CN104558160B - 比伐芦定中间体的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了比伐芦定中间体的固相合成方法。本发明提供了肽树脂18的固相合成方法：步骤1，非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂17进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂17’；步骤2，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的肽树脂17’与Fmoc‑Arg(R2)‑OH进行缩合反应，得到肽树脂18；所述的非质子极性溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺、N‑甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂。本发明的方法可促进大位阻的氨基酸Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH顺利完成缩合反应，工艺简单、反应条件温和、转化率高、缩合率达到84%～100%、生产成本低、适合于大规模工业化生产。

Description

比伐芦定中间体的固相合成方法
技术领域
本发明涉及比伐芦定中间体的固相合成方法。
背景技术
凝血酶是胰蛋白酶样高度特异的丝氨酸蛋白酶，催化活性位点为作用于精氨酸残基的特异性袋状结构。除活性位点外，凝血酶上还有阴离子结合位点识别纤维蛋白原或肝素。凝血酶在生理止血过程中起核心作用。水蛭素是天然存在的活性最强的凝血酶抑制蛋白，由65个氨基酸组成，含硫酸化酪氨酸，和凝血酶通过二价结合形成特异紧密的1:1复合物。水蛭素由N-端含紧密核心结构域与C-端延展带负电结构域组成，C-端结构域识别阴离子结合位点后导致凝血酶发生微小的构象转换，随后N-端结构域与催化位点及邻近的非极性区域结合，将十肽环状结构挤出活性位点。
凝血酶活性位点抑制剂与阴离子结合位点抑制剂有协同效应，1990年Maraganore,Feton和Kline在美国专利US5196404中，据此设计了凝血酶二价抑制剂比伐芦定：H-D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Gly10-Asp11-Phe12-Glu13-Glu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19-Leu20-OH。C-端12肽为水蛭素片段，能够结合阴离子结合位点；N-端四肽D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4与活性位点结合；中间用四个连续的甘氨酸Gly5-Gly6-Gly7-Gly8连接。因其Arg3-Pro4会被凝血酶缓慢水解而游离出活性位点，故为可逆性二价凝血酶直接抑制剂。比伐芦定自2000年上市以来临床应用成长迅速，在美国的冠脉介入手术中已取代肝素成为主导用药(Nat.Rev.Drug Disc.2009;Vol8:353-354)。
比伐芦定是含20个氨基酸残基的多肽，固相、液相合成技术都被尝试用于比伐芦定的合成。液相合成的优点是每步中间产物的合成可以直接进行过程控制，并有机会得以纯化；缺点是工艺复杂，占用较多工时与人力，需要较多设备与场地。固相合成工艺简单，占用工时与人力较少，物料转移较少而节省设备与场地；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须优化各步反应条件使得转化率接近100%、而且尽可能避免副反应的发生。比伐芦定的合成中需要将体积庞大的保护精氨酸与Pro的亚氨基缩合，导致比伐芦定中Arg3-Pro4缩合不完全。这不利于工艺过程中反应终点的控制，也在合成产物中引入了杂质、增加了纯化难度。使用Fmoc-Arg(Pbf)-Opfp，Fmoc为9-芴甲氧羰基，Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基，Opfp为五氟苯酯，通过12小时以上的长时间反应能够改善缩合不完全问题。先合成二肽中间体为Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH，再用中间体进行缩合反应，来避开该缩合难点。也有人发现使用5.5-6.5倍过量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH有助于该缩合反应的进行。我们的实验表明增加投料量、延长反应时间、重复缩合并不能达到缩合完全。
针对固相合成工艺中Arg3-Pro4位点的缩合困难问题，有专利使用五氟苯酯Fmoc-Arg(Pbf)-Opfp来改善缩合不完全问题，但需要长达12小时的缩合反应。有专利使用二肽中间体Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH来回避缩合困难，但需要复杂工艺制备二肽中间体。有专利通过提高Fmoc-Arg(Pbf)-OH的投料量来推动反应，这样会增加物料成本，更重要的是该方法对Wang树脂效果不佳。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有比伐芦定固相合成工艺中，Arg3-Pro4位点的缩合困难、反应时间长、转化率低、收率低、反应工艺复杂、反应条件苛刻、生产成本高、不利于工业化生产等缺陷，而提供了比伐芦定中间体的固相合成方法。本发明的固相合成方法可促进大位阻的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行缩合反应，实现了比伐芦定的高载样量合成，缩合收率可达到84%～100%，反应工艺简单、反应条件温和、转化率高、收率高、生产成本低、适合于大规模工业化生产。
本发明提供了一种肽树脂18的固相合成方法，其包括以下步骤：
步骤1，在非质子极性溶剂中，将有机碱与与肽树脂17进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂17’；所述的肽树脂17为Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂17’为H-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
步骤2，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的肽树脂17’与Fmoc-Arg(R2)-OH进行缩合反应，得到肽树脂18；所述的肽树脂18为Fmoc-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
其中，R2为胍基保护基，所述的胍基保护基可以为本领域中对胍基进行保护的常规保护基，优选2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基或2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；R3为酰胺保护基，所述的酰胺基保护基可以为本领域中对酰胺基进行保护的常规保护基，优选三苯甲基、2,4,6-三甲氧基苄基或4-甲基三苯甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自独立的为羧基保护基，所述的羧基保护基可以为本领域中对羧基进行保护的常规保护基，优选叔丁基或金刚烷基；R9为酚羟基保护基，所述的酚羟基保护基可以为本领域中对酚羟基进行保护的常规保护基，优选叔丁基或2-氯三苯甲基；Leu-R10为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂与亮氨酸中的羧基缩合后的基团；所述的Trityl-Cl类型树脂优选2-氯三苯甲基树脂；所述的羟基类型树脂是指含有羟基的树脂，优选wang树脂。
在制备所述的肽树脂18的步骤1中，假设肽树脂17由具有具体摩尔量的起始原料完全转化得到，因此，制备过程中使用的各个试剂的用量均依据该具有具体摩尔量的起始原料计算得到。
在制备所述的肽树脂18的步骤1或步骤2中，所述的非质子极性溶剂优选酰胺类溶剂、酮类溶剂、亚砜类溶剂和卤代烃类溶剂中的一种或多种；所述的酰胺类溶剂优选N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)；所述的酮类溶剂优选N-甲基吡咯烷酮（NMP）；所述的亚砜类溶剂优选二甲基亚砜（DMSO）；所述的卤代烃类溶剂优选氯代烃类溶剂；所述的氯代烃类溶剂优选二氯甲烷；所述的非质子极性溶剂进一步优选酰胺类溶剂和/或酮类溶剂，酰胺类溶剂和/或亚砜类溶剂，酰胺类溶剂和/或卤代烃类溶剂，酮类溶剂和/或亚砜类溶剂，酰胺类溶剂、酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂，酰胺类溶剂、酮类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂，或者，酰胺类溶剂、亚砜类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂。所述的酰胺类溶剂和酮类溶剂的混合溶剂优选N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂优选N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜（DMSO）的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂优选N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）的混合溶剂；所述的酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂优选N-甲基吡咯烷酮（NMP）和二甲基亚砜（DMSO）的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂优选N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮（NMP）和二甲基亚砜（DMSO）的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂优选N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮（NMP）和二氯甲烷（DCM）的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂、亚砜类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂优选N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜（DMSO）和二氯甲烷（DCM）的混合溶剂。
当采用酰胺类溶剂和酮类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂与所述的酮类溶剂的体积比优选3:1～3:10；当采用酰胺类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂与所述的亚砜类溶剂的体积比优选3:1～3:10；当采用酰胺类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂与所述的卤代烃类溶剂的体积比优选3:1～3:10；当采用酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂时，所述的酮类溶剂与所述的亚砜类溶剂的体积比优选1:10～10:1；
当采用所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂、所述酮类溶剂和所述的亚砜类溶剂的体积比优选3：（1～10）：（1～10），进一步优选3：（1～5）：（1～5），再进一步优选3:1:1或3:1:2；当采用所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂、所述的酮类溶剂和所述的卤代烃类溶剂的体积比优选3：（1～10）：（1～10）；当采用所述的酰胺类溶剂、亚砜类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂、所述的亚砜类溶剂和所述的卤代烃类溶剂的体积比优选3：（1～10）：（1～10）。
在制备所述的肽树脂18的步骤1中，所述的溶剂与所述的肽树脂17的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～160:1。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤1中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常规有机碱，优选哌啶。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤1中，所述的有机碱与所述的肽树脂17的摩尔比优选10:1～50:1，进一步优选20:1～30:1。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤1中，所述的脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的温度，可以为本领域中该类脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常规温度，优选22℃～28℃。
在制备所述的肽树脂18的步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂17’的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～140:1。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合剂可以采用本领域中该类缩合反应中的常规缩合剂，优选N,N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合剂与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比优选1:1～1:3，进一步优选1:1～1:2。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的催化剂可以采用本领域中该类缩合反应中的常规催化剂，优选1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟基苯并三氮唑。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的催化剂与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比优选1:1～1:4，进一步优选1:2～1:3。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的肽树脂17’与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比优选1:1～1:5，进一步优选1:1～1:2。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合反应的温度可以采用本领域中该类缩合反应的常规温度，优选22℃～28℃。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法（如茚三酮检测显阴性和/或四氯苯醌检测显阴性）进行监控，反应时间优选1h～30h，进一步优选2h～26h。
在制备所述的肽树脂18的方法步骤2反应结束后，得到的产物还可以通过后处理步骤进行纯化。所述的后处理步骤采用的方法和条件可按本领域常规的此类反应的后处理步骤的方法和条件进行，一般包括如下步骤：将反应体系真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干即可。
本发明提供了一种比伐卢定中间体肽树脂C的固相合成方法，其包括以下步骤：步骤1，在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂A进行脱除芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂A’；
步骤2，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的肽树脂A’与保护的B进行缩合反应，得到肽树脂C即可；
所述的肽树脂A为肽树脂19、肽树脂18、肽树脂17、肽树脂16、肽树脂15、肽树脂14、肽树脂13、肽树脂12、肽树脂11、肽树脂10、肽树脂9、肽树脂8、肽树脂7、肽树脂6、肽树脂5、肽树脂4、肽树脂3、肽树脂2或肽树脂1；
所述的保护的氨基酸B为R1-D-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(R2)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(R3)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(R4)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(R5)-OH、Fmoc-Glu(R6)-OH、Fmoc-Il-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(R7)-OH、Fmoc-Glu(R8)-OH或Fmoc-Tyr(R9)-OH；
所述的肽树脂C为肽树脂20、肽树脂19、肽树脂18、肽树脂17、肽树脂16、肽树脂15、肽树脂14、肽树脂13、肽树脂12、肽树脂11、肽树脂10、肽树脂9、肽树脂8、肽树脂7、肽树脂6、肽树脂5、肽树脂4、肽树脂3或肽树脂2；
当肽树脂A为肽树脂19时，肽树脂A’为肽树脂19’，保护的氨基酸B为R1-D-Phe-OH，肽树脂C为肽树脂20；当肽树脂A为肽树脂18时，肽树脂A’为肽树脂18’，保护的氨基酸B为Fmoc-Pro-OH，肽树脂C为肽树脂19；当肽树脂A为肽树脂17时，肽树脂A’为肽树脂17’，保护的氨基酸B为Fmoc-Arg(R2)-OH，肽树脂C为肽树脂18；当肽树脂A为肽树脂16时，肽树脂A’为肽树脂16’，保护的氨基酸B为Fmoc-Pro-OH，肽树脂C为肽树脂17；当肽树脂A为肽树脂15时，肽树脂A’为肽树脂15’，B为Fmoc-Gly-OH，肽树脂C为肽树脂16；当肽树脂A为肽树脂14时，肽树脂A’为肽树脂14’，保护的氨基酸B为Fmoc-Gly-OH，肽树脂C为肽树脂15；当肽树脂A为肽树脂13时，肽树脂A’为肽树脂13’，B为Fmoc-Gly-OH，肽树脂C为肽树脂14；当肽树脂A为肽树脂12时，肽树脂A’为肽树脂12’，保护的氨基酸B为Fmoc-Gly-OH，肽树脂C为肽树脂13；当肽树脂A为肽树脂11时，肽树脂A’为肽树脂11’，保护的氨基酸B为Fmoc-Asn(R3)-OH，肽树脂C为肽树脂12；当肽树脂A为肽树脂10时，肽树脂A’为肽树脂10’，保护的氨基酸B为Fmoc-Gly-OH，肽树脂C为肽树脂11；当肽树脂A为肽树脂9时，肽树脂A’为肽树脂9’，保护的氨基酸B为Fmoc-Asp(R4)-OH，肽树脂C为肽树脂10；当肽树脂A为肽树脂8时，肽树脂A’为肽树脂8’，保护的氨基酸B为Fmoc-Phe-OH，肽树脂C为肽树脂9；当肽树脂A为肽树脂7时，肽树脂A’为肽树脂7’，保护的氨基酸B为Fmoc-Glu(R5)-OH，肽树脂C为肽树脂8；当肽树脂A为肽树脂6时，肽树脂A’为肽树脂6’，保护的氨基酸B为Fmoc-Glu(R6)-OH，肽树脂C为肽树脂7；当肽树脂A为肽树脂5时，肽树脂A’为肽树脂5’，保护的氨基酸B为Fmoc-Il-OH，肽树脂C为肽树脂6；当肽树脂A为肽树脂4时，肽树脂A’为肽树脂4’，保护的氨基酸B为Fmoc-Pro-OH，肽树脂C为肽树脂5；当肽树脂A为肽树脂3时，肽树脂A’为肽树脂3’，保护的氨基酸B为Fmoc-Glu(R7)-OH，肽树脂C为肽树脂4；当肽树脂A为肽树脂2时，肽树脂A’为肽树脂2’，保护的氨基酸B为Fmoc-Glu(R8)-OH，肽树脂C为肽树脂3；当肽树脂A为肽树脂1时，A’为肽树脂1’，保护的氨基酸B为Fmoc-Tyr(R9)-OH，肽树脂C为肽树脂2；优选当肽树脂A为肽树脂17时，肽树脂A’为肽树脂17’，保护的氨基酸B为Fmoc-Arg(R2)-OH，肽树脂C为肽树脂18；
所述的肽树脂20为R1-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂19为Fmoc-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂19’为H-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂18为Fmoc-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂18’为H-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂17为Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂17’为H-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂16为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的所述的肽树脂16’为H-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂15为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂15’为H-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂14为Fmoc-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂14’为H-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂13为Fmoc-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂13’为H-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂12为Fmoc-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂12’为H-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂11为Fmoc-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂11’为H-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂10为Fmoc-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂10’为H-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂9为Fmoc-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂9’为H-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂8为Fmoc-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂8’为H-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂7为Fmoc-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂7’为H-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂6为Fmoc-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂6’为H-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂5为Fmoc-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂5’为H-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂4为Fmoc-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂4’为H-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂3为Fmoc-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂3’为H-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂2为Fmoc-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂2’为H-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂1为Fmoc-Leu-R10；所述的肽树脂1’为H-Leu-R10；
其中，R1为氨基保护基，优选叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基或苄氧羰基；R2为胍基保护基，所述的胍基保护基可以为本领域中对胍基进行保护的常规保护基，优选2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基或2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；R3为酰胺保护基，所述的酰胺基保护基可以为本领域中对酰胺基进行保护的常规保护基，优选三苯甲基、2,4,6-三甲氧基苄基或4-甲基三苯甲基；R4、R5、R6、R7和R8各自独立的为羧基保护基，所述的羧基保护基可以为本领域中对羧基进行保护的常规保护基，优选叔丁基或金刚烷基；R9为酚羟基保护基，所述的酚羟基保护基可以为本领域中对酚羟基进行保护的常规保护基，优选叔丁基或2-氯三苯甲基；Leu-R10为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂中的羧基与亮氨酸的羧基缩合后的基团，所述的Trityl-Cl类型树脂优选2-氯三苯甲基树脂，所述的羟基类型树脂优选wang树脂。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤1或2中，所述的非质子极性溶剂同制备肽数脂18的步骤1或步骤2中所述。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤1中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂A的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～160:1。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤1中，所述的有机碱可以为该类脱除芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常规有机碱，优选哌啶。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤1中，所述的有机碱与所述的肽树脂A的摩尔比优选10:1～50:1，进一步优选20:1～30:1。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤1中，所述的脱除芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的温度可以为该类脱除芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常规温度，优选22℃～28℃。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂A’的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～140:1。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的缩合剂可以为本领域中该类缩合反应的常规缩合剂，优选N,N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的缩合剂与所述的B的摩尔比优选1:1～1:3，进一步优选1:1～1:2。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的催化剂可以为本领域中该类缩合反应的常规催化剂，优选1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟基苯并三氮唑。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的肽树脂A’与所述的B的摩尔比优选1:1～1:5，进一步优选1:1～1:2。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的催化剂与所述的B的摩尔比优选1:1～1:4，进一步优选1:2～1:3。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的缩合反应的温度可以为本领域中该类缩合反应的常规温度，优选22℃～28℃。
在比伐卢定中间体肽树脂的固相合成方法的步骤2中，所述的缩合反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法（如茚三酮检测显阴性和/或四氯苯醌检测显阴性）进行监控，反应时间优选1h～30h，进一步优选2h～26h。
在制备所述的比伐卢定中间体肽树脂C的方法中，所述的肽树脂1可以采用下述方法制得：在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂，存在的条件下，将Fmoc-Leu-OH与含羧基保护基的树脂进行缩合反应，得到肽树脂1即可；
其中，含羧基保护基的树脂的定义同上所述。
所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法可以为本领域中该类缩合反应的常规方法，本发明中特别优选以下反应方法和条件：
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的非质子极性溶剂同制备肽数脂18的步骤1或步骤2中所述。
在制备所述的肽树脂1的方法中，所述的非质子极性溶剂与所述的树脂R10的摩尔比优选50:1～200:1，进一步优选50:1～100:1。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的缩合剂优选N,N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的缩合剂与所述的树脂R10的摩尔比优选1:1～1:3，进一步优选1:1～1:2。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的催化剂优选1-羟基苯并三氮唑、6-氯-1-羟基苯并三氮唑和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的催化剂与所述的树脂R10的摩尔比优选1:1～1:4，进一步优选1:2～1:3。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的Fmoc-Leu-OH与所述的树脂R10的摩尔比优选1:1～3:1，进一步优选1:1～2:1。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的缩合反应的温度优选22℃～28℃。
在所述的比伐卢定中间体肽树脂1的固相合成方法中，所述的缩合反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法（如茚三酮检测显阴性和/或四氯苯醌检测显阴性）进行监控，反应时间优选1h～10h，进一步优选3h～6h。
本发明还提供了一种肽树脂19的固相合成方法，其包括以下步骤：
步骤1，按照上述方法制得肽树脂18；
步骤2，在非质子极性溶剂中，将有机碱与步骤1中制得的肽树脂18进行脱除精氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂18’；所述的肽树脂18为Fmoc-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂18’为H-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
步骤3，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤2中制得的肽树脂18’与Fmoc-Pro-OH进行缩合反应，得到肽树脂19；所述的肽树脂19为Fmoc-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；其中，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10的定义均同上所述。
在所述的肽树脂19的固相合成方法中步骤1的反应条件如前制备肽树脂18的反应条件所述。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤2或步骤3中，所述的非质子极性溶剂同制备所述的肽树脂18的步骤1或2中所述。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂18的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～160:1。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤2中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除精氨酸芴甲氧羰酰基保护基的反应的常规有机碱，优选哌啶。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤2中，所述的有机碱与所述的肽树脂18的摩尔比优选10:1～50:1，进一步优选20:1～30:1。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤2中，所述的脱除精氨酸芴甲氧羰酰基保护基的反应的温度可以为本领域中该类脱除精氨酸芴甲氧羰酰基保护基的反应的常规温度，优选22℃～28℃。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂18’的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～140:1。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的缩合剂可以为本领域中该类缩合的反应的常规缩合剂，优选N,N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的缩合剂与所述的Fmoc-Pro-OH的摩尔比优选1:1～1:3，进一步优选1:1～1:2。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的催化剂可以为本领域中该类缩合的反应的常规催化剂，优选1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟基苯并三氮唑。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的肽树脂18’与所述的Fmoc-Pro-OH的摩尔比优选1:1～1:5，进一步优选1:1～1:2。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的催化剂与所述的Fmoc-Pro-OH的摩尔比优选1:1～1:4，进一步优选1:2～1:3。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的缩合反应的温度可以为本领域中该类缩合反应的常规温度，优选22℃～28℃。
在所述的肽树脂19的固相合成方法步骤3中，所述的缩合反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法（如茚三酮检测显阴性和/或四氯苯醌检测显阴性）进行监控，反应时间优选1h～10h，进一步优选3h～6h。
本发明提供了一种保护比伐卢定20的固相合成方法，其包括以下步骤：
步骤1，按照所述的制备肽树脂19的方法制得所述的肽树脂19；
步骤2，在非质子极性溶剂中，将步骤1中制得的肽树脂19与有机碱进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂19’；所述的肽树脂19为Fmoc-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂19’为H-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
步骤3，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤2中制得的肽树脂19’与R1-D-Phe-OH进行缩合反应，得到保护比伐卢定20；所述的保护比伐卢定20为R1-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
其中，R1为氨基保护基，优选叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基或苄氧羰基；R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10的定义均同上所述。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法中步骤1的反应条件如前制备肽树脂19的反应条件所述。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤2或步骤3中，所述的非质子极性溶剂同制备所述的肽树脂18的步骤1或2中所述。
所述的保护比伐卢定20的固相合成方法的步骤2可以为本领域中该类脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常规方法，本发明中特别优选以下反应方法和条件：
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂19的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～160:1。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤2中，所述的有机碱优选哌啶。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤2中，所述的有机碱与所述的肽树脂19的摩尔比优选10:1～50:1，进一步优选20:1～30:1。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤2中，所述的脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的温度优选22℃～28℃。
所述的保护比伐卢定20的固相合成方法的步骤3可以为本领域中该类缩合的反应的常规方法，本发明中特别优选以下反应方法和条件：
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂19’的摩尔比优选100:1～200:1，进一步优选120:1～140:1。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的缩合剂优选N,N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的缩合剂与所述的R1-D-Phe-OH的摩尔比优选1:1～1:3，进一步优选1:2～1:3。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的催化剂优选1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟基苯并三氮唑。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的肽树脂19’与所述的R1-D-Phe-OH的摩尔比优选1:1～1:5，进一步优选1:1～1:2。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的催化剂与所述的R1-D-Phe-OH的摩尔比优选1:1～1:4，进一步优选1:2～1:3。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的缩合反应的温度优选22℃～28℃。
在制备所述的保护比伐卢定20的固相合成方法步骤3中，所述的缩合反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法（如茚三酮检测显阴性和/或四氯苯醌检测显阴性）进行监控，反应时间优选1h～5h，进一步优选2h～3h。
本发明还提供了一种比卢伐定的制备方法：步骤1，按照所述的制备保护比伐卢定20的方法制得保护比伐卢定20；步骤2，将步骤1制得的保护比伐卢定20加入到三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合试剂中，反应2-3小时，抽滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集比伐芦定粗品。粗肽经反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥得到纯品。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的固相合成方法可促进大位阻的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH顺利完成缩合反应，实现了比伐芦定的高载样量合成，反应工艺简单、反应条件温和、转化率高、收率高（收率比现有固相合成工艺提高4%～20%）、生产成本低、适合于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
在下列实施例中，实施例2～实施例20的反应原料肽树脂的投加量均是前一实施例所得的全部肽树脂，其中各个实施例中所用的其他试剂的投加量均依具有具体摩尔量的起始原料（Fmoc-Leu-Wang树脂，即肽树脂1）计算得到。
实施例1Fmoc-Leu-Wang树脂(肽树脂1)的制备
称量Wang树脂100g(100-200目，1.23mmol/g)，装入砂芯反应器，用1000mL DMF洗涤一次，抽干，再用1000mL二氯甲烷使树脂充分溶胀，抽干。加Fmoc-Leu-OH(184.5mmol)65.2g，1-羟基苯并三氮唑(123mmol)24.9g，N,N-二异丙基碳二亚胺(123mmol)29.0mL，500mL DMF，缓慢加入4-二甲氨基吡啶(24.6mmol)3.0g，将混合物在27℃搅拌5小时。真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加吡啶(1230mmol)99.0mL，醋酸酐(1230mmol)116.3mL，800mLDMF，将混合物在27℃搅拌3小时，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、甲醇依次洗涤，再用甲醇洗涤2遍。真空抽干至恒重。测得Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0.63mmol/g(Fmoc-Leu-Wang树脂总重131.3g，保护氨基酸总摩尔数82.7mmol)。
替代度检测方法：a.用1.5mL离心管称量3份10±1mg Fmoc-Phe-Wang树脂，各加入新配置的1mL20%哌啶/DMF震荡20分钟后，静置使树脂沉降。b.分别取a中100μL上清液转移至装有5mL DMF的3个试管中，混合均匀。c.取200μL新配置的20%哌啶/DMF转移至装有10mLDMF的试管中，混合均匀做空白对照。d.取b、c溶液于比色皿中，测样品吸光值A290nm，扣除空白值。e.替代度(Sub)的计算：Sub＝51×A290nm/(5.8×w)，单位：mmol/g,式中：A290nm为样品在290nm下的吸光值；w＝树脂的质量(mg)。f.3次替代度的计算值的平均值即为Fmoc-Phe-Wang树脂的替代度。
实施例2:Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂2)的制备
实施例1制得的Fmoc-Leu-Wang树脂(1)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Tyr(tBu)-OH(165.4mmol)76.0g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。tBu为叔丁基。
茚三酮检测方法：a.取约100粒树脂于检测试管中，用甲醇洗涤两遍，吸干甲醇。b.向试管中加入5%茚三酮/乙醇溶液、80%苯酚/乙醇溶液、重蒸吡啶各3滴，震荡混合后将试管置于105-110℃加热3分钟，观察试管中树脂的颜色。c.检测结果：树脂显深蓝色或深红色为阳性；树脂显淡蓝色或淡红色表明为偶联不完全；树脂显无色透明为阴性，表明偶联完全。
实施例3:Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂3)的制备
实施例2制得的肽树脂(2)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(165.4mmol)70.4g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在26℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。OtBu为叔丁酯。
实施例4:Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂4)的制备
实施例3制得的肽树脂(3)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(165.4mmol)70.4g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在26℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例5:Fmoc-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂5)的制备
实施例4制得的肽树脂(4)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(165.4mmol)55.8g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例6:Fmoc-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂6)的制备
实施例5制得的肽树脂(5)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Ile-OH(165.4mmol)58.5g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌5.5小时，茚三酮检测和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
四氯苯醌检测方法：a.取约100粒树脂于检测试管中，用DMF洗涤两遍，吸干甲醇。b.向试管中加入2%四氯苯醌/DMF溶液、2%乙醛/DMF溶液各3滴，震荡混合5分钟后，观察试管中树脂的颜色。c.检测结果：树脂显深绿色为呈阳性；树脂显淡蓝色或淡绿色表明为偶联不完全；树脂显无色透明为阴性，表明偶联完全。
实施例7:
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂7)的制备
实施例6制得的肽树脂(6)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(165.4mmol)70.4g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在26℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例8:
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂8)的制备
实施例7制得的肽树脂(7)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(165.4mmol)70.4g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例9:
Fmoc-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂9)的制备
实施例8制得的肽树脂(8)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Phe-OH(165.4mmol)64.1g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(165.4mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例10:
Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂10)的制备
实施例9制得的肽树脂(9)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Asp(OtBu)-OH(165.4mmol)68.1g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在24℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例11:
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂11)的制备
实施例10制得的肽树脂(10)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(165.4mmol)49.2g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例12:
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂12)的制备
实施例11制得的肽树脂(11)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Asn(Trt)-OH(165.4mmol)98.7g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。Trt为三苯甲基。
实施例13:
Fmoc-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂13)的制备
实施例12制得的肽树脂(12)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(165.4mmol)49.2g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例14:
Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂14)的制备
实施例13制得的肽树脂(13)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(165.4mmol)49.2g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例15:
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂15)的制备
实施例14制得的肽树脂(14)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(165.4mmol)49.2g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例16:
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂16)的制备
实施例15制得的肽树脂(15)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(165.4mmol)49.2g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例17:
Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂17)的制备
实施例16制得的肽树脂(16)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(165.4mmol)55.8g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例18-1(溶剂为DMF/N-甲基吡咯烷酮/二甲基亚砜，即DMF、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂):
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂18)的制备
实施例17制得的肽树脂(17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(165.4mmol)107.3g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF/N-甲基吡咯烷酮/二甲基亚砜(即DMF、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂，体积比为3:1:2)，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌3小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
实施例18-2（溶剂为DMF/N-甲基吡咯烷酮，即DMF和N-甲基吡咯烷酮的混合溶剂）:
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂18)的制备
实施例17制得的肽树脂(17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(165.4mmol)107.3g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF/N-甲基吡咯烷酮(即DMF和N-甲基吡咯烷酮的混合溶剂，体积比为1:1)，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌25小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈弱阳性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mL DMF，将混合物在27℃搅拌2小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干。Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
实施例18-3（溶剂为DMF/二甲基亚砜，即DMF和二甲基亚砜的混合溶剂）:Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂18)的制备
实施例17制得的肽树脂(17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(165.4mmol)107.3g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF/二甲亚砜(即DMF和二甲基亚砜的混合溶剂，体积比为5:3)，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌16.5小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈微弱阳性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mL DMF，将混合物在27℃搅拌1小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干。Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
实施例18-4（溶剂为DMF/二氯甲烷，即DMF和二氯甲烷的混合溶剂）:Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂18)的制备
实施例17制得的肽树脂(17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(165.4mmol)107.3g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF/二氯甲烷(即DMF和二氯甲烷的混合溶剂，体积比为5:4)，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌26小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈弱阳性，真空抽干。加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mLDMF，将混合物在27℃搅拌2小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干。甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
实施例19:
Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂19)的制备
实施例18制得的肽树脂(18)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(165.4mmol)55.8g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌3小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例20:
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂(肽树脂20)的制备
实施例19制得的肽树脂(19)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Boc-D-Phe-OH(165.4mmol)43.9g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL DMF，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，甲醇洗涤三次，真空抽干。真空干燥至恒重，得保护比伐芦定多肽树脂348.3g。Boc为叔丁氧羰基。
实施例21:
H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH（比伐芦定）的制备
按三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95:2.5:2.5（体积比）配制溶液2.5L，降温至4℃，在搅拌的情况下，将348.3g的肽树脂(20)加入到上述溶液中，26℃搅拌3小时。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，将比伐卢定粗品浓缩液加到0℃甲基叔丁基醚中沉淀，离心沉降收集到185.3g比伐芦定粗品，HPLC纯度为89%。将比伐芦定粗品用5%乙腈/水（体积比）溶解，配成15g/L，利用制备型高效液相在0.1%三氟乙酸/水（体积比）和0.1%三氟乙酸/乙腈（体积比）梯度洗脱，分部收集需要的组分并检测，将合格的组分经减压旋蒸浓缩并除乙腈，最后经冷冻干燥得HLPC纯度99.3%的比伐芦定三氟乙酸盐纯品。
实施例22：比伐芦定粗品、纯品HPLC检测方法，质谱鉴定方法及结果。
试验所得的粗品及纯品均按以下分析方法：
仪器：Waters2695
色谱柱：Diamonsil-C18,4.6*250mm,5μm；流速：1.0mL/min；检测波长：214nm
流动相A：20mM磷酸二氢钾水溶液(pH3.0)；流动相B：90%乙腈水溶液
时间/分钟 流动相A 流动相B
0 90 10
10 50 50
17 40 60
30 0 100
30.1 90 10
检测样品的HPLC纯度。比伐芦定粗品HPLC出峰时间为10.8分钟左右，比伐芦定纯品HPLC出峰时间为10.9分钟左右。
比伐芦定纯品采用如下条件：
仪器：Waters Q-TOF Premier
极性：正，电喷雾离子源
毛细管电压：3.0kV，采样锥电压：45V，碰撞能量：4eV
离子源温度：100℃，脱气温度：350℃，脱气速率：600l/hr
M/Z扫描范围：100～2000，扫描时间：0.3秒，趋势时间：0.02秒。
进行质谱鉴定，比伐芦定纯品：[M/2+H]+为1090.9966，样品的分子量为2180，与理论值相符。
实施例23：反应溶剂对Arg3-Pro4位点缩合的影响
以不同取代度的Fmoc-Leu-Wang树脂作为起始物料，通过本发明实施例描述方法合成至肽树脂(17)，在脱去Fmoc后与Fmoc-Arg(Pbf)-OH（165.4mml）107.3g缩合，缩合剂均为1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基碳二亚胺。Arg3-Pro4位点缩合率通过四氯苯醌检测判断或HPLC检测判断。
实施例23-1～实施例23-7的普遍合成方法如下：
（1）根据实施例1～实施例17的方法制备得到肽树脂17；
（2）实施例17制得的肽树脂(17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(165.4mmol)107.3g，1-羟基苯并三氮唑(330.8mmol)44.7g，800mL缩合反应溶剂，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(330.8mmol)51.8mL，将混合物在28℃搅拌，茚三酮和四氯苯醌检测均呈弱阳性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干；
（3）将上述（2）的得到的余留物进行后处理（当缩合反应溶剂为DMF、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂时，反应无需此步后处理）；
当缩合反应溶剂为DMF时，后处理包括如下步骤：加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mL DMF，将混合物在27℃搅拌3小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干；
当缩合反应溶剂为DMF/N-甲基吡咯烷酮时，后处理包括如下步骤：加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mL DMF，将混合物在27℃搅拌2小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干；
当缩合反应溶剂为DMF/二甲基亚砜时，后处理包括如下步骤：加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mL DMF，将混合物在27℃搅拌1小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干；
当缩合反应溶剂为DMF/二氯甲烷时，后处理包括如下步骤：加吡啶(165.4mmol)13.3.mL，醋酸酐(165.4mmol)15.6mL，800mL DMF，将混合物在27℃搅拌2小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干。甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干；
Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
上述普遍合成方法中，涉及的缩合反应溶剂、溶剂的比例，以及缩合反应的时间均参考下表数据。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种肽树脂18的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1，在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂17进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂17’；所述的肽树脂17为Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；所述的肽树脂17’为H-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
步骤2，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的肽树脂17’与Fmoc-Arg(R2)-OH进行缩合反应，得到肽树脂18；所述的肽树脂18为Fmoc-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-R10；
其中，R2为胍基保护基；R3为酰胺保护基；R4、R5、R6、R7和R8各自独立的为羧基保护基；R9为酚羟基保护基；Leu-R10为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂与亮氨酸中的羧基缩合后的基团；
步骤2中，所述的非质子极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂；所述的N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂中所述的N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮与二甲基亚砜的体积比为3：(1～5)：(1～5)；所述的缩合反应的温度为22℃～28℃。
2.如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：
所述的R2为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基或2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；
和/或，
所述的R3为三苯甲基、2,4,6-三甲氧基苄基或4-甲基三苯甲基；
和/或，
所述的R4、R5、R6、R7和R8各自独立的为叔丁基或金刚烷基；
和/或，
所述的R9为叔丁基或2-氯三苯甲基。
3.如权利要求2所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：
所述的Trityl-Cl类型树脂为2-氯三苯甲基树脂；所述的羟基类型树脂为wang树脂。
4.如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：
所述的N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜的混合溶剂中所述的N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮与二甲基亚砜的体积比为3：1：1或者3：1：2。
5.如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽树脂18的步骤1中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂17的摩尔比为100:1～200:1；
和/或，
在所述的肽树脂18的步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂17’的摩尔比为100:1～200:1。
6.如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽树脂18的步骤1中，所述的有机碱为哌啶；所述的有机碱与所述的肽树脂17的摩尔比为10:1～50:1；所述的脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的温度为22℃～28℃。
7.如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：
在所述的肽树脂18的步骤2中，所述的缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；所述的缩合剂与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比为1:1～1:3。
8.如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：在所 述的肽树脂18的步骤2中，所述的催化剂为1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟基苯并三氮唑；所述的催化剂与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比为1:1～1:4；所述的肽树脂17’与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比为1:1～1:5。
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