CN104177491A - 一种替莫瑞林的制备方法 - Google Patents
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-
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
本发明涉及一种制备替莫瑞林的方法,所述方法包括以下步骤:1).以一种树脂为载体,按照替莫瑞林顺序进行依次顺序偶联Fmoc-Leu-OH及其它保护氨基酸得到肽树脂A;2).分别采用固相合成方法合成全保护片段B1—Bn(n为满足2≤n<21的整数),所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分,且依次连接A、B1—Bn后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同;3).肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1—Bn和反式己烯酸,得到替莫瑞林肽树脂;4).裂解替莫瑞林肽树脂,得到粗肽。本发明制备替莫瑞林的方法易于操作、成本低、纯化简单,且所制备的替莫瑞林收率高。
Description
技术领域
本发明涉及替莫瑞林的制备方法,尤其涉及采用片段偶联固相合成替莫瑞林的方法。
背景技术
替莫瑞林具有如下结构:
trans-3-hexenoyl-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2。
它由人生长激素释放因子(GRF)的44个氨基酸序列组成,在其酪氨酸N端残基上附着3-己烯酰基。替莫瑞林是FDA批准的首个脂肪代谢障碍治疗药物,用于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者的脂肪代谢障碍的治疗,通常脂肪代谢障碍可导致背部和颈部疼痛,同时也可引起头痛和呼吸困难,其还会出现内脏脂肪组织蓄积的现象,而这个过程与心血管危险性增加相关。
《中国药物化学杂志》第21卷,第三期,2011年6月总101期报道了替莫瑞林的Fmoc固相合成方法,所用的固相载体为聚乙二醇树脂,由于聚乙二醇树脂来源稀缺,价格昂贵,该方法限制了替莫瑞林的大规模生产和使用。
中国专利CN102702343A采用了Rink Amide AM树脂或RinkAmide MBHA树脂作为固相载体,顺序偶联了整个肽序及反式3-己烯酸,然后将肽从树脂上裂解下来,通过HPLC纯化最终得到替莫瑞林。但是该顺序偶联长肽的方法存在杂质控制困难,纯化难度高,规模难以放大等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种节约生产成本,简化纯化难度,利于实现大规模生产的替莫瑞林合成方法,包括以下步骤:
1)以一种树脂为载体,按照替莫瑞林顺序进行依次顺序偶联Fmoc-Leu-OH及其它保护氨基酸得到肽树脂A;
2)分别采用固相合成方法合成全保护片段B1—Bn(n为满足2≤n<21的整数),所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分,且依次连接A、B1—Bn后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同;
3)肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1—Bn和反式3-己烯酸,得到替莫瑞林肽树脂;
4)裂解替莫瑞林肽树脂,得到粗肽。
优选地,本发明方法还包括纯化替莫瑞林的步骤。
本发明制备替莫瑞林的方法成本低、纯化难度小。
具体实施方式
对本发明中所用缩写及其含义说明如下:
本发明提供一种替莫瑞林的合成方法,包括以下步骤:
1)以一种树脂为载体,按照替莫瑞林顺序进行依次顺序偶联Fmoc-Leu-OH及其它保护氨基酸得到肽树脂A;
2)分别采用固相合成方法合成全保护片段B1—Bn(n为满足2≤n<21的整数),所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分,且依次连接A、B1—Bn后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同;
3)肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1—Bn和反式3-己烯酸,得到替莫瑞林肽树脂;
4)裂解替莫瑞林肽树脂,得到粗肽。
除非另有说明,所述各反应的压力优选为常压,也可在适当提高或降低的压力(例如0.01-1.5大气压)下进行;温度优选为室温(指20±5℃),也可在适当提高或降低的温度下(例如0-50℃)进行。
在步骤1)中,偶联氨基酸在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制,可为可实现此目的的任意固相反应柱。
优选地,在反应之前对氨基酸的羧基进行活化,活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIC。
所述的树脂无特别限定,只要其具有能与Fmoc-Leu-OH的羧基进行反应的活性位点且不与参与反应的氨基酸中的其他基团反应即可。所述树脂优选为氨基树脂,例如Rink Amide Resin、Rink Amide MBHAResin、Rink Amide AM Resin,所述Fmoc-Leu-OH树脂替代度为0.1-0.6mmol/g。
本发明所用Rink Amide Resin结构如下:
所用Rink Amide MBHA Resin结构如下:
所用Rink Amide AM Resin结构如下:
其中代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。
上述四种树脂均可商购得到(天津南开和成科技有限公司)或按文献已知的方法制备。
不具体限定肽树脂A的氨基酸个数,只要不引起片段A和片段B1—Bn消旋即可。在一个具体的实施方案中,片段肽树脂A为NH2-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-树脂,其偶联方法为:
(1)将所选树脂载体先进行Fmoc脱除、洗涤,然后加入到一个固相反应柱中,洗涤,并使树脂溶胀;之后,将Fmoc-Leu-OH溶解并活化后,加入上述柱中进行反应;反应完成后,得到一次偶联的肽树脂;
(2)将(1)中所得肽树脂加入到固相反应柱中,进行洗涤,并使树脂溶胀;脱除Fmoc,接着再次洗涤树脂,直至用检测剂检测到树脂显色为止;随后将第二个待偶联的物质Fmoc-Arg(pbf)-OH和偶联剂溶解并活化后,一起加入柱中,进行反应,待检测到树脂无色透明时,反应终止;
(3)按与(2)相同的操作重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照替莫瑞林主链肽序,依次完成偶联,最终得到肽树脂A。
其中在步骤(1)中,在氨基酸Fmoc-Leu-OH偶联至树脂载体上之后,还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤,以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物,以及除去所加入的封闭液的步骤。所加入的封闭液优选为乙酸酐和吡啶的混合物,其摩尔比为乙酸酐:吡啶=1:1。
偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行,优选DMF。
在偶联过程中(首次偶联Fmoc-Leu-OH除外),所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂,优选茚三酮。
在步骤(1)和(3)中的Fmoc脱除试剂可为可实现该目的的任何试剂,优选有机碱(例如哌啶)的溶液,更优选哌啶的DMF溶液,其浓度优选15%-25%,更优选18%-23%。
步骤2)所用的固相载体为酸敏感型树脂,在后续的裂解反应中可使片段从树脂上切除而不使氨基酸侧链保护基脱除。所使用的固相载体优选为CTC树脂,其结构如下:
优选地,在反应之前对氨基酸的羧基进行活化,活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA。
不具体限定肽树脂B1—Bn(n为满足2≤n<21的整数)片段的片段数及每个片段的氨基酸个数,只要不引起片段B1—Bn消旋,并且使每个片段溶解度良好即可。在一个具体的实施方案中,n=2,片段B1为
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH;
片段B2为
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH,它们分别通过以下方法合成:
(1)将所选树脂载体加入到一个固相反应柱中,洗涤,并使树脂溶胀;之后,将Fmoc-Gly-OH溶解并活化后,加入上述柱中进行反应;反应完成后,得到一次偶联的肽树脂;
(2)将(1)中所得肽树脂加入到固相反应柱中,进行洗涤,并使树脂溶胀;脱除Fmoc,接着再次洗涤树脂,直至用检测剂检测到树脂显色为止;随后将第二个待偶联的物质(Fmoc-Gln(Trt)-OH或Fmoc-Leu-OH)和偶联剂溶解并活化后,一起加入柱中,进行反应,待检测到树脂无色透明时,反应终止;
(3)按与(2)相同的操作重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照替莫瑞林主链肽序,依次完成偶联,最终得到肽树脂B1或B2;
(4)向(3)的肽树脂中加入裂解试剂,待反应完成后,分离得到肽片段B1或B2。
其中在步骤(1)中,在氨基酸Fmoc-Gly-OH偶联至树脂载体上之后,还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤,以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物,以及除去所加入的封闭液的步骤。当所述树脂载体为CTC树脂时,所加入的封闭液优选为甲醇。
偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行,优选DMF。
在偶联过程中(首次偶联Fmoc-Gly-OH除外),所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂,优选茚三酮。
脱除Fmoc的试剂可为可实现该目的的任何试剂,优选20%的哌啶/DMF溶液,即哌啶:DMF(体积比)为1:4的混合试剂。
裂解试剂可为实现该目的的任何试剂,优选TFE与DCM的混合液或TFA与DCM的混合液,优选TFE:DCM=1:5-1:3(v/v),或TFA:DCM=1:99-1:3(v/v),更优选TFE:DCM=1:4(v/v),或TFA:DCM=1:100-1:19(v/v)。
在步骤3)中,
(1)将片段树脂A加入到固相反应柱中,洗涤,并使树脂溶胀;之后,将片段B1和偶联剂溶解并使片段B1活化后,加入上述柱中进行反应;检测反应完成后,脱除Fmoc保护,洗涤并干燥肽树脂;
(2)将(1)的肽树脂加入固相反应柱中,重复上述步骤偶联片段直至将所有片段偶联完全;
(3)将(2)的肽树脂加入固相反应柱中,洗涤,并使树脂溶胀;将适量的反式3-己烯酸和偶联剂溶解并使反式3-己烯酸活化后,加入上述柱中进行反应;检测反应完成后,脱除Fmoc保护,洗涤并干燥肽树脂得到替莫瑞林肽树脂。
在偶联过程中,所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂,优选茚三酮。所述偶联剂可为可实现此目的的任何试剂,在(1)和(2)中,所述偶联剂优选HATU/HOAt/DIPEA;在(3)中,所述偶联剂优选HATU/HOAt/DIPEA、PyBOP/HOBt/DIPEA或DIC/HOAt。
优选在每次偶联完片段B1—Bn后用溶剂(优选甲醇)收缩树脂再进行干燥。
步骤4)中,向替莫瑞林肽树脂中裂解试剂,反应完成后,分离(例如过滤)得到替莫瑞林粗肽。
所述裂解试剂为可实现这一目的的任何试剂,优选一定比例的TFA/PhSMe/EDT/TIS/H2O,所述比例可为TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O=80-100:0-2:0-3:0-5:0-5。
优选地,制备替莫瑞林的方法还包括纯化替莫瑞林的步骤。纯化可优选采用HPLC等方法进行。
在本发明中所述的替莫瑞林不仅包括游离形式的替莫瑞林,还包括其药学上可接受的盐,在一个具体的实施方案中,所述盐为乙酸盐。
本发明主要采用了片段偶联固相合成方法来制备替莫瑞林,且制备中各步骤均可在室温和常压下进行,使得该方法易于操作、成本低、纯化简单,且所制备的替莫瑞林收率高。
以下参照实施例详细描述本发明,应理解,下述实施例意在说明,不对本发明构成限制。
实施例1:替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Leu-氨基树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide resin400g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20%哌啶/DMF)脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。称取88.4g Fmoc-Leu-OH(250mmol)和40.5g HOBt(300mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液,冰水浴下加入46.9mlDIC(300mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应2小时。用DMF洗涤3次,加入1395.1ml封闭液(吡啶/乙酸酐=1:1,8mol:8mol)封闭8小时(树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂)。用DMF洗涤4次,DCM洗4次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Leu-Rink Amide树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.512mmol/g。
以替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-MBHA resin400g为原料,采用以上相同的方法,得到Fmoc-Leu-Rink Amide-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.502mmol/g。
以替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-AM resin400g为原料,采用以上相同的方法,得到Fmoc-Leu-Rink Amide-AM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.509mmol/g。
实施例2:替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Leu-氨基树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide resin400g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20%哌啶/DMF)脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。称取35.3g Fmoc-Leu-OH(100mmol)和16.2g HOBt(120mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液,冰水浴下加入18.8mlDIC(120mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应2小时。用DMF洗涤3次,加入1395.1ml封闭液(吡啶/乙酸酐=1:1,8mol:8mol)封闭8小时(树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂)。用DMF洗涤4次,DCM洗4次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Leu-Rink Amide树脂。检测替代度为0.201mmol/g。
以替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-MBHA resin400g为原料,采用以上相同的方法,得到Fmoc-Leu-Rink Amide-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.205mmol/g。
以替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-AM resin400g为原料,采用以上相同的方法,得到Fmoc-Leu-Rink Amide-AM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.210mmol/g。
实施例3:替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Leu-氨基树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide resin400g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20%哌啶/DMF)脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。称取53.0g Fmoc-Leu-OH(150mmol)和24.3g HOBt(180mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液,冰水浴下加入28.1mlDIC(180mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应2小时。用DMF洗涤3次,加入1395.1ml封闭液(吡啶/乙酸酐=1:1,8mol:8mol)封闭8小时(树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂)。用DMF洗涤4次,DCM洗4次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Leu-Rink Amideresin树脂。检测替代度为0.308mmol/g。
以替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-MBHA resin400g为原料,采用以上相同的方法,得到Fmoc-Leu-Rink Amide-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.307mmol/g。
以替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-AM resin400g为原料,采用以上相同的方法,得到Fmoc-Leu-Rink Amide-AM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.302mmol/g。
实施例4:
NH2-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂的制备
称取实施例3中替代度为0.308mmol/g的Fmoc-Leu-Rink Amide氨基树脂324.7g(100mmol),加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20%哌啶/DMF)脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。取194.6gFmoc-Arg(pbf)-OH(300mmol),48.6g HOBt(360mmol),溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液,冰水浴下加入56.3ml DIC(360mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照替莫瑞林主链肽序,从C端到N端依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶联,反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到NH2-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-Rink Amide氨基肽树脂559.1g。
实施例5:替代度为0.6mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂600g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。称取115.8gFmoc-Gly-OH(390mmol)溶于DMF溶液中,冰水浴下加入135.6mlDIPEA(780mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应5min后再次加入67.8mlDIPEA(390mmol)。室温反应60min。用DMF洗涤3次,加入315.9ml封闭液(甲醇:7.8mol)封闭30min(树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂)。用DMF洗涤6次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Gly-CTC树脂。检测替代度为0.613mmol/g。
实施例6:替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂600g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。称取62.4gFmoc-Gly-OH(210mmol)溶于DMF溶液中,冰水浴下加入73.0mlDIPEA(420mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应5min后再次加入36.5mlDIPEA(210mmol)。室温反应60min。用DMF洗涤3次,加入315.9ml封闭液(甲醇:7.8mol)封闭30min(树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂)。用DMF洗涤6次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Gly-CTC树脂。检测替代度为0.298mmol/g。
实施例7:替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂600g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。称取98.1gFmoc-Gly-OH(330mmol)溶于DMF溶液中,冰水浴下加入114.7mlDIPEA(660mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应5min后再次加入57.4mlDIPEA(330mmol)。室温反应60min。用DMF洗涤3次,加入315.9ml封闭液(甲醇:7.8mol)封闭30min(树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂)。用DMF洗涤6次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Gly-CTC树脂678.9g。检测替代度为0.507mmol/g。
实施例8:
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-CTC肽树脂的制备
称取实施例7中替代度为0.507mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂591.7g(300mmol),加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20%哌啶/DMF)脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。取549.6g Fmoc-Gln(Trt)-OH(900mmol),145.9g HOBt(1080mmol),溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液,冰水浴下加入168.8ml DIC(1080mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照替莫瑞林主链肽序,从C端到N端依次完成Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶联,最后的Gln偶联完毕后不需要进行Fmoc脱除,反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-CTC肽树脂1528.6g。
实施例9:
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-CTC肽树脂的制备
重复实施例7的步骤获得替代度为0.507mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂,称取该树脂591.7g(300mmol),加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20%哌啶/DMF)脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。取345.1gFmoc-Leu-OH(900mmol),145.9g HOBt(1080mmol),溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液,冰水浴下加入168.8ml DIC(1080mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照替莫瑞林主链肽序,从C端到N端依次完成Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH的偶联,最后的Tyr偶联完毕后不需要进行Fmoc脱除,反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-CTC肽树脂1287.9g。
实施例10:
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH全保护肽片段的制备
将实施例8中的肽树脂片段1528.6g置于裂解反应瓶中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE:DCM=20:80(V/V)),室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即粗肽片段
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH,共计1159.2g,重量收率(实际重量/理论重量)为97.7%。HPLC纯度为95.1%。
实施例11:
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH全保护肽片段的制备
重复实施例8的步骤获得肽树脂片段,称取1528.6g置于裂解反应瓶中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA:DCM=1:99(V/V)),室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即粗肽片段
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH,共计1173.6g,重量收率为99.0%。HPLC纯度为96.0%。
实施例12:
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH全保护肽片段的制备
重复实施例8的步骤获得肽树脂片段,称取1528.6g置于裂解反应瓶中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA:DCM=3:97(V/V)),室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即粗肽片段
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH,共计1168.2g,重量收率为98.5%。HPLC纯度为95.7%。
实施例13:
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH全保护肽片段的制备
将实施例9中的肽树脂片段置于裂解反应瓶中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA:DCM=5:95(V/V)),室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即粗肽片段
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH,共计820.8g,重量收率为96.7%。HPLC纯度为97.5%。
实施例14:
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH全保护肽片段的制备
重复实施例9的步骤获得肽树脂片段,称取1287.9g置于裂解反应瓶中,将实施例九中的肽树脂片段置于裂解反应瓶中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE:DCM=20:80(V/V)),室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即粗肽片段
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH,共计813.6,重量收率为95.8%。HPLC纯度为96.3%。
实施例15:
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH全保护肽片段的制备
重复实施例9的步骤获得肽树脂片段,称取1287.9g置于裂解反应瓶中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE:DCM=4:96(V/V)),室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即粗肽片段
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH,共计809.4g,重量收率为95.3%。HPLC纯度为97.1%。
实施例16:
NH2-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂的制备
称取实施例4中NH2-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂503.2g(90mmol),加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。取1067.3g粗肽片段
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH(270mmol),102.7g HATU(270mmol),44.1g HOAt(324mmol),溶于体积比为9:1的DMF和DMSO混合溶液,冰水浴下加入93.9mlDIPEA(540mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应5小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。脱除Fmoc保护,用DMF洗涤树脂8次。反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到
NH2-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂752.7g。
实施例17:
NH2-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂的制备
将实施例16中的肽树脂加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。取764.1g粗肽片段
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH(270mmol),102.7gHATU(270mmol),44.1g HOAt(324mmol),溶于体积比为9:1的DMF和DMSO混合溶液,冰水浴下加入93.9mlDIPEA(540mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应8小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。脱除Fmoc保护,用DMF洗涤树脂8次。反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到
NH2-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂912.8g。
实施例18:
Trans-3-hexenoyl-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂的制备
称取912.8g实施例17中肽树脂加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。取44.1g反式己烯酸(270mmol),102.7g HATU(270mmol),44.1g HOAt(324mmol),溶于DMF溶液,冰水浴下加入93.9mlDIPEA(540mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应1小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。脱除Fmoc保护,用DMF洗涤树脂8次。反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到替莫瑞林肽树脂920.6g
实施例19:
Trans-3-hexenoyl-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂的制备
重复实施例17的反应得到目标树脂,称取912.8g该肽树脂加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。取44.1g反式己烯酸(270mmol),140.5g PyBOP(270mmol),43.8g HOBt(324mmol),溶于DMF溶液,冰水浴下加入93.9mlDIPEA(540mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应1小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。脱除Fmoc保护,用DMF洗涤树脂8次。反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到替莫瑞林肽树脂919.5g
实施例20:
Trans-3-hexenoyl-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-氨基肽树脂的制备
重复实施例17的反应得到目标树脂,称取912.8g该肽树脂加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟。取44.1g反式己烯酸(270mmol),43.8g HOBt(324mmol),溶于DMF溶液,冰水浴下加入50.7mlDIC(324mmol)活化3min后加入固相反应柱中,室温反应1小时。以茚三酮法检测判断反应终点,如果树脂无色透明,则表示反应完全;树脂显色,则表示反应不完全,需再偶联反应1小时,此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。脱除Fmoc保护,用DMF洗涤树脂8次。反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到替莫瑞林肽树脂918.6g。
实施例21:替莫瑞林粗肽的制备
取实施例18中制备的肽树脂置于裂解反应其中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA:苯甲硫醚:EDT:TIS:水=86:5:5:3:1(V/V)),室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量TFA洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即替莫瑞林粗肽430.5g,粗肽重量收率为93.1%,HPLC纯度为56.9%。
实施例22:替莫瑞林粗肽的制备
取实施例20中制备的肽树脂置于裂解反应其中,以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA:苯甲硫醚:EDT:TIS:水=86:5:5:3:1(V/V)),室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量TFA洗涤3次,合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即替莫瑞林粗肽441.5g,粗肽重量收率为95.5%,HPLC纯度为54.2%。
实施例23:替莫瑞林精肽乙酸盐的制备
称取实施例21中的替莫瑞林粗肽40.0g用4000ml水溶解后,采用Waters2545RP-HPLC系统,波长230nm,色谱柱为50×250mm反相C18柱,常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化,收集目的峰馏分,得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统,色谱柱为50×250mm反相C18柱,0.1%乙酸溶液/乙腈流动相转盐,收集目的峰馏分,旋转蒸发浓缩,冻干得到替莫瑞林乙酸盐精肽6.5g,计算总收率15.1%,RP-HPLC纯度为98.71%
实施例24:替莫瑞林精肽乙酸盐的制备
称取实施例22中任意40.0g替度鲁肽粗肽用4000ml水溶解后,采用Waters2545RP-HPLC系统,波长230nm,色谱柱为50×250mm反相C18柱,常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化,收集目的峰馏分,得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统,色谱柱为50×250mm反相C18柱,0.1%乙酸溶液/乙腈流动相转盐,收集目的峰馏分,旋转蒸发浓缩,冻干得到替莫瑞林乙酸盐精肽6.3g,计算总收率15.0%,RP-HPLC纯度为98.85%。
Claims (9)
1.一种制备替莫瑞林的方法,所述方法包括以下步骤:
1).以一种树脂为载体,按照替莫瑞林顺序依次顺序偶联Fmoc-Leu-OH及其它保护氨基酸得到肽树脂A;
2).分别采用固相合成方法合成全保护片段B1—Bn(n为满足2≤n<21的整数),所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分,且依次连接A、B1—Bn后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同;
3).肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1—Bn和反式3-己烯酸,得到替莫瑞林肽树脂;
4).裂解替莫瑞林肽树脂,得到粗肽。
2.权利要求1的方法,还包括纯化替莫瑞林的步骤,纯化优选通过HPLC方法进行。
3.权利要求1的方法,其中所述偶联在固相反应柱中进行;且其中各步骤均在室温和常压下进行。
4.权利要求1的方法,其中1)中所述树脂载体为氨基树脂,优选Rink Amide Resin、Rink Amide MBHA Resin、Rink Amide AM Resin,偶联首个氨基酸后的树脂替代度为0.1-0.6mmol/g;2)中所述树脂优选为CTC树脂,偶联首个氨基酸后的树脂替代度为0.2-0.7mmol/g。
5.权利要求1的方法,其中3)中需先脱除Fmoc再进行下一片段的偶联,所用的Fmoc脱除试剂为TFE与DCM的混合液或TFA与DCM的混合液,优选TFE:DCM=1:5-1:3(v/v),或TFA:DCM=1:99-1:3(v/v),更优选TFE:DCM=1:4(v/v),或TFA:DCM=1:100-1:19(v/v);4)中所用的裂解试剂为TFA、PhSMe、EDT、TIS和H2O的混合物,它们的体积比顺序地为80-100:0-2:0-3:0-5:0-5,优选86:5:5:3:1。
6.权利要求4的方法,其中所述氨基树脂在偶联首个氨基酸之前先进行Fmoc脱除,Fmoc脱除试剂优选有机碱(例如哌啶)的溶液,更优选哌啶的DMF溶液,其浓度优选15%-25%,更优选18%-23%。
7.权利要求1的方法,优选地,在每次偶联之前,将待偶联的每种物质中的羧基进行活化,活化在冰水浴中进行;活化剂优选为DIPEA或DIC。
8.权利要求1的方法,其中3)的偶联在偶联剂的存在下进行,当偶联肽片段B1—Bn时,使用的偶联剂优选为HATU/HOAt/DIPEA;当最后偶联反式3-己烯酸时,使用的偶联剂优选为HATU/HOAt/DIPEA、PyBOP/HOBt/DIPEA或DIC/HOAt。
9.权利要求1的方法,其中所述肽树脂A为:
NH2-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Arg(pbf)-Leu-树脂;片段B1为:
Fmoc-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-OH;
片段B2为:
Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-OH。
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