CN115073587A - 一种半连续液相合成比伐芦定的合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，具体包括如下步骤：a）、用半连续液相法合成片段a：N‑端全保护6肽；用半连续液相法合成片段b：中端全保护6肽；用连续液相法合成片段c：C‑端全保护8肽；b）、将片段a和b缩合后脱保护，得到片段d，即N‑端全保护12肽；c）、将片段d和片段c缩合得到比伐芦定全保护肽；d）脱除所有保护基团得到比伐芦定粗品。本发明比传统的液相合成比伐芦定具有：耗费溶剂更少、放大生产更加安全、不使用贵金属催化剂、操作更简单、工艺周期更短、成本更低、更适合工业化规模生产等优势。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成制备技术领域，具体涉及一种半连续液相合成比伐芦定的合成工艺。
背景技术
比伐芦定（bivalirudin）是2000年12月美国食品药物管理局FDA批准上市的直接凝血酶抑制剂之一（商品名Angiomax，由Medicines制药公司出品），它来源于水蛭素衍生物，是一种合成的含20个氨基酸的多肽，是凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂。其相对分子质量为2180，氨基酸序列为：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu。
比伐芦定氨基端的D-Phe-Pro-Arg-Pro区域是与凝血酶活性点相互作用的位点，它可与游离型或与结合型凝血酶催化位点和底物识别位点发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和Pro4之间的肽键，使本品失活，所以比伐芦定对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。比伐芦定与水蛭素相反，经肾排泄不是其主要的清除途径，它可能是被内源性多肽酶降解，可安全用于肾损害患者，肾功能正常时，比伐芦定的半衰期为25min。
基于比伐芦定的以上特点与生物学活性，用比伐芦定作为防治血栓的药物有诸多优点：（1）专一性强，特异性直接抑制凝血酶活性，且对血栓结合的凝血酶也有抑制作用；（2）半衰期短，且对凝血酶的抑制作用是可逆性的，故而抗凝效果可以被预测，不需要实验室监测；（3）可安全用于肾损害患者。
比伐芦定在药理学上克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺点，用于抗凝防栓安全有效。诸多临床试验研究表明，它可替代肝素安全、有效地用于冠状动脉血管成形术PCI、不稳定型心绞痛以及急性心肌梗死溶栓辅助治疗，尤其在肝素诱导的血小板减少症Hf的抗栓治疗中有独特的优势，且在外周动脉介入治疗PPI、心肺移植手术及肾功能不全患者防栓抗栓治疗中亦显示出良好的作用。因此，比伐芦定是一种有着很好临床应用前景的药物。
比伐芦定作为一个很有合成难度的多肽药物，其高昂的合成成本限制了大规模生产和市场应用。目前，国内外已有的液相合成法制备比伐芦定的文献和专利报道较少，而且工艺流程极其繁琐，大多数是固相合成工艺，已有的主要研究论文及专利如下：
美国专利US5196404是比伐芦定的化合物专利，最早报导了比伐芦定的制备方法（1990年7月6日申请），以BOC（叔丁氧羰基）保护的氨基酸为原料，采用固相合成，Boc合成法是采用TFA（三氟乙酸）可脱除的Boc（叔丁氧羰基）为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DIC（N,N-二异丙基碳二亚胺）活化，偶联下一个氨基酸，最终脱保护多采用强刺激、剧毒的氟化氢，在特殊的聚四氟乙烯装置中切肽树脂。此方法不适合规模化合成。在Boc多肽合成法中，为了便于下一步的多肽合成，反复用酸进行脱保护，一些副反应被带入实验中，例如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等。
中国专利CN201811101059.4，使用Fmoc-tBu固相合成策略，采用了碱可脱除的Fmoc（9-芴甲氧羰基）为α-氨基的保护基，其优势为在酸性条件下是稳定的，不受TFA等试剂的影响，应用温和的碱处理可脱保护，所以侧链可用易于酸脱除的叔丁氧基、三苯甲基等，树脂采用90%TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂或者低浓度就能够切除的CTC树脂。
上述文献报道的是比伐芦定的固相合成两种主要方法，目前主流是使用Fmoc-tBu固相合成策略，但无论哪种固相合成需略都需采用昂贵的特殊树脂和大过量的特殊保护氨基酸及缩合试剂，放大不稳定，可重复性差，难以实现大规模合成，而且需要特殊反应器，生产成本非常高。
而液相合成的多肽一般为较小分子量的多肽，多数是10个氨基酸序列以内，但是生产工艺周期长，操作繁琐，适用范围小，且产生工业三废较高，收率低。
中国专利CN200910028793.7，即是一种液相合成比伐芦定的合成工艺，虽然对比固相合成比伐芦定的工艺，有一定优势，即成本较低，可重复稳定放大，不用昂贵的特殊树脂和大过量的特殊保护氨基酸及缩合试剂，不需要特殊反应器等。但是仍然没有跳出传统液相合成多肽的生产工艺周期长，操作繁琐，收率低，适用范围小，且产生工业三废较高等劣势。具体表现有：
1）传统液相合成多肽操作繁琐，需要对中间体进行提纯，一般用柱层析方法提纯，上述液相合成比伐芦定的专利对中间体提纯的操作有11次柱层析，耗费大量溶剂，操作复杂繁琐，放大生产较为困难。
2）上述液相合成比伐芦定的专利对中间体的脱保护方法使用了钯碳催化氢化，是昂贵的贵金属催化剂，而且用了7次钯碳催化，成本极高，而且放大很危险，因为钯碳属于极易燃烧物质。
3）因为上述液相合成比伐芦定的专利合成的方法是不连续的，所以工艺周期很长，加上多次使用柱层析和钯碳催化氢化也是耗时长的工艺操作，使得整个工艺周期变得更为冗长繁琐，至少需要一个月时间。
发明内容
本发明的发明目的是解决现有技术存在的上述问题，提供一种生产成本低、工艺周期短、操作相对简单、可稳定放大、适宜规模化生产的比伐芦定的半连续液相合成工艺。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
a）、用半连续液相法合成片段a：N-端全保护6肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH；用半连续液相法合成片段b：中端全保护6肽HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe；用连续液相法合成片段c：C-端全保护8肽HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；
b）、将片段a和b缩合后脱保护，得到片段d，即N-端全保护12肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH；
c）、将片段d和片段c缩合得到比伐芦定全保护肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe- Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；
d）脱除所有保护基团得到比伐芦定粗品。
优选地，所述片段a的合成工艺是先分别液相合成短肽中间体Boc-D-Phe-Pro-OH和H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe，然后使两个短肽中间体缩合得到Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe，然后用氢氧化钠脱除保护基并酸化得到Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH片段a。
优选地，所述片段b的合成工艺是先分别液相合成短肽中间体Fmoc-Gly-Gly-活性酯OBt 和HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe，然后使两个短肽中间体缩合得到Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe，然后用二乙胺脱除保护基最后再用盐酸酸化得到HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe片段b。
优选地，所述片段c的合成工艺是先分别液相合成短肽中间体Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯OBt 和HCl.H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu，然后用二乙胺脱除保护基最后再用盐酸酸化得到HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu片段c。
优选地，所述片段d的合成，其前体化合物的脱保护由DMF和水作为溶剂，甲醇、乙醇、叔丁醇或四氢呋喃作为脱保护添加剂，氢氧化钠作为碱。
优选地，所有Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基脱保护试剂是二乙胺。
优选地，各短肽中间体的提纯采用萃取、洗涤、析晶沉淀工艺。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明本发明采用半连续液相合成法制备比伐芦定，所需设备简单，与固相合成法相比，具有许多优点：（1）不需要树脂和大过量的保护氨基酸及缩合剂；（2）能够实现规模化生产；（3）不需大量的洗涤溶剂，常用溶剂可回收再利用，没有传统固相多肽工艺面临的巨大环保压力；（4）成本相较极低。
2、本发明与传统液相合成法相比，也具有很多优势：（1）生产工艺周期更短；（2）操作相对更简单；（3）工业排放三废更少；（4）收率更高、成本更低。
3、本发明则没有使用柱层析方法进行提纯，使用普通的萃取、洗涤、析晶沉淀等简单方法进行对中间体提纯，耗费溶剂少，成本更低，而且放大生产更为简单。
4、本发明对中间体所使用的脱保护方法都是成本极低的碱脱除，而且放大生产也很安全。而本发明由于是半连续的工艺，整个工艺周期非常短，只要6天左右，即使放大生产也不超过10天。
以上所述，说明本发明比传统的液相合成比伐芦定具有：耗费溶剂更少、放大生产更加安全、不使用贵金属催化剂、操作更简单、工艺周期更短、成本更低、更适合工业化规模生产等优势。
附图说明
图1为本发明片段a全保护6肽的HPLC图谱。
图2为本发明片段b全保护6肽的HPLC图谱。
图3为本发明片段d全保护12肽的HPLC图谱。
图4为本发明片段c全保护8肽的HPLC图谱。
图5为本发明比伐芦定全保护肽的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明以液相合成比伐芦定为目的，根据固相合成和液相合成的基本原理，通过对比伐芦定所含氨基酸的正交保护策略、缩合剂和溶剂的选择、反应条件的优化、粗产品的简单纯化等多种因素进行全面分析，得到连续液相合成片段肽的方法和技术，设计出一条创造性的比伐芦定的半连续液相合成工艺路线，能够在保证产品质量的前提下，能够实现规模化生产并最大限度地降低比伐芦定的合成成本。
本发明主要的技术路线是：
首先，用连续液相法逐步合成三个全保护片段肽，即：片段a的N-端全保护6肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH；片段b的中端全保护6肽HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe；片段c的C-端全保护8肽HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；
然后将片段a和b缩合后脱保护，得到片段d，即N-端全保护12肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH；
接着将片段d和片段c缩合得到比伐芦定全保护肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；
最后脱除所有保护基团得到比伐芦定粗品。
根据本发明的技术方案，所述的三个全保护片段肽的合成工艺是连续液相合成工艺，通过对比伐芦定所含氨基酸的正交保护策略、缩合剂和溶剂的选择、反应条件的优化、粗产品的简单纯化等多种因素进行全面分析，得到连续液相合成片段肽的方法和技术。由于片段肽的合成工艺是连续液相合成工艺，而片段肽之间的缩合并不连续，所以合成比伐芦定全保护肽是一种半连续的液相合成。
脱去9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护基时，用的是二乙胺作为脱保护试剂。N-端全保护12肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe的脱保护添加剂为甲醇、乙醇、叔丁醇或四氢呋喃，最优采用叔丁醇，水和DMF为溶剂，氢氧化钠做脱保护的碱。
本发明中一些常用的英文缩写具体含义如下： Boc-D-Phe-OH：叔丁氧羰酰基-D-苯丙氨酸 Fmoc-Pro-OH：9-芴甲氧羰基-L-脯氨酸 Fmoc-Arg(Pbf)-OH：9-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L- 精氨酸 Fmoc-Gly-OH：9-芴甲氧羰基-L-甘氨酸Fmoc-Asn(Trt)-OH：9-芴甲氧羰基-N-三苯甲基-L-天冬酰胺 Fmoc-Glu(OtBu)-OH：9-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-5-叔丁酯 Fmoc-Ile-OH：9-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸 Fmoc-Tyr(tBu)-OH：9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸 H-Asp(OtBu)-OH：L-天冬氨酸-4-叔丁酯 H-Glu(OtBu)-OH：L-谷氨酸-5-叔丁酯 HOBt：1-羟基苯并三唑 HOSu：N-羟基丁二酰亚胺
HONB：N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺 DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺 DCC：N,N'-二环己基碳二亚胺 EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 DIEA：N,N-二异丙基乙胺 DMF：N,N-二甲基甲酰胺 TBTU：2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯 HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 PyBOP：1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐
下面以具体实例进一步说明本发明半连续液相法制备比伐芦定的过程，其仅为典型范例，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
1、片段a的N-端全保护6肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH的合成工艺步骤
其中有短肽中间体如下：
（1）Boc-D-Phe-Pro-OH
（2）H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe
工艺流程如下：
（1）Boc-D-Phe-Pro-OH合成：Boc-D-Phe-OH+缩合剂+添加剂→Boc-D-Phe-活性酯+脯氨酸+碱→Boc-D-Phe-Pro-OH
（2）H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe合成：
Fmoc-Pro-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Pro-活性酯+甘氨酸+碱→Fmoc-Pro-Gly-OH+缩合剂+添加剂+甘氨酸甲酯盐酸盐→Fmoc-Pro-Gly-Gly-OMe+二乙胺→H-Pro-Gly-Gly-OMe+Fmoc-Arg(pbf)-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe+二乙胺→H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe
（3）Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe的合成：
Boc-D-Phe-Pro-OH+H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe+缩合剂+添加剂→Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe+碱→Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH
其中短肽H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe是连续液相合成工艺的一步法合成得来。其它中间体短肽不是连续液相合成工艺，所以合成片段a的N-端全保护6肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH的合成工艺是半连续的。具体方法如下：
1.1、Boc-D-Phe-Pro-OH合成：20mmol
室温下Boc-D-Phe-OH（20mmol）加入30ml溶剂A1，加入22mmol添加剂A1（HOSu），加入23mmol缩合剂A1(DIC)，在35-40℃搅拌反应30min，同时准备40mmol脯氨酸+60mmol碱A1用水30ml溶解待用，待反应到30min之后，降温至30-35℃，加入准备好的脯氨酸-碱水溶液，反应30min；降温至20-25℃加入20ml溶剂A2，搅拌2min后分液，保留水相，有机相加入2ml饱和碳酸氢钠钠+10ml水+2ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相2min，分液后得水相，合并水相，加入50ml二氯甲烷，搅拌下加入盐酸调至pH≤2，分液，得有机相用50ml 5%氯化钠水溶液洗涤两次，分液得有机相，加入60ml溶剂A3，在40-45℃下减压（0.05-0.07atm）旋转蒸发除去二氯甲烷及部分溶剂A3，有大量白色固体析出，旋转蒸发使悬浊液体积剩余40-50ml，然后冷却至10-15℃下搅拌析晶30min，抽滤抽干，用溶剂A3洗涤一次抽干，干燥后得到Boc-D-Phe-Pro-OH纯度99.0%以上，收率90%左右。
以上所述的溶剂A1为：四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯+DMF、甲基四氢呋喃+DMF其中的一种。前4个为溶剂，后两个为溶剂组合，溶剂组合内部组分比例为1：1。优选溶剂四氢呋喃。
以上所述的溶剂A2为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂A3为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的缩合剂A1为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的添加剂A1为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOSu。
以上所述的碱A1为碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠其中的一种，优选碳酸钠，因为碳酸钠为二元碱，而以上所述的碱都视为一元碱，使用量是一元碱的量，所以使用碳酸钠时物质的量减半。
1.2、H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe合成：20mmol（以Fmoc-Arg(pbf)-OH为起始物料）
室温下Fmoc-Gly-OH（30mmol）加入45ml溶剂B1，加入33mmol添加剂B1（HOSu），加入34mmol缩合剂B1(DIC)，在35-40℃搅拌反应30min，同时准备60mmol甘氨酸+90mmol碱B1用水45ml溶解待用，待反应到30min之后，降温至20-25℃，加入准备好的甘氨酸-碱水溶液，反应20min，加入30ml溶剂B2，搅拌2min后分液，保留水相，有机相加入3ml饱和碳酸氢钠钠水溶液+15ml水+3ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相2min，分液后得水相，合并水相，加入80ml 溶剂B3，搅拌下加入盐酸调节pH≤2，分液保留有机相，有机相加入20%氯化钠40ml洗涤分液保留有机相得到Fmoc-Pro-Gly-OH溶液。
33mmol缩合剂B2(TBTU)用50ml DMF溶解备用，甘氨酸甲酯盐酸盐（33mmol）和DIEA（78mmol）依次加入到Fmoc-Pro-Gly-OH溶液中，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂B2溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，之后加入80ml溶剂B3，再加入22%的氯化钠水溶液160ml，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液120ml，并加入盐酸调节pH≤2以内，分液，保留有机相加入90ml水和30ml饱和碳酸氢钠钠溶液搅拌洗涤，搅拌2min后分液，保留有机相加入30ml水+30ml饱和碳酸氢钠钠搅拌洗涤，搅拌2min后分液，保留有机相；有机相减压浓缩至溶液体积为40-50ml，得Fmoc-Pro-Gly-Gly-OMe溶液。
Fmoc-Pro-Gly-Gly-OMe溶液加入30ml二乙胺，在25-30℃反应30min，加入10mlDMF后减压浓缩至干，加入乙酸乙酯10ml搅拌溶解，再减压浓缩至粘稠状，然后再加入乙酸乙酯10ml和DIEA 2ml，再减压浓缩至粘稠状，至此完全蒸出二乙胺，得H-Pro-Gly-Gly-OMe的DMF溶液。
24mmol缩合剂B3(TBTU)用40ml DMF溶解备用，Fmoc-Arg(pbf)-OH和DIEA（78mmol）依次加入到H-Pro-Gly-Gly-OMe溶液中，加入50ml溶剂B4，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂B3溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，加入50ml溶剂B4，加入22%氯化钠水溶液100ml，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液90ml，并加入盐酸调节pH≤2，分液，保留有机相加入60ml水+20ml饱和碳酸氢钠钠溶液搅拌洗涤2min，分液，保留有机相加入50ml水+10ml饱和碳酸氢钠钠溶液搅拌洗涤2min，分液，保留有机相减压浓缩至溶液体积剩余45-50ml左右，得Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe溶液。
Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe溶液加入20ml二乙胺，在25-30℃反应30min，20-25℃下将所得反应液匀速滴加到250ml溶剂B5中搅拌析晶30min，抽滤抽干后用溶剂B5洗涤一次，抽干后干燥得H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe，收率95%左右，纯度98.0%以上。
以上所述的溶剂B1为：四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯+DMF、甲基四氢呋喃+DMF其中的一种，前4个为溶剂，后两个为溶剂组合，溶剂组合内部组分比例为1：1。优选溶剂四氢呋喃。
以上所述的溶剂B2为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂B3为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯其中的一种溶剂，优选甲酸乙酯。
以上所述的溶剂B4为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯其中的一种溶剂，优选甲酸乙酯。
以上所述的溶剂B5为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的缩合剂B1为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的缩合剂B2为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的缩合剂B3为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的添加剂B1为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOSu。
以上所述的碱B1为碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠其中的一种，优选碳酸钠，因为碳酸钠为二元碱，而以上所述的碱都视为一元碱，使用量是一元碱的量，所以使用碳酸钠时物质的量减半。
1.3、Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH合成（18mmol）
Boc-D-Phe-Pro-OH（18mmol）用80ml的DMF溶解，加入H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe（18mmol）和DIEA（36mmol），在20-25℃下加入21.6mmol缩合剂C1(TBTU)反应10min后，加入2mmol碱C1淬灭反应，反应3min，放入10℃下冷却备用。
氢氧化钠（80mmol）用30ml水溶解后冷却至10℃，加入反应液中反应，10℃下水解反应30-60min，HPLC跟踪反应进度，原料剩余0.2%以内即可停止反应，后加入盐酸使ph≤2淬灭反应，升至室温，将所得反应液匀速滴加到3%氯化钠水溶液400ml中搅拌析晶30min，抽滤用水洗涤后抽干，干燥得Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH，收率95%左右，纯度96.0%以上。
以上所述的缩合剂C1为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的碱C1为氨水、二乙胺、苄胺、4-甲氧基苄胺、4-叔丁基苄胺其中的一种，优选苄胺。
2、片段b的中端全保护6肽HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe的合成工艺步骤
其中有短肽中间体如下：
（1）Fmoc-Gly-Gly-活性酯
（2）HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
（3）HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
工艺流程如下：
（1）Fmoc-Gly-Gly-活性酯合成：
Fmoc-Gly-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Gly-活性酯+甘氨酸+碱→Fmoc-Gly-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Gly-Gly-活性酯
（2）HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe合成：
Fmoc-Gly-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Gly-活性酯+H-Asp(OtBu)-OH+碱→Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH+缩合剂+添加剂+苯丙氨酸甲酯盐酸盐→Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+二乙胺→H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+Fmoc-Asn(Trt)-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+二乙胺→H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+HCl→HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
（3）HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe的合成：
Fmoc-Gly-Gly-活性酯+HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+碱→Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+碱→H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+HCl→HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
其中短肽HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe是连续液相合成工艺的一步法合成得来。其它中间体短肽不是不是连续液相合成工艺，所以合成片段b的中端全保护6肽HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe的合成工艺是半连续的。具体方法如下：
2.1、Fmoc-Gly-Gly-活性酯合成：20mmol
室温下Fmoc-Gly-OH（20mmol）加入30ml溶剂D1，加入22mmol添加剂D1(HOSu)，加入23mmol缩合剂D1(DIC)，在35-40℃搅拌反应30min，同时准备甘氨酸（40mmol）+60mmol碱D1用水30ml溶解待用，待反应到30min之后，降温至20-25℃，加入准备好的甘氨酸-碱水溶液，反应20min；加入10ml溶剂D2，搅拌2min后分液，保留水相，有机相加入2ml饱和碳酸氢钠钠+10ml水+2ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相2min，分液后得水相，合并水相，加入120ml溶剂D3和5g氯化钠，搅拌下加入盐酸调至pH≤2，分液，得有机相用50ml 饱和氯化钠水溶液洗涤分液得有机相，加入22mmol添加剂D2(HOBt)，加入24mmol缩合剂D2(DIC)，35-40℃下反应20-40min有大量白色固体析出，加入120ml溶剂D4继续搅拌反应20min，然后冷却至20-25℃后，抽滤抽干，用溶剂D4洗涤一次抽干，干燥后得到Fmoc-Gly-Gly-活性酯纯度99.0%以上，收率85%左右。
以上所述的溶剂D1为：四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯+DMF、甲基四氢呋喃+DMF其中的一种溶剂或者溶剂组合，前4个为溶剂，后两个为溶剂组合，溶剂组合内部组分比例为1：1。优选溶剂甲酸乙酯。
以上所述的溶剂D2为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂D3为四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯其中的一种溶剂，优选甲酸乙酯。
以上所述的溶剂D4为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的缩合剂D1为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的缩合剂D2为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的添加剂D1为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOSu。
以上所述的添加剂D2为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOBt。
以上所述的碱D1为碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠其中的一种，优选碳酸钠，因为碳酸钠为二元碱，而以上所述的碱都视为一元碱，使用量是一元碱的量，所以使用碳酸钠时物质的量减半。
2.2、HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe的合成：18mmol（以Fmoc-Asn(Trt)-OH为起始物料）
室温下Fmoc-Gly-OH（20mmol）加入30ml溶剂E1，加入22mmol添加剂E1（HOSu），加入23mmol缩合剂E1(DIC)，在35-40℃搅拌反应30min，同时准备H-Asp(OtBu)-OH（22mmol）+22mmol碱E1用水30ml溶解待用，待反应到30min之后，降温至20-25℃，加入准备好的H-Asp(OtBu)-OH-碱水溶液，反应30min，加入20ml溶剂E2，搅拌2min后分液，保留水相，有机相加入2ml饱和碳酸氢钠钠水溶液+10ml水+2ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相2min，分液后得水相，合并水相，加入20ml溶剂E2搅拌洗涤2min，分液后得水相加入40ml溶剂E3，搅拌下加入盐酸调节pH≤2，分液保留有机相，有机相加入饱和氯化钠溶液20ml洗涤2min，分液保留有机相得到Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH溶液。
22mmol缩合剂E2(TBTU)用30ml DMF溶解备用，苯丙氨酸甲酯盐酸盐（22mmol）和DIEA（56mmol）依次加入到Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH溶液中，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂E2溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，之后加入60ml溶剂E3，再加入22%的氯化钠水溶液100ml，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液80ml，并加入盐酸调节pH≤2以内，分液，保留有机相加入40ml水和20ml饱和碳酸氢钠钠溶液搅拌洗涤，搅拌2min后分液，保留有机相加入20ml水+20ml饱和碳酸氢钠钠搅拌洗涤，搅拌2min后分液，保留有机相；有机相减压浓缩至溶液体积为30-40ml，得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe溶液。
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe溶液加入20ml二乙胺，在25-30℃反应30min，减压浓缩至干，加入10ml溶剂E3搅拌溶解，再减压浓缩至粘稠状，然后再加入10ml溶剂E3和DIEA1ml，再减压浓缩至粘稠状，至此完全蒸出二乙胺，加入40ml溶剂E3得H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe溶液。
20mmol缩合剂E3(TBTU)用25ml DMF溶解备用，Fmoc-Asn(trt)-OH（18mmol）和DIEA（32mmol）依次加入到H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe溶液中，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂E3溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，加入30ml二乙胺，在25-30℃反应30min，减压浓缩蒸出二乙胺和溶剂E3，剩下DMF，加入22%氯化钠水溶液80ml和100ml溶剂E4，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液90ml，并加入盐酸调节pH≤2，分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液60ml搅拌洗涤2min分液，保留有机相减压浓缩至溶液体积剩余70-80ml之间，得HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe溶液。
加入100ml溶剂E5在室温下搅拌析晶60min，抽滤用溶剂E5洗涤一次抽干，干燥得HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe，收率85%左右，纯度98.0%以上。
以上所述的溶剂E1为：四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯+DMF、甲基四氢呋喃+DMF其中的一种溶剂或者溶剂组合，前4个为溶剂，后两个为溶剂组合，溶剂组合内部组分比例为1：1。优选溶剂四氢呋喃。
以上所述的溶剂E2为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂E3为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯其中的一种溶剂，优选甲酸乙酯。
以上所述的溶剂E4为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯其中的一种溶剂，优选乙酸乙酯。
以上所述的溶剂E5为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的缩合剂E1为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的缩合剂E2为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的缩合剂E3为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的添加剂E1为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOSu。
以上所述的碱E1为碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠其中的一种，优选碳酸钠，因为碳酸钠为二元碱，而以上所述的碱都视为一元碱，使用量是一元碱的量，所以使用碳酸钠时物质的量减半。
2.3、HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe合成（15mmol）
HCl.H-Asn(trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe（15mmol）用20ml 溶剂F1溶解，加入DIEA（30mmol），用10mlDMF溶解Fmoc-Gly-Gly-OBt（16mmol），室温下加入溶剂F1溶液中反应10min，加入20ml二乙胺，在25-30℃反应30min，减压浓缩蒸出二乙胺和溶剂F1，剩下DMF，加入22%氯化钠水溶液50ml和70ml溶剂F2，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液50ml，并加入盐酸调节pH≤2，分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液40ml搅拌洗涤2min分液，保留有机相室温下加入60ml溶剂F3搅拌析晶60min，得HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe溶液。抽滤用溶剂F3洗涤一次抽干，干燥得HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe，收率85%左右，纯度96.0%以上。
以上所述的溶剂F1为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选溶剂四氢呋喃。
以上所述的溶剂F2为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选乙酸乙酯。
以上所述的溶剂F3为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
3、片段c的C-端全保护8肽HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的合成工艺步骤
其中有短肽中间体如下：
（1）Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯
（2）HCl.H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu
工艺流程如下：
（1）Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯合成：
Fmoc-Glu(OtBu)-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Glu(OtBu)-活性酯+H-Glu(OtBu)-OH+碱→Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯
（2）HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu合成：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH+亮氨酸叔丁酯盐酸盐+缩合剂+添加剂→Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OtBu +二乙胺→H-Tyr(tBu)-Leu-OtBu+Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯+碱→Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu +二乙胺→H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu+Fmoc-Pro-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu +二乙胺→H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu+Fmoc-Ile-OH+缩合剂+添加剂→Fmoc-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu +二乙胺→H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu + Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯+碱→Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu +二乙胺→H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu+HCl→HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu
其中短肽Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯是连续液相合成而来，由Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯为原料连续合成片段c的C-端全保护8肽HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu，可以认为片段c的C-端全保护8肽都是由连续液相合成而来。具体方法如下：
3.1、Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯合成：40mmol
室温下Fmoc-Glu(OtBu)-OH（40mmol）加入60ml溶剂G1，加入44mmol添加剂G1(HOSu)，加入46mmol缩合剂G1(DIC)，在35-40℃搅拌反应30min，同时准备H-Glu(OtBu)-OH（44mmol）+80mmol碱G1用水60ml溶解待用，待反应到30min之后，降温至20-25℃，加入准备好的H-Glu(OtBu)-OH-碱水溶液，反应40min；加入40ml溶剂G2，搅拌2min后分液，保留水相，有机相加入4ml饱和碳酸氢钠钠+20ml水+4ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相2min，分液后保留水相，有机相加入2ml饱和碳酸氢钠钠+10ml水+2ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相2min，分液后得水相，合并所有水相，加入120ml溶剂G3和5g氯化钠，搅拌下加入盐酸调至pH≤2，分液，得有机相用90ml 饱和氯化钠水溶液洗涤分液得有机相，减压浓缩有机相80-90ml溶液体积剩余，加入44mmol添加剂G2(HOBt)，加入46mmol缩合剂G2（DIC），35-40℃下反应20-40min有大量白色固体即副产物二异丙基脲析出，冷却至室温后抽滤除去副产物；继续在35-40℃下反应20min，加入400ml溶剂G4搅拌析晶，然后冷却至20-25℃搅拌析晶60min，抽滤抽干，用溶剂G4洗涤一次抽干，干燥后得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯纯度98.0%以上，收率80%左右。
以上所述的溶剂G1为：四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯+DMF、甲酸乙酯+DMF、甲基四氢呋喃+DMF其中的一种溶剂或者溶剂组合，前4个为溶剂，后两个为溶剂组合，溶剂组合内部组分比例为1：1。优选溶剂甲酸乙酯+DMF的溶剂组合，甲酸乙酯+DMF中体积比为1：1。
以上所述的溶剂G2为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂G3为四氢呋喃、DMF、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯其中的一种溶剂，优选乙酸乙酯。
以上所述的溶剂G4为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选庚烷。
以上所述的缩合剂G1为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的缩合剂G2为：DCC、DIC、EDC.HCl其中的一种缩合剂，优选DIC。
以上所述的添加剂G1为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOSu。
以上所述的添加剂G2为HOSu、HONB、HOBt其中的一种，优选HOBt。
以上所述的碱G1为碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠其中的一种，优选碳酸钠，因为碳酸钠为二元碱，而以上所述的碱都视为一元碱，使用量是一元碱的量，所以使用碳酸钠时物质的量减半。
3.2、HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu合成：16mmol（以Fmoc-Pro-OH为起始物料）
20mmol缩合剂H1(乙酸乙酯)用25ml DMF溶解备用，Fmoc-Tyr(tBu)-OH（18mmol）和DIEA（50mmol）和亮氨酸叔丁酯盐酸盐（19mmol）用40ml溶剂H1溶解，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂H1溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，加入40ml溶剂H1和20%氯化钠水溶液80ml，搅拌洗涤2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液60ml，并加入盐酸调节pH≤2，分液，保留有机相加入40ml水+20ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌洗涤2min分液，保留有机相减压浓缩至溶液体积剩余30-40ml之间，加入20ml二乙胺，20-25℃反应30min，减压浓缩蒸干溶剂，加入10ml溶剂H1再次减压蒸干溶剂，再加入5ml 溶剂H1和1mlDIEA再次减压蒸干溶剂；最后加入40ml溶剂H2溶解得H-Tyr(tBu)-Leu-OtBu溶液。
H-Tyr(tBu)-Leu-OtBu溶液加入DIEA（18mmol）在室温下搅拌，加入Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯（18mmol），固体溶解澄清后反应10min，加入20ml二乙胺，在25-30℃反应30min，减压浓缩蒸出二乙胺和溶剂H2，加入5%氯化钠水溶液50ml和60ml溶剂H3，并加入盐酸调节pH≤2，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入水40ml和碳酸钠（20mmol）搅拌溶解2min后分液，保留有机相，室温下加入160ml溶剂H4搅拌析晶60min，抽滤用溶剂H4洗涤一次抽干，得H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu湿品保留待用。经HPLC检测纯度为97.0%以上。
18mmol缩合剂H2(乙酸乙酯)用22ml DMF溶解备用，Fmoc-Pro-OH（16mmol）和DIEA（30mmol）和上述H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu湿品用20ml溶剂H5溶解，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂H2溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，加入20ml二乙胺，室温下反应30min，减压浓缩蒸出二乙胺和溶剂H5，得H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的DMF溶液，加入80ml溶剂H5和20%氯化钠水溶液70ml，搅拌洗涤2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液60ml，搅拌洗涤2min分液，保留有机相加入180ml溶剂H5和100ml水，室温搅拌下加入盐酸调节pH≤2析晶，搅拌析晶30min，抽滤，分别用水和溶剂H5洗涤一次抽干，得HCl.H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu湿品保留待用。经HPLC检测纯度为98.0%以上。
16mmol缩合剂H3(甲基叔丁基醚)用20ml DMF溶解备用，Fmoc-Ile-OH（15mmol）和DIEA（30mmol）和上述HCl.H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu湿品用40ml溶剂H6溶解，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入缩合剂H3溶液反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10min，加入30ml二乙胺，室温下反应30min，减压浓缩蒸出二乙胺和溶剂H6，得H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的DMF溶液，加入70ml溶剂H7和20%氯化钠水溶液60ml，搅拌洗涤2min后分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液60ml，加入盐酸调节pH≤2，搅拌洗涤2min分液，保留有机相加入5%氯化钠水溶液40ml，搅拌洗涤2min分液，保留有机相加入DMF 15ml，减压蒸馏蒸出溶剂H7，得HCl.H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的DMF溶液。
HCl.H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu溶液加入15ml溶剂H8和DIEA(30mmol)在室温下搅拌，加入Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯（15mmol）反应，固体溶解澄清后反应10min，加入20ml二乙胺，在25-30℃反应30min，减压浓缩蒸出二乙胺和溶剂H8，加入10%氯化钠水溶液60ml和80ml溶剂H9，搅拌洗涤2min后分液，保留有机相加入60ml水并加入盐酸调节pH≤2，搅拌均匀2min后分液，保留有机相加入20%氯化钠水溶液40ml，搅拌洗涤2min后分液，保留有机相室温下加入150ml溶剂H10析晶，搅拌析晶30min后抽滤，抽干后加入100ml溶剂H10在45℃下搅拌打浆10min，后加入60ml溶剂H9，然后自然冷却至室温并搅拌打浆2h，抽滤，抽干后用溶剂H10洗涤一次抽干，干燥后得HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu，纯度92.0%以上，收率（以Fmoc-Pro-OH为起始物料来算）80%左右。
以上所述的溶剂H1为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选溶剂乙酸乙酯。
以上所述的溶剂H2为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选溶剂乙酸乙酯。
以上所述的溶剂H3为甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂H4为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选庚烷。
以上所述的溶剂H5为甲酸乙酯、乙酸甲酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选溶剂乙酸乙酯。
以上所述的溶剂H6为四氢呋喃、甲酸乙酯、乙酸甲酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选溶剂乙酸乙酯。
以上所述的溶剂H7为甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂H8为甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷、其中的一种溶剂，优选乙酸乙酯。
以上所述的溶剂H9为甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲基四氢呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂H10为庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、异丙醚其中的一种溶剂，优选庚烷。
以上所述的缩合剂H1为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的缩合剂H2为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
以上所述的缩合剂H3为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选TBTU。
4、比伐芦定全保护肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的合成工艺步骤
其中有中间体片段肽中间体如下：
（1）Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH
（2）Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu
工艺流程如下：
（1）Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH的合成：
Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH+HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+缩合剂+添加剂→Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe+碱→Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH
（2）Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的合成：
Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH+HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu+缩合剂+添加剂→Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu
具体方法如下：
4.1、Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH的合成：12mmol
Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH（12mmol）和DIEA（36mmol）和HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe（12mmol）用50mlDMF溶解，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入15mmol缩合剂M1(PyBOP)反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10-30min，HPLC跟踪反应进度，至原料剩余0.5%以内停止反应，加入60ml脱保护添加剂M1和40ml水混合，在10℃下搅拌冷却待用；氢氧化钠（54mmol）用20ml水溶解，冷却至10℃以内，加入到反应液中反应，每10min取样一次HPLC跟踪反应进度，至原料剩余1.0%以内，马上加入盐酸调节pH=3左右淬灭反应；减压浓缩蒸出脱保护添加剂M1，加入50ml DMF混合，室温下匀速滴加到3%氯化钠水溶液400ml中搅拌析晶，搅拌30min后抽滤，抽干后用水洗涤3次抽干，干燥后室温下用200ml溶剂组合打浆2h，抽滤抽干，干燥后得Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH，纯度92%以上，收率90%左右。
以上所述的缩合剂M1为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选PyBOP。
以上所述的脱保护添加剂M1为甲醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃其中的一种溶剂，优选叔丁醇。
以上所述的溶剂组合为乙酸甲酯+甲基叔丁基醚、乙酸乙酯+甲基叔丁基醚、甲酸乙酯+甲基叔丁基醚、二氯甲烷+甲基叔丁基醚其中的一种溶剂组合，优选溶剂组合乙酸乙酯+甲基叔丁基醚，其中体积比为1:1。
4.2、Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu的合成：
10mmol
Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH（10mmol）和DIEA（30mmol）和HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu（10mmol）用80mlDMF溶解，在20-25℃恒温搅拌均匀，加入13mmol缩合剂N1(PyBOP)反应，待固体完全溶解澄清后继续搅拌反应10-30min，HPLC跟踪反应进度，至原料剩余0.5%以内停止反应，加入40ml DMF混合，室温下匀速滴加到3%氯化钠水溶液360ml中搅拌析晶，搅拌30min后抽滤，抽干后用水洗涤3次抽干，干燥后用150ml溶剂N1溶解，室温下加入550ml溶剂N2析晶，搅拌析晶1h，抽滤抽干，用溶剂N2洗涤两次抽干，干燥得比伐芦定全保护肽粗品，纯度86.0%以上，收率90%左右。
以上所述的缩合剂N1为：TBTU、HBTU、PyBOP其中的一种缩合剂，优选PyBOP。
以上所述的溶剂N1为甲醇、乙醇、四氢呋喃其中的一种溶剂，优选乙醇。
以上所述的溶剂N2为甲基叔丁基醚、庚烷、异丙醚其中的一种溶剂，优选庚烷。
5、比伐芦定粗品合成（比伐芦定全保护肽裂解）：9mmol
最后一步为比伐芦定全保护肽的裂解，即把肽链上所有保护基全部脱除。
配置裂解液，其投料物质的量比例为三异丙基硅烷：3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇：水：比伐芦定全保护肽=3：3：20：1，即27mmol三异丙基硅烷、27mmol的3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇、180mmol水，混合后加入150ml三氟乙酸搅拌溶解，澄清后放入15℃下冷却，加入比伐芦定全保护肽粗品溶解反应，移至室温下自然升温，升至室温后反应2h；减压浓缩至100ml溶液待用，准备500ml溶剂P1在-20℃下冷却，搅拌下匀速加入浓缩反应液析晶，滴加完毕后移至室温，自然升至室温搅拌析晶30min，离心沉降，用200ml溶剂P1洗涤一次再次离心沉降，再用150ml溶剂P2洗涤一次再次离心沉降，最后用150ml溶剂P2打浆2h，离心沉降，干燥得比伐芦定粗品，纯度82.0%左右，收率95%左右。
以上所述的溶剂P1为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷其中的一种溶剂，优选甲基叔丁基醚。
以上所述的溶剂P2为乙腈、四氢呋喃、乙醇其中的一种溶剂，优选乙腈。
以上显示和描述了本发明创造的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明创造精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
a）、用半连续液相法合成片段a：N-端全保护6肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH；用半连续液相法合成片段b：中端全保护6肽HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe；用连续液相法合成片段c：C-端全保护8肽HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；
b）、将片段a和b缩合后脱保护，得到片段d，即N-端全保护12肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH；
c）、将片段d和片段c缩合得到比伐芦定全保护肽Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；
d）脱除所有保护基团得到比伐芦定粗品。
2.根据权利要求1所述的半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于：所述片段a的合成工艺是先分别液相合成短肽中间体Boc-D-Phe-Pro-OH和H-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe，然后使两个短肽中间体缩合得到Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe，然后用氢氧化钠脱除保护基并酸化得到Boc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-OH片段a。
3.根据权利要求1所述的半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于：所述片段b的合成工艺是先分别液相合成短肽中间体Fmoc-Gly-Gly-活性酯和HCl.H-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe，然后使两个短肽中间体缩合得到Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe，然后用二乙胺脱除保护基最后再用盐酸酸化得到HCl.H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe片段b。
4.根据权利要求1所述的半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于：所述片段c的合成工艺是先分别液相合成短肽中间体Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-活性酯和HCl.H-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu，然后用二乙胺脱除保护基最后再用盐酸酸化得到HCl.H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu片段c。
5.根据权利要求1所述的半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于：所述片段d的合成，其前体化合物的脱保护由DMF和水作为溶剂，甲醇、乙醇、叔丁醇或四氢呋喃作为脱保护添加剂，氢氧化钠作为碱。
6.根据权利要求2、3、4所述的半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于：所有Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基脱保护试剂是二乙胺。
7.根据权利要求1所述的半连续液相合成比伐芦定的合成工艺，其特征在于：各短肽中间体的提纯采用萃取、洗涤、析晶沉淀工艺。
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Also Published As
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