CN102816208B - 一种比伐卢定的液相合成方法 - Google Patents
一种比伐卢定的液相合成方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种比伐卢定的液相合成方法。首先合成四个全保护的片段，然后将这四个片段依次缩合得到全保护的比伐卢定，最后脱除所有保护基团得到比伐卢定粗品，再经过高效液相色谱纯化，得到比伐卢定纯品。该方法不需要树脂和大过量的保护氨基酸及缩合剂，并且通过选择特定的氨基酸保护基团避免了在脱除保护基团时使用强酸强碱条件，易于实现规模化生产，且生产成本相对较低。
Description
技术领域
本发明涉及一种20肽，具体来说是涉及比伐卢定的合成方法，尤其是比伐卢定的液相合成方法，属于多肽合成技术领域。
背景技术
抗凝血药(anticoagulants)是一类通过影响凝血过程不同环节，阻止血液凝固的药物。临床使用的抗凝血药主要有肝素和低分子肝素、直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂等。抗凝血药物的市场潜力很大，目前抗凝血药物的全球市值约40亿美元，并以13％的速度逐年递增。
肝素、低分子量肝素、华法林等抗凝血药物在血栓栓塞性疾病的治疗中发挥了重要的作用，但它们仍然存在各自的局限性。近年严重心血管缺血事件的发生率居高不下，出血相关的并发症是抗凝药治疗的主要障碍。
对凝血酶的研究，促进了直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitors，DTIs)的发展，这类药物主要有水蛭素(hirudin)及其衍生物、阿加曲班(argatroban)和希美家群(ximelagatran)、DTIs抑制循环和结合的凝血酶。临床试验中大多数DTIs表现出与肝素和香豆素类抗凝药相当或更好的临床疗效，出血危险小，无须严密的实验室监测。水蛭素是最早的DITs，是一种高效、高选择性的凝血酶抑制剂。但是水蛭素在近年研究中发现治疗窗窄、出血危险高，不宜用于治疗急性冠脉综合症。然而，水蛭素的重组物研究却获得了成功，来匹卢定(lepirudin)已于1998年上市，用于需要抗凝的伴有肝素诱发血小板减少症患者的预防和治疗。来匹卢定由于分子较大(相对分子量7000)产生抗体，无法达到结合凝血酶活性位点，因此，只能灭活循环中的凝血酶。
比伐卢定(bivalirudin)是一种近年来应用于临床的直接凝血酶抑制剂，FDA于2000年12月批准在美国上市(商品名Angiomax，由Medicines制药公司出品)，欧洲药品局(EMEA)于2008年2月份批准该药用于急性冠脉综合症的治疗，商品名为Angiox。比伐卢定的有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，作用可逆而短暂。早期的临床研究显示：比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。
比伐卢定相对分子量2180，其氨基酸序列是：H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。比伐卢定可通过结合于催化剂位点和循环及凝血酶血块的阴离子输出位点而直接抑制凝血酶的作用。能灭活循环和结合的凝血酶，不产生抗体。比伐卢定与凝血酶的结合是可逆的，当凝血酶逐渐断开比伐卢定3，4位精氨酸和脯氨酸的连接时，凝血酶活性位点的功能可恢复。
在药物代谢学方面，比伐卢定能被内源性多肽酶降解，可安全用于肾脏损坏患者，肾功能正常时，比伐卢定的半衰期为25min。在药理学方面，比伐卢定克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺点，用于抗凝安全有效。基于比伐卢定的以上特点于生物活性，用比伐卢定作为防治血栓的药物有诸多优点：(1)疗效佳，能灭活循环和结合的凝血酶，抑制作用是可逆的，且不产生抗体；(2)专一性强，特异性直接抑制凝血酶活性，且对血栓结合的凝血酶也有抑制作用；(3)半衰期短，抗凝效果可以预测，不需要实验室监测；(4)可安全用于肾脏损坏患者。
综上所述，比伐卢定是一种有着很好临床应用前景的药物，目前已经获准在美国、欧洲、加拿大、以色列、阿根廷等国家和地区上市销售，特别是其具有的能够降低临时抗凝带来的出血的优势，使得该药在高危患者中也得到了广泛的应用，取得了较好的临床应用效果。
多肽类药物高昂的合成成本和复杂的合成操作，是限制其大规模生产和市场应用的主要因素。比伐卢定是一个20个氨基酸的肽链，其合适的合成方法，不仅可以减少原料的浪费，提高比伐卢定的粗品纯度，从而降低成本，还要有利于大规模的生产。目前，国内外合成制备比伐卢定的文献和专利报道很多，其主要研究论文及专利如下：
美国专利US5196404中，介绍了一种采用Boc固相多肽合成法(SPPS)合成比伐卢定的方法，这种方法每步脱Boc均需用强烈刺激性的三氟乙酸，将肽从树脂切割时需使用强烈刺激性、剧毒的无水氟化氢。而大量的使用三氟乙酸和无水氟化氢必将会给环境保护、劳动保护带来相当大的麻烦，因此Boc固相多肽合成比伐卢定的方法无法满足实际生产的需要。
专利WO2006045503介绍了一种使用Fmoc体系固相合成法(SPPS)合成比伐卢定的方法：利用已经预先接了Fmoc-Leu-OH的聚苯乙烯基质的二氯三苯甲基树脂，使用TCTU/NMP的缩合剂策略，逐次偶合，得到比伐卢定树脂肽后，为了防止酪氨酸残基发生烷基化反应，采用了用低浓度的三氟乙酸将肽从树脂裂解，然后再用高浓度的三氟乙酸脱去侧基保护的方法进行裂解。但是这样做最终粗品中比伐卢定的纯度也仅有55％左右，且操作较麻烦。
专利WO2007033383中介绍了一种比伐卢定的片段合成方法：首先使用固相合成的方法(SPPS)，用二氯三苯甲基氯树脂分别合成片段A和片段B，再将片段A与[片段B]连接，最后脱侧链保护经反相柱制备得到比伐卢定纯品。这样做工艺复杂，步骤繁琐，涉及的纯化步骤较多，不利于工艺的放大及实际生产要求。
专利CN200610024611中介绍了一种用Wang树脂或CTC树脂的固相合成方法。
专利CN200910028793中介绍了比伐卢定的液相合成方法：首先使用液相合成的方法，合成N-端全保护的6肽，中间全保护的6肽，C-端全保护的8肽。在全保护片段肽合成过程中，进行了多次柱层析纯化。在全保护片段肽之间偶合过程中，选用PyBOP形成酰胺键，反应时间长。
上述文献报道的比伐卢定的固相合成方法，需采用昂贵的特殊树脂和过量的保护氨基酸及缩合试剂，生产成本高。有的工艺需要用到剧毒的氟化氢，需要特殊的反应装置，也难以实现大规模生产。而上述文献报道的比伐卢定的液相合成方法，需要多次的柱层析纯化，全保护片段之间缩合反应时间过长，不利于大规模的生产。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的上述问题，提供一种生产成本相对较低、适合规模化生产的比伐卢定的液相合成方法。
本发明的目的在于提供一种比伐卢定的合成方法，包含下列步骤：
1)用液相合成方法合成片段A、片段B、片段C、片段D，
2)将“片段A”和“片段B”缩合，得到“片段E”，
3)将“片段C”和“片段E”缩合，得到“片段F”，
4)将“片段D”和“片段F”缩合，得到比伐卢定的全保护20肽R6-D-Phe-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2，
5)脱除上述全保护20肽的所有保护基团R2、R3、R5、R6、R7，进一步纯化得到比伐卢定纯品，即：H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。
其中，“片段A”是C-端全保护的5肽：H-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2，
“片段B”是中段全保护的5肽-1：R1-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-OH，
“片段C”是中段全保护的5肽-2：R1-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-OH，
“片段D”是N-端全保护的5肽：R6-D-Phe-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-OH，
所述片段A氨基端保护基为R1，已脱除；片段B、C、D羧基端保护基为R4，已脱除。
所述“片段E”，是C-端全保护的10肽：H-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2；所述“片段F”是C-端全保护的15肽：H-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2；
所述保护基团R1～R5分别为：
R1＝Fmoc(9-芴甲氧羰基)；
R2＝OtBu(叔丁酯)；
R3＝tBu(叔丁基)；
R4＝Obzl(苄酯)；
R5＝Trt(三苯甲基)；
R6＝Boc(叔丁氧羰基)；
R7＝Pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)。
所述片段A～D的液相合成方法是，EDC*HCl/HOBT方法形成酰胺键。
所述“片段A”和“片段B”、“片段C”和“片段E”、“片段D”和“片段F”片段之间缩合的液相合成方法是，ONP活化酯或HOSU活化酯方法。
其中，在制得片段A～D之后要进行纯化。
对片段A～D进行纯化的方法为柱层析法。
所述脱除全保护20肽的所有保护基团的方法是，用TFA/TIS/H2O溶液一次性脱除所述全保护20肽的两端及侧链的所有保护基团。
对所述比伐卢定粗品进行纯化的方法为高效液相色谱法。
本发明采用液相合成法制备比伐卢定，所需设备简单，与固相合成法相比，具有许多优点：(1)不需要树脂和大过量的保护氨基酸即缩合剂，大大降低生产成本；(2)不必使用剧毒的氟化氢，易于实现安全生产。而与专利CN200910028793的液相合成法相比，其特点是：(1)在片段之间合成选用了活化酯方法，缩合效率高，后处理简单，成本相对更低；(2)减少了柱层析的次数，减少了溶剂的使用，提高了总体合成效率。
具体实施方式
本发明以液相合成比伐卢定为目的，综合固相法和液相法合成多肽的先进方法和技术，通过对比伐卢定所含氨基酸的正交保护策略、缩合剂和溶剂的选择、反应条件的优化、粗产品的纯化等多种因素进行全面分析，设计出一条新颖的比伐卢定的液相合成路线，能够在保证产品质量的前提下，最大限度地降低比伐卢定的合成成本。
本发明的主要技术路线是——
首先，用液相合成方法合成三个全保护片段，即：
“片段A”，C-端全保护的5肽：H-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2，
“片段B”，中段全保护的5肽-1：R1-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-OH，
“片段C”，中段全保护的5肽-2：R1-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-OH，
“片段D”，N-端全保护的5肽：R6-D-Phe-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-OH，
然后，将“片段A”和“片段B”缩合，得到“片段E”，即C-端全保护的10肽：H-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR4；
接着，将“片段C”和“片段E”缩合，得到“片段F”，即C-端全保护的15肽：H-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2；
接着，将“片段D”和“片段F”缩合，得到比伐卢定的全保护20肽：R6-D-Phe-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2；
最后，脱除上述全保护20肽的所有保护基团R2、R3、R5、R6、R7，得到比伐卢定的粗品，进一步纯化得到比伐卢定纯品，即：H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。
根据上述方法所述的比伐卢定的液相合成方法，其中所述保护基团R1-R5选择——
R1＝Fmoc(9-芴甲氧羰基)；
R2＝OtBu(叔丁酯)；
R3＝tBu(叔丁基)；
R4＝Obzl(苄酯)；
R5＝Trt(三苯甲基)
R6＝Boc(叔丁氧羰基)；
R7＝Pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)。
下面实施例仅为典型范例，并不是对本发明保护范围的限制。
1、“片段A”，C-端全保护的5肽的合成。
1.1H-Tyr(tBu)-Leu-OtBu合成
称取Z-Tyr(tBu)-OH·DCHA 22.4g(40.6mmol)，H-Leu-OtBu·HCl9.1g(40.6mmol)，HOBT 5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在乙醇/乙酸(500ml/10ml)中，30℃搅拌至溶清；加入Pd/C(2.0g)，通氢气，抽真空减压排气三次，密封，搅拌反应4h，TLC检测反应完全。过滤除去Pd/C，减压浓缩至约200ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得H-Tyr(tBu)-Leu-OtBu：14.8g(收率89.9％M＝406.5)。
1.2Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH合成
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 17.3g(40.6mmol)，H-Glu(OtBu)-OBZL·HCl 13.4g(40.6mmol)，HOBT 5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在乙醇/乙酸(500ml/10ml)中，30℃搅拌至溶清；加入Pd/C(2.0g)，通氢气，抽真空减压排气三次，密封，搅拌反应4h，TLC检测反应完全。过滤除去Pd/C，减压浓缩至约200ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH：22.6g(收率91.3％M＝610.4)。
1.3H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu合成
称取Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH 21.7g(35.6mmol)，H-Tyr(tBu)-Leu-OtBu14.5g(35.6mmol)，HOBT 4.8g(35.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.1g(39.2mmol)，EDAC·HCl 7.1g(37.3mmol)，30℃搅拌溶清并反应4h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml 20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu：24.0g(收率86.9％M＝776.9)。
1.4H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu合成
称取Fmoc-Pro-OH 10.2g(30.2mmol)，H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 23.5g(30.2mmol)，HOBT 4.1g(30.2mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 4.3g(33.2mmol)，EDAC·HCl 6.0g(31.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应4h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml 20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，用乙酸乙酯500ml溶解，减压浓缩除去溶剂，剩余物柱层析纯化，得H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu：23.3g(收率88.3％M＝874.3)。
2、“片段B”，中段N-端全保护的5肽-1的合成。
2.1H-Glu(OtBu)-Ile-OBZL合成
称取Boc-Glu(OtBu)-OH 12.3g(40.6mmol)，H-Ile-OBZL·TosOH15.9g(40.6mmol)，HOBT 5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml 20％TFA/DCM，30℃搅拌反应30min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Glu(OtBu)-Ile-OBZL：15.3g(收率92.9％M＝406.6)。
2.2Fmoc-Phe-Glu(OtBu)-OH合成
称取Fmoc-Phe-OH 15.7g(40.6mmol)，H-Glu(OtBu)-OBZL·HCl13.4g(40.6mmol)，HOBT 5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在乙醇/乙酸(500ml/10ml)中，30℃搅拌至溶清；加入Pd/C(2.0g)，通氢气，抽真空减压排气三次，密封，搅拌反应4h，TLC检测反应完全。过滤除去Pd/C，减压浓缩至约200ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Fmoc-Phe-Glu(OtBu)-OH：21.7g(收率93.3％M＝572.9)。
2.3H-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OBZL合成
称取Fmoc-Phe-Glu(OtBu)-OH 21.0g(36.6mmol)，H-Glu(OtBu)-Leu-OBZL 14.9g(36.6mmol)，HOBT 4.9g(36.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.2g(39.2mmol)，EDAC·HCl 7.3g(37.3mmol)，30℃搅拌溶清并反应4h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml 20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OBZL：24.4g(收率90.1％M＝739.5)。
2.4Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OH合成
称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 13.3g(32.4mmol)，H-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OBZL 24.0g(32.4mmol)，HOBT 4.4g(32.4mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 4.6g(35.6mmol)，EDAC·HCl 6.5g(34.0mmol)，30℃搅拌溶清并反应4h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在乙醇/乙酸(500ml/10ml)中，30℃搅拌至溶清；加入Pd/C(2.0g)，通氢气，抽真空减压排气三次，密封，搅拌反应4h，TLC检测反应完全。过滤除去Pd/C，减压浓缩至约200ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，用乙酸乙酯500ml溶解，减压浓缩除去溶剂，剩余物柱层析纯化，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OH：29.0g(收率85.9％M＝1042.9)。
3、“片段C”，中段N-端全保护的5肽-2的合成。R1-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-OH
3.1H-Asn(Trt)-Gly-OH合成
称取Z-Asn(Trt)-OH 20.6g(40.6mmol)，H-Gly-OBZL·HCl 8.5g(40.6mmol)，HOBT5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在乙醇/乙酸(500ml/10ml)中，30℃搅拌至溶清；加入Pd/C(2.0g)，通氢气，抽真空减压排气三次，密封，搅拌反应4h，TLC检测反应完全。过滤除去Pd/C，减压浓缩至约200ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得H-Asn(Trt)-Gly-OH：15.9g(收率91.2％M＝431.1)。
3.2H-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH
称取Fmoc-Gly-Opfp 16.7g(36.0mmol)，H-Asn(Trt)-Gly-OH 15.5g(36.0mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.1g(39.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH：17.1g(收率97.1％M＝488.2)。
3.3Fmoc-Gly-Gly-OSU
称取Fmoc-Gly-OH 12.1g(40.6mmol)，H-Gly-OBZL·HCl 8.5g(40.6mmol)，HOBT5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在DCM(200ml)中，加入HOSU5.1g(44.7mmol)，0℃搅拌；滴加DIC/DCM(5.6g/200ml)，滴加过程中HOSU逐渐溶解，又有新的沉淀产生，维持0℃，滴加完成后搅拌反应4h，然后升温至30℃搅拌反应12h，TLC检测反应完全。过滤除去沉淀，滤液减压浓缩至约100ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Fmoc-Gly-Gly-OSU：17.1g(收率93.4％M＝451.3)。
3.4Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH合成
称取H-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH 17.0g(34.8mmol)溶解在DMF/DCM(30ml/300ml)中，再加入DIEA 4.9g(38.3mmol)，30℃搅拌溶清。再将Fmoc-Gly-Gly-OSU15.7g(34.8mmol)溶解在200mlDCM中，缓慢滴加至H-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH/DIEA/DMF/DCM溶液中，滴加完毕后，30℃搅拌4h，TLC检测，反应完全。反应液用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，，减压浓缩除去溶剂，剩余物柱层析纯化，得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH：27.7g(收率96.6％M＝824.2)。
4、“片段D”，N-端全保护的5肽的合成。R6-D-Phe-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-OH
4.1H-Pro-Gly-OBZL合成
称取Boc-Pro-OH 8.7g(40.6mmol)，H-Gly-OBZL·HCl 8.5g(40.6mmol)，HOBT5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml 20％TFA/DCM，30℃搅拌反应30min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Pro-Gly-OBZL：9.87g(收率92.7％M＝262.2)。
4.2H-Arg(pbf)-Pro-Gly-OBZL合成
称取Fmoc-Arg(pbf)-OPfp 30.1g(37.0mmol)，H-Pro-Gly-OBZL 9.7g(37.0mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA 5.1g(39.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。加入100ml20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Arg(pbf)-Pro-Gly-OBZL：23.6g(收率95.3％M＝670.7)。
4.3Boc-D-Phe-Pro-OSU
称取Boc-D-Phe-OH 10.8g(40.6mmol)，H-Pro-OBZL·HCl 9.8g(40.6mmol)，HOBT5.5g(40.6mmol)，加入乙酸乙酯/DMF(300ml/70ml)，30℃搅拌，不能完全溶解；再加入DIEA5.8g(44.7mmol)，EDAC·HCl 8.2g(42.6mmol)，30℃搅拌溶清并反应2h。取少量反应液用饱和NaCl溶液洗涤，有机层TLC检测，反应完全。反应液中加入700ml乙酸乙酯，然后用10％Na2CO3/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，用10％NaHSO4/satNaCl(1∶3)100ml洗两次，再用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至油状，无液体蒸出。将其溶解在DCM(200ml)中，加入HOSU5.1g(44.7mmol)，0℃搅拌；滴加DIC/DCM(5.6g/200ml)，滴加过程中HOSU逐渐溶解，又有新的沉淀产生，维持0℃，滴加完成后搅拌反应4h，然后升温至30℃搅拌反应12h，TLC检测反应完全。过滤除去沉淀，滤液减压浓缩至约100ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Boc-D-Phe-Pro-OSU：17.0g(收率91.4％M＝459.3)。
4.4Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OH合成
称取H-Arg(pbf)-Pro-Gly-OBZL 23.0g(34.3mmol)溶解在DMF/DCM(30ml/300ml)中，再加入DIEA 4.8g(38.3mmol)，30℃搅拌溶清。再将Boc-D-Phe-Pro-OSU 15.8g(34.3mmol)溶解在200mlDCM中，缓慢滴加至H-Arg(pbf)-Pro-Gly-OH/DIEA/DMF/DCM溶液中，滴加完毕后，30℃搅拌8h，TLC检测，反应完全。反应液用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。将其溶解在乙醇/乙酸(500ml/10ml)中，30℃搅拌至溶清；加入Pd/C(2.0g)，通氢气，抽真空减压排气三次，密封，搅拌反应4h，TLC检测反应完全。过滤除去Pd/C，减压浓缩至约200ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，用乙酸乙酯500ml溶解，减压浓缩除去溶剂，剩余物柱层析纯化，得Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OH：28.8g(收率90.8％M＝924.8)。
5、片段B、C、D的活化
5.1“片段B活化酯”，中段全保护的5肽-1：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OSU的合成
称取Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OH 28.5g(27.3mmol)溶解在DCM(200ml)中，加入HOSU 3.5g(30.0mmol)，0℃搅拌；滴加DIC/DCM(3.8g/200ml)，滴加过程中HOSU逐渐溶解，又有新的沉淀产生，维持0℃，滴加完成后搅拌反应4h，然后升温至30℃搅拌反应12h，TLC检测反应完全。过滤除去沉淀，滤液减压浓缩至约100ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OSU 31.1g(收率99.9％M＝1139.9)。
5.2“片段C活化酯”，中段全保护的5肽-2：Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OSU的合成
称取Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH 27.0g(32.7mmol)溶解在DCM(200ml)中，加入HOSU 4.2g(36.0mmol)，0℃搅拌；滴加DIC/DCM(4.5g/200ml)，滴加过程中HOSU逐渐溶解，又有新的沉淀产生，维持0℃，滴加完成后搅拌反应4h，然后升温至30℃搅拌反应12h，TLC检测反应完全。过滤除去沉淀，滤液减压浓缩至约100ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OSU 30.0g(收率99.7％M＝921.2)。
5.3“片段D活化酯”，N-端全保护的5肽：Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OSU的合成
称取Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OH 28.0g(30.3mmol)溶解在DCM(200ml)中，加入HOSU 3.8g(33.3mmol)，0℃搅拌；滴加DIC/DCM(4.2g/200ml)，滴加过程中HOSU逐渐溶解，又有新的沉淀产生，维持0℃，滴加完成后搅拌反应4h，然后升温至30℃搅拌反应12h，TLC检测反应完全。过滤除去沉淀，滤液减压浓缩至约100ml，加入乙醚析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗两次，真空干燥。得Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OSU 30.9g (收率99.9％M＝1021.8)。
6、“片段E”的合成
称取H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 23.0g(26.3mmol)溶解在DMF/DCM(30ml/300ml)中，再加入DIEA 3.7g(28.9mmol)，30℃搅拌溶清。再将Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OSU 30.7g(27.0mmol)溶解在200mlDCM中，缓慢滴加至H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu/DIEA/DMF/DCM溶液中，滴加完毕后，30℃搅拌8h，HPLC中控，H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu反应完全。加入AMResin 2.0g (0.9mmol/g)，30℃搅拌1h，HPLC中控无Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-OSU，反应液过滤除去树脂，滤液用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。加入100ml 20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 43.6g(收率98.9％M＝1677.2)。
7、“片段F”的合成
称取H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 43.1g(25.7mmol)溶解在DMF/DCM(30ml/300ml)中，再加入DIEA 3.6g(28.3mmol)，30℃搅拌溶清。再将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OSU 31.3g(26.5mmol)溶解在200mlDCM中，缓慢滴加至H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu/DIEA/DMF/DCM溶液中，滴加完毕后，30℃搅拌8h，HPLC中控，H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu反应完全。加入AM Resin 2.0g(0.9mmol/g)，30℃搅拌1h，HPLC中控无Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OSU，反应液过滤除去树脂，滤液用satNaCl 100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。加入100ml 20％PiP/DMF，30℃搅拌反应20min，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得H-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 57.7g(收率99.3％M＝2261.4)。
8、全保护比伐卢定的合成
称取H-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 57.6g(25.5mmol)溶解在DMF/DCM(30ml/300ml)中，再加入DIEA 3.6g(28.0mmol)，30℃搅拌溶清。再将Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OSU 26.9g (26.3mmol)溶解在200mlDCM中，缓慢滴加至H-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu/DIEA/DMF/DCM溶液中，滴加完毕后，30℃搅拌8h，HPLC中控，H-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu反应完全。加入AM Resin 2.0g(0.9mmol/g)，30℃搅拌1h，HPLC中控无Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-OSU，反应液过滤除去树脂，滤液用satNaCl100ml洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩至100ml，加入石油醚/乙醚(2∶1)500ml析晶，得白色沉淀，过滤，沉淀用石油醚打浆洗两次，真空干燥，得Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 80.0g(收率99.0％M＝3168.2)。
9、比伐卢定精品制备
将Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu 80g溶于冰浴冷却的2L TFA/TIS/H2O(95∶2.5∶2.5)中，搅拌，逐渐升温至30℃，反应3h后减压浓缩至500ml，加入冰浴冷却的2500ml乙醚，得到白色固体沉淀，即为比伐卢定粗品。经HPLC纯化和冰冻干燥，得46.3g干粉比伐卢定，纯度99.0％(收率84.5％M＝2180.3)。
Claims (9)
1.一种比伐卢定的液相合成方法，包括下列步骤：
1)用液相合成方法合成片段A、片段B、片段C、片段D，
2)将“片段A”和“片段B”缩合，得到“片段E”，
3)将“片段C”和“片段E”缩合，得到“片段F”，
4)将“片段D”和“片段F”缩合，得到比伐卢定的全保护20肽R6-(D-Phe)-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2，
5)脱除上述全保护20肽的所有保护基团R2、R3、R5、R6、R7，进一步纯化得到比伐卢定纯品，即：H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，其中所述的：
“片段A”是C-端全保护的5肽：H-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2；
“片段B”是中段全保护的5肽-1：R1-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-OH；
“片段C”是中段全保护的5肽-2：R1-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-OH；
“片段D”是N-端全保护的5肽：R6-(D-Phe)-Pro-Arg(R7)-Pro-Gly-OH。
2.根据权利要求1所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于，所述“片段E”，是C-端全保护的10肽：H-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2；所述“片段F”是C-端全保护的15肽：H-Gly-Gly-Gly-Asn(R5)-Gly-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tyr(R3)-Leu-OR2。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于，所述保护基团分别为：
R1＝Fmoc(9－芴甲氧羰基)；
R2＝OtBu(叔丁酯)；
R3＝tBu(叔丁基)；
R5＝Trt(三苯甲基)；
R6＝Boc(叔丁氧羰基)；
R7＝Pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)。
4.根据权利要求3所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于：所述片段A-D的液相合成方法是，EDC*HCl/HOBT方法形成酰胺键。
5.根据权利要求3所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于：所述“片段A”和“片段B”、“片段C”和“片段E”、“片段D”和“片段F”片段之间缩合的液相合成方法是，ONP活化酯或HOSU活化酯方法。
6.根据权利要求3所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于：在制得片段A-D之后要进行纯化。
7.根据权利要求6所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于：对片段A-D进行纯化的方法为柱层析法。
8.根据权利要求3所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于：所述脱除全保护20肽的所有保护基团的方法是，用TFA/TIS/H2O溶液一次性脱除所述全保护20肽的两端及侧链的所有保护基团。
9.根据权利要求3所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于：对所述比伐卢定粗品进行纯化的方法为高效液相色谱法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 222006 Jiangsu province Lianyungang Kaitai Dapu Road Industrial Area Applicant after: JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP LIANYUNGANG HONGCHUANG PHARMACEUTICAL CO., LTD. Address before: 222006 Jiangsu province Lianyungang Kaitai Dapu Road Industrial Area Applicant before: Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Lianyungang Hongchuang Medical Co., Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160315 Address after: 222047 Lianyungang economic and Technological Development Zone, Jiangsu Applicant after: JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP LIANYUNGANG HONGCHUANG PHARMACEUTICAL CO., LTD. Address before: 222006 Jiangsu province Lianyungang Kaitai Dapu Road Industrial Area Applicant before: JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP LIANYUNGANG HONGCHUANG PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |