka valitaan OH-, Cj-Ce alkoksi-, amino-, mono- tai di-iC^-Cg) alkyylillä 5 substituoidusta amino- tai bentsyyliaminoryhmästä.

Peptidien, jotka ovat homologisia hirudiinin karboksipään alueen kanssa, on osoitettu sitoutuvan trombii-nin anionia sitovaan rajakohtaan (haettavana oleva US-pa-tenttihakemus 314 756 ja J.M. Maraganore et ai., "Anti-10 coagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides", J. Biol. Chem., 264, sivut 8692 - 98 (1989), jotka molemmat on liitetty tähän viitteiksi).

Tämän keksinnön mukaisen suositeltavan suoritustavan mukaisesti ABEAM on homologinen hirudiinin aminoha-15 poille 56 - 64, se tarkoittaa, että Bx on Glu, B2 on Glu, B3 on Ile, B4 on Pro, B5 on Glu, B6 on Glu, B7 on Tyr-Leu, Tyr(S03H)-Leu tai Tyr( 0S03H )-Leu tai (3-, 5-dijodiTyr )-Leu, B8 on sidos ja Z on OH. On huomattava, että luonnollinen hirudiini sisältää Tyr(0S03H)-ryhmän kohdassa 63. Kuiten-20 kin, hirudiinin karboksipään peptideillä, jotka sisältävät Tyr(S03H)-ryhmän, on samanlainen hyytymisen vastainen aktiivisuus kuin niillä, jotka sisältävät luonnollisen Tyr(0S03H)-ryhmän (katso haettavana oleva US-patenttihake-mus 314 756).

25 Muut tämän keksinnön piiriin kuuluvat ABEAM-osat voivat sisältää minkä tahansa molekyylin ne osat, joiden tiedetään sitoutuvan trombiinin anionia sitovaan kohtaan. Nämä sisältävät faktori V:n aminohapot 1675 - 1686, verihiutaleen glykoproteiini Ib:n aminohapot 272 - 285, trom-30 bomoduliinin aminohapot 415 - 428, protrombiinin fragmen-• tin 2 aminohapot 245 - 259 ja fibrinogeenin aa-ketjun ami nohapot 30 - 44. Lisäksi ABEAM-osa voidaan valita mistä tahansa hirudiinipeptidianalogista, jotka ovat kuvanneet J.L. Krstenansky et ai., "Development of MDL-28,050, A 35 Small Stable Antithrombin Agent Based On A Functional Dom- 20 102183 ain of the Leech Protein, Hirudin", Thromb. Haemostas., 63, sivut 208 - 14 (1990).

Tämän keksinnön mukaisia suositeltavia trombiini-inhibiittoreita nimitetään Hirulog'eiksi ja ne kuvataan 5 seuraavissa esimerkeissä. Suositeltavimmat Hirulog'it ovat Hirulog-8, Hirulog-12, Hirulog-18a, Hirulog-18b ja Hiru-log-33. Hirulog-8, -12 ja -33 ovat reversiibeleitä trom-biini-inhibiittoreita, jotka katkaistaan hitaasti. Hiru-log-18a ja -18b ovat reversiibeleitä inhibiittoreita, joi-10 ta ei katkaista.

Esillä olevan keksinnön mukaiset trombiini-inhibiittorit voidaan syntetisoida eri menetelmillä, jotka ovat hyvin tunnettuja alalla. Nämä sisältävät luonnollisen tai rekombinanttihirudiinin entsymaattisen katkaisun, yh-15 distelmä-DNA-menetelmät, kiinteän faasin peptidisynteesin, liukoisen faasin peptidisynteesin, orgaanisen kemian synteesimenetelmät tai näiden menetelmien yhdistelmät. Synteesimenetelmän valinta riippuu tietysti tietyn inhibiittorin koostumuksesta. Tämän keksinnön mukaisessa suositel-20 tavassa suoritustavassa trombiini-inhibiittori on kokonai suudessaan peptidi ja se syntetisoidaan kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä, liukoisen faasin peptidisyn-teesimenetelmillä tai niiden yhdistelmällä, joka muodostaa hinnan suhteen tehokkaimmat menetelmät näiden molekyylien 25 kaupallisten määrien tuottamiseksi.

Kun trombiini-inhibiittorimolekyylissä on "ei-pro-teiini" -aminohappoja, ne voidaan joko lisätä suoraan kasvavaan ketjuun peptidisynteesin aikana tai valmistaa täydellisesti syntetisoidun peptidin kemiallisella modifikaa-30 tiolla riippuen halutun "ei-proteiini" -aminohapon luon-teestä. Kemiallisen synteesialan asiantuntijat tietävät hyvin, mitkä "ei-proteiini" -aminohapot voidaan lisätä suoraan ja mitkä täytyy syntetisoida modifioimalla täydellinen peptidiketju kemiallisesti peptidisynteesin jälkeen. 35 Tämän keksinnön mukaisten niiden trombiini-inhi- 21 102183 biittoreiden, jotka sisältävät sekä ei-aminohappo -osia että peptidiosia, synteesi suoritetaan suositeltavasti heterologisen/kiinteän faasin menetelmän yhdistelmällä. Tämä menetelmä sisältää kaikkien tai molekyylin useimpien 5 peptidiosien kiinteän faasin synteesin, jonka jälkeen lisätään ei-aminohappo -osat, jotka syntetisoidaan liuos-faasimenetelmillä. Ei-aminohappo voidaan liittää peptidi-osaan kiinteän faasin tai liuosfaasimenetelmillä. Mikä tahansa jäljelle jäävä peptidiosa voidaan samalla tavalla 10 lisätä kiinteän faasin tai liuosfaasimenetelmillä.

Esillä olevan keksinnön mukaisilla molekyyleillä on vahva hyytymisen vastainen aktiivisuus. Tätä aktiivisuutta voidaan testata in vitro käyttäen mitä tahansa tavanomaista menetelmää. Hyytymisen vastaisen aktiivisuuden testaus 15 sisältää suositeltavasti molekyylin trombiinia inhiboivan aktiivisuuden suoran määrittämisen. Sellaiset menetelmät mittaavat trombiinin katalysoiman kolorimetristen substraattien katkaisun inhibitiota tai suositeltavammin ihmisen plasman trombiiniaikojen tai aktivoitujen osittaisten 20 tromboplastiiniaikojen kohoamista. Jälkimmäinen testi mittaa faktoreita hyytymisen "sisäisellä" reitillä. Käytettävä testi voi vaihtoehtoisesti käyttää puhdistettua trombiinia ja fibrinogeenia fibrinopeptidien A tai B vapautumisen inhibition mittaamiseen radioimmuunitestillä tai 25 ELISA-testillä.

Tämän keksinnön mukaisten molekyylien verihiutaleiden vastainen aktiivisuus voidaan myös mitata millä tahansa useista tavanomaisista verihiutaletesteistä. Testi mittaa suositeltavasti muutoksen verihiutaleiden aggregaa-30 tiotasossa tai muutoksen verihiutaleiden erittyvän komponentin vapautumisessa trombiinin läsnä ollessa. Edellinen voidaan mitata aggregometrillä. Jälkimmäinen voidaan mitata käyttäen RIA- tai ELISA-menetelmiä, jotka ovat spesifisiä erittyvälle komponentille.

22 102163

Esillä olevan keksinnön mukaiset molekyylit ovat käyttökelpoisia kokoonpanoissa, yhdistelmissä ja menetelmissä hoidettaessa ja ehkäistäessä eri tauteja, jotka johtuvat trombiinivälitteisestä ja trombiiniin liittyvistä 5 toiminnoista ja prosesseista. Nämä sisältävät sydänlihaksen infarktin, sydänkohtauksen, keuhkoveritulpan, syvällä laskimossa olevan verisuonitukoksen, perifeerisen valtimon tukkeutumisen, valtimon vauriota tai sydäntautiopillisia menetelmiä seuraavan uuden ahtauman, akuutin tai kroonisen 10 ateroskleroosin, turvotuksen ja tulehduksen, solun eri säätelyprosessit (esim. eritys, muodonmuutokset, lisääntyminen), syövän ja metastasoinnin ja hermojen rappeuma-taudit.

Esillä olevan keksinnön mukaiset trombiini-inhi-15 biittorit voidaan formuloida käyttäen tavanomaisia menetelmiä farmaseuttisesti käyttökelpoisten kokoonpanojen valmistamiseksi, kuten farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan lisäyksen. Näitä kokoonpanoja ja niitä käyttäviä menetelmiä voidaan käyttää hoidettaessa tai ehkäistäessä 20 verisuonitukostauteja potilaassa.

Esillä olevan keksinnön vaihtoehtoisen suoritustavan mukaisesti trombiini-inhibiittoreita voidaan käyttää yhdistelmissä, kokoonpanoissa ja menetelmissä verisuoni-tukostautien hoitamiseksi ja sen veritulppaa liuottavan 25 aineen annoksen, jota tarvitaan uuden läpivirtauksen muodostamiseksi tai uuden tukkeuman ehkäisemiseksi potilaassa, alentamiseksi. Lisäksi tämän keksinnön mukaisia trombiini-inhibiittoreita voidaan käyttää yhdistelmissä, kokoonpanoissa ja menetelmissä uuteen läpivirtaukseen kulu-30 van ajan alentamiseksi ja uuteen tukkeutumiseen kuluvan • ajan kohottamiseksi potilaassa, jota hoidetaan veritulppaa liuottavalla aineella. Nämä yhdistelmät ja kokoonpanot sisältävät farmaseuttisesti tehokkaan määrän esillä olevan keksinnön mukaista trombiini-inhibiittoria ja farmaseut-35 tisesti tehokkaan määrän veritulppaa liuottavaa ainetta.

23 102183 Näissä yhdistelmissä ja kokoonpanoissa trombiini-inhibiittori ja veritulppaa liuottava aine toimivat toisiaan täydentävällä tavalla liuottaen verihyytymät, mikä johtaa alentuneisiin aikoihin uudessa läpivirtauksessa ja 5 kohonneisiin aikoihin uuden tukkeuman synnyssä potilaissa, joita hoidetaan niillä. Erikoisesti, veritulppaa liuottava aine liuottaa hyytymän samalla, kun trombiini-inhibiittori estää juuri paljastuneen, hyytymään tarttuneen tai hyytymään sitoutuneen trombiinin muodostamasta hyytymää uudel-10 leen. Trombiini-inhibiittorin käyttö tämän keksinnön mukaisissa yhdistelmissä ja kokoonpanoissa sallii edullisesti veritulppaa liuottavan aineen antamisen annoksina, joita aiemmin pidettiin liian alhaisina saamaan aikaan veruhyytymää liuottavat vaikutukset, jos ne annettiin yk-15 sinään. Tällä vältetään joitakin epätoivottavia sivuvaikutuksia, jotka liittyvät veritulppaa liuottavien aineiden käyttöön, kuten verenvuotokomplikaatiot.

Veritulppaa liuottavat aineet, joita voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisissa yhdistelmissä ja 20 kokoonpanoissa, ovat alalla tunnettuja. Sellaiset aineet sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, luonnollisista lähteistä puhdistetun kudoksen plasminogeeniaktivaattorin, kudoksen rekombinanttiplasminogeeniaktivaattorin, strepto-kinaasin, urokinaasin, prourokinaasin, eristämättömän 25 streptokinaasi-plasminogeeniaktivaattori -kompleksin (ASPAC), eläimen sylkirauhasen plasminogeeniaktivaattorit ja minkä tahansa yllä mainitun tunnetut biologisesti aktiiviset johdannaiset.

Termi "yhdistelmä" tässä käytettynä sisältää yksit-30 täisen annosmuodon, joka sisältää ainakin yhden tämän kek sinnön mukaisen trombiini-inhibiittorin ja ainakin yhden veritulppaa liuottavan aineen; moniannosmuodon, jossa trombiini-inhibiittori ja veritulppaa liuottava aine annetaan erikseen, mutta samanaikaisesti tai moniannosmuodon, 35 jossa kaksi komponenttia annetaan erikseen, mutta peräk- 24 1C2183 käin. Peräkkäin tapahtuvassa annossa trombiini-inhibiitto-ri voidaan antaa potilaalle ajanjaksona, joka vaihtelee välillä noin 5 tuntia ennen - noin 5 tuntia jälkeen veritulppaa liuottavan aineen antamisen jälkeen. Trombiini-5 inhibiittori annetaan suositeltavasti potilaalle ajan jaksona, joka vaihtelee välillä 2 tuntia ennen - 2 tuntia veritulppaa liuottavan aineen annon jälkeen.

Trombiini-inhibiittori ja veritulppaa liuottava aine voivat vaihtoehtoisesti olla yhden konjugoidun mole-10 kyylin muodossa. Kahden komponentin konjugointi voidaan suorittaa standardeilla ristisitomismenetelmillä, jotka ovat alalla hyvin tunnettuja. Yksittäinen molekyyli voi olla myös rekombinanttifuusioproteiinin muodossa, jos sekä trombiini-inhibiittori että veritulppaa liuottava aine 15 ovat peptidejä.

Erilaisia annosmuotoja voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten kokoonpanojen ja yhdistelmien antamiseksi. Nämä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, paren-teraalisen annon, annon suun kautta ja ulkoisen annon. 20 Tämän keksinnön mukaiset kokoonpanot ja yhdistelmät voi daan antaa potilaalle missä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävässä annosmuodossa sisältäen ne, jotka voidaan antaa potilaalle laskimonsisäisesti kerta-annoksena tai jatkuvana infuusiona, lihaksensisäisesti — sisältäen sel-25 kärangan viereisen ja niveltä ympäröivän annon -- ihonalaisesti, ihonsisäisesti, nivelensisäisesti, nivelnes-teensisäisesti, kotelonsisäisesti, vaurionsisäisesti, luu-kalvoa ympäröivästi tai suun, nenän tai ulkoisen reitin kautta annolla. Sellaiset kokoonpanot ja yhdistelmät muo-30 dostetaan suositeltavasti ulkoista, nenän kautta, suun • kautta ja parenteraalista antoa varten, mutta suositelta- vimmin ne formuloidaan parenteraalista antoa varten.

Parenteraaliset kokoonpanot annetaan suositeltavim-min laskimonsisäisesti joko kerta-annosmuodossa tai jat-35 kuvalla infuusiolla. Jos trombiini-inhibiittoria käytetään 102183 25 verihiutaleiden vastaisena yhdisteenä, on jatkuva infuusio suositeltava. Jos trombiini-inhibiittoria käytetään hyytymisen vastaisena aineena, on ihonalainen tai laskimonsi-säinen kertainjektio suositeltava. Parenteraalista antoa 5 varten valmistetaan nestemäiset yksikköannokset, jotka sisältävät esillä olevan keksinnön mukaisen trombiini-in-hibiittorin ja steriilin liuotteen. Trombiini-inhibiittori voi olla joko suspendoitu tai liuotettu riippuen liuotteen ja tietyn trombiini-inhibiittorin luonteesta. Parenteraa-10 liset kokoonpanot valmistetaan normaalisti liuottamalla trombiini-inhibiittori liuotteeseen, valinnaisesti yhdessä muiden komponenttien kanssa, ja suodatinsteriloimalla ennen täyttämistä sopivaan pulloon tai ampulliin ja ennen niiden sinetöimistä. Adjuvantit, kuten paikallispuudute, 15 säilöntäaineet ja puskuroivat aineet liuotetaan myös suosi tel tavasti liuotteeseen. Sitten kokoonpano voidaan jäädyttää ja lyofilisoida stabiilisuuden parantamiseksi.

Parenteraaliset suspensiot valmistetaan oleellisesti samalla tavalla paitsi, että aktiivinen komponentti 20 mieluummin suspendoidaan kuin liuotetaan liuotteeseen. Kokoonpanojen sterilointi suoritetaan suositeltavasti altistamalla etyleenioksidille ennen suspendoimista steriiliin liuotteeseen. Kokoonpanoon sisällytetään edullisesti pinta-aktiivinen tai kostutusaine sen sisältämien kompo-25 nenttien tasaisen jakaantumisen parantamiseksi.

Tabletit ja kapselit suun kautta antoa varten voivat sisältää tavanomaisia täyteaineita, kuten sitovia aineita, täytteitä, laimentimia, tabletointiaineita, liukas-tusaineita, hajottavia aineita ja kostutusaineita. Tablet-30 ti voidaan päällystää alalla hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti. Sopivat täytteet, joita voidaan käyttää, sisältävät selluloosan, mannitolin, laktoosin ja muut samanlaiset aineet. Sopivat hajottavat aineet sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, tärkkelyksen, polyvinyylipyrroli-35 donin ja tärkkelysjohdannaiset, kuten natriumtärkkelysgly- oc 102183 26 kolaatin. Sopivat liukastusaineet sisältävät esimerkiksi magnesiumstearaatin. Sopivat kosteuttavat aineet sisältävät natriumlauryylisulfaatin.

Suun kautta annettavat nestemäiset valmisteet voi-5 vat olla vesipohjaisissa tai öljypohjaisissa suspensio-, liuos-, emulsio-, siirappi- tai eliksiirimuodoissa tai ne voidaan pitää kuivana tuotteena, joka liuotetaan veteen tai muuhun sopivaan liuotteeseen ennen käyttöä. Sellaiset nestemäiset valmisteet voivat sisältää tavanomaisia lisä-10 aineita. Nämä sisältävät suspendoivat aineet, kuten sorbitolin, siirapin, metyyliselluloosan, gelatiinin, hydrok-sietyyliselluloosan, karboksimetyyliselluloosan, alumiini-stearaattigeelin tai hydrogenoidut syötävät rasvat; emul-sioivat aineet, jotka sisältävät lesitiinin, sorbitaani-15 mono-oleaatin, polyetyleeniglykolit tai akaasian; ei-vesi-pohjaiset liuotteet, kuten manteliöljyn, fraktioidun koo-kospähkinäöljyn ja öljyesterit; ja säilöntäaineet, kuten metyyli- tai propyyli-p-hydroksibentsoaatin tai sorbiini-hapon.

20 Kokoonpanot, jotka on formuloitu ulkoista antoa varten, voivat olla esimerkiksi vesipohjaisessa geelimuo-dossa, öljypohjaisessa suspensio- tai emulsioidussa voide-muodossa .

Trombiini-inhibiittorin annos ja antonopeus riippuu 25 useista eri tekijöistä, kuten potilaan koosta, käytetystä spesifisestä farmaseuttisesta kokoonpanosta, hoitoaihees-ta, se tarkoittaa, onko kyseessä hoito vai ennaltaehkäisy, hoidettavan veritukostaudin luonteesta ja hoitavan lääkärin arviosta.

30 Esillä olevan keksinnön mukaisesti tämän keksinnön mukaisen trombiini-inhibiittorin suositeltava farmaseuttisesti tehokas päivittäinen annos on välillä noin 1 pg/kg hoidettavan potilaan kehon painoa ("kehon paino") ja noin 5 mg/kg kehon painoa. Yhdistelmissä, jotka sisältävät ve-35 ritulppaa liuottavaa ainetta, veritulppaa liuottavan ai- 102183 27 neen farmaseuttisesti tehokas päivittäinen annos on välillä noin 10 % ja 80 % tavanomaisesta annosmäärästä. Veritulppaa liuottavan aineen "tavanomainen annosmäärä" on se päivittäinen annos, jota käytetään annettaessa sitä ainet-5 ta yksinään. (Physician’s Desk Reference 1989, 43. painos, Edward R. Barnhart, julkaisija). Se tavanomainen annosmäärä vaihtelee tietysti riippuen käytetystä veritulppaa liuottavasta aineesta. Esimerkit tavanomaisista annosmääristä ovat seuraavia: urokinaasi - 500 000 - 6 250 000 yksik-10 köä/potilas; streptokinaasi - 140 000 - 2 500 000 yksik-köä/potilas; tPA - 0,5 - 5,0 mg/kg kehon painoa; ASPAC -0,1 - 10 yksikköä/kg kehon painoa.

Suositeltavimmin esillä olevan keksinnön mukaiset terapeuttiset ja profylaktiset kokoonpanot sisältävät 15 trombiini-inhibiittoriannoksen, joka on välillä noin 10 pg/kg kehon painoa ja noin 500 pg/kg kehon painoa. Suositeltavimmat yhdistelmät sisältävät saman määrän trombii-ni-inhibiittoria ja veritulppaa liuottavaa ainetta määrän, joka on välillä noin 10 % ja noin 70 % tavanomaisesta an-20 nosmäärästä. On ymmärrettävä, että päivittäinen farmaseuttisesti tehokas annos joko tämän keksinnön mukaisia trom-biini-inhibiittoreita tai keksinnön mukaisissa yhdistelmissä olevaa veritulppaa liuottavaa ainetta voi olla pienempi tai suurempi kuin yllä ilmoitetut spesifiset rajat. 25 Kun potilaan tilassa on tapahtunut parannusta, an netaan tämän keksinnön mukaisen yhdistelmän tai kokoonpanon ylläpitoannos, jos tarpeellista. Sen jälkeen annosta tai antotiheyttä tai molempia voidaan vähentää oireiden vaatimalle tasolle, jossa parantunut tila säilyy. Kun oi-30 reet on lievitetty halutulle tasolle, hoito lopetetaan. Potilaat voivat kuitenkin tarvita ajoittaista hoitoa taudin oireiden uusiutuessa.

Tämän keksinnön mukaisen vaihtoehtoisen suoritustavan mukaisesti trombiini-inhibiittoreita voidaan käyttää 35 yhdistelmissä ja menetelmissä potilaan sisään vietävien 28 102183 laitteiden päällystykseen, joka johtaa alempaan hyytymän muodostusriskiin tai verihiutaleiden aktivaatioriskiin potilailla, jotka saavat sellaisia laitteita. Pinnat, jotka voidaan päällystää tämän keksinnön mukaisilla kokoon-5 panoilla, sisältävät esimerkiksi proteesit, keinotekoiset läpät, verisuonikudossiirrokset, stentsit ja katetrit. Menetelmät ja kokoonpanot näiden laitteiden päällystämiseksi ovat alan asiantuntijoiden tuntemia. Nämä sisältävät trombiini-inhibiittoria sisältävien kokoonpanojen kemial-10 lisen ristisitomisen tai fysikaalisen adsorption laitteiden pinnalle. Esillä olevan keksinnön lisäsuoritustavan mukaisesti trombiini-inhibiittoreita voidaan käyttää veri-tukoksen ex vivo kuvaamiseksi potilaassa. Tässä suoritustavassa trombiini-inhibiittori leimataan radioaktiivisella 15 isotoopilla. Radioaktiivisen isotoopin valinta perustuu useisiin tunnettuihin tekijöihin, esimerkiksi myrkyllisyyteen, biologiseen puoliintumisaikaan ja havaittavuuteen. Suositeltavat radioaktiiviset isotoopit sisältävät, mutta eivät ole rajoitettuja, 125I:n 123I:n ja 111In:n. Menetelmät 20 trombiini-inhibiittorin leimaamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Radioaktiivinen isotooppi on suositeltavimmin 123I ja leimaus suoritetaan käyttäen 123I-Bolton-Hunter-rea-genssia. Leimattu trombiini-inhibiittori annetaan potilaalle ja sen sallitaan sitoutua hyytymässä sijaitsevaan 25 trombiinkin. Sitten hyytymä havaitaan käyttäen hyvin tunnettuja tunnistusmenetelmiä, kuten tietokonekuvaussystee-miin liitettyä kameraa, joka kykenee tunnistamaan radioaktiivisuuden. Tämä menetelmä antaa myös kuvat verihiutaleisiin sitoutuneesta trombiinista ja meizotrombiinista.

30 Tämä keksintö koskee myös kokoonpanoja, jotka si- ·. sältävät tämän keksinnön mukaisia trombiini-inhibiitto reita ja menetelmiä sellaisten kokoonpanojen käyttämiseksi metastasoivien kasvainten hoidossa. Tämän keksinnön mukaisten trombiini-inhibiittoreiden tehokkuus metastasoivi-35 en kasvainten hoidossa ilmentyy metastaasikasvun inhibiti- 29 102183 ona. Tämä perustuu tietyissä syöpäsoluissa läsnä olevaan prokoagulaatioentsyymiin. Tämä entsyymi aktivoi faktori V:n muutoksen faktori Xa:ksi hyytymiskaskadissa, joka johtaa fibriinin kerääntymiseen, joka puolestaan toimii subs-5 traattina kasvaimen kasvulle. Inhiboimalla fibriinin kerääntyminen trombiinia inhiboimalla esillä olevan keksinnön mukaiset molekyylit toimivat tehokkaina metastasoinnin vastaisina kasvainaineina. Esimerkit metastasoivista kasvaimista, joita voidaan hoitaa tämän keksinnön mukaisilla 10 trombiini-inhibiittoreilla sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, aivokarsinooman, maksakarsinooman, keuhko-karsinooman, osteosarkooman ja plasmakasvainsolujen karsi-nooman.

Keksintö koskee myös menetelmiä ja kokoonpanoja, 15 jotka käyttävät yllä kuvattuja trombiini-inhibiittoreita trombiinilla indusoituvien endoteelisolujen aktivaation inhiboimiseksi. Tämä inhibitio sisältää endoteelisolujen verihiutalefaktorin (PAF) synteesin repression. Näillä kokoonpanoilla ja menetelmillä on tärkeitä sovellutuksia 20 sellaisten tautien hoidossa, joille on ominaista trombii-nin indusoima tulehdus ja turvotus, jonka oletetaan välittyvän PAF: n välityksellä. Sellaiset taudit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, aikuisen hengityshäiriöoire-yhtymän, septisen sokin, verenmyrkytyksen ja uudesta läpi-25 virtauksesta aiheutuneen vaurion.

Septisen sokin aikaiset vaiheet sisältävät erilliset akuutit tulehdusresponssit ja hyytymistä aiheuttavat responssit. Aiemmin on osoitettu, että paviaanien injektoiminen tappavalla annoksella eläviä E. coli -bakteereja 30 johtaa merkittäviin alentumisiin neutrofiilien määrissä, ·. verenpaineessa ja hematokriitissä. Muutokset verenpainees sa ja hematokriitissä johtuvat osaksi hajapesäkkeisen suonensisäisen hyytymisen (DIC) muodostumisesta ja sen on osoitettu esiintyvän rinnan fibrinogeenin kulutuksen kans-35 sa (F.B. Taylor et ai., "Protein C Prevents the Coagulopa- 102183 30 thic and Lethal Effects of Escherichia coli infusion in the Baboon", J. Clin, Invest., 79, sivut 918 - 25 (1987)). Neutrosolujen niukkuus johtuu vakavasta tulehdusrespons-sista, joka johtuu septisestä sokista, joka johtaa merkit-5 täviin kohoamisiin kasvaimen nekroositekijän tasoissa. Tämän keksinnön mukaisia trombiini-inhibiittoreita voidaan käyttää kokoonpanoissa ja menetelmissä hoidettaessa ja ehkäistäessä DIC verenmyrkytyksessä ja muissa taudeissa.

Tämä keksintö koskee myös yllä kuvattujen trombiΙ-ΙΟ ni-inhibiittorien tai niitä sisältävien kokoonpanojen käyttöä kehon ulkopuolisen veren hyytymisen vastaisina aineina. Tässä käytettynä termi "kehon ulkopuolinen veri" sisältää veren, joka on poistettu hallittavasti potilaasta, altistettu kehon ulkopuoliselle käsittelylle ja sitten 15 palautettu takaisin potilaaseen sellaisissa menetelmissä, kuten dialyysimenetelmät, veren suodatuksessa tai veren ohi johtaminen leikkauksen aikana. Termi sisältää myös verituotteet, joita varastoidaan kehon ulkopuolella, kun-' nes annetaan potilaalle, ja veren, joka on kerätty poti- 20 laasta käytettäväksi eri testimenetelmissä. Sellaiset tuotteet sisältävät kokoveren, plasman tai minkä tahansa verifraktion, jossa hyytymisen inhibitio on toivottavaa.

Trombiini-inhibiittorin määrä tai konsentraatio tämän tyyppisissä kokoonpanoissa perustuu käsiteltävän 25 veren tilavuuteen tai suositeltavammin sen trombiinimää-rään. Tämän keksinnön mukaisen trombiini-inhibiittorin tehokas määrä kehon ulkopuolisen veren hyytymisen estämiseksi on suositeltavasta noin 1 pg/60 ml - noin 5 mg/60 ml kehon ulkopuolista verta.

30 Tämän keksinnön mukaisia trombiini-inhibiittoreita voidaan käyttää myös hyytymään tarttuneen trombiinin inhi-boimiseksi, jonka trombiinin ajatellaan ottavan osaa hyytymän lisäkasvuun. Tämä on erikoisen tärkeätä, koska tavallisesti käytetyt trombiinin vastaiset aineet, kuten 31 102183 hepariini ja matalan molekyylipainon omaava hepariini, ovat tehottomia hyytymään tarttunutta trombiinia vastaan.

Lopuksi, tämän keksinnön mukaisia trombiini-inhi-biittoreita voidaan käyttää kokoonpanoissa ja menetelmissä 5 hermojen rappeumatautien hoitamiseksi. Trombiinin tiedetään aiheuttavan hermosolun viejähaaran kutistumista, prosessi, jonka ajatellaan aiheuttavan pyöristymismuutoksia aivosolujen muodossa ja ottavan osaa tauteihin, kuten Alzheimerin ja Parkinsonin tautiin.

10 Jotta tässä kuvattu keksintö olisi täydellisemmin ymmärrettävissä, on kuvattu seuraavat esimerkit. On ymmärrettävä, että nämä esimerkit on annettu ainoastaan kuvaavia tarkoituksia varten eikä niitä pidä tulkita millään tavalla tätä keksintöä rajoittaviksi.

15 Esimerkki 1

Sulfo-Tyrej-hirudiinin^^n synteesi Sulfo-Tyr63hirudiini54_64:n aminohappokaava on: H-

Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(0S03)-Leu-OH. Val-* mistimme tämän peptidin kiinteän faasin peptidisynteesillä 20 käyttäen Applied Biosystems 430 A -peptidisyntetisaattoria (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Spesifisesti, annoimme 0,259 milliekvivalentin BOC-O-Leu-resiiniä (1 % DVB-resiini) reagoida peräkkäin 2 mmoolin kanssa suojattuja aminohappoja. 10 synteesisyklin 25 jälkeen poistimme peptidin suojauksen ja irrotimme sen DVB-resiinistä käsittelemällä vedettömällä HF:p-kresoli: etyylimetyylisulfaatti -liuoksella (10:1:1, v/v/v). Peptidi puhdistettiin edelleen Vydac C18 HPLC -käänteisfaasipyl-väässä (22 mm x 25 cm), joka oli aiemmin tasapainotettu 30 vedessä olevassa 0,1 % TFA:ssa. Ennen peptidin lisäämistä pylvääseen liuotimme sen 2,0 ml:aan vedessä olevaa 0,1 % TFA:ta. Jos oli tarpeen, näytteeseen lisättiin lisää 1 ml 6 M guanidiniumkloridia liukoisuuden parantamiseksi. Kun olimme lisänneet näytteen, pylväs eluoitiin lineaarisella 35 gradientilla, jossa oli kasvava konsentraatio (0 - 80 %) 32 102183 0,1 % TFArssa olevaa asetonitriiliä, 45 minuutin ajan virtausnopeudella 4,0 ml/min. Läpitullutta virtausta tarkkailtiin 229 nm:ssä ja fraktiot kerättiin käsin.

Sulfonoimme tuloksena syntyneen puhdistetun pepti-5 din ainoaan tyrosiinitähteeseen käyttäen standardeja menetelmiä (T. Nakahara et ai., "Preparation of Tyrosine-0-(35S) Sulfated Cholecystokinin Octapeptide From A Non-Sul-fated Precursor Peptide", Anal. Biochem♦, 154, sivut 194 -99 (1986)). Sitten Sulfo-Tyr63hirudiini54_64 puhdistettiin 10 eroon muista peptideistä ja reaktiokomponenteista kään-teisfaasi-HPLC:llä käyttäen Vydac C18 -pylvästä (4,6 x 25 cm) ja Applied Biosystems -nestekromatografiasysteemiä. Pylväs tasapainotettiin 0,1 % TFA/vesi -liuottimessa ja eluoitiin lineaarisella gradientilla, jossa oli kasvava 15 asetonitriilikonsentraatio 0 - 35 %, 90 minuutin ajan virtausnopeudella 0,8 ml/min, liuottimena, joka oli 0,085 % TFA:n suhteen. Fraktiot testattiin absorbanssilla 214 nm.

Esimerkki 2

Ihmisen trombiinin ristiliitos Sulfo-Tyr^-dinitro-20 fluoribentsyylihirudiini54_64:n kanssa

Valmistimme Sulfo-Tyr63-dinitrof luoribentsyylihi- rudiini54_64:n (Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64) antamalla Sul-fo-Tyr63hirudiini54_64:n (2,0 mg; valmistettu, kuten esimerkissä 1) reagoida stoikiometrisen määrän kanssa difluori-25 dinitrobentseeniä (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) di-metyyliformamidissa (DMF) 18 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten altistimme näytteen analyyttiselle HPLC-erotukselle käyttäen Applied Biosystems 150 A -nestekromatografiasysteemiä ja Brownlee RP-300 C8 -pylvästä (0,46 x 10 cm) deri-30 vatisaatioasteen määrittämiseksi. Pylväs tasapainotettiin \ vedessä olevalla 0,1 % TFArlla (liuotin A) ja elutoitiin 0 - 50 % lineaarisella gradientilla, joka oli 0,085 % TFA/70 % asetonitriili (liuotin B), 45 minuutin ajan ja sitten liuottimen B 50 - 100 % lineaarisella gradientilla 33 102183 15 minuutin ajan. Käytimme vakiota virtausnopeutta 1,0 ml/min.

Läpitullutta virtausta tarkkailtiin 214 nm:ssä ja 310 nm:ssä absorbanssin suhteen. Peptidi, joka on deriva-5 tisoitunut difluoridinitrobentseenireagenssilla, absorboi 310 nm:ssä. Havaitsimme, että yllä kuvattu reaktio tuotti Sul£o-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64;ää 15 - 30 % saannolla. Synteesin jälkeen Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64 säilytettiin samassa dimetyyliformamidiliuottimessa -20 °C:ssa korkein-10 taan yksi kuukausi.

Annoimme 10-kertaisen mooliylimäärän Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54.64:ää reagoida ihmisen a-trombiinin (12,5 mg) kanssa 18 tuntia huoneenlämpötilassa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa. Määritimme ristiliitostason 15 analysoimalla reaktioseoksen SDS-polyakryyliamidigeelissä.

SDS-PAGE osoitti alentumisen α-trombiinin rintaman suhteellisessa liikkuvuudessa, joka kuvasti molekyylipainon kohoamisen 1 000 - 2 000 daltonilla (Da). Tämä muutos on johdonmukainen siten, että trombiini on ristisitoutunut 20 Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54.64:n kanssa yhdestä kohdasta.

Vahvistimme, että kovalenttisen kompleksin muodostuminen Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64:n ja ihmisen trombii-nin välillä on spesifinen käyttäen (35S )-Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64: ää. (35S) -Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64 valmis-25 tettiin oleellisesti, kuten on kuvattu yllä käyttäen H2(35S)04:ää H2S04:n sijasta Nakaharan sulfonointimenetelmäs-sä (katso myös haettavana olevat US-patenttihakemukset, joiden sarjanumerot ovat 164 178, 251 150, 280 618 ja 314 756, ja J.M. Maraganore et ai., "Anticoagulant Activi-30 ty of Synthetic Hirudin Peptides", J♦ Biol. Chem., 264, '· sivut 8692 - 98 (1989), jotka kaikki on liitetty tähän viitteiksi).

Annoimme (35S)-Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64:n reagoida ihmisen α-trombiinin kanssa niin, että läsnä oli 5-35 tai 20-kertainen mooliylimäärä (trombiinikonsentraation 34 102183 suhteen) Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64:ää (valmistettu, kuten esimerkissä 1 lisäämällä N-asetyyliasparagiinia peptidisynteesin loppuvaiheessa) tai ilman sitä. Kun oli inkuboitu huoneenlämpötilassa 18 tuntia, teimme seokselle 5 SDS-PAGE:n ja autoradiografian. Tulokset (kuva 1) osoittivat, että (35S)-leimattu peptidi inkorporoitui rintamaan, joka vastaa trombiinia ja että kylmän leimaamattoman hiru-diinipeptidin läsnäolo vähensi kovalenttisen kompleksin muodos tiimi sen määrää < 10 %. Näin ollen trombiinin reaktio 10 Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64 :n kanssa johtaa hirudiinipep- tidin 1:1 stoikiometriseen sitoutumiseen spesifiseen sito-miskohtaan.

Sen kohdan tunnistamiseksi trombiinissa, johon Sul-fo-Tyr63-DNFB-hirudiini54.64 sitoutuu, trombiini/Sulfo-Tyr63-15 dinitrobentsyyli (DNB) -hirudiini54_64 -kompleksi (1,0 mg) laitettiin Sephadex G-50 -pylvääseen (1,5 x 45 cm), joka tasapainotettiin ja eluoitiin 7 M urea, 20 mM Tris -liuoksella, pH 7,5. Tämä kromatografia poisti kaiken reagoimattoman Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini54_64:n. Huippu, joka sisälsi 20 trombiini/Sulfo-Tyr63-DNB-hirudiini54_64:n, eristettiin läpi tulleen nestetilavuuden fraktioissa, yhdistettiin ja pelkistettiin lisäämällä 10 μΐ β-merkaptoetanolia.

Pelkistyksen jälkeen S-karboksimetyloimme kompleksin käyttäen jodietikkahappoa, kuten aiemmin on kuvattu 25 (J.M. Maraganore et ai., "A New Class of Phospholipases A2 with Lysine in Place of Aspartate-49", J. Biol. Chem., 259, sivut 13839 - 43 (1984)). Sitten pelkistetty S-alky-loitu proteiini dialysoitiin voimakkaasti 3 % etikkahappoa vastaan huoneenlämpötilassa. Dialyysin jälkeen digestoimme 30 kompleksin pepsiinillä (2 % w/v) 4 tuntia 37 °C:ssa. Pel-’· kistetyn S-karboksimetyloidun trombiini/Sulfo-Tyr63-DNB- hirudiini54_64:n peptidifragmentit puhdistettiin kään-teisfaasi-HPLC:llä käyttäen Aquapore RP-300 C8 -pylvästä (0,46 x 10 cm). Pylväs tasapainotettiin vedessä olevalla 35 0,1 % TFAilla ja eluoitiin kohoavalla 0,085 % TFA/70 % 35 102183 asetonitriiligradientilla (0 - 60 %) 80 minuutin ajan virtausnopeudella 1,0 ml/min. Läpi tullutta virtausta tarkkailtiin absorbanssin suhteen sekä 214 että 310 nm:ssa.

1,0 ml:n fraktiot kerättiin automaattisesti. Peptidifrag-5 menttien HPLC-erotus salli resoluution, jossa saatiin yksi ainoa pääasiallinen huippu sekä 214 että 310 nm:ssa absorboivaa materiaalia. Johtuen syvästä UV-absorbanssista tämä fragmentti sisälsi sitoutuneen Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudiini5«_ 64ΪΠ.

10 Sitten altistimme fragmentin automatisoidulle Ed- man-degradaatiolle käyttäen Applied Biosystems 470A -kaa-sufaasisekvenaattoria, joka oli varustettu 900A -tietokonesysteemillä. Fenyylitiohydantoiiniaminohapot (PTH) analysoitiin yhtä aikaa käyttäen Applied Biosystems 120A PTH 15 -analysaattoria ja PTH-Cie -pylvästä (2,1 x 220 mm). Alla on esitetty taulukko sekvenssianalyysin toistettavista saannoista:

Sykli Aminohappo pmoolia 20 1 Lys 858,5 2 Glu 629,2 3 Thr 367,6 4 Trp 276,3 5 Thr 289,0 25 6 Ala 474,4 7 Asn 369,0 8 Vai 490,7 9 Gly 296,1 10 (X) (-) 30 11 Gly 267,2 12 Gin 208,8 13 Pro 103,5 14 Ser 21,6 15 Vai 23,3 ,Ä 102183 do

Peptidisekvenssin havaittiin vastaavan ihmisen a-trombiinin tähteitä 144 - 154 (J.W. Fenton, II., "Thrombin Active Site Regions", Semin. Thromb. Hemostasis, 12, sivut 200 - 08 (1986)). Peptidien katkeamiset tapahtuivat Leu-5 Lys ja Val-Leu -sidoksissa, joka oli johdonmukaista tämän entsyymin spesifisyyden kanssa.

Sekvenssianalyysin aikana aminohappoa, joka vastaa Lys-149:ää (sykli 10), ei voitu tunnistaa tai sen määrää määrittää. Tämä johtui luultavasti tämän aminohapon epsi-10 lon-NH2-ryhmän derivatisoitumisesta Sulfo-Tyr63-DNFB-hiru-diini54_64:n dinitrofluoribentsyyliosalla. Näin ollen Lys-149 on pääasiallinen kohta, jossa Sulfo-Tyr63-DNFB-hiru-diini54_64 reagoi α-trombiinin kanssa.

Esimerkki 3 15 Sellaisen trombiini-inhibiittorin suunnittelu, joka kykenee blokeeraamaan katalyyttisen kohdan ja sitoutumaan anionia sitovaan rajakohtaan

Hirudiinin karboksipään peptidit blokeeraavat tehokkaasti trombiinin katalysoiman fibrinogeenin hydrolyy-20 sin, mutta ei kromogeenisen substraatin hydrolyysiä (J.M. Maraganore et ai., J. Biol. Chem., 264, sivut 8692 - 98 (1989)). Lisäksi, hirudiinipeptidit eivät neutraloi trombiinin katalysoimaa faktorien V ja VIII aktivaatiota (J.W. Fenton, II. et ai., "Hirudin Inhibition by Thrombin", 25 Angio. Archiv. Biol., 18, sivu 27 (1989)).

Hirudiinipeptideillä, kuten Sulfo-Tyr63-N-asetyy-lihirudiini53_64:llä, on vahvat inhibitoriset vaikutukset trombiinin indusoimalle verihiutaleiden aktivaatiolle in vitro (J.A. Jakubowsky ja J.M. Maraganore, "Inhibition of 30 Thrombin-Induced Platelet Activities By A Synthetic 12

Amino Acid Residue Sulfated Peptide (Hirugen)", Blood, sivu 1213 (1989)). Siitä huolimatta voidaan tarvita trom-biini-inhibiittoria, joka kykenee blokeeraamaan aktiivisen kohdan, verihiutaleiden aiheuttaman veritukoksen inhiboi-35 miseksi in vivo, jos faktorien V ja VIII aktivaatiot ovat 37 102183 nopeutta rajoittavia vaiheita. Tälle päätelmälle antaa aiheen tulokset, jotka saatiin irreversiibelillä trombii-ni-inhibiittorilla (D-Phe)-Pro-Arg-CH2Cl (S.R. Hanson ja L.A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependent 5 Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenylalanyl-L-Prolyl-L-Arginyl Chloromethyl Ketone", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, sivut 3184 - 88 (1988) ja muilla reversii-beleillä trombiini-inhibiittoreilla (J.F. Eidt et ai., "Thrombin is an Important Mediator of Platelet Aggregation 10 in Stenosed Canine Coronary Arteries with Endothelial Injury", J. Clin. Invest., 84, sivut 18 - 27 (1989)).

Käyttäen yllä olevaa tietoa, että hirudiinipeptidi-en NH2-pää sijaitsee proksimaalisesti Lys-149:stä, käytimme trombiinin kolmiulotteista mallia (kuva 2)(B. Furie et 15 ai., "Computer-Generated Models of Blood Coagulation Factor Xa, Factor IXa, and Thrombin Based Upon Structural Homology with Other Serine Proteases", J. Biol. Chem., 257, sivut 3875 - 82 (1982)) sellaisen aineen suunnittelemiseksi, joka: 1) sitoutuu trombiinin anionia sitovaan 20 rajakohtaan ja 2) kykenee blokeeraamaan trombiinin aktiivisen kohdan taskun ja inhiboimaan siinä olevien katalyyttisten tähteiden toiminnan.

Määritimme, että pienin mahdollinen etäisyys Lys-149:n epsilon-NH2-ryhmästä Ser-195:n β-hydroksylaattiryh-25 mään on 18 - 20 A. Perustuen siihen, että pituus on 3 A/ aminohappotähde laskimme, että tarvitaan ainakin noin 4 -7 aminohappoa hirudiinipeptidin, kuten Sulfo-Tyr63-hirudii-n;*-53-64' liittämiseksi domeeniin, joka sisältää rakenteen, jossa on aktiivinen kohta ja inhibiittori. Linkkerin suun-30 niteltiin koostuvan glysiinistä. Glysiini valittiin, jotta pystyttiin muodostamaan suurin mahdollinen linkkerin joustavuus näihin alkututkimuksiin. On ymmärrettävä kuitenkin, että muita joustamattomampia biopolymeerilinkkereitä voidaan myös käyttää.

38 102183

Valitsimme sekvenssin (D-Phe)-Pro-Arg-Pro aktiivisen kohdan inhibiittoriksi, koska trombiinin spesifisyys substraattien katkaisussa Px aminohapon suhteen on Arg. Pro, jota seuraa Arg, muodostaa sidoksen, jonka trombiini 5 katkaisee hyvin hitaasti. Suunnittelimme vaihtoehtoisia peptidejä korvaamalla Pro:n (joka seuraa P^Argria) sar-kosyyli- tai N-metyylialaniiniaminohapolla tai katkaistavan Arg-Gly -sidoksen kemiallisella pelkistyksellä.

Esimerkki 4 10 Hirulog-8:n synteesi

Hirulog-8:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Syntetisoimme Hirulog-8:n tavanomaisella kiinteän faasin pep-tidisynteesillä käyttäen Applied Biosystems 430 A -pepti-15 disyntetisaattoria. Tämä peptidi syntetisoitiin käyttäen BOC-L-Leusiini-O-divinyylibentseeniresiiniä. Käytetyt t-BOC-lisäaminohapot (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) sisälsivät BOC-O-2,6-diklooribentsyylityrosiinin, BOC-L-glutamiinihapon (gamma-bentsyyliesteri), BOC-L- proliinin, 20 BOC-L-isoleusiinin, BOC-L-fenyylialaniinin, BOC-L-aspara- giinihapon (β-bentsyyliesteri), BOC-glysiinin, BOC-L-as-paragiinin, BOC-D-fenyylialaniinin ja BOC-L-arginiinin. Jotta synteesissä saatiin korkeammat saannot, (Gly)4-link-kerisegmentti kiinnitettiin kahdella käsin tehdyllä syk-25 Iillä, joissa lisättiin BOC-glysyyliglysiini (Beckman

Biosciences, Inc., Philadelphia, PA). Kun synteesi oli täydellinen, peptidistä poistettiin kaikki suojaukset ja se irrotettiin divinyylibentseeniresiinistä käsittelemällä vedettömällä HF:p-kresoli:etyylimetyylisulfaatti -liuok-30 sella (10:1:1, v/v/v). Resiinistä irrotuksen jälkeen pep- ” tidi lyofilisoitiin kuivaksi.

• I

Raaka Hirulog-8 puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen Applied Biosystems 151A -nestekromato-grafiasysteemiä ja Vydac C18 -pylvästä (2,2 x 25 cm). Pyl-35 väs tasapainotettiin 0,1 % TFA/vesi -liuoksessa ja eluoi- 39 102183 tiin lineaarisella gradientilla, jossa oli kohoava asetoni triilikonsentraatio 0 - 80 % 0,1 % TFA:ssa, 45 minuutin ajan virtausnopeudella 4,0 ml/min. Läpi tullutta eluutio-virtausta tarkkailtiin absorbanssin suhteen 229 nm:ssa ja 5 fraktiot kerättiin käsin. Puhdistimme 25 - 30 mg raakaa Hirulog-8:aa HPLCrllä ja saimme 15 - 20 mg puhdasta peptidiä.

Varmistimme puhdistetun Hirulog-8:n rakenteen aminohappo- ja sekvenssianalyyseillä. Aminohappohydrolysaatit 10 valmistettiin käsittelemällä peptidiä 6 N HCl:lla in vacuo 110 eC:ssa 24 tuntia. Sitten analysoimme hydrolysaatit ioninvaihtokromatografiällä ja sen jälkeen suoritetulla ninhydriiniderivatisoinnilla/tunnistuksella käyttäen automaattista Beckman 6300 -analysaattoria. Sekvenssianalyysin 15 suoritimme käyttäen automaattista Edman-degradaatiota Applied Biosystems 470A -kaasufaasisekvenaattorissa, joka oli varustettu Model 900A -tietokonesysteemillä. Fenyylitio-hydantoiiniaminohapot (PTH) analysoitiin yhtä aikaa käyttäen Applied Biosystems 120A PTH -analysaattoria ja PTH-20 C18-pylvästä (2,1 x 220 mm).

Esimerkki 5

Hirulog-9:n synteesi

Hirulog-9:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-D-Pro- (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-25 OH. Syntetisoimme tämän peptidin samalla tavalla kuin esimerkissä 4 kuvatun peptidin käyttäen BOC-D-proliinia (Peninsula Laboratories) syklissä 15 BOC-L-proliinin asemesta. Puhdistus ja karakterisointi suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

30 Esimerkki 6

Hirulog-10:n synteesi « 4

Hirulog-10:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Sar-(Gly)5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH.Peptidi syntetisoitiin, kuten esimerkissä 4 käyttäen BOC-D-sar-35 kosiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. ) syklissä 16.

40 102183

Puhdistus ja karakterisointi suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 7 Hirulog-ll:n synteesi 5 Hirulog-ll:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-

Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-(3, 5-dijodiTyr)-Leu-OH. Tämä peptidi syntetisoidaan, kuten esimerkissä 4 käyttäen BOC-3,5-dijodi-L-tyrosiinia (Sigma) syklissä 2. Puhdistus ja karakterisointi suoritetaan, kuten on kuvattu 10 esimerkissä 4.

Esimerkki 8 Hirulog-12:n synteesi

Hirulog-12:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr (0S03) -Leu-OH. 15 Tämä peptidi syntetisoidaan antamalla 1,0 mg:n Hirulog-8:aa reagoida dimetyyliformamidissa (80 μΐ) disykloheksyy-likarbodi-imidiliuoksen (1,25 g/ml, 0,007 ml) ja konsentroidun rikkihapon (0,5 μΐ) kanssa 0 °C:ssa 10 minuuttia. Reaktio lopetetaan lisäämällä vettä (1,0 ml).

20 Reaktioseokselle voidaan tehdä käänteisfaasi-HPLC

käyttäen Applied Biosystems 150A -nestekromatografiasys-teemiä ja Aquapore RP-300 C8-pylvästä (0,46 x 10 cm). Pylväs tasapainotetaan liuottimessa A (0,1 % TFA/vesi) ja eluoidaan 0 - 50 % kohoavalla konsentraatiolla liuotinta r 25 B (0,085 % TFA/70 % asetonitriili) 45 minuutin ajan virtausnopeudella 1,0 ml/min. Läpi tullutta eluutiovirtausta tarkkaillaan absorbanssin suhteen 214 nm:ssa.

Sitten puhdistettu Hirulog-12 neutraloidaan pH 7:ksi lisäämällä 0,1 N NaOH:ia. Sitten se lyofilisoidaan 30 ja liuotetaan uudelleen fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen.

• 4 41 102183

Esimerkki 9

Trombiinin katalysoiman synteettisen p-nitroanilii- disubstraatin hydrolyysin inhibitio Hirulog-8:lla

Seuraavaksi analysoimme Hirulog-8:n vaikutukset 5 ihmisen α-trombiinin katalysoimaan Spectrozyme TH:n (to-syyli-Gly-Pro-Arg-p-nitroaniliidi; American Diagnostics, New York, NY) hydrolyysiin. Mittasimme erikoisesti alkunopeudet Hirulog-8:n läsnä- tai poissaollessa substraat-tikonsentraatloilla, jotka vaihtelivat välillä 2,2 10 22 μΜ. Trombiinin katalysaationopeutta tarkkailtiin Cary 19 -spektrofotometrillä 405 nm:ssa ja tulokset talletettiin keskeytymättä ajan funktiona. Kinetiikat suoritettiin huoneenlämpötilassa (25 ± 1 °C) 0,05 M Tris, 0,1 M NaCl -puskurissa, pH 7,5.

15 Tyypillisessä entsyymireaktiossa sekä näyte- että referenssikyvetteihin lisättiin 1,0 ml puskuria. Trombiini (3,2 x 10'9 M, lopullinen konsentraatio) ja Hirulog-8 (0 -4 x 10'8 M) lisättiin näytekyvettiin ennen Spectrozyme TH:n (2,2 - 22 μΜ) lisäystä. Juuri substraatin lisäyksen jäi- t 20 keen näytekyvetin sisältö sekoitettiin käyttäen muovipi-pettiä. Reaktiota tarkkailtiin spektrofotometrisesti 5 -15 minuuttia.

Alkunopeudet kussakin substraattikonsentraatiossa ilmoitettiin mooleina hydrolysoitunutta Spectrozyme TH: t-[ 25 a/sekunti/mooli trombiinia. Tämä määritettiin reaktion alussa olevan lineaarisen faasin aikana (S 15 % substraatin kokonaishydrolyysistä) mittaamalla hydrolyyttisen reaktion kulmakerroin. Sen mukaisesti muodostettiin Line-weaver-Burke -käyrät esittämällä alkunopeuden käänteisarvo 30 substraattikonsentraation käänteisarvon funktiona. Tulok set osoittivat, että ihmisen α-trombiinin katalysoiman Spectrozyme TH: n hydrolyysin Vmax = 17 moolia hydrolysoitu-nutta/sekunti/mooli trombiinia ja Km on 1,19 x 10'6 M. Kuvion 3 paneelit A ja B osoittavat, että Hirulog-8:n kasvavat 35 konsentraatiot johtivat merkittäviin annoksesta riippuvai- 102183 42 siin kasvuihin KB:ssä niin, että Spectrozyme TH:n hydro-lyysin VBax kohosi hiukan. Sen vuoksi trombiinin katalysoiman reaktion inhibitio Hirulog-8:11a suoritettiin sekoitetuilla kompetetiivisilla/ei-kompetetiivisilla komponen-5 teillä mitä tulee Spectrozyme TH:n hydrolyysiin. Hirulog-8:n KA a-trombiinilie määritettiin käyttäen kaavaa: VBax VBax [Hirulog-8] (-) = (-) X (1 + -) 10 KM inhiboitu KM inhiboimaton K£ jossa (-) K„ inhiboitu 15 on kulmakerroin trombiinin katalysoimalle reaktiolle Hirulog-8: n läsnä ollessa; (Hirulog-8) on peptidin molaarinen konsentraatio; VB„ (-) 20 K„ inhiboimaton on trombiinin katalysoima reaktio inhibiittorin poissaollessa ja K* on Hirulog-8:n molaarinen inhibitiovakio ihmisen α-trombiinille. Hirulog-8:n Kx:n laskettiin olevan 1,95 ± 0,11 x 10‘9 M.

25 Esimerkki 10

Hirulog-8:n spesifisyys ihmisen α-trombiinin hiru-diinipeptidiä sitovalle kohdalle ja aktiiviselle kohdalle

Hirulog-8 suunniteltiin analogiksi, joka sitoutuu 30 ihmisen α-trombiiniin sen hirudiinipeptidin sitoutumiskoh dan välityksellä samalla blokeeraten trombiinin katalyyttisen kohdan. Testasimme Hirulog-8:n kyvyn suorittaa nämä toiminnot alla kuvatuilla eri tutkimuksilla.

Hirulog-8:n aiheuttaman ihmisen gamma-trombiinin 35 inhibition kinetiikkaa tutkittiin oleellisesti, kuten on kuvattu yllä esimerkissä 9 ihmisen a-trombiinin suhteen. Gamma-trombiinin katalysoima reaktio Spectrozyme TH:ta 43 102183 vastaan osoitti, että VBax - 7,14 moolia hydrolysoitunut-ta/sekunti/mooli mooli trombiinia ja K, 1,1 x 10'6 M. Nämä tulokset vahvistavat, että gamma-trombiini, joka on trom-biinin proteolyyttinen muoto, omaa lähes täydellisen kata-5 lyyttisen suorituskyvyn, vaikka tältä muodolta puuttuu oleellisesti veren hyydyttämisaktiivisuus (S.D. Lewis et ai., "Catalytic Competence of Human a- and Gamma-Thrombins in the Activation of Fibrinogen and Factor XIII", Biochemistry, 26, sivut 7597 - 7603 (1987)). Hirulog-8:n aiheut-10 tamaa gamma-trombiinin inhibitiota tutkittiin peptidikon-sentraatioilla, jotka vaihtelivat välillä 2,7 x 10*8 - 6,8 x 10*6 M. Kuten alla on esitetty, Hirulog-8:lla oli 3 suuruusluokkaa kohonnut verrattuna α-trombiiniin. Tämä korkea K* gamma-trombiinia vastaan johtuu koskemattoman 15 anionia sitovan rajakohdan (ABE) poissaolosta gamma-trom- biinissa (J.W. Fenton, II, et ai., "Anion-Binding Exosite of Human α-Thrombin and Fibrin(ogen) Recognition", Biochemistry, 27, sivut 7106 - 12 (1988)). Gamma-trombiini muodostuu α-trombiinin B-ketjun proteolyysillä kohdilla Lys-20 149 ja Arg-78.

Ihmisen α-trombiinin inhibitio Hirulog-8:11a aleni merkittävästi Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64:n läsnä ollessa konsentraatioina 2,6 x 10*6 M - 1,29 x 10"5 M. Tämä johtuu siitä, että Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64 kil-25 pailee Hirulog-8:n kanssa sitoutumisesta trombiinin ABE-kohtaan.

Tämä osoitettiin myös lisäämällä fenyylimetyylisul-fonyyli-a-trombiinia ("PMS-α-trombiinia, 18 nM, lopullinen konsentraatio) reaktioihin, joissa oli Hirulog-8:aa ihmi-30 sen a-trombiinin kanssa. Tämän modifioidun trombiinin lisäys johti oleelliseen alentumiseen Hirulog-8:n kyvyssä inhiboida a-trombiinia. PMS-a-trombiinilla on koskematon ABE-kohta, mutta se on kovalenttisesti derivatisoitu aktiiviseen kohtaansa. Tämä modifioitu trombiini eristää 35 Hirulog-8:n reaktioseoksessa ja sen vuoksi alentaa sellai- 44 102183 sen peptidin määrää, joka on käytettävissä inhiboimaan koskematonta katalyyttisesti aktiivista ihmisen a-trombii-nia.

Suoritimme myös tutkimukset suolakonsentraatioiden 5 vaikutuksista Hirulog-8:n K±:hin trombiinille, kuten on kuvattu yllä esimerkissä 9. Mittasimme ΚΑ:η Hirulog-8:n (11,5 x 10'9 M) läsnä- tai poissaollessa puskureissa, jotka sisälsivät 0,1, 0,25 ja 0,5 M NaCl:ia. Kuten alla olevassa taulukossa on esitetty, Hirulog-8:n aiheuttama a-trombii-10 nin inhibitio kohosi matalissa suolakonsentraatioissa. Tämä tulos vahvisti, että Hirulog-8:n erittäin anionisen hirudiinipeptidiosan interaktio trombiinin Lys-149:n ympärillä olevan positiivisesti varatun kohdan kanssa on elin-tärkeätä Hirulog-8:n aiheuttamalle trombiinin katalysoiman 15 Spectrozyme TH:n hydrolyysin inhibitiolle.

Entsyymi Olosuhteet Hirulog-8, K4, nM

Ihmisen a- 0,05 M Tris, pH 1,95

trombiini 7,5, 0,1 M NaCI

20 (puskuri)

Ihmisen gamma- Puskuri 1,080 trombiini

Ihmisen a- Puskuri + 2,6 μΜ 25,5 trombiini Sulfo-Tyr63-N- 25 asetyylihiru- diini53.64

Ihmisen a- Puskuri + 12,9 μΜ < 2,000 trombiini Sulfo-Tyr63-N- asetyylihiru- 30 diini53_64

Ihmisen a- Puskuri + PMS-a 9,90 trombiini trombiini

Ihmisen a- 0,05 M Tris, pH 2,09

trombiini 7,5, 0,25 M NaCI

«· 35 Ihmisen a- 0,05 M Tris, pH 3,72

trombiini 7,5, 0,5 M NaCI

« 102183

Esimerkki 11

Hirulog-8:n hyytymisen vastainen aktiivisuus: vertailu hirudiiniin ja Sulfo-Tyr^-N-asetyylihirudii-niM 6t:ään 5 Tutkimme Hirulog-8:n hyytymisen vastaista aktiivi suutta käyttäen ihmisen yhdistettyä normaalia plasmaa (George King Biomedical, Overland Park, KA) ja Coag-A-Mate XC -laitetta (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK). Aktiivisuutta tarkkailtiin käyttäen aktivoitua 10 osittaista tromboplastiiniaika -testiä (APTT) CaCl2- ja fosfolipidiliuosten kanssa, jotka saatiin valmistajalta. Sitten APTT-määrityskuoppiin lisättiin Hirulog-8, hirudii-ni ja Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64 niin, että lopulliset konsentraatiot olivat 10 - 32 300 ng/ml 25 μ1:η ko-15 konaistilavuudessa, ennen kuin lisätiin 100 μΐ plasmaa.

Kontrolli-APTT (ei inhibiittoria) oli 29,6 sekuntia (keskiarvo, n = 8, keskiarvon keskivirhe < 0,5 %). Kuvio 4 esittää näiden annoksesta riippuvaisten tutkimusten tulokset. Hirulog-8 oli 2-3 kertaa vahvempi kuin hirudiini ja 20 100 - 150 kertaa vahvempi kuin Sulfo-Tyr63-N-asetyylihiru- diini53_64. Sekä Hirulog-8 että hirudiini kohottivat plasman APTT:n arvoihin, jotka olivat liian korkeita mitattaviksi. Tämä on vastoin Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64:ää, jolla oli kyllästävä annosresponssi APTT-arvossa, joka oli 25 200 - 250 % kontrolliarvoista (J.M. Maraganore et ai., J.

Biol. Chem., 264, sivut 8692 - 98, (1989)). Tämä tulos osoitti, että Hirulog-8 voi blokeerata trombiinin aktiivisen kohdan plasmassa kuin myös in vitro kromogeenisissa kokeissa samalla tavalla kuin hirudiini.

30 Esimerkki 12 *! Hirulog-8:n aiheuttama trombiinin indusoiman veri- hitaleiden aktivaation inhibitio

Trombiinin indusoimat verihiutaleiden aktivaatio-tutkimukset suoritetaan 37 °C:ssa käyttäen Biodata PAP4 35 Platelet Aggregometer -laitetta. Verihiutalerikas plasma 46 102183 (PRP) saadaan normaaleista terveistä vapaaehtoisista, jotka eivät ole ottaneet mitään verihiutaleiden toimintaa muuttavaa lääkitystä ainakaan yhteen viikkoon ennen tutkimusta. PRP valmistetaan, kuten ovat kuvanneet J.A. Jaku-5 bowski et ai., "Modification of Human Platelet by a Diet Enriched in Saturated or Polyunsaturated Fat", Atherosclerosis, 31, sivut 335 - 44, (1978). Vaihtelevat konsentraa-tiot (0 - 500 ng/ml 50 pl:ssa vettä) Hirulog-8:aa lisätään 0,4 ml:aan esilämmitettyä (37 °C) PRP:tä. Minuuttia myö-10 hemmin lisäämme ihmisen α-trombiinia verihiutalesuspen-sioon niin, että lopullinen konsentraatio on 0,2, 0,25 tai 0,5 yksikköä/ml testin kokonaistilavuutta. Aggregaatiota tarkkaillaan valon transmission kohoamisena 5 minuutin ajan trombiinin lisäyksen jälkeen. Sitten laskemme inhi-15 bitioprosentin kaavalla (aggregaatioprosenttin8yte)/(aggreg-aatioprosenttikontrolli) x 100. Tämä tutkimus osoittaa, että Hirulog-8 blokeeraa trombiinin indusoiman verihiutaleiden aktivaation in vitro.

Esimerkki 13 20 Hirulog-8:n käyttö veritukoksen kuvauksessa

Hirulog-8:aa modifioidaan liittämällä kovalentti-sesti 123I:tä sisältävä kemiallinen ryhmä. Erikoisesti, Hirulog-8: n (valmistettu, kuten esimerkissä 4) annetaan reagoida 123I-Bolton Hunter -reagenssin (New England Nuclear, 25 Boston, Massachusetts) kanssa 0,1 M natriumboraatissa, pH

9,0. Sitten 123I-leimatusta molekyylistä (jonka spesifinen aktiivisuus on > 5 pCi/pg) poistetaan suolat Biogel P2 -pylväässä, joka on tasapainotettu fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella.

30 Kokeellisesti muodostettujen veritukosten ex vivo kuvaus suoritetaan oleellisesti, kuten ovat kuvanneet T.M. Palabrica et ai., "Thrombus Imaging in a Primate Model with Antibodies Specific for an External Membrane Protein of Activated Platelets", Proc. natl. Acad. Sci. USA, 86, 35 sivut 1036 - 40 (1989). Kuvaus suoritetaan spesifisesti 47 102183 paviaaneilla käyttäen ulkoista Ticoflex-sivukytkentää rei-sivaltimon ja -laskimon välillä. Kokeellinen veritukos muodostetaan sijoittamalla sivukytkentään segmentti esi-hyydytettyä Dacron-siirrosta. Ticoflex-sivukytkennän las-5 kimo-osaan injektoidaan 123-I-leimattua trombiini-inhibiit-toria. Sitten otetaan peräkkäiset etukuvat 0,5 - 1 tunnin ajalta käyttäen Ohio Nuclear Series 100 Gamma -kameraa, jossa on PDP-11/34 -tietokone. Siirroksen ja veripoolin 123I-trombiini-inhibiittorin ottokinetiikka "aadaan näin 10 otetuista radionuklidikuvista.

Samaa menetelmää voidaan käyttää ex vivo kuvien saamiseksi syvällä laskimossa olevasta veritukoksesta, jonka on aiheuttanut staasi paviaanien reisilaskimossa. Koska 123I-Hirulog-8 sitoutuu trombiiniin korkealla spesifi-15 syydellä, tämän molekyylin käyttö sallii veritukosten tarkkojen ex vivo kuvien saamisen. Myöskin Hirulog-8:n pieni koko verrattuna luonnolliseen hirudiiniin tai trombiini vasta-aineisiin muodostaa mahdollisuuden, että radio-aktiivisesti leimattu trombiini-inhibiittori muodostaa 20 kuvat verihiutaleisiin kiinnittyneestä trombiinista ja meizotrombiinista kuin myös fibriinihyytymässä sijaitsevasta trombiinista.

Esimerkki 14

Trombiini-inhibiittorien metastasoinnin vastaiset 25 aktiivisuudet Tämän keksinnön mukaisten tormbiini-inhibiittorien, suositeltavsti Hirulog-8:n, metastasoinnin vastainen aktiivisuus testataan käyttäen T241-sarkoomasoluja (L.A. Liotta et ai., Nature, 284, sivut 67 - 68 (1980)) ja syn-30 geenisiä C57BL/6 -hiiriä (Jackson Laboratory, Bar Harbor, *! ME). Hiiret injektoidaan joko laskimonsisäisesti tai ihon alaisesti 0 - 250 g Hirulog-8:aa/kg, joka Hirulog-8 valmistetaan, kuten esimerkissä 4, jonka jälkeen injektoidaan 104 - 106 T241-kasvainsolulla. 15 vuorokauden jälkeen eläin 35 lopetetaan ja lasketaan keuhkokasvainpesäkkeiden määrä.

102183 48

Hirulog-8:n metastasoinnin vastainen aktiivisuus mitataan kasvainpesäkkeiden määrän alenemisprosenttina verrattuna näennäislääkkeellä käsiteltyihin kontrollihiiriin. Hiru-log-8:lla on metastasoinnin vastaista aktiivisuutta tässä 5 testissä.

Esimerkki 15

Endoteelisolujen inhibitio trombiini-inhibiittoril- la Tämän keksinnön mukaisten trombiini-inhibiittorien 10 kyky estää trombiinin indusoima verihiutaleita aktivoivan faktorin (PAF) synteesi testataan käyttäen viljeltyjä ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVECS). HUVECS-solut uutetaan ihmisen napanuorista kollagenaasidigestiolla tavanomaisten menetelmien mukaisesti (M.A. Gimborne, Jr., 15 "Culture of Vascular Endothelium", Prog. Hemost. Thromb., 3, sivut 1-28 (1976)). HUVECS-solut kasvatetaan yhtyneeksi matoksi 96-kuoppaisella mikrotiitterilevyllä (3H)-asetaatin läsnäollessa. Tällä tavoin viljellyt solut tuottavat (3H)-asetyyli-PAF:ia, jonka määrä voidaan määrittää 20 uuttamalla HUVEC-solujen membraanifosfolipidit.

Hirulog-8 (0-1 pg/ml) lisätään (3H)-asetaatilla kasvatettujen HUVECS-solujen sekaan yksi minuutti ennen trombiinin (lopullinen konsentraatio 1 yksikkö/ml) lisäystä. Soluja inkuboidaan 5 minuuttia ja sitten supernatantti 25 poistetaan. Sitten HUVECS-soluille lisätään alusta, joka sisältää 0,1 % gelatiinia, 50 mM etikkahappoa metanolissa (2:1 v/v). Sitten PAF uutetaan ja sen määrä määritetään käyttäen tavanomaisia menetelmiä (T.M. McIntyre et ai., "Cultured Endothelial Cells Synthesize Both Platelet-Acti-30 vating Factor and Prostacyclin in Response to Histamine, Bradykinin and Adenosine Triphosphate", J. Clin. Invest., 76, sivut 271 - 80 (1985)). Sitten lasketaan IC50-arvot. Hirulog-8 inhiboi HUVECS-solujen aiheuttaman PAF:in synteesin tässä testissä.

102183 49

Hirulog-8:n vaikutus trombiinin indusoimaan poly-morfonukleaarisen leukosyytin (PMN) tarttumiseen HUVECS-soluun voidaan osoittaa seuraavasti. HUVECS-solut kasvatetaan yhtyneeksi matoksi MEM-alustassa, joka sisältää 1 5 % naudan sikiön seerumia, 24-kuoppaisilla levyillä. Sitten alusta poistetaan, solut pestään kaksi kertaa tuoreella seerumivapaalla alustalla ja inkuboidaan samassa alustassa 10 - 30 minuuttia 37 °C:ssa seerumituotteiden poistamiseksi. Sitten PMN:t (2,5 x 106/ml), jotka on tasapainotettu 10 etukäteen 37 °C:ssa, lisätään kuhunkin kuoppaan. PMN:ien annetaan asettua HUVEC-solujen muodostamalle yksisoluker-rokselle 2 minuutin ajan. Kuhunkin kuoppaan lisätään Hiru-log-8:aa (5 pg/ml) tai suolaliuosta, jonka jälkeen välittömästi lisätään a-trombiinia (0,1 tai 1 yksikkö/ml). So-15 luja inkuboidaan 5 minuuttia 37 eC:ssa, pestään kahdesti ja sitten tutkitaan faasikontrastimikroskoopilla. Tarttuneet PMN:t lasketaan suoraan. Näytteissä, joita inkuboi-tiin Hirulog-8:n kanssa oli merkittävästi vähemmän tarttuneita PMN:iä kuin niissä, joita käsiteltiin suolaliuoksel-20 la.

Esimerkki 16

Hirulog-13:n synteesi

Hirulog-13:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)2-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Syn-25 tetisoimme, puhdistimme ja karakterisoimme tämän peptidin oleellisesti, kuten on kuvattu esimerkissä 4 paitsi, että käytettiin ainoastaan yhtä sykliä BOC-glysyyliglysiiniä diglysiininosan tuottamiseksi.

Esimerkki 17 30 Hirulog-14:n synteesi t ·

Hirulog-14:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)6-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hiru-log-14 syntetisoitiin, puhdistettiin ja karakterisoitiin käyttäen esimerkissä 4 kuvattuja menetelmiä paitsi, että 35 käytettiin yhtä BOC-glysiinin lisäyssykliä kahden BOC- so 102183 glysyyliglysiinin lisäysyklin jälkeen pentaglysiininosan tuottamiseksi.

Esimerkki 18 Hirulog-15:n synteesi 5 Hirulog-15:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)6-

Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hiru-log-15 syntetisoitiin, puhdistettiin ja karakterisoitiin käyttäen esimerkissä 4 kuvattuja menetelmiä paitsi, että käytettiin kolmea BOC-glysyyliglysiinin lisäysykliä heksa-10 glysiininosan tuottamiseksi.

Esimerkki 19 Hirulog-16:n synteesi

Hirulog-16:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly )e-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hiru-15 log-16 syntetisoitiin, puhdistettiin ja karakterisoitiin käyttäen esimerkissä 4 kuvattuja menetelmiä paitsi, että käytettiin neljää BOC-glysyyliglysiinin lisäysykliä okta-glysiininosan tuottamiseksi.

Esimerkki 20 20 Hirulog-17:n synteesi

Hirulog-17:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Glu-Gly-His-Gly-Äsn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-17 syntetisoitiin oleellisesti, kuten on kuvattu esimerkissä 4 paitsi, että Gly-Gly-Glu-25 Gly-His-Gly korvasi Hirulog-8:ssa olevan Gly4-osan. Tämä sekvenssi lisättiin kasvavaan peptidiketjuun lisäämällä peräkkäin Boc-glysiiniä, BOC-L-histidiiniä, BOC-glysiiniä, BOC-L-glutamiinihappoa ja BOC-glysyyliglysiiniä synteesi-sykleissä 13 - 17. Puhdistus ja karakterisointi suoritet-30 tiin, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 21

Hirulog-18a:n, -18b:n ja -18c:n synteesit Hirulog-18a:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-(B-homoargi-niini )-(Gly )5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-35 Leu-OH. Hirulog-18b:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-(B-homoargi- 51 102183 niini) -Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-18c:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-(6-homo-arginiini)-Val-(Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Syntetisoimme Hirulog-8:n käyttäen homo-5 geenista/kiinteän faasin sekamenetelmää. Tähteet 5-20 valmistettiin kiinteän faasin synteesillä, kuten on kuvattu esimerkeissä 4 ja 17. Tuloksena syntyneen resiiniin kiinnittyneen välimuodon annettiin reagoida suojatun BOC-β-homoarginiini-Gly-välimuodon kanssa, joka syntetisoi-10 tiin monivaiheisella reaktiokaaviolla, joka on kuvattu alla ja selostettu juuri sen jälkeen.

H*N τ« ΗιΗ-Ν·Τ* H”UT‘ "’"-Ν'1* H-N N _ H-N H-N H—N_ HN^C02H HN^COCHNa HNy^'C°*CM*

BOC BOC BOC BOC

NT*y.NH2 NTy.NH2

20 H-N H-N

j . —* ] s M-H-^^-N^COaBz Η*Ν^^Ν^002Η BOC H BOC h 25 N°-B0C-N9-Tos-arginiinidiatsometyyliketoni

Sekoitimme 10 g (13,4 mmoolia) N°-B0C-N9-Tos-argi-niinia (Bachem, Torrance, CA) ja 2,1 ml (19,1 mmoolia) N-30 metyylimorfoliinia (Aldrich, Milwaukee, Wis.) 100 ml:ssa vedetöntä tetrahydrofuraania (THF) argonin alla 5 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten liuos jäähdytettiin -15 eC:seen ja lisättiin 2,8 ml (21,6 mmoolia) isobutyyli-klooriformaattia (Aldrich). Jatkoimme reaktioseoksen se-35 koittamista -15 eC:ssa 5 minuuttia ja sitten suodatimme 52 102183 sen Celite/MgS04 -tyynyn läpi. Seuraavaksi lisäsimme suo-doksen jääkylmään diatsometaanin eetteriliuokseen (150 mM, muodostettu 32,4 g:sta Diazald'ia; Aldrich). Liuosta sekoitettiin ja sen annettiin vähitellen saavuttaa ympäris-5 tön lämpötila yön aikana. Sitten liuotin poistettiin in vacuo ja jäännös liuotettiin 200 mitään kloroformia. Sitten pesimme orgaanisen liuoksen peräkkäin 200 ml:11a kyllästettyä NaHC03:a, sen jälkeen 200 ml:11a kyllästettyä NaCltia, kuivasimme sen vedettömän MgS04:n yllä ja konsent-10 roimme sen jälleen öljymäiseksi jäännökseksi. Sitten jäännös puhdistettiin nopealla kromatografiällä 4 x 17 cm kokoisessa silikageelipylväässä käyttäen vaiheittaista gra-dienttia, jossa oli asetonia kloroformissa (10 % asetonia 2 litrassa kloroformia, jonka jälkeen 20 % asetonia 3 lit-15 rassa kloroformia). Kerättiin 25 ml:n kokoiset fraktiot. Pieni määrä kustakin fraktiosta testattiin ohutkerroskro-matografialla (TLC). Fraktiot, jotka sisälsivät halutun tuotteen, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviksi. Tuote, diatsometyyliketoni, puhdistettiin vaalean keltaisena 20 vaahtona (6,54 g).

Ne-B0C-N9-Tos-B-homoarginiinimetyyliesteri Liuotimme yllä valmistetun diatsometyyliketonin 100 ml:aan vedetöntä metanolia ja takaisinvirtautimme tätä liuosta argonin alla kunnes lisättiin tipoittain liuosta, 25 jossa oli hopeabentsoaattikatalyyttiä (165 mg 400 pl:ssa trietyyliamiinia). 30 minuutin kuluttua takaisinvirtautet-tava liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan, lietettiin Norifin kanssa ja suodatettiin Celite'n läpi. Sitten liuotin poistettiin in vacuo ja öljyinen jäännös puhdistet-30 tiin nopealla kromatografiällä silikageelin läpi. Eluutio suoritettiin kloroformissa olevalla 4 litralla 10 % asetonia. Haluttu tuote, β-homoarginiinimetyyliesteri, puhdistettiin näin vaalean keltaisenruskeana vaahtona (6,43 g).

53 102183 l^-BOC-N^Tos-B-homoarginiini

Liuotimme kaiken yllä olevan metyyliesterin 100 ml:aan metanolia ja sitten annoimme sen reagoida LiOH-liuoksen (1,48 g 50 ml:ssa vettä) kanssa yli yön huoneen-5 lämpötilassa argonin alla sekoittaen jatkuvasti. Poistimme metanolin in vacuo, liuotimme jäännöksen veteen ja pesimme sen etyyliasetaatilla. Seuraavaksi lisäsimme kyllästettyä sitruunahappoa kunnes liuoksen pH:ksi tuli 4. Sitten uutimme tuloksena syntyneen karboksyylihapon etyyli-10 asetaatiksi. Uutos toistettiin pH 3:ssa ja yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin MgS04:n yllä ja konsentroitiin in vacuo. Tuloksena syntynyt raaka happo otettiin talteen valkoisena vaahtona (4,9 g). Happo puhdistettiin edelleen Vydac C18 -käänteisfaasi-HPLC-pylväässä, kuten on kuvattu 15 esimerkissä 4 paitsi, että läpitullutta eluutiovirtausta tarkkailtiin 214 nmrssa. Haluttujen fraktioiden lyofili-saation jälkeen tuote, Na-B0C-N9-Tos-8-homoarginiini, otettiin talteen valkoisena amorfisena kiinteänä aineena.

N°-B0C-N9-Tos-8-homoarginiinin näyte hydrolysoitiin 20 HF:ssä ja sitä käytettiin standardina aminohappoanalyy-seissä. β-homoarginiinin retentioaika oli samanlainen kuin arginiinin, mutta huipun voimakkuus oli huomattavasti pienempi, kuten oli odotettukin.

N“-B0C-N9-Tos-B-homoargininyyliglysiinibentsyylies-25 teri

Seuraavaksi yhdistimme 4,06 g (9,2 mmoolia) yllä olevaa karboksyylihappoa 2,04 ml:n kanssa N-metyylimorfo-liinia 25 ml:ssa vedetöntä THF:ää. Seosta sekoitettiin argonin alla -5 eC:ssa. Sitten lisättiin jäähdytettyä iso-30 butyyliklooriformaattiliuosta (2,4 ml 25 ml:ssa THF:ää) tipoittain liuokseen 10 minuutin aikana. Tämän lisäyksen jälkeen reaktioseosta sekoitettiin 12 minuuttia -5 °C:ssa. Hirulog-18a:han lisäsimme sitten glysiinibentsyyliesteri-liuosta (4,9 g 40 ml:ssa THF:ää; 27,6 mmoolia) ja annoimme 35 reaktioseoksen tulla huoneenlämpötilaan. Sitten liuotin 54 102183 poistettiin in vacuo ja tuloksena syntynyt jäännös liuotettiin 100 ml:aan etyyliasetaattia. Liuos uutettiin peräkkäin 100 ml:11a kyllästettyä NaHC03:a ja 100 ml:11a kyllästettyä NaCl:ia, kuivattiin MgS04:n yllä ja konsentroi-5 tiin in vacuo. Tuloksena syntynyt raaka dipeptidiesteri puhdistettiin 4 x 20 cm silikageelipylväässä vaiheittaisella kloroformissa olevalla metanoligradientilla, joka sisälsi 10 tippaa NH40H:ta per 100 ml (2 litraa 1 % meta-nolia kloroformissa, jonka jälkeen 3 litraa 2 % metanolia 10 kloroformissa). Fraktiot (25 ml) kerättiin, testattiin TLC:llä ja ne fraktiot, jotka sisälsivät tuotteen, yhdistettiin ja liuotin poistettiin in vacuo. Tuloksena syntynyt tuote, Na-B0C-N9-Tos-8-homoargininyyliglysiinibentsyy-liesteri, eristettiin valkoisena vaahtona (3,9 g).

15 Hirulog-18b:tä ja -18c:tä varten yllä oleva reaktio oli samanlainen paitsi sisältäen seuraavat modifikaatiot: Hirulog-18b:tä varten glysiinibentsyyliesteri korvattiin proliinibentsyyliesterillä ja reaktio suoritettiin 1,8 mmoolin mittakaavassa. Hirulog-18c:tä varten glysiinibent-20 syyliesteri korvattiin valiinibentsyyliesterillä ja reak tio suoritettiin 3,0 mmoolin mittakaavassa.

Na-BOC-N9-Tos-ö-homoargininyyliglysiini Yllä oleva bentsyyliesteri liuotettiin 50 ml:aan metanolia ja hydrogenoitiin ilmakehän paineessa 1,0 g:n 25 yllä 10 % palladium/hiiltä 17 tunnin ajan. Tuloksena syn-tynyt liuos suodatettiin Celite'n läpi ja liuotin poistettiin in vacuo. Reaktio antoi 2,9 g raakaa Na-B0C-N9-Tos-β-homoargininyyliglysiiniä, joka puhdistettiin Vydac C18 -HPLC-pylväässä, kuten yllä on kuvattu.

30 Yllä oleva Na-BOC-N9-Tos-8-homoargininyyliglysiini *’ (1,02 g) liuotettiin 1 ml:aan vedetöntä DMF:ää ja jäähdy tettiin jäähauteessa. Sitten lisäsimme tähän liuokseen peräkkäin 5,5 ml DMF:ssä olevaa 0,5 M hydroksibentstriat-solia (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) ja 5,5 ml 35 CH2Cl2:ssa olevaa 0,5 M disykloheksyylikarbodi-imidiä (App- 55 1 02 1 83 lied Biosystems). Tunnin kuluttua dipeptidiyksikön kylmä symmetrinen anhydridisuspensio suodatettiin sitten nopeasti lasivillatyynyn läpi disykloheksyyliurean poistamiseksi .

5 Sillä aikaa N-BOC-(Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-

Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM -suspensio (0,2 mmoolia CH2Cl2:ssa) aktivoitiin standardeilla peptidisynteesime-netelmillä. Tuloksena syntyneen tuotteen Kaiser-testi osoitti vapaan terminaalisen aminoryhmän olemassaolon.

10 Sitten aktivoitu fl-homoarginyyliglysiinidipeptidi liitettiin resiiniin sidottuun heksadekapeptidiin. Sitten tuloksena syntynyt oktadekapeptidi liitettiin peräkkäin N-B0C-Pro:n ja N-BOC-(D-Phe):n kanssa käyttäen standardia liitosmenetelmää. Tuloksena syntynyt peptidi Hirulog-18a 15 puhdistettiin ja ja karakterisoitiin, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

Samanlainen protokolla suoritettiin Hirulog-18b:n ja Hirulog-18c:n syntetisoimiseksi.

Esimerkki 22 20 Hirulog-19:n synteesi

Hirulog-19:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-(psiCH,NH)-(Gly )S-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Tämän peptidin tähteet 4-20 koottiin kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä, kuten on kuvattu esimerkissä 25 4. Seuraava liitettävä tähde Na-B0C-N9-tosyyli-argininaali valmistettiin, kuten on kuvattu ja selostettu alla.

H”W "V·

u.u rl* N

30 H \ "'N^COjH “V^ho

BOC BOC

35 56 102183 N"-BOC-Ne-Tos-argininaali I^-BOC-I^-Tos-arginiini (Bachein Inc.; 10 g) lisättiin 80 ml:aan vedetöntä THF:ää ja suspensio jäähdytettiin 0-5 °C:seen. Sitten lisäsimme 1,1'-karbonyylidi-imidat-5 solia (Aldrich; 3,61 g) koko määrän yhdellä kertaa ja jatkoimme sekoittamista 20 minuuttia. Tuloksena syntynyt kirkas liuos upotettiin osittain kuivajää/asetoni -hauteeseen lämpötilan pitämiseksi -20 - -30 °C:eessa samalla, kun lisättiin tipoittain litiumalumiinihydridisuspensiota 10 (Aldrich; 1,8 g 80 ml:ssa THF:ää) 45 minuutin aikana samalla sekoittaen jatkuvasti. Reaktiota sekoitettiin lisää 30 minuuttia -20 °C:ssa ja sitten lopetettiin lisäämällä tipoittain 63 ml 2 N HCl:oa -10 eC:ssa. Suodatimme tuloksena syntyneen liuoksen keskikokoisen sintterilasisuppilon 15 läpi ja konsentroimme tuloksena syntyneen suodoksen in vacuo.

Tuloksena syntynyt raaka aldehydi, joka saatiin talteen valkoisena vaahtona (11,5 g), suspendoitiin 100 ml:aan kloroformia, pestiin vedellä (2 x 50 ml) ja orgaa-20 ninen kerros kuivattiin sitten natriumsulfaatin yllä ja konsentroitiin in vacuo. Raaka aldehydi (7,7 g) liuotettiin 100 ml:aan kloroformia ja puhdistettiin nopealla kro-matografiällä nopeassa 5 x 20 cm kokoisessa pylväässä, joka sisälsi 350 ml silikageeliä (Merck Grade 60, 230 -25 400 mesh, 60 Ä). Eluutio suoritettiin käyttäen vaiheit taista gradienttia, joka oli 0,5 % metanoli 500 ml:ssa kloroformia, 1 % metanoli 1 litrassa kloroformia ja 1,5 % metanoli 1 litrassa kloroformia. Tämä menetelmä antoi 8,9 g Na-B0C-N9-Tos-argininaalia.

30 Sitten Na-BOC-N9-Tos-argininaali (258 mg) lisättiin ·] resiiniinsidottuun (Gly )5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-

Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM -peptidiin kiinteän faasin pelkistävissä alkylaatio-olosuhteissa (40 mg natriumsyaaniboori-hydridiä 24 tunnin ajan) käyttäen menetelmää, jonka ovat 35 kuvanneet D.H. Coy et ai., "Solid-Phase Synthesis of Pep- 57 102183 tides”, teoksessa Peptides, osa 8, sivut 119 - 121 (1978). Sen jälkeen, kun oli annettu resiiniin sidotun peptidin reagoida suojatun argininaalin kanssa, peptidisynteesi suoritettiin loppuun sykleillä, joissa lisättiin BOC-pro-5 liini ja BOC-(D-fenyylialaniini). Kun synteesi oli täydellinen, Hirulog-19:stä poistettiin suojaukset ja se irrotettiin resiinistä, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

Hirulog-19 puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen Applied Biosystems 151A -nestekromatografiasys-10 teemiä ja Aguapore C8 -pylvästä (10 x 22 cm). Pylväs tasapainotettiin yhdellä osalla 70 % asetonitriili/30 % vesi -liuosta, joka sisälsi 0,85 % TFA:ta (puskuri B) ja neljällä osalla vettä, joka sisälsi 1 % TFA:ta (puskuri A). Pylväs eluoitiin lineaarisella gradientilla, jossa oli kohoa-15 va puskuri B:n konsentraatio (20 - 50 %), 120 minuutin ajan virtausnopeudella 4,0 ml/min. Läpitullutta eluutio-virtausta tarkkailtiin absorbanssin suhteen 214 nm:ssa ja fraktiot kerättiin käsin. Lisäpuhdistus suoritettiin iso-kraattisissa olosuhteissa käyttäen 20 % puskuri B/80 % 20 puskuri A -liuosta.

Esimerkki 23 Hirulog-21:n synteesi

Hirulog-21:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu- (Gly )2-Lys-25 OH. Hirulog-21 syntetisoitiin käyttäen esimerkissä 4 kuvattuja menetelmiä sopivia BOC-aminohappoja käyttäen. Hirulog-21: n puhdistus ja karakterisointi suoritettiin menetelmillä, jotka on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 24 30 Hirulog-25:n synteesi

Hirulog-25:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-(4-argininyy-li-2,2-dif luori )malonyyliglysyyli- (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-

Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu -heksadekapeptidi synte-35 tisoitiin, kuten aiemmin on kuvattu ja jätettiin kiinni 58 102183 resiiniin. Seuraava tähde (3-argininyyli-2,2-difluori)ma-lonyyliglysiini syntetisoidaan reaktiokaaviolla, joka on kuvattu ja selostettu alla.

5 /-Q /"“O

H|fC0, CO, CO,

)_cT; c;:-H

BOC BOC BOC

l

Τ·ΝγΝΜ» ΗΝγΝΜ* T

NN NN NN, J# ! c ψ co,e« sn co,*t l co,et

13 BOC ^ BOC *OC

Τ·ΚγΜΗ* Τ*ΝγΜΜ*

NM _ MM

2° Ar ^co* n CO*

Γ IOC

»OC B-EI-N

R - H

1- ((2 ' -karboetoksi-1', 1' -dif luori) etyyli)N“-B0C-Nora-25 bentsyyli-Non,-Cbz-ornitinoli

Liuosta, jossa oli 3,1 g (7,1 mmoolia) Na-B0C-Norn-bentsyyli-Norn-Cbz-ornitinaalia (F. Salituro et ai., "Inhibition of Aspartic Proteinases By Peptides Containing Lysine and Ornithine Side Chain Analogues of Statine", 30 Med. Chem., 30, sivut 286 - 95 (1987)) ja 1,56 ml (9,23 mmoolia) etyylibromidifluoriasetaattia 15 ml:ssa vedetöntä THF:ää, lisättiin 90 minuutin aikana takaisinvirtautetta-vaan suspensioon, jossa oli 786 mg Zn-jauhetta (Fluka) 15 ml:ssa THF:ää argonin alla. Kun oli takaisinvirtautettu 4 35 tuntia ja pidetty 2 tuntia huoneenlämpötilassa, seos jääh- 59 102183 dytettiin ja jaettiin osiin etyyliasetaatilla ja kyllästetyllä NaCl/KHS04 -liuoksella, 200 ml kumpaakin. Orgaaninen faasi eristettiin, kuivattiin MgS04:n yllä ja konsentroitiin in vacuo. Tuloksena syntynyt öljyinen jäännös puhdis-5 tettiin silikageelissä käyttäen eluanttina CHCl3:metanolia (90:10), jossa oli 100 tippaa NH40H:ta/litra.

1-((2' -karboetoksi-1', 1 ’ - di fluori) e tyyli )1^-800-“t-nitinoli-tert-butyy1idimetyylisilyy1ieetteri Tuloksena syntyneen yhdisteen l-((2'-karboetoksi-10 1', 1' -dif luori )etyyli )Na-BOC-Norn-bentsyyli-N°rn-Cbz-omiti- nolin annetaan sitten reagoida 5 ekvivalentin kanssa tert-butyylidimetyylisilyylikloridia ja 10 ekvivalentin kanssa imidatsolia vedettömässä DMF:ssä 35 °C:ssa seuraten menetelmää, jonka ovat kuvanneet E.J. Corey et ai., "Protec-15 tion of Hydroxyl Groups as tert-Butyldimethylsilyl Derivatives", J. Amer. Chem. Soc., 94, sivut 6190 - 91 (1972). Sitten ortogonaalisesti suojattu amiini liuotetaan metano-liin ja hydrogenoidaan Pd(0H)2:n yllä 30 psi:ssä 18 tuntia. Sitten katalyytti poistetaan suodattamalla ja suodos kon-20 sentroidaan in vacuo tuottaen l-((2'-karboetoksi-11'-difluori )etyyli) Na-BOC-ornitinoli-tert-butyylidlmetyylisi -lyylieetterin.

1-[(2' -karboetoksi-1', 1' -difluori)etyyli]N“-BOC-Ns-Tos-argininoli-tert-butyylidimetyylisilyylieetteri 25 Siiten yllä valmistetun yhdisteen annetaan reagoida 6,8 ekvivalentin kanssa sekä l-guanyyli-3,5-dimetyylipy-ratsolia että trietyyliamiinia vedessä 105 °C:ssa 24 tuntia. Sitten seos lyofilisoidaan ja jäännös altistetaan preparatiiviselle HPLC:lle, kuten on kuvattu esimerkissä 30 4. Fraktiot, jotka sisältävät halutun guanidiniumyhdisteen (testattu TLC:llä), yhdistetään ja kuivataan in vacuo.

• —— — Jäännös liuotetaan H20:asetoni -liuokseen (1:4), jäähdytetään jäähauteessa ja pH säädetään 12reen 50 % w/v NaOH -liuoksella. Tähän liuokseen lisäämme liuosta, jossa on 3 35 ekvivalenttia para-tolueenisulfonyylikloridia asetonissa, 60 102183 60 minuutin aikana pitäen samalla pH ll:ssä - 12:ssa NaOHrlla. Liuoksen annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan ja sekoitetaan yön yli. Sitten asetoni poistetaan in vacuo ja jäljelle jäänyt vesipohjainen liuos pestään eetterillä.

5 Eetterikerros poistetaan ja takaisinuutetaan kyllästetyllä NaHC03:lla. Vesipohjaiset faasit yhdistetään ja tehdään happamiksi pH 3:een 2 N HCl:lla. Sitten tuloksena syntynyt hapan liuos uutetaan kaksi kertaa etyyliasetaatilla, kuivataan ja konsentroidaan in vacuo halutun tuotteen saarni-10 seksi.

1- [ (21 -karboksi-1', 1' -dif luori)etyyli JlT'-BOC-I^-Tos-argininoli

Tuloksena syntynyt tuote 1-((2'-karboetoksi-1',1'-dif luori )etyyli )N°-BOC-N9-Tos-argininoli-1ert-butyylidime-15 tyylisilyylieetteri desilyloidaan käsittelemällä 3 ekvivalentilla tetra-n-butyyllammoniumfluoridia THF:ssä huoneenlämpötilassa, kuten ovat kuvanneet E.J. Corey et ai., supra. Tällä menetelmällä tuotettu yhdiste saippuoidaan sitten käsittelemällä 2,5 ekvivalentilla metanoli/vesi 20 -liuoksessa olevaa LiOHiia huoneenlämpötilassa yli yön ar gonin alla. Sitten reaktioseos pestään etyyliasetaatilla ja tehdään happamaksi sitruunahapolla pH 4:ään. Uutamme tuloksena syntyneen hapon etyyliasetaattiin, kuivaamme orgaanisen faasin ja konsentroimme in vacuo. Sitten raaka-25 happo puhdistetaan Vydac C18 -käänteisfaasi-HPLC-pylväässä olosuhteissa, jotka on kuvattu esimerkissä 4.

l-[ (2 ' -karboksi-1', 1' -difluori)etyyli]I^-BOC-l^-Tos-argininoni

Yllä olevan yhdisteen alkoholiryhmä muutetaan keto-30 niksi lisäämällä yksi ekvivalentti CH2Cl2:ssa olevaa pyri- .. diniumdikromaattia, joka sisältää 0,5 % jääetikkahappoa, molekyyliseulojen läsnäollessa (N. Peet et ai., "Synthesis of Peptidyl and Fluoromethyl Ketones and Peptidyl a-Keto Esters as Inhibitors of Porcine Pancreatic Elastase, Human 35 Neutrophil Elastase and Rat and Human Neutrophil Cathepsin 61 102183 G", J. Med. Chem., 33, sivut 394 - 407 (1990)). Kun on sekoitettu argonin alla 15 tuntia, reaktioseos suodatetaan ja liuotin poistetaan iji vacuo. Tuloksena syntynyt 1—((2 * — karboksi-1', 1' -dif luori )etyyli )N°-BOC-Ne-Tos-argininoni 5 otetaan talteen öljyisenä jäännöksenä ja sitten puhdistetaan HPLC:llä esimerkissä 4 spesifioiduissa olosuhteissa.

Vapaa karboksyylihappo muutetaan symmetriseksi an-hydridiksi ja sen annetaan reagoida resiiniin kiinnitetyn heksadekapeptidin kanssa, kuten on kuvattu esimerkissä 21.

10 Hirulog-25:n kaksi N-pään tähdettä BOC-Pro ja BOC-(D-Phe) lisätään standardeissa peptidisynteesiolosuhteissa ja sitten tuloksena syntynyt peptidi irrotetaan HF:llä. Esimerkki 25 Hirulog-26:n synteesi 15 Hirulog-26:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Argoksipropio- nyyliglysyyli- (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-clu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu -heksadekapeptidi syntetisoitiin, kuten aiem-, min on kuvattu ja jätettiin kiinni resiiniin. Seuraava 20 tähde hT-BOC-argoksipropionyyliglysiini syntetisoidaan re-aktiokaaviolla, joka on kuvattu ja selostettu alla.

62 102183 H’W ηΛ=ν·τ* HN HN Hlt

Cbz o Cbz O COjtBu O

1°

H’W

HN ^ *

l - Cbz, R,-vV

\ ~ 2 ^ ^ R, - H. Rj-H

15 HcOzRa (~*

£ S H VR,-BOC. R,- H

3- (Cbz-amino)-2-oksi-3-(3-((N®-Tos)guanidinyyli)pro- pyy1i-ditert-butyylimalonaatt1 20 Valmistimme erän N°-Cbz-N9-Tos-arginiinidiatsome- tyyliketonia samalla tavalla kuin valmistimme esimerkissä 21 kuvatun Na-BOC-N9-Tos-arginiinidiatsometyyliketonin paitsi, että Na-BOC-N9-Tos-arginiini korvattiin N°-Cbz-N9-Tos-arginiinilla. Liuotimme 4,5 mg Na-Cbz-N9-Tos-arginiini-25 diatsometyyliketonia 200 ml:aan CH2Cl2:ta pullossa ja jäähdytimme liuoksen -70 eC:seen kuivajää/asetoni -hauteessa sekoittaen. Sitten liuoksen läpi kuplitettiin vedetöntä HBr-kaasua tasaisella virtausnopeudella 15 minuuttia. Liuosta sekoitettiin lisää 15 minuuttia -70 °C:ssa ja sitten 30 konsentroitiin in vacuo. Tuloksena syntynyt tuote N°-Cbz-N9-Tos-Arg-C0CH2Br otettiin talteen 5,0 g:na keltaisia ki-·; teitä.

Samalla aikaa lisättiin suspensio, jossa oli nat- riumhydridiä (36 mg; 80 % dispersio öljyssä) 1 ml:ssa 35 DMF:ää ja 1,2 ml heksametyylifosforiamidia ("HMPA"), liu- 63 102183 okseen, jossa oli 259 mg di-tert-butoksimalonaattia 4 ml:ssa DMF:ää. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 40 minuuttia ja sitten lisättiin tipoittain 20 minuutin aikana liuokseen, jossa oli 1 mmooli l^-Cbz-N^Tos-Arg-5 COCH2Br-yhdistettä liuoksessa, joka oli 1 ml DMF/0,13 ml HMPA. Reaktion annettiin jatkua 3 tuntia, jonka jälkeen liuos kaadettiin 50 ml:aan vettä ja uutettiin 2 x 50 ml:11a etyyliasetaattia. Orgaaninen faasi eristettiin, kuivattiin ja konsentroitiin in vacuo öljyiseksi jäännök-10 seksi. Seuraavaksi jäännös puhdistettiin 3 x 10 cm silika-geelipylväässä, joka eluoitiin peräkkäin 400 ml:11a kloroformissa olevaa 5 % asetonia, 400 ml:11a kloroformissa olevaa 10 % asetonia ja 200 ml:11a kloroformissa olevaa 20 % asetonia. Kerättiin fraktiot (25 ml) ja testattiin 15 TLC:lla. Fraktiot, jotka sisälsivät halutun tuotteen, yhdistettiin ja konsentroitiin saaden 3-(Cbz-amino)-2-oksi-3-(3-( (N9-Tos)guanidinyyli)propyyli-di-tert-butyylimalo-naatti.

5- (Nα-¾z-amino) -4-oksi-5- (3- ((N9-Tos) guanidinyyli) -20 propyyli)pentanoyyliglysiinibentsyyliesteri

Yllä kuvattua di-t-butyyliesteriä sekoitetaan 1,2 ekvivalentin kanssa 1 N HCl:oa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten se dekarboksyloidaan ylimäärässä pyri-diiniä 100 eC:ssa 15 minuuttia. Sitten liuotin poistetaan • 25 iri vacuo ja jäännös puhdistetaan silikageelikromatografi- alla, kuten yllä on kuvattu. Tuloksena syntynyt karboksyy-lihappo asyloidaan glysiinibentsyyliesterillä esimerkissä 21 kuvatun menetelmän mukaisesti.

5- (*taino) -4-oksi-5- (3- ((N9-Tos)guanidinyyli)propyy-30 li)pentanoyyliglysiini

Tuloksena syntynyt esteri liuotetaan 500 ml:aan metanolia ja hydrogenoidaan yli yön 1 ilmakehän vetykaasu-paineessa 600 mg yllä 10 % palladium-hiili -katalyyttiä. Sitten reaktioseos suodatetaan Celite'n läpi ja konsent-35 roidaan in vacuo kiinteäksi jäännökseksi (155 mg). Sitten 64 102183 tuloksena syntynyt aminohappo puhdistetaan HPLC:llä käyttäen esimerkissä 4 kuvattuja olosuhteita.

5- (iT-BOC-^iino) -4-oksi-5- (3- ((N9-Tos)guanidinyyli) -propyyli)pentanoyyliglysiini 5 Yllä oleva aminohappo muutetaan sen vastaavaksi BOC-johdannaiseksi liuottamalla se dioksaani/vesi -liuokseen (2:1, v/v) ja jäähdyttämällä 0 °C:seen sekoittaen. pH säädetään 10:een 0,1 N NaOH:lla ja sitten lisätään 1,1 ekvivalenttia di-tert-butyylidikarbonaattia (dioksaanis-10 sa). Reaktiota sekoitetaan 0 eC - 20 °C:ssa 4 tuntia ja sitten haihdutetaan in vacuo. Sitten jäännös jaetaan osiin etyyliasetaatti/1 % sitruunahappo -liuoksella (2:1). Orgaaninen faasi eristetään, uutetaan kerran 1 % sitruunahapolla ja sitten 3 kertaa kyllästetyllä NaClrlla. Orgaani-15 nen faasi kuivataan MgS04:n yllä, suodatetaan ja konsentroidaan in vacuo BOC-suojatun tuotteen saamiseksi.

Sitten tuloksena syntynyt suojattu vapaa pseudopep-tidikarboksylaatti kiinnitetään resiiniin sidottuun hek-sadekapeptidiin käyttäen standardeja peptidisynteesimene-20 telmiä. Tämän jälkeen resiiniin sidottuun peptidiin lisätään peräkkäin BOC-D-Phe ja BOC-Pro. Sitten täydellinen Hirulog-26 irrotetaan resiinistä, suojaus poistetaan ja puhdistetaan, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 26 25 Hirulog-27:n synteesi

Hirulog-27:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-(CO-CH2)-Pro-(Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu -heksadekapeptidi syntetisoitiin, kuten aiemmin on 30 kuvattu ja jätettiin kiinni resiiniin. Molekyylin jäljellä ; oleva osa syntetisoitiin reaktiokaaviolla, joka on kuvattu ja selostettu alla.

65 102183 η2ν ,Τ. h*h τ· >N Vn' Η·Ν Η·Ν

Cbl ° S$ «* ο Λ0ι 10 / o

HiVnJ* / H*N r

l R, H, Ra-H

15 1 ____ ^Β,-ΒΟΟ. B,-H

«v^o

Ri ° COiRj 20

Ne-Cbz-N9-Tos-arginiini (COCH2) -proliinibentsyylies-teri

Liuotimme 720 mg proliinibentsyyliesteriä (HC1-suola) 25 ml:aan THF:ää. Sitten tämä liuos jäähdytettiin 25 -78 °C:seen asetoni/kuivajää -hauteessa sekoittaen argonin alla. Sitten lisäsimme litiumdi-isopropyyliamidia (8,0 ml 0,75 M heksaanisuspensiota) ja sekoitimme 5 minuuttia lisää. Tähän lisäsimme 1,08 g Na-Cbz-N9-Tos-arginiinibromime-tyyliketonia 10 ml:ssa THF:ää, joka oli valmistettu, kuten 30 on kuvattu esimerkissä 25, tipoittain 20 minuutin aikana. Reaktiota sekoitettiin lisää 5 minuuttia ja sitten liuoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan sekoittaen. Lopetimme reaktion lisäämällä 10 ml kyllästettyä NaClria, annoimme faasien erota ja eristimme orgaanisen faasin. Sit- 66 102183 ten tämä faasi kuivattiin MgS04:n yllä, suodatettiin ja haihdutettiin in vacuo♦ N°-B0C-N9-Tos-arginiini (COCHj) -proliini Yllä oleva bentsyyliesteri (1,3 g) hydrogenoitiin 5 käyttäen palladium-hiili menetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 25. Tuloksena syntynyt pseudodipeptidi BOC-suo-jattiin menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 25, halutun tuotteen saamiseksi.

Sitten puhdistettu suojattu pseudodipeptidi kiin-10 nitettiin resiiniin sidottuun heksadekapeptidiin standardeilla peptidisynteesimenetelmillä. Hirulog-27:stä poistettiin suojaus, irrotettiin resiinistä ja puhdistettiin menetelmillä, jotka on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 27 15 Hirulog-28:n synteesi

Hirulog-28:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-(CH2N,~

Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-

Tyr-Leu-O-PAM -heksadekapeptidi syntetisoitiin, kuten 20 aiemmin on kuvattu ja jätettiin kiinni resiiniin. Molekyylin jäljellä oleva osa syntetisoitiin reaktiokaaviolla, joka on kuvattu ja selostettu alla.

25 "’Ή’

HN

V CHO n—/ N T

30 BOC H C0*Q B0C C°*R

Cr-h 67 102183

Ne-BOC-Ne-Tos-arginiini (psiCHjNjproliinibentsyyli- esteri

Yksi gramma murskattuja 3 A molekyyliseuloja (Aid-rich) lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli 5,25 g 5 proliinibentsyyliesterin vapaata emästä (Schweizerhall, Inc.) 10 ml:ssa vedetöntä THFrää ja 2 ml:ssa vedetöntä etanolia, argonin alla huoneenlämpötilassa. Lisäsimme 1,45 ml 5 N metanoli-HClroa ja 1,5 g Na-B0C-N9-Tos-arginaalia (valmistettu, kuten on kuvattu ersimerkissä 22) tähän 10 seokseen ja sekoitimme yhden tunnin. Seokseen lisättiin 85 mg:n erä natriumsyaaniboorihydridiä ja sitten tuntia myöhemmin lisättiin toinen 85 mg:n erä natriumsyaaniboorihydridiä. Sitten reaktiota sekoitettiin 20 tuntia ja suodatettiin. Lisäsimme 1 ml vettä ja 0,9 ml 1 N HCl:oa suo-15 dokseen sekoittaen ja sitten konsentroimme liuoksen in vacuo saaden 6,2 g N°-B0C-N9-Arg(psiCH,N)-Pro-bentsyylies-teriä kirkkaana öljynä.

öljy puhdistettiin edelleen nopealla kromatografi-alla nopean 5 cm pylvään läpi, joka pylväs sisälsi 350 ml 20 silikageeliä (Merck Grade 60, 230 - 400 mesh, 60 A). Tuote saatiin eluoimalla peräkkäin kloroformissa olevalla 0,25 %, 0,75 % ja 1,5 % metanolilla.

Na-BOC-N*-Tos-arginiini(psiCH,N)proliini

Tuloksena syntynyt bentsyyliesteri hydrogenoidaan • 25 palladium-hiilen yllä ja puhdistetaan, kuten on kuvattu esimerkissä 25. Tämä menetelmä antoi 160 mg Na-B0C-N9-Arg(psiCH,N)-proliinin vapaata happoa, joka puhdistettiin edelleen käyttäen HPLC-kromatografiasysteemiä, kuten on kuvattu esimerkissä 4 paitsi, että eluutio suoritettiin 30 isokraattisella 26 % puskuri B/74 % puskuri A -systeemil-- lä, joka aiemmin on kuvattu esimerkissä 22. Dipeptidin lopullinen saanto oli 86 mg.

Sitten dipeptidi kiinnitetään resiiniin sidottuun heksadekapeptidiin, jonka jälkeen seuraa B0C-Pro:n ja BOC-35 (D-Phe):n lisäyssyklit. Täysin syntetisoidun Hirulog-28:n Μ 102183 bo suojauksen poisto, irrotus ja puhdistus suoritetaan menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 28

Hirulog-29:n synteesi 5 Hirulog-29:n kaava on: 4-kloori-isokumariini-3- karboksietoksi-(Gly )5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. (Gly )5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-heksadekapeptidi syntetisoitiin, kuten aiemmin on kuvattu ja jätettiin kiinni resiiniin. 4-kloori-10 isokumariini-3-karboksialkoksiosa syntetisoitiin alla kuvatuilla reaktiokaaviolla ja menetelmillä.

COjH

O S' O

oCw·. cQw-

Cl Cl

Etyyli-2-bromi-homoftalaatti

Sekoitimme homoftaalihappoa (10,0 g), 2-bromieta-25 nolia (21,0 g) ja bentseeniä (200 ml). Sitten lisäsimme 12-15 tippaa rikkihappoa ja kuumensimme takaisinvirtau-tukseen 2,5 tunniksi. Sitten liuos suodatettiin ja konsentroitiin in vacuo. Jäännös pestiin 250 ml :11a eetteri/ heksaania (1:1) ja suodatettiin sintterilasisuppilolla. 30 Tuloksena syntynyt vaalean ruskea kiinteä aine kuivattiin tyhjiössä saaden noin 15,0 g tuotetta.

4-kloori-3-(2-bromietyylioksi)-isokumariini

Sekoitimme yllä kuvatulla tavalla valmistetun etyy-li-2-bromi-homoftalaatin (4 g) yhteen fosforipentakloridin 35 (8,2 g) ja bentseenin (100 ml) kanssa. Seosta takaisinvir- 69 102183 tautettiin 4,5 tuntia, suodatettiin kuumana ja haihdutettiin in vacuo. Punaisenruskea öljyinen jäännös kromatogra-foitiin välittömästi 24 mm x 175 mm silikageelipylväässä käyttäen dikloorimetaania eluenttina. 20 ml: n kokoiset 5 fraktiot kerättiin ja testattiin TLC:lla. 4-kloori-3-(2-bromietyylioksi)-isokumariini eluoitui fraktioissa 2-6. Fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin in vacuo ja tuloksena syntynyt jäännös otettiin talteen kirkkaana vaalean keltaisena öljynä (2,2 g).

10 4-kloori-3-(3-oksipropaanihappo)-isokumariini

Yllä valmistettua 4-kloori-3-(3-bromietyyli)-iso-kumariinia (1,4 g) liuotettiin vedettömään THF:ään ja lisättiin suoraan takaisinvirtautettavaan liuokseen, jossa oli magnesiumlastuja (170 mg) ja muutamia jodikiteitä 15 15 ml:ssa vedetöntä THF:ää, jota liuosta sekoitettiin ar gonin alla. Seosta takaisinvirtautettiin 1,5 tuntia. Sitten se kaadettiin ylimäärin olevan kuivajään päälle 400 ml:n dekantterilasissa. Annoimme seoksen seisoa . 20 °C:ssa kunnes kaikki ylimääräinen C02 oli sublimoitunut 20 ja sitten lisäsimme seokseen dietyylieetteriä ja THF:ää, noin 100 ml kumpaakin, joka lisäys tuotti keltaisen liuoksen, joka sisälsi suuren määrän valkoista raakasaostumaa.

Kuplitimme vedetöntä HCl:oa tämän seoksen läpi 20 °C:ssa, joka liuotti suurimman osan saostumasta. Sitten ·' 25 liuos suodatettiin ja haihdutettiin in vacuo raakatuotteen saamiseksi. Sitten tämä kiteytettiin uudelleen yli yön DCM:stä.

Tuloksena syntynyt 4-kloori-3-(3-oksipropaanihappo) -isokumariini kiinnitetään glysiinibentsyyliesteriin ja 30 tuloksena syntynyt tuote hydrogenoidaan katalyyttisesti *; palladium-hiilen yllä, kuten on kuvattu esimerkissä 25.

Sitten tämä pseudopeptidi kiinnitetään resiiniin sidottuun (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-hek-sadekapeptidiin standardeilla peptidisynteesimenetelmillä.

70 102183

Esimerkki 29

Hirulog-30:n synteesi

Hirulog-30:n kaava on: 4-kloori-3-(2-aminoetanoli)-isokumariini- (Gly )5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-5 Glu-Tyr-Leu. (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-

Glu-Tyr-Leu -heksadekapeptidi syntetisoidaan, kuten aiemmin on kuvattu ja jätetään kiinni resiiniin.

4-kloori-3-(2-aminoetanoli)-isokumariiniosavalmis-tetaan samanlaisella menetelmällä, joka on kuvattu esimer-10 kissä 28 syntetisoitaessa 4-kloori-3-(2-bromietanoli)-isokumariinia paitsi, että 2-aminoetanolia käytetään 2-bromietanolin sijasta homoftaalihapon esterifikaation alkuvaiheessa .

Ureasidos muodostetaan antamalla 4-kloori-3-(2-15 aminoetanoli)-isokumariinin aminoryhmän reagoida aktivoi van aineen, karbonyylidi-imidatsolin ("CDI"), kanssa. Tuloksena syntynyttä imidatsolidi-välimuotoa ei eristetä, vaan sen annetaan reagoida resiiniin kiinnitetyn heksade-kapeptidin kanssa muodostaen Hirulog-30:n. Sitten Hirulog-20 30:n suojaus poistetaan, se irrotetaan resiinistä ja puh distetaan menetelmillä, jotka on kuvattu esimerkissä 4.

Esimerkki 30

Hirulog-31:n synteesi

Hirulog-31:n kaava on: argipidyyli-(Gly)5-Asn-Gly-25 Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Syntetisoimme (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu heksadekapeptidin standardeilla peptidisynteesimenetelmil-lä, kuten aiemmin on kuvattu ja jätimme peptidin kiinni resiiniin. Tämän Hirulog:n argipidyyliglysiiniosa synte-30 tisoidaan reaktiokaaviolla, joka on kuvattu ja selostettu alla.

71 102183 wt, J=*~· "Γ

/ HOfcC

οο-δα-Ιία δα "K,

ίο M I

Z^·»"· Z^*~· -ΗΛ- m -¾ 15 o - · «j» o o*

W to W

\ >*—

: “ ^iX

o o*s όα 25 Dehydro-N9-nitroargipidiini syntetisoidaan oleel lisesti argipidiinin syntetisointimenetelmällä, joka on kuvattu Amerikkalaisessa patentissa numero 4 258 192, joka on liitetty tähän viitteeksi. Ainoat erot ovat, että gua-nidiniumryhmä on suojattu nitroryhmällä ja kinoliinin he- 30 terosyklinen rengas jää tyydyttymättömäksi. Tätä välimuotoa käytetään asyloitaessa t-butyyliglysiini menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 21. T-butyyliesteri poistetaan standardeilla happohydrolyysimenetelmillä. Tuloksena syntyneen vapaan hapon annetaan reagoida heksadekapeptidin 35 kanssa käyttäen standardeja kiinnitysmenetelmiä. Tuloksena 72 102183 syntyneen peptidin suojaus poistetaan, se irrotetaan re-siinistä ja puhdistetaan esimerkissä 4 kuvatuilla menetelmillä.

Sitten peptidi altistetaan hydrogenaatiomenetelmäl-5 le, joka on kuvattu patentissa 4 258 192 ja puhdistetaan esimerkissä 4 kuvatulla HPLC-menetelmällä.

Esimerkki 31

Hirulog-32:n synteesi

Hirulog-32:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-(Gly)5- 10 Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hiru- log-32 syntetisoitiin, puhdistettiin ja karakterisoitiin käyttäen esimerkissä 4 kuvattuja menetelmiä paitsi, että BOC-proliinin sijasta käytettiin BOC-glysiiniä syklissä, joka seurasi kahta BOC-glysyyliglysiinin lisäyssykliä.

15 Esimerkki 32

Hirulog-33:n synteesi

Hirulog-33:n kaava on: N-asetyyli-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu- (Gly )3-Val-Arg-Pro- (Gly )4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-33 syntetisoitiin, 20 puhdistettiin ja karakterisoitiin standardeilla peptidi- synteesimenetelmillä, joita käytettiin esimerkissä 4 käyttäen sopivia BOC-aminohapposubstituutioita. Hirulog-33:n CSDM-osassa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen ihmisen fibrinogeenin Αα-ketjun fibrinopeptidi A:n sek-25 venssin osalle.

Esimerkki 33

Eri Hirulog:ien katkaisu trombiinilla

Trombiinin inhibition Hirulog-8:11a havaittiin olevan lyhytaikainen johtuen trombiinin aiheuttamasta hitaas-30 ta Arg-Pro -sidoksen katkaisusta. Tämän katkaisun jälkeen trombiinin havaittiin saavan takaisin täyden hydrolyytti-sen aktiivisuutensa kromogeeniselle substraatille. Sen vuoksi Hirulog-8 karakterisoitiin olevan trombiinin "hidas substraatti" -inhibiittori.

73 102183

Ihmisen α-trombiinin aiheuttama Hirulog-8:n kuin myös muiden tämän keksinnön mukaisten Hirulog:ien katkaisu osoitettiin in vitro kokeissa. Valmistettiin reaktioseok-set, jotka sisälsivät ihmisen a-trombiinia (1,6 nM) ja 5 vaihtelevia määriä joko Hirulog-8:aa, Hirulog-10:ntä, Hi-rulog-18a:ta, Hirulog-18b:tä, Hirulog-18c:tä, Hirulog-19:ää, Hirulog-32:ta tai Hirulog-33:a (80 - 160 nM), 20 mM Tris-HCl -puskuriin, pH 7,4, joka sisälsi 0,1 M NaCl:ia. Pienet määrät (0,975 ml) reaktioseoksia poistettiin eri 10 aikoina ja sekoitettiin kyvetissä 0,025 ml:n kanssa kromo-geenista Spectrozyme TH -substraattia (lopullinen konsent-raatio 11 μΜ). Määritettiin reaktion alkunopeus ja perustuen kontrolliseoksiin, jotka sisälsivät trombiinia ilman Hirulog:ia, laskettiin inhibitioprosentti.

15 Vaihtoehtoinen menetelmä käytti Hirulog/trombiini -reaktioseoksen pienten määrien käänteisfaasi-HPLC -erotusta. Tässä kokeessa lisäsimme ihmisen α-trombiinia (lopulliset konsentraatiot 0,25 μΜ) reaktioastiaan, joka sisälsi yhden yllä olevista Hirulog:sta (lopullinen konsent-20 raatio 12,5 μΜ). Pienet määrät (50 μΐ) poistettiin sekä ennen trombiinin lisäystä että eri aikoina trombiinin lisäyksen jälkeen. Pienet määrät joko jäädytettiin nopeasti tai injektoitiin suoraan HPLC-pylvääseen. HPLC-systeemissä käytettiin Applied Biosystems -nestekromatografiasystee-25 miä, joka oli varustettu Aquapore C8 -pylväällä (0,46 x 10 cm). Pylväs tasapainotettiin 70 % liuotin A:ssa (0,1 % TFA vedessä) ja 30 % liuotin B:ssä (0,085 % TFA/70 % ase-tonitriili) ja eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka 011 30 - 50 % liuotin B, 30 minuutin aikana virtausnopeu-30 della 1 ml/min. Läpitullutta eluutiovirtausta tarkkailtiin *. 214 nm:ssa. Peptidikonsentraatiot määritettiin mittaamalla huippujen korkeudet.

Molemmat yllä kuvatut kokeet sallivat trombiinin aiheuttaman Hirulogiin hydrolyysin nopeuden määrityksen 35 (ilmoitettu arvona M/min) ja katalyysinopeuden (kcat; ilmoi- ’o 102183 tettu min'1 kohti). Molemmat menetelmät tuottivat verrattavissa olevat kcat -arvot, jotka on esitetty alla olevassa taulukossa.

5 Inhibiittori Pj - P’j -sekvenssi kMt (min-1)

Hirulog-8 Arg-Pro 0,31 - 0,5

Hirulog-8 Arg-Sar 10

Hirulog-18a β-HomoArg-Gly < 0,01

Hirulog-18b β-HomoArg-Pro < 0,01 10 Hirulog-18c β-HomoArg-Val < 0,01

Hirulog-19 Arg[plsCh,NH]-Gly < 0,01

Hirulog-32 Arg-Gly 535

Hirulog-33 Arg-Pro 0,056 15 Kuten yllä on esitetty, Hirulog-8, -10, -32 ja -33 katkesivat trombiinilla kcat -arvojen vaihdellessa 0,056 min'1 (hidas katkaisu) - 535 min'1 (nopea katkaisu). Hirulog-18a, -18b, -18c ja -19 tuntuvat päinvastaisesti olevan resistenttejä trombiinikatkaisulle.

20 Kuvion 5 paneelit A ja B esittävät yksityiskohtai semman analyysin trombiinin aiheuttamasta Hirulog-8:n katkaisusta. Kuten kuvion 5 paneelissa A on kuvattu, Hirulog-8:n konsentraatioilla, jotka hiukan ylittivät trombiinin konsentraatiot, oli lyhytaikainen inhibitorinen aktiivi-25 suus (suurempi tai yhtä suuri kuin 10 minuuttia riippuen Hirulog:in konsentraatiosta). Hirulog-8:n jatkuvasti korkeammat konsentraatiot osoittivat pidentyneet inhibitor!-set vaikutukset. Lineaarinen suhde inhibition keston ja Hirulog-8:n konsentraation välillä on esitetty kuvion 5 30 paneelissa B. Näistä tuloksista laskimme katalyysiajän, ·" tai kcat:in, olevan 0,37 min*1.

Yllä olevissa reaktioissa tuotettujen Hirulog-8:sta peräisin olevien digestiotuotteiden puhdistuksella ja sekvenssianalyysillä määritimme, että Hirulog-8 katkeaa hi-35 taasti trombiinin välityksellä Arg-Pro -sidoksesta. Tämä 75 102183 on erittäin epätavallinen seriiniproteaasien katkaisukohta ja uskomme, että se on herkkä katkeamiselle Hirulog-8:ssa johtuen peptidin korkeasta affiniteetista trombiinille. Esimerkki 34 5 Linkkerin pituuden vaikutus Hirulog:in aktiivisuu teen

Hirulog-8, Hirulog-13, Hirulog-15 ja Hirulog-16 poikkeavat toisistaan ainoastaan niiden vastaavissa link-keriosissa olevan polyglysiiniosan pituuden suhteen. Sen 10 määrittämiseksi, mikä on linkkerin pituuden vaikutus aktiivisuuteen, vertasimme kunkin näiden Hirulog:ien aiheuttaman inhibition ihmisen α-trombiinille. Seuraava taulukko luettelee kunkin näiden Hirulog:ien linkkerien pituudet: 15 Peptidi Linkkerin pituus (A)

Hirulog-8 24

Hirulog-13 18

Hirulog-15 30

Hirulog-16 36 20 Näiden Hirulog:ien trombiinin vastaiset aktiivisuudet mitattiin trombiinin aiheuttamalle Spectrozyme TH:n hydrolyysille oleellisesti, kuten on kuvattu esimerkissä 9. Kuvio 6 kuvaa linkkerin pituuden suhdetta Hirulog:in 25 aiheuttaman tämän trombiinin katalysoiman reaktion inhibition Kj-arvoon. Tämä kuvio osoittaa, että Hirulog-8, -15 ja -16 sisältävät verrattavissa olevat inhibitioaktiivi-suudet, kun taas Hirulog-13:n, jolla on 18 A pituinen linkkeri, aktiivisuus on pudonnut yli 10-kertaisesti. Tämä 30 vahvistaa sen, että linkkerien pituudet > 18A ja < 42A eivät vaikuta Hirulog:in aktiivisuuteen. Samalla, kun ei haluta sitoutua teoriaan, patentinhakijat uskovat, että tämä johtuu siitä tosiasiasta, että Hirulogrin linkkeri on samalla tavoin epäjärjestäytynyt ollessaan vapaana liuok-35 sessa kuin ollessaan sitoutuneena trombiiniin. Patentin- 76 102183 hakijat uskovat myös, että tämän keksinnön mukaisten trom-biini-inhibiittorien CSDM- ja ABEAM-osilla on ainoastaan vähän yhteistoimintaa sitoutumisessa trombiiniin.

Esimerkki 35 5 Eri Hirulog:ien aiheuttama trombiinin katalysoiman hydrolyysin inhibitio

Vertasimme esillä olevan keksinnön mukaisten eri trombiini-inhibiittorien inhibitorista aktiivisuutta trombiinin katalysoimalle tripeptidyyli-p-nitroaniliidisubst-10 raatin hydrolyysille. Hirulog-10:n, Hirulog-18a:n, Hiru-log-18b:n, Hirulog-18c:n, Hirulog-19:n, Hirulog-32:n ja Hirulog-33:n trombiinin vastaiset aktiivisuudet testattiin esimerkissä 9 kuvatulla menetelmällä käyttäen Spect-rozyme TH:ta substraattina. Alla oleva taulukko luettelee 15 kunkin näiden trombiini-inhibiittorien lasketut F^-arvot kuin myös Px - Pr' -sekvenssit.

Inhibiittori Pi - Px' -sekvenssi Kt (nM)

Hirulog-8 Arg-Pro 1,9 ± 1,4 20 Hirulog-10 Arg-Sar < 2,000

Hirulog-18a B-HomoArg-Gly 7,4

Hirulog-18b 8-HomoArg-Pro 4,6

Hirulog-18c β-HomoArg-Val 205,0

Hirulog-19 Arg[psiCH7NH] -Gly 20,0 25 Hirulog-32 Arg-Gly < 2,000

Hirulog-33 Arg-Pro 3,6

Kuten yllä on osoitettu, Hirulog-10 ja Hirulog-32 olivat huonoja trombiinin katalysoiman Spectrozyme TH:n 30 hydrolyysin inhibiittoreita. Tämä oli johdonmukaista sen . tosiasian kanssa, että trombiini katkaisi nämä inhibiit torit nopeasti Px - Px' -sidoksesta. Hirulog-19:ssä, jossa tämä tämä sidos oli pelkistetty psiCH,-NH -sidokseksi ja joka sen vuoksi ei ollut trombiinin katkaistavissa, ha- 77 102183 valttiin tehokas trombiinin katalysoiman hydrolyysin inhi-bitio.

Kokeet β-homoarginiinia sisältävillä inhibiittoreilla (Hirulog-18a, -18b ja -18c) osoittivat, että tämä 5 aminohappojohdannainen voi korvata arginiinin tämän kek sinnön mukaisissa inhibiittoreissa vaikuttamatta aktiivisuuteen. Lisäksi tämä osoittaa, että amidisidoksen korvaaminen metyleenisldoksella ei merkittävästi alenna trombii-nia inhiboivaa aktiivisuutta. 30 - 50 -kertainen kohoami-10 nen Hirulog-18c:n ^-arvossa verrattuna Hirulog-18a:han ja -18b:hen, vastaavassa järjestyksessä, antaa olettaa, että P'3 -aminohapon rakenne on tärkeä inhibitorisessa aktiivisuudessa. Ilman, että halutaan sitoutua teoriaan, patentinhakijat uskovat, että phi-psi -kulmien läsnäolo P'3 -15 aminohapossa (Gly Hirulog-18a:ssa; Pro Hirulog-18b:ssä) kuin myös konformaation aiheuttamat rajoitukset (kuten sellaiset, jotka proliini aiheuttaa Hirulog-18b:ssä) ottavat osaa tämän keksinnön mukaisten inhibiittorien vahvuuteen. Vaihtoehtoinen mahdollisuus on, että Hirulog-18c:n 20 Vai P'i -aminohapon β-sivuketju voi heikentää tämän molekyylin CSDM-osan sitoutumista trombiinin reaktiiviseen keskukseen steerisistä syistä.

Esimerkki 36

Hirulog-8:n sitoutuminen trombiinin aktiiviseen 25 kohtaan

Di-isopropyylifluorifosfaatti (DFP) on hyvin tunnettu seriiniproteaasien, sisältäen trombiinin, inhibiittori, joka toimii modifioimalla kovalenttisesti Ser-195:n hydroksyyliryhmän. Lisäsimme 270-kertaisen ylimäärän 14C-30 DFP:tä trombiiniin 0,1 M natriumboraatti-puskurissa, pH \ 8,0. 10 minuutin reaktion jälkeen trombiinikompleksin muo dostuminen osoitettiin SDS-PAGE ja fluorigrafisella analyysillä (kuvio 7, kaista 1). Kun reaktio suoritettiin Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64 :n läsnäollessa (300-ja 35 3000-kertainen ylimäärä trombiiniin verrattuna), (14C)- 78 102183 DFP:n aiheuttama trombiinin modifikaatio ei muuttunut merkittävästi (kuvio 7, kaistat 4 ja 5). Kuitenkin, kun suoritimme reaktion Hirulog-8:n läsnä ollessa (3- tai 30-ker-tainen ylimäärä trombiiniin verrattuna), (14C)-DFP:n inkor-5 poraatio trombiinin katalyyttiseen kohtaan oli täysin blo- keerattu (kuvio 7, kaistat 2 ja 3). Nämä tulokset osoittavat, että tämän keksinnön mukaisten trombiini-inhibiittorien CSDM-osat kykenevät sitoutumaan trombiinin katalytti-seen kohtaan ja inhiboimaan sen katalyyttisen aktiivisuu-10 den.

Esimerkki 37

Hirulog-8:n ja synteettisen katalyyttiseen kohtaan suunnatun pentapeptidin (D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly) trombiinin vastaisen aktiivisuuden vertailu 15 Kuten kuviossa 1 on esitetty, Hirulog-8, päinvas toin kuin sen anionia sitovaan rajakohtaan liittyvä rakenneosa Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudiini53_64, kykeni inhiboimaan trombiinin katalysoiman pienten p-nitroaniliidisubst-raattien hydrolyysin. Samalla tavalla testasimme (D-Phe)-20 Pro-Arg-Pro-Gly -pentapeptidin kyvyn inhiboida trombiinin katalysoima reaktio.

Pentapeptidi syntetisoitiin, kuten on kuvattu esimerkissä 4 käyttäen BOC-glysiinidivinyylibentseeniresii-niä. Pentapeptidi puhdistettiin ja karakterisoitiin, kuten 25 on kuvattu esimerkissä 4.

Sekä Hirulog-8:n että tämän pentapeptidin vaikutuksia trombiinin katalysoimaa Spectrozyme TH:n hydrolyysiä vastaan tutkittiin, kuten on kuvattu esimerkissä 9 käyttäen vakioita peptidikonsentraatioita 50 nM tai 10 μΜ, vas-30 taavassa järjestyksessä. Tuloksemme osoittavat, että sa-maila kun Hirulog-8:n nanomolaariset konsentraatiot voivat inhiboida trombiinin katalysoimaa reaktiota, niinkin korkeilla pentapeptidikonsentraatioilla kuin 10 μΜ ei ollut mitään merkittävää vaikutusta trombiinin katalysoiman re-35 aktion nopeudelle. Nämä tulokset osoittavat, että tämän 79 102183 keksinnön mukaisten trombiini-inhibiittorien CSDM-osa on itsessään ainoastaan heikko trombiinin katalyyttisen toiminnan inhibiittori.

Esimerkki 38 5 Hirulog-8:n hyytymisen vastainen aktiivisuus in vivo Määritimme Hirulog-8:n hyytymisen vastaisen aktiivisuuden in vivo sen jälkeen, kun tätä peptidiä oli annettu paviaaneille laskimonsisäisesti. Käytimme eri Hirulog-10 8:n annoksia vaihdellen 0,002 - 0,2 mg/kg/min. Paviaanit (uroksia, 10 - 15 kg) rauhoitettiin ketamiinihydroklori-dilla ennen Hirulog-8:n antoa. Käsiteltyjen ja kontrolli-eläinten kokoveri poistettiin katetrin kautta, joka oli asetettu reisilaskimoon, ja kerättiin 3,8 % natriumsi-15 traattiin (9:1; veri:natriumsitraatti). Plasma saatiin standardeilla menetelmillä ja APTT määritettiin menetelmillä, jotka on kuvattu esimerkissä 10. Kuten kuviossa 8 on esitetty, Hirulog-8 antoi annoksesta riippuvaisen nousun APTT:ssä. 200 % nousu APTTrssä (jota pidetään tera-20 peuttisena määränä) saatiin alhaisimmalla Hirulog-annok-sella (0,002 mg/kg/min infuusio).

Esimerkki 39

Hirulog-8:n aiheuttama hyytymään sitoutuneen trombiinin inhibitio 25 Tiedetään, että trombiini voi sitoutua fibriinihyy- tymään ja kerran absorboiduttuaan jatkaa lisäfibrinogeenin katkaisua johtaen hyytymän kasvuun. Hyytymään sitoutuneen trombiinin on osoitettu olevan resistentti hepariini-anti-trombiini III -kompleksin aiheuttamalle neutralisaatiolle 30 (P.J. Hogg et ai., "Fibrin Monomer Protects Thrombin From ’< Inactivation By Heparin-Antithrombin III: Implications for

Heparin Efficacy", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, sivut 3619 - 23 (1989)), mutta se voidaan inhiboida antitrom-biini Illrsta riippumattomilla inhibiittoreilla, kuten 35 PPACK:lla, hirudiinilla tai Sulfo-Tyr63-N-asetyylihirudii- βο 102183 ni53-63:lla. Hyytymään sitoutuneen trombiinin uskotaan ottavan osaa veritukoksen kiinnikasvettumiseen ja uudelleen tukkeutumiseen, joka seuraa veritulpan liuotusterapiaa.

Vertasimme Hirulog-8:n ja hepariinin kykyjä inhi-5 boida hyytymään sitoutunutta trombiinia käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet J.I. Weitz et ai., "Clot-Bound Thrombin Is Protected from Heparin Inhibition — A Potential Mechanism for Rethrombosis After Lytic Therapy", Blood, 74, sivu 136a (1989).

10 Kliinisesti asianmukainen annos hepariinia (0,1 yksikköä/ml) inhiboi liukoisen trombiinin aiheuttamaa fib-rinopeptidi A:n (FPA) vapautumista noin 70 prosenttisesti. Kuitenkin, samanlaisella annoksella ei ole mitään vaikutusta hyytymään sitoutuneen trombiinin aiheuttamaan FPA:n 15 vapautumiseen. Hirulog-8:11a oli päinvastaisesti lähes samanlainen inhibitorinen vaikutus FPA:n vapautumiseen, jota vapautumista katalysoi joko liukoinen tai hyytymään sitoutunut trombiini (kuvio 9).

Tämä tutkimus osoitti, että Hirulog-8 kuin myös 20 muut tämän keksinnön mukaiset trombiini-inhibiittorit ovat tehokkaampia kuin nykyiset lääkkeet veritukoksen kiinni-kasvettumisen blokeerauksessa lisäten nopeutta veritulpan liuottamisesta uuteen läpivirtaukseen ja estäen uuden tukkeuman synnyn veritulpan liuotushoidon jälkeen.

25 Esimerkki 40

Hirulog-8:n vaikutus verihiutaleista riippuvaiseen verisuonitukokseen in vivo

Koska tiedetään, että paviaaneilla on samanlaiset veren hyytymis- ja verenvuotoa tyrehdyttävät responssit 30 kuin ihmisellä, käytimme hyväksemme paviaanimallia määritti täessämme Hirulog-8:n kykyä keskeyttää verihiutaleista riippuvainen veritukoksen synty. Erikoisesti, laitoimme erilaisia veritukosta synnyttäviä pintoja eläinten jatkuvasti paljastettuna olevaan kammio-eteissivukytkentään. 35 Nämä pinnat sisälsivät paviaanin aortan osia, joista oli ei 102183 poistettu valtimon sisäkalvon pehmentyneet osat, kollageenilla päällystettyjä silikoniletkuja, kollageenilla päällystettyjä Gortex- ja Dacron -siirroksia. Kun oli asetettu sivukytkentään, pinnat altistettiin luonnollisesti virtaa-5 valle verelle veritukoksen muodostamiseksi. Mittasimme veritukosten muodostusta 60 minuutin aikana tarkkailemalla verihiutaleiden kerääntymistä veritukosta muodostavalle pinnalle. Nämä mittaukset suoritettiin ulkoisella gamma-kamerakuvauksella sen jälkeen, kun koe-eläimelle oli ensin 10 infusoitu autologisia luIn-leimattuja verihiutaleita.

5 cm kokoisen paviaanin aortan osan, josta oli poistettu valtimon pehmentyneitä osia, sijoittaminen paljastuneeseen kammio-eteissivukytkentään Hirulog-8:n poissaollessa johti ajasta riippuvaiseen verihiutaleiden ke-15 rääntymiseen. Tämä akkumulaatio saavutti tasannevaiheen 60 minuutissa, jolloin kokonaismäärä 14,0 ± 5,0 x 10® verihiu-taletta/cm löydettiin kerääntyneenä osalla, josta oli poistettu valtimon pehmentyneitä osia. Hirulog-8:n annokset 0,002 ja 0,01 mg/kg/min inhiboivat verihiutaleiden 20 kerääntymisen 53,6-prosenttisesti ja 75,5-prosenttisesti, vastaavassa järjestyksessä. Nämä tulokset on esitetty kuviossa 10. Hirulog-8:n ED50-arvo (annos, joka tarvitaan alentamaan verihiutaleiden kerääntymistä 50-%lilla) tässä mallisysteemissä oli 0,002 mg/kg/min.

; 25 Kun asetimme 5 cm pituiset osat kollageenilla pääl lystettyä letkua kammio-eteissivukytkentään, 12,6 ± 5,0 x 10® verihiutaletta/cm kerääntyi 60 minuutissa Hirulog-8:n poissaollessa. Hirulog-8:n anto johti annoksesta riippuvaiseen verihiutaleiden kerääntymisen inhibitioon. Hiru-30 log:in annos 0,04 mg/kg/min inhiboi täydellisesti verihiu-!. taleiden kerääntymisen. Tämän koeosan tulokset kuvataan kuviossa 11. Hirulog-8:n ED50-arvon tässä systeemissä laskettiin olevan 0,004 mg/kg/min.

Sekä kollageenilla päällystettyjen Gortex- tai 35 Dacron-suonisiirrosten tiedetään olevan enemmän veritukok- 102183 82 siä muodostavia kuin silikoniletkujen. Yhteensä 35,0 ± 6,0 x 108 verihiutaletta/cm kerääntyi Gortex'ille altistettaessa 60 minuutiksi luonnolliselle verelle Hirulog-8:n poissaollessa. Havaitsimme, että Hirulog-8 jälleen 5 osoitti annoksesta riippuvaisen veritukoksen synnyn vastaisen vaikutuksen verihiutaletukoksen muodostumiselle. Hirulog-8:n annos 0,2 mg/kg/min aiheutti verihiutaleiden kerääntymisen 62,9 % inhibition. Hirulog-8:n ED50-arvo

Gortex-systeemissä oli 0,135 mg/kg/min. Samanlainen tulos 10 saatiin Dacron-siirroksilla. Suurempi Hirulog-8:n annos verihiutaleiden kerääntymisen inhiboimiseksi näille kahdelle pinnalle oli odotettavissa johtuen niiden korkeasta veritukosta muodostavasta aktiivisuudesta.

Määritimme myös Hirulog-8:n vaikutuksen verihiuta-15 leista riippuvaisen veritukoksen muodostukseen sekä korkeissa että matalissa sekoitusolosuhteissa käyttäen kak-soiskammiolaitetta, joka salli molempien sekoitustilojen samanaikaisen mittauksen. Laite koottiin 2 cm osasta kollageenilla päällystettyä Gortex'ia, jota seurasi 2 cm 20 osat, joissa läpimitta oli laajennettu. Tätä laitetta käyttäen veritukoksen muodostus aloitettiin altistamalla luonnollinen verivirtaus kollageenilla päällystetyn Gor-tex'in osalle korkeassa sekoitusolosuhteessa. Tämä koemenetelmän osa simuloi valtimon kaltaisia olosuhteita. Kun 25 veri saavutti laajennetun läpimitan sisältävät matalan sekoituksen sisältävät osat, pyörreolosuhteet säilytettiin edelleen näin simuloiden laskimon veritukosta. Kontrolli-eläimillä akkumuloitui yhteensä 9,3 ± 2,3 x 108 ja 6,1 ± 0,5 x 108 verihiutaletta/cm 40 minuutissa korkean ja mata-30 lan sekoituksen sisältäville osille, vastaavassa järjes-tyksessä. Hirulog-8 inhiboi verihiutaleiden kerääntymisen sekä korkean että matalan sekoituksen sisältäviin osiin annoksesta riippuvaisella tavalla. 0,05 mg/kg/min annos inhiboi verihiutaleiden akkumulaatiota 42, 6-prosenttisesti 102183 83 matalassa sekoituksessa ja 29,O-prosenttisesti korkeassa sekoituksessa.

Esimerkki 41

Hirulog-8:n vertailu muihin hyytymän vastaisiin 5 aineisiin akuutin verihiutaleista riippuvaisen ve- ritukoksen synnyn inhiboimisessa

Tutkimme hepariinin, matalan molekyylipainon omaavan hepariinin ja rekombinanttihirudiinin vaikutuksia verihiutaleiden kerääntymiseen kollageenilla päällystetty 10 silikoniletku/paljastettu kammio-eteissivukytkentä paviaani -mallissa, joka on kuvattu esimerkissä 40.

Aiemmin on osoitettu, että hepariini annettuna 160 yksikköä/kg -kertainjektiona, jota seurasi infuusio 160 yksikköä/kg/tunti, inhiboi verihiutaleiden kerääntymistä 15 noin 80 % tasolle siitä, joka havaittiin suolaliuoksella käsitellyssä kontrollieläimessä. Matalan molekyylipainon omaava hepariini annettuna 53 anti-Xa yksikköä/kg -kerta-injektiona, jota seurasi infuusio 53 anti-Xa yksikköä/kg/ tunti, antoi samanlaiset tulokset (Y. Cadroy, "In Vivo 20 Mechanism of Thrombus Formation. Studies Using a Primate Model", väitöskirja, L'Universite Paul Sabatier de Toulouse (tieteet)(1989)). Samanalaisilla molaarisilla annoksilla (5 nmoolia/kg/min) rekombinanttihirudiini (A.B. Kelly et al., "Recombinant Hirudin Interruption of 25 Platelet-Dependent Thrombus Formation", Circulation, 78, sivu 11-311 (1988)) ja Hirulog-8 molemmat inhiboivat verihiutaleista riippuvaisen veritukoksen muodostuksen 60 -70-%:illa verrattuna kontrolliin. Nämä tulokset on kuvattu kuviossa 12. Muita trombiini-inhibiittoreita on aiemmin 30 testattu paviaanimallissa (A.B. Kelley et ai., "Comparison !. of Antithrombotic and Antihemostatic Effects Produced by

Antithrombins in Primate Models of Arterial Thrombosis", Thromb. and Hemostas., 62, sivu 42 (1989)). Näiden aineiden julkaistut ED50-annokset kollageenilla päällystetyille 84 102183 pinnoille kuin myös meidän EDS0-määrityksemme on vedetty yhteen alla olevassa taulukossa:

Aine EDjg 5 PPACK 75 nmoolia/kg/min

Gyki 14,451 500

Bentsamidiini 3000

Argipidiini (MD805) 550

Rekombinanttihirudiini < 5 10 Hirulog-8 < 5

Esimerkki 42

Hirulog-8:n vaikutus fibriinin kerääntymiseen

Mittasimme Hirulog-8:n vaikutuksen fibriinin (fib-15 rinogeenin) kerääntymiseen hyytymään, joka muodostettiin aortan, josta oli poistettu valtimon pehmentyneet osat, ja kollageenilla päällystetyn silikoniputken osille mallisysteemeissä, jotka on kuvattu esimerkissä 40. Fibriinin kerääntyminen määritettiin mittaamalla 125I-fibriini (fibrino-20 geeni) 30 vuorokautta yllä kuvatun mIn-verihiutalekokeen suorittamisen jälkeen. Tämä salli U1ln-leiman hajoamisen häiritsemättömälle tasolle.

Kuvio 13 osoittaa, että Hirulog-8:n poissaollessa 0,17 mg fibriiniä/cm kerääntyi kollageenilla päällystetyl-25 le letkulle, kun se oli altistettu 60 minuuttia verivir-ralle, kuten on kuvattu esimerkissä 40. Annokset 0,01 ja 0,04 mg/kg/min inhiboivat täydellisesti fibriinin (fibri-nogeenin) kerääntymisen. Samanlaiset tulokset saatiin mallissa, jossa aortasta oli poltettu valtimon pehmentyneet 30 osat. Nämä tulokset osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset trombiini-inhibiittorit ovat tehokkaita hyytymään liittyvän fibriinin (fibrinogeenin) kerääntymisen alentajina kuin myös blokeeraamaan akuutti verihiutaleista riippuvainen veritukoksen muodostus.

85 *102183

Esimerkki 43

Hirulog-8:n poistumisaikojen mittaus Käytimme paviaanimallia Hirulog-8:n poistumisaikojen määrittämiseksi laskimonsisäisen infuusion, laskimon-5 sisäisen kertainjektion ja ihonalaisen kertainjektion annon jälkeen. APTT-kokeita, jotka suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 11, käytettiin tarkkailtaessa poistu-misalkoja.

Annoimme vaihtelevia Hirulog-8 annoksia (0,002 -10 0,2 mg/kg/min) paviaaneille systeemisen laskimonsisäisen infuusion välityksellä 60 minuutin ajan. APTT mitattiin 60 minuutin infuusion jälkeen ja eri aikavälein sen jälkeen. Määritimme Hirulog-8:n poistumisen keskimääräisen puoliintumisajan olevan 9,2 ± 3,3 minuuttia.

15 Poistumisajan määrittämiseksi kertainjektion jäl keen injektoimme paviaanit Hirulog-8:n annoksella 1 mg/kg laskimonsisäisesti tai ihonalaisesti. APTT-mittaukset tehtiin eri aikavälein injektion jälkeen. Kuvio 14 osoittaa, että APTT kohosi huippuun 570 % kontrolliarvosta 2 minuu-20 tissa laskimonsisäisestä injektiosta. Hirulog-8:n puoliintumisaika laskimonsisäisen injektion jälkeen oli 14 minuuttia .

Kuvio 15 osoittaa, että aikaisemmassa aikapisteessä Hirulog-8:n ihonalaisen injektion jälkeen (se on 15 mi-; 25 nuuttia) APTT kohosi noin 200 % kontrollista. Poistuminen ihonalaista reittiä pitkin pidentyi puoliintumisaikaan 340 minuuttia. Ihonalaisesti annetun Hirulog-8:n havaittiin adsorboituvan kvantitatiivisesti.

Esimerkki 44 30 Hirulog-8:n vaikutus hajapesäkkeiseen suonensisäi- !. seen hyytymiseen paviaanimallissa

Indusoimme verenmyrkytyksen paviaaneissa injektoimalla tappavan annoksen eläviä E. coli -bakteereita menetelmällä, jonka ovat kuvanneet f.b. Taylor et ai., 35 Clin. Invest., 79, sivut 918 - 25 (1987). Hirulog-8 infu- 102183 86 soitiin annoksena 0,08 mg/kg/tunti alkaen 15 minuuttia ennen E. coll -bakteerien injektiota jatkaen 6 tuntia injektion jälkeen. Hirulog-8:n poissaollessa E. coli -bakteerien indusoima septinen sokki johti merkittävään alene-5 miseen neutrofiilien määrässä, verenpaineessa ja hemato-kriitissä. Kontrollieläimillä hematokriitin aleneminen oli 70 % perustasosta ja pudotus verenpaineessa 20-%:iin perustasosta 3 tunnin jälkeen. Hirulog-8:n anto heikensi täydellisesti hematokriitin putoamisen ja rajoitti veren-10 paineen huipun putoamisen 60-%:iin perustasosta.

Vaikka Hirulog-8 aiheutti heikentymisen DIC:ssä, E. coli -bakteerien tappavan annoksen infuusio johti silti kuolleisuuteen. Sekä kontrollieläinten että Hirulog-8 -käsiteltyjen eläinten ruumiinavaukset paljastivat massii-15 visen kudosturvotuksen molemmissa ryhmissä. Kuitenkin, ainoastaan kontrolliryhmällä oli suonensisäisiä hyytymiä. Ruumiinavausten tulokset osoittavat, että verenmyrkytyksen hyytymistä aiheuttavan vaiheen keskeyttäminen yksistään ei riitä estämään septisestä sokista johtuvaa kuolleisuutta. 20 Esimerkki 45 tPA:n ja Hirulog-8:n yhdistelmän vaikutus veritulpan liukenemiseen

Hirulog-8:n vaikutuksen määrittämiseksi tPA:n indusoiman veritulpan liukenemisen vahvistamisessa käytimme 25 rottamallia valtimon veritulpan liuottamisessa. Tässä mallissa muodostettiin kokeellinen hyytymä vatsa-aorttaan, jota seurasi pallokatetrin denudaatio ja korkean asteen (95 %) ahtauma. Jaoimme rotat umpimähkäisesti niin, että ne saivat tPA:n (1,0 mg/kg kerta-annos, jonka jälkeen an-30 nettiin infuusio 1,0 mg/kg/tunti) kanssa yhtä seuraavis-!. ta: suolaliuosta, hepariinia (10 yksikköä/kg kerta-annok sena, jonka jälkeen annettiin infuusio 1,5 yksikköä/kg/m-in), rekombinanttihirudiinia (1,0 mg/kg kerta-annos, jonka jälkeen annettiin infuusio 0,02 mg/kg/tunti) tai Hirulog-35 8:aa (0,6 mg/kg kerta-annos, jonka jälkeen annettiin in- 87 102183 fuusio 0,02 mg/kg/tunti). Hyytymisen vastaista ainetta tai suolaliuosta annettiin samanaikaisesti tPA:n kanssa ja 50 minuuttia lisää tPA-infuusion jälkeen.

Kuvio 16 kuvaa näiden kokeiden tulokset. Eläimillä, 5 joita käsiteltiin tPA + suolaliuoksella, oli uuteen läpivirtaukseen kulunut aika 16,2 minuuttia. Hepariini alensi uuteen läpivirtaukseen kuluvaa aikaa 12,2 minuuttiin, kun taas rekombinanttihirudiini alensi sen 13,0 minuuttiin. Kumpikaan näistä alenemisista ei ollut tilastollisesti 10 merkitsevä (p < 0,05). Hirulog-8:n yhdistäminen tPA:n kanssa alensi merkitsevästi uuteen läpivirtaukseen kulunutta aikaa 4,4 minuuttiin (p < 0,01) näin nopeuttaen tPA:n fibrinolyyttistä vaikutusta kertoimella 4.

Hepariini, hirudiini ja Hirulog-8 kaikki estivät 15 merkitsevästi uuden tukkeutuman synnyn verrattuna suolaliuoksella käsiteltyihin kontrolleihin (kuvio 17). Kukin näistä aineista myös pidensi APTT:tä arvoihin 600 %, 500 % ja 400 %, vastaavassa järjestyksessä, kontrolliarvoihin verrattuna (kuvio 18). Lopuksi, hepariini, hirudiini ja 20 Hirulog-8 kukin kohottivat suonen avautumiseen kulunutta aikaa arvoihin 80,2 %, 82 % ja 93,1 %, vastaavassa järjestyksessä (kontrolli = 43,6 %) (kuvio 19). Nämä tulokset osoittavat, että esillä olevan keksinnön mukaiset trombii-ni-inhibiittorit ovat ylivoimaisia muihin tunnettuihin 25 hyytymisen vastaisiin aineisiin verrattuina tPA:n tehokkuuden kohottamisessa.

Esimerkki 46

Hirulog-8:n ja muiden hyytymisen vastaisten aineiden vaikutus paviaanien verenvuotoaikoihin 30 Käytimme templaatin verenvuotoaikamittausta Hiru- log-8:n verenvuotoa tyrehdyttävien vaikutusten tutkimiseksi .

Vaihtelevia Hirulog-8:n annoksia (0,002 - 0,2 mg/ kg/min) analysoitiin niiden vaikutuksen suhteen verenvuo- 35 toaikaan. Annokset 0,002 - 0,04 mg/kg/min eivät aiheut- 88 102183 taneet mitään merkittävää kohoamista verenvuotoajoissa. Tämän kokeen tulokset on kuvattu kuviossa 20. Annoksella 0,1 mg/kg/min Hirulog-8 aiheuttaa kaksinkertaisen kohoamisen verenvuotoajassa kontrolliarvoihin verrattaessa. 5 Hirulog-8:n annoksella 0,2 mg/kg/min verenvuotoajat kohosivat 3-kertaisiksi kontrolliarvoihin verrattuina. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että ne annokset, joita tarvitaan inhiboimaan verihiutaleista riippuvainen hyytyminen (0,002 mg/kg/min; katso esimerkki 40) eivät aiheuta mer-10 kittävää vaikutusta verenvuotoa tyrehdyttävän tulpan muodostumiselle.

Testasimme myös useiden muiden aineiden vaikutukset templaatin verenvuotoaikään paviaanilla kuin myös systeemisiin hyytymisen vastaisiin vaikutuksiin (APTTillä mitat-15 tuina). Nämä tulokset on vedetty yhteen alla: APTT Verenvuoto-

Aine (% kontrollista) aika (min)

Hirulog-8 300,6 5,5 . 20 Rekombinantti- hirudiini 393,9 12,1 PPACK 287,9 12

Gyki 14,451 439,4 14

Bentsamidiini 757,6 10 25 Argipidiini (MD805) > 900 > 30

Hepariini 706,1 10

Esimerkki 47 Hirulog-34:n synteesi 30 Hirulog-34:n kaava on: H-(D-Phe)-Pro-Arg-( tetraety- • leeniglykolyylisukkinyyli)-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile- * .

Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Dekapeptidi Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu syntetisoidaan, kuten aiemmin on kuvattu ja jätetään kiinni resiiniin. Molekyylin loppu 89 102183 osa syntetisoidaan reaktiokaaviolla, joka on kuvattu ja selostettu alla:

BOC CD) Phi Pro Ne,N9- (Cbz^ArgCOH) + ho""'o 0H

5 | \_f \_f £lQ*C-N=N-COjEt

Ph3P

10 Λ „ r-\ r\ BOC (D) Phe Pro κΡ.Νβ- (Cbz)2Argv,o o ' 0 I 5 ^ ^ f CiPr)2NEt f /—)T i° BOC CD) Phe Pro Ne,NB- (Cbz)2ArgyO Λ/\0ί, o 20 | 25 o, DCC o ♦ r o ^

BOC (D) Phe Pro Ν',ν·- (CDZ^Arg^o __J

0 O

30 Ne-BOC- (D-Phe) -Pro-N9, N9- (Cbz) 2-Ärg

Yhdisteen Na-BOC-N9-(Cbz )2-Arg (Bachem, Inc., Torrance, CA) annetaan reagoida ylimäärän kanssa eetterissä olevaa diatsometaania ja sitten sitä käsitellään hapolla Na-BOC-ryhmän poistamiseksi. Tuloksena syntynyt tuote, 35 N3,N9-(Cbz )2-arginiinimetyyliesteri liuotetaan sitten 90 102183 DMF:ään, jäähdytetään jäähauteessa ja käsitellään, tässä järjestyksessä, 2 ekvivalentilla Na-BOC-proliinia, 1 ekvivalentilla butanolia, 1 ekvivalentilla EDCI:tä ja 1 ekvivalentilla di-isopropyylietyyliamiinia. Reaktioseosta se-5 koitetaan yli yön, sitten laimennetaan 5 tilavuudella kylmää vettä ja uutetaan etyyliasetaatilla. Orgaaninen faasi otetaan talteen ja pestään peräkkäin samalla tilavuudella kyllästettyä sitruunahappoa, kyllästettyä NaHC03:a ja kyllästettyä NaCl:ia. Sitten tuote kuivataan MgS04:n yllä ja 10 konsentroidaan in vacuo. Tuloksena syntynyttä dipeptidi-välimuotoa,Na-B0C-prolyyli-N9, N9-(Cbz )2-arginiinimetyylies-teriä, käsitellään 10-kertaisella molaarisella ylimäärällä 4 N HCl/dioksaani -liuosta 30 minuuttia. Vapaa HC1 poistetaan in vacuo ja jäännös liuotetaan vedettömään DMF:ään. 15 Sitten tuote jäähdytetään jäähauteessa ja sen annetaan reagoida 2 ekvivalentin kanssa yhdistettä N°-B0C-(D-Phe) butanolin, EDCI:n ja di-isopropyylietyyliamiinin läsnä ollessa, kuten yllä on kuvattu. Raaka ortogonaalisesti suojattu tripeptidi eristetään, kuten yllä on kuvattu, ja 20 puhdistetaan silikageelipylväässä eluoiden kloroformi: metanoli -liuoksella (95:5), joka sisältää 0,1 % NH4OH:ta. Sitten Na-BOC- (D) -fenyylialanyyliprolyyli-N9, N9- (Cbz )2- arginiinimetyyliesteri saippuoidaan 2 ekvivalentilla LiOH:ia metanoli:vesi -liuoksessa (2:1) huoneenlämpötilas-25 sa 3 tuntia. Metanoli poistetaan in vacuo ja vesipohjainen liuos pestään 2 tilavuudella dietyylieetteriä. Sitten liuos tehdään happamaksi pH 3:een kyllästetyllä sitruunahapolla. Tuloksena syntynyt raaka tripeptidin vapaa happo uutetaan etyyliasetaattiin. Orgaaninen faasi pestään 3 30 tilavuudella kyllästettyä NaCl:ia, kuivataan vedettömän

MgS04:n yllä ja konsentroidaan in vacuo. Tuloksena syntynyt Na-B0C-(D )-fenyylialanyylipropyyli-N9, N9- (Cbz )2-arginiini puhdistetaan käänteisfaasi-HPLC:llä olosuhteissa, jotka on kuvattu esimerkissä 4.

91 102183 N®-BOC- (D) -fenyylialanyyliprolyyli-N9, N9- (Cbz) 2-argi-niinitetraetyleeniglykoliesteri

Yllä olevan tripeptidin liuos liuotetaan THF:ään ja esterifloidaan 1,5 ekvivalentilla tetraetyleeniglykolia, 5 kun läsnä on 1 ekvivalentti dietyyliatsodikarboksylaattia ja trifenyylifosfiinia kumpaakin, kuten on kuvannut O. Mitsunobu, "The Use of DiethylAzodicarboxylate and Triph-enylphosphine in Synthesis and Transformation of Natural Products", Synthesis, sivut Xl - 28 (1981), jonka kuvaus 10 on liitetty tähän viitteeksi.

Na-BOC- (D) -fenyylialanyyliprolyyli-N9, N9- (Cbz)2-argi-niinitetraetyleeniglykolyylihemisukkinaatti Tuloksena syntynyt yhdiste liuotetaan DMF:ään ja esterifioidaan 1 ekvivalentilla sukkinyylianhydridiä, kun 15 läsnä on 1 ekvivalentti di-isopropyylietyyliamiinia. Haihtuvat liuottimet poistetaan ijn vacuo ja vapaa happo puhdistetaan käänteisfaasi-HPLC:llä olosuhteissa, jotka on kuvattu esimerkissä 4.

N“-B0C- (D)-fenyylialanyyliprolyyli-N9,N9-(Cbz) 2-argi-20 niinitetraetyleeniglykolyylihemisukkinaatin N-hyd- roksisukkinimidiesteri

Yllä olevan hapon liuos sekoitetaan 1 ekvivalentin kanssa N-hydroksisukkinimidiä DMF:ssä, jäähdytetään jää-hauteessa ja sekoitetaan 1 ekvivalentin kanssa DMF:ssä 25 olevaa DCC:tä, joka lisätään tipoittain. Reaktiota sekoi tetaan huoneenlämpötilassa 24 tuntia, suodatetaan saostuneen disykloheksyyliurean poistamiseksi ja konsentroidaan in vacuo. Sitten liuos konsentroidaan kylmällä bentsee-ni/heksaani -liuoksella saaden raaka peptidi-glykoli-kon-30 jugoitu N-hydroksisukkinimidiesteri.

Yllä olevan yhdisteen annetaan reagoida resiiniin sidotun dodekapeptidin kanssa, kuten on kuvattu esimerkissä 21. Tuloksena syntynyt Hirulog-34 irrotetaan resiinis-tä, puhdistetaan ja karakterisoidaan, kuten on esitetty 35 esimerkissä 4.

92 102183

Samalla, kun olemme tässä alemmin esittäneet useita tämän keksinnön mukaisia suoritustapoja, on ilmeistä, että perusmenetelmäämme voidaan muuttaa muiden sellaisten suoritustapojen saamiseksi, jotka käyttävät tämän keksinnön 5 mukaisia molekyylejä, kokoonpanoja, yhdistelmiä ja menetelmiä. Sen vuoksi on ymmärrettävä, että tämän keksinnön piiri määritetään tähän liitetyillä patenttivaatimuksilla mieluummin kuin spesifisillä suoritustavoilla, jotka on esitetty tässä aiemmin esimerkkien valossa.

Claims (19)

1. 93 1 02 1 83
2. 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen trombiini- inhibiittorin valmistamiseksi, joka sisältää: 5 a) katalyyttiseen kohtaan suunnatun osan, joka si toutuu trombiinin aktiiviseen kohtaan ja inhiboi sen; jolloin katalyyttiseen kohtaan suunnattu osa valitaan serii-niproteinaasi-inhibiittoreista, heterosyklisistä proteaa-si-inhibiittoreista, trombiinispesifisistä inhibiittoreis-10 ta, transitiotila-analogeista, bentsamidiinista, DAPA:sta, NAPAP:sta, argipidiinista tai osista, joilla on kaava X-A1-A2-A3-Y tai X-C^-Cj-Aj-Y, joissa kaavoissa X on vety tai sille on ominaista runkoketju, joka koostuu 1-35 atomista; Αλ on Arg, Lys tai Orn; A2 on ei-amidisidos; A3:lle on 15 ominaista runkoketju, joka koostuu, 1-9 atomista ja Y on sidos; Cx on Arg:n, Lys:n tai Orn:n johdannainen, joka sisältää karboksylaattiosan, joka on pelkistetty tai syrjäytetty α-hiilestä osalla, jolle on ominaista 1-10 atomin pituinen runkoketju; ja C2 on ei-katkaistava sidos 20 b) linkkeriosan, jolle on ominaista, että sillä on runkoketju, jonka laskettu pituus on välillä noin 18Ä ja noin 42Ä; ja c) anionia sitovaan rajakohtaan liittyvän osan, joka sitoutuu trombiinin anionia sitovaan rajakohtaan; 25 mainitun katalyyttiseen kohtaan suunnatun osan ollessa sitoutunut mainittuun linkkeriosaan ja mainitun linkkeriosan ollessa sitoutunut mainittuun anionia sitovaan rajakohtaan liittyvään osaan, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu 30 vaihe, jossa trombiini-inhibiittori syntetisoidaan kiin- teäfaasipeptidisynteesillä, liuosfaasisynteesillä, hete-rologisen/kiinteän faasin menetelmän yhdistelmällä tai näiden menetelmien yhdistelmällä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että anionia sitovan rajakohdan osan kaava on: 94 102183 W-B1-B2-B3-B4-B5-B6-B7-B8 - Z; jossa W on sidos; B3 on anioninen aminohappo; B2 on mikä tahansa aminohappo; B3 on Ile, Vai, Leu, Nle tai Phe; B4 on 5 Pro, Hyp, 3,4-dehydroPro, tiatsolidiini-4-karboksylaatti, Sar, mikä tahansa N-metyyliaminohappo tai D-Ala; B5 on anioninen aminohappo; B6 on anioninen aminohappo; B7 on lipofiilinen aminohappo, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha, Pro tai 10 dipeptidi, joka koostuu yhdestä näistä lipofiilisista ami nohapoista ja mistä tahansa muusta aminohaposta; B8 on sidos tai peptidi, joka sisältää yhdestä viiteen mitä tahansa aminohappotähdettä ja Z on karboksipään tähde, joka valitaan OH-, C1-C6-alkoksi-, amino-, mono- tai di-(C^-CJ -15 alkyylillä substituoidusta amino- tai bentsyyliaminoryh- mästä.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B3 on Glu; B2 on Glu; B3 on Ile; B4 on Pro; B5 on Glu; B6 on Glu; B7 on Tyr-Leu,
5. 20 Tyr (S03H)-Leu, Tyr (0S03H) -Leu tai (3 - , 5-di jodiTyr)-Leu; Ba on sidos; ja Z on OH.
6. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiini-inhibiittorin link-keriosan runkoketju sisältää minkä tahansa atomien yhdis- 25 telmän, jotka atomit valitaan ryhmästä, joka koostuu hii lestä, typestä, rikistä ja hapesta.
7. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että linkkeri sisältää aminohappo-sekvenssin : Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe.
8. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalyyttiseen kohtaan suunnattu osa sitoutuu reversiibelisti trombiiniin ja katkeaa hitaasti trombiinin välityksellä.
9. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että katalyyttiseen kohtaan suun- 102183 nattu osa sitoutuu reversiibelisti trombiiniin eikä sitä voida katkaista trombiinin välityksellä.
10. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalyyttiseen kohtaan suun- 5 nattu osa sitoutuu irreversiibelisti trombiiniin.
11. 9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalyyttiseen kohtaan suunnattu osa koostuu kaavasta X-A1-A2-A3-Y.
12. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että X on D-Phe-Pro; Ax on Arg ja A3 on D-Pro, Pro tai Sar.
13. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiini-inhibiittori valitaan ryhmästä, joka koostuu Hirulog-8:sta (H-)D-Phe)-Pro-
14. 15 Arg-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr- Leu-OH) ja Hirulog-12:sta (H-)D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr (0S03) -Leu-OH) .
15. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on N-asetyyli-Gly-Asp-Phe-
16. 2. Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val; A3 on Arg; ja A3 on Pro, trombiini-inhibiittorin ollessa Hirulog-33 (N-asetyyli-Gly-Asp-Phe-Ala-Glu- (Gly) 3-Val-Arg-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH).
17. 13. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että katalyyttiseen kohtaan suun nattu osa koostuu kaavasta X-C1-C2-A3-Y.
18. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiini-inhibiittori valitaan ryhmästä, joka koostuu Hirulog-18a:sta (H-(D-Phe)-
19. 30 Pro- (β-homoarginiini) - (Gly) S-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile- .* Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH ja Hirulog-18b:stä (H-(D-Phe)-Pro- (β-homoarginiini) - (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. 96 102183