CN101555274B - 一种多肽固相合成比法卢定粗品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)粗品的制备方法，所述的方法包括步骤：(1)将Fmoc-氨基酸树脂或Fmoc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；(2)在缩合剂的存在下，使带有Fmoc或Boc的氨基酸和树脂上的氨基酸或多肽进行缩合；(3)重复步骤(1)-(2)，得到如式II所示的多肽树脂；和(4)在切割剂的存在下，使多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定；所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)。<tables num="0001"><table><tgroup cols="2"><colspec colname="c001" colwidth="91%"/><colspec colname="c002" colwidth="9%"/><thead><row><entry> D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe- Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu</entry><entry>式I</entry></row></thead><tbody><row><entry> Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11- Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂</entry><entry>式II</entry></row></tbody></tgroup></table></tables>
Description
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及比法卢定(Bivalirudin)粗品的固相合成方法。
背景技术
在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上；在去保护剂的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过试剂活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。
凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药：通过凝血酶进行的蛋白水解过程是血液凝结控制的关键所在。抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭素(hirulog)”。水蛭素是一种获自吸血水蛭-医用水蛭Hirudo medicinalis的有效治疗性凝血酶肽抑制剂，其包含20个氨基酸。
US20070093423A公开了一种多肽固相合成比法卢定的方法，其采用固液相合成方法，其操作繁琐，使用的切割剂中含有酸性物质、乙二硫醇等物质。该方法的成本较高，产生的杂质多，产品纯度有限。
因此，本领域迫切需要提供一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低廉、得到的比法卢定纯度高，尤其可以去除HPLC主峰前杂质。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种多肽固相合成中的去保护剂。
本发明的再一个目的是提供一种去保护剂在多肽固相合成中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种五氟苯酚的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)的制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)将Fmoc-氨基酸树脂或Fmoc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；
(2)在缩合剂的存在下，使带有Fmoc或Boc的氨基酸和树脂上的氨基酸或多肽进行缩合；
(3)重复步骤(1)-(2)，得到如式II所示的多肽树脂；和
(4)在切割剂的存在下，使多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定；
所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；优选，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-8％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)
| D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu | 式I |
| Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂 | 式II |
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(1)将树脂或连接有氨基酸或多肽的树脂和保护氨基酸混合，形成Fmoc-氨基酸树脂或Fmoc-多肽树脂；优选，所述的树脂是Wang树脂；
(2)Fmoc-氨基酸树脂或Fmoc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；
(3)在缩合剂的存在下，使带有Fmoc或Boc的氨基酸和树脂上的氨基酸或多肽进行缩合；
(4)重复步骤(2)-(3)，得到如式II所示的多肽树脂；和
(5)在切割剂的存在下，使多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定；
所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；优选，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-8％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)
| D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu | 式I |
| Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂 | 式II |
在另一优选例中，所述的去保护剂含有5-15％哌啶和1-7％二环脒(DBU)；更佳地，所述去保护剂还含有选自下述的一种或多种物质：0.5-10％1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-5％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
在另一优选例中，步骤(1)和步骤(2)中所述的树脂上的氨基酸是亮氨酸；步骤(2)中所述带有Boc的氨基酸是Boc-D-Phe-OH。
在另一优选例中，步骤(2)中将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚以及缩合剂混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-OH和树脂上的多肽进行缩合。
在另一优选例中，步骤(2)中所述的缩合剂选自下述的一种或多种：N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基吗啉(NMM)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鏻六氟磷酸(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)。
在另一优选例中，步骤(4)中所述的切割剂中的各物质配比为95-60三氟乙酸(TFA)∶5-10三异丙基硅烷(TIS)∶5-30水。
在另一优选例中，所述切割液用冰水浴或其它致冷剂冷却至0±2℃。
在另一优选例中，所述的步骤(2)重复1-3次。
在本发明的第二方面，提供了一种多肽固相合成中的去保护剂，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；更佳地，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-10％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
在另一优选例中，所述的去保护剂中含有5-15％哌啶和1-7％二环脒(DBU)；更佳地，所述去保护剂还含有选自下述的一种或多种物质：0.5-10％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0.2-5％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
在本发明的第三方面，提供了一种去保护剂在多肽固相合成中的应用，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)，所述的多肽中含有-Asn-Gly-结构；更佳地，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-10％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
在本发明的第四方面，提供了一种五氟苯酚的用途，用于多肽固相合成中，将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和树脂上的氨基酸或多肽缩合的步骤。
在另一优选例中，所述步骤是：将1.5-6.0当量保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，以及1.5-6.0当量的缩合剂，和连接有氨基酸或多肽的树脂混合12-36小时；所述的缩合剂选自下述的一种或多种：N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鏻六氟磷酸(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-甲基吗啉(NMM)。
据此，本发明提供了一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低廉、得到的比法卢定纯度高，尤其可以去除HPLC主峰前杂质。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了在多肽固相合成比法卢定的过程中，如果使用含有DMF、哌啶、DBU、HOBt、HOOBT的去保护剂，可以使杂质最小化，尤其是DBU其对主峰前杂质的影响非常重要。
进一步地，发明人发现在多肽固相合成过程中，针对-Asn-Gly-结构，使用含有哌啶、DBU、HOOBT和HOBt中的一种或多种物质组成的保护剂尤其有效。
另外，发明人还发现，在多肽固相合成比法卢定的过程中，针对缩合步骤，可加入含有HOBt/DIC或TBTU/NMM的缩合剂，并且在缩合过程中进行监测；而针对缩合精氨酸(Arg)的步骤，其中还需含有五氟苯酚，可以有效降低成本。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表：
| Fmoc | 9芴甲氧羰基 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| KSCN | 硫氰化钾 |
| DBU | 二环脒(双脒类化合物) |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| DIC | N，N′-二异丙基碳二亚胺 |
| TBTU | 苯并三唑四甲基脲四氟硼酸 |
| NMM | N-甲基吗啉 |
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
| Opfp | 五氟苯酯 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三乙丙基硅烷 |
| MTBE | 甲基叔丁基醚 |
| HOOBT | 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮 |
| HATU | O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸 |
| TBTU | O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸 |
| PyBOP | (苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鏻六氟磷酸 |
如本文所用，“去保护剂”是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc；优选地，本发明的去保护剂含有以其总体积计，含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；优选，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-10％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
如本文所用，“缩合剂”是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，碳二亚胺、ByPOB、HATU、TBTU。
如本文所用，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。
在本发明的一个实例中，本发明多肽固相合成比法卢定的制备方法包括以下步骤：
第一步，将Fmoc-亮氨酸(Fmoc-Leu)键合到树脂上。所使用的树脂可以使本领域所熟知的，优选Wang树脂，更优选Wang树脂的替代率为1.0-1.4mmol/g。
第二步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团，即用本发明的去保护剂洗涤第一步所获得的Fmoc-Leu-树脂以去除Fmoc基团。
第三步，是将Fmoc-氨基酸和树脂上的氨基酸缩合，在本发明的一个优选例中，是将氨基酸根据式I所示的多肽自C端向N端逐一缩合，直至在树脂上键合有如式I所示的多肽。
第四步，在切割剂存在下，使多肽树脂上的如式I所示多肽和树脂分离，得到比法卢定。所述切割剂中含有TFA、TIS和水。
在本发明的一个优选例中，第一步中将1.8-3.0倍的Fmoc-Leu-OH和Wang树脂反应。
在本发明的一个优选例中，第三步是将1.5-4.5倍树脂当量的Fmoc-氨基酸，1.5-3.0倍树脂当量的HOBt用1mL/g树脂量的DMF溶解后排加入到树脂中，再加入2.0-6.0倍树脂当量的DIC或TBTU反应90钟后。将上述溶液在10℃下，再用DMF将上述溶液稀释至4mL/g树脂的体积，反应6小时。
在本发明的一个优选实施例中，第三步中有关Fmoc-Arg(Pbf)-OH的缩合步骤是这样进行的：1.5-6.0当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，用3毫升每克树脂量的DMF或KSCN溶解后，再加入1.5-6.0当量的缩合剂，如DIC或HATU或TBTU或PyBOP，搅拌90分钟，将上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到树脂中，搅拌反应12-36小时。
本发明通过上述四步得到的比法卢定，产率可以是90-125％，其纯度可以达到77-93％。在本发明的一个优选例中，还可以将第四步得到的比法卢定进行沉降，是将第四步得到的如式I的多肽和MTBE或乙醚混合，形成多肽沉淀；较佳地，是用冰水浴或本领域熟知的其它致冷剂将MTBE或乙醚冷却至零下10至0℃，用另一种醚洗涤、分离。将沉淀混合物过滤或离心分离沉淀，得到纯化的比法卢定，其纯度可达到90％或以上。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、大大节约成本：通过比较树脂、特殊氨基酸的合成等方面的传统工艺和本发明的工艺，可以降低成本约50％。
2、降低杂质，提高纯度：
现有技术中比伐卢定粗品中纯度约77-93％左右，其中主峰前杂质可控制在＜1％。
3、危险系数降低：
采用少量乙醚，大大提高了生产的安全性。乙醚闪点-45℃，沸点34.6℃，为极易燃化学物品。甲基叔丁基醚闪点-28℃，沸点55.3℃。
4、环保，产生废弃物少：
本发明的生产工艺完全为固相合成法，因此几乎为无水生产，洗涤用的有机溶剂可回收循环再利用，产生废弃物少。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明实施例中所用HPLC方法为：
本发明中比法卢定出峰时间约23.7分钟，主要杂质为23-23.3分钟。
实施例1
制备比法卢定1
步骤一：
Fmoc-亮氨酸键合步骤：2.0equivalent mol Fmoc-亮氨酸，经2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化与Wang树脂(替代率1.2-1.4mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应。
步骤二：
Fmoc脱除步骤：用15％哌啶/5％DBU的DMF溶液30分钟脱除Fmoc基团。再用DMF洗涤树脂1遍；甲醇洗涤树脂3遍；DMF洗涤树脂3遍。
Fmoc-氨基酸(Boc-D-Phe-OH最后一个氨基酸缩合)缩合步骤：2.0-3.0倍树脂当量的Fmoc-氨基酸，1.5倍树脂当量的HOBt用3mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入3.0倍树脂当量的DIC.反应90钟后，用茚三酮显色法(Kaiser)监控，控制温度到10oC，再用DMF将上述溶液稀释至4mL/g树脂的体积，反应6小时。
Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合步骤：1.5当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚用1毫升每克树脂量的DMF溶解后，再加入6.0当量的HATU，搅拌90分钟，将上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到树脂中，控制温度到5-8oC，搅拌反应48小时。用茚三酮显色法(Kaiser)监控.
合成完毕洗涤步骤：完成多肽序列的所有氨基酸缩合后，树脂用甲醇洗涤2遍，再用DMF洗涤3遍，最后用洗涤3遍。然后树脂在真空下干燥直至很重。最后包装好树脂，并根据树脂增重计算合成产率。
步骤三：
切割液配制：在一个合适大小的容器里将三氟乙酸(TFA)/三乙丙基硅烷(TIS)/水，按80∶10∶10(体积比)的配比混合，配制切割液。再将上述切割液用冰水浴或其它致冷剂冷却至0+2℃。
切割：将多肽树脂慢慢加入到冷却好的切割液中，维持混合液温度在5℃以下，在此温度下搅拌反应2-3小时。过滤分离混合液，收集所有滤液，去除树脂。
沉降：将甲基叔丁基醚(MTBE)冷却至-10℃，将过滤后多肽溶液加入其中形成多肽沉淀。将得到的固体沉淀用冷的乙醚洗涤3次。每次洗涤时，用足够覆盖离心袋或者过滤器中的固体沉淀的乙醚，并用刮铲混合固体沉淀和乙醚，然后再次用用离心机分离沉淀，得到比法卢定I。
产品干燥：将如式I所示的比法卢定I多肽固体转移到一个合适的容器中，在真空干燥箱或者干燥器中室温干燥6小时以上。称量多肽固体，并将其装入一个合适的容器。
产品纯度85％，主峰前杂质(保留时间23.2分钟)含量小于1％，最大单一杂质(保留时间26.3分钟)含量小于2.5％。
实施例2
制备比法卢定2
Fmoc-亮氨酸键合步骤：3.0equivalent mol Fmoc-亮氨酸经2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化与Wang树脂(替代率1.0-1.2mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应。树脂上未反应的基团由苯甲酰氯/三乙胺封闭。
步骤二：
Fmoc脱除步骤：用5倍树脂床层体积的10％哌啶/7％DBU/3％HOOBT的DMF溶液30分钟脱除Fmoc基团。再用5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂1遍；5倍树脂床层体积的甲醇洗涤树脂3遍；5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂3遍。
Fmoc-氨基酸(Boc-D-Phe-OH最后一个氨基酸缩合)缩合步骤：1.5-2.0倍树脂当量的Fmoc-氨基酸，3.0倍树脂当量的HOBt用5mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入3.0倍树脂当量的TBTU/NMM.反应90钟后，小时用茚三酮显色法(Kaiser)监控反应是否结束，继续反应。
Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合步骤：6.0当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚用4毫升每克树脂量的DMF溶解后，再加入1.5当量的DIC，搅拌90分钟，将上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到树脂中，搅拌反应18小时。
合成完毕洗涤步骤：完成多肽序列的所有氨基酸缩合后，树脂用5倍树脂体积的甲醇洗涤2遍，再用5倍体积的DMF洗涤3遍，最后用5倍树脂体积的甲醇洗涤3遍。然后树脂在真空下干燥直至很重。最后包装好树脂，并根据树脂增重计算合成产率。
步骤三：
切割液配制：在一个合适大小的容器里将三氟乙酸(TFA)/三乙丙基硅烷(TIS)/水，按90∶5∶5(体积比)的配比混合，配制切割液。再将上述切割液用冰水浴或其它致冷剂冷却至0+2℃。多肽树脂和切割液混合，维持混合液温度在5℃以下。反应2-3小时。过滤，收集所有滤液。
沉降：乙醚冷却至-10℃，将多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。用过滤或离心分离沉淀。将得到的固体沉淀用冷的甲基叔丁基醚洗涤3次。每次洗涤时，用足够覆盖离心袋或者过滤器中的固体沉淀的甲基叔丁基醚，并用刮铲混合固体沉淀和甲基叔丁基醚，然后再次用用离心机分离沉淀，得到比法卢定II。
产品干燥：将如式I所示的比法卢定多肽II固体转移到一个合适的容器中，在真空干燥箱或者干燥器中室温干燥6小时以上。称量多肽固体，并将其装入一个合适的容器。
产品纯度87％，主峰前杂质(保留时间23.5分钟)含量0.63％，最大单一杂质(保留时间27.1分钟)含量2.1％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (4)
1.一种多肽固相合成比法卢定（Bivalirudin）的制备方法，所述的方法包括步骤：
（1）将Fmoc-氨基酸树脂或Fmoc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；
（2）在缩合剂的存在下，使带有Fmoc或Boc的氨基酸和树脂上的氨基酸或多肽进行缩合；
（3）重复步骤（1）－（2），得到如式Ⅱ所示的多肽树脂；和
（4）在切割剂的存在下，使多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的比法卢定；
其特征在于，所述去保护剂以其总体积计，是5－15％哌啶和1－7％二环脒（DBU），是5－15％哌啶、1－7％二环脒（DBU）和2－5％3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮（HOOBT），或是5－15％哌啶、1－7％二环脒（DBU）和0.5－10％1－羟基苯并三唑（HOBt）；
步骤（2）中所述的缩合剂选自下述的一种或多种：N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）、O-（7-氮杂苯并三唑-1-基）-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸（HATU）、O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸（TBTU）/N-甲基吗啉（NMM）、（苯并三唑-1-基-氧）三吡咯烷鏻六氟磷酸（PyBOP）、1－羟基苯并三唑（HOBt）；
步骤（2）中所述使带有Fmoc或Boc的氨基酸是精氨酸时，将Fmoc-Arg（Pbf）-OH和五氟苯酚以及缩合剂混合，使Fmoc-Arg（Pbf）-OH和树脂上的多肽进行缩合；
步骤（4）中所述的切割剂中的各物质配比为95－60三氟乙酸（TFA）：5－10三异丙基硅烷（TIS）：5－30水；
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu 式Ⅰ
Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu) 式Ⅱ
Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)
19-Leu20-树脂
2.一种用于比法卢定多肽固相合成中的去保护剂，其特征在于，所述去保护剂以其总体积计，是5－15％哌啶和1－7％二环脒（DBU），是5－15％哌啶、1－7％二环脒（DBU）和2－5％3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮（HOOBT），或是5－15％哌啶、1－7％二环脒（DBU）和0.5－10％1－羟基苯并三唑（HOBt）。
3.一种去保护剂在比法卢定多肽固相合成中的应用，其特征在于，所述去保护剂以其总体积计，是5－15％哌啶和1－7％二环脒（DBU）、5－15％哌啶，是1－7％二环脒（DBU）和2－5％3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮（HOOBT），或是5－15％哌啶、1－7％二环脒（DBU）和0.5－10％1－羟基苯并三唑（HOBt）。
4.一种五氟苯酚的用途，其特征在于，用于比法卢定多肽固相合成中，将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和树脂上的氨基酸或多肽缩合的步骤；
所述步骤是：将1.5－6.0当量保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，以及1.5－6.0当量的缩合剂，和连接有氨基酸或多肽的树脂混合12－36小时；所述的缩合剂选自下述的一种或多种：N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）、O-（7-氮杂苯并三唑-1-基）-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸（HATU）、O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸（TBTU）、（苯并三唑-1-基-氧）三吡咯烷鏻六氟磷酸（PyBOP）、1－羟基苯并三唑（HOBt）、N-甲基吗啉（NMM）。
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