CN107629111B - 一种乙酰基四肽-2的液相合成方法 - Google Patents

一种乙酰基四肽-2的液相合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乙酰基四肽‑2的液相合成方法，该方法通过液相合成法合成2个N端或侧链保护小片段肽：Ac‑D‑Lys(Boc)‑Asp(OtBu)‑OH和H‑Val‑m‑Tyr‑OMe，再将小片段肽进行缩合后，通过酯交换完成碳端酰胺化，得到带保护的目标产物，然后脱保护得到乙酰基四肽‑2粗品，粗品经纯化后得到乙酰基四肽‑2纯品。本发明合成方法避免了固相法昂贵树脂的使用，克服了固相法每步都使用保护氨基酸、试剂用量过大的缺点，降低了成本，具有合成方法简单、节能环保等优点。

Description

一种乙酰基四肽-2的液相合成方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种通过液相法合成乙酰基四肽-2的方法。
背景技术
乙酰基四肽-2是一种含有4个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为：Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2，是对胸腺生成素Ⅱ的33～36位氨基酸序列的改构，具有一定的调节机体免疫功能作用，能增强皮肤免疫防御力；能增强维持胶原蛋白水平和弹性纤维正确装配的自然因素，促进细胞与细胞外基质的结合，对抗导致皮肤紧实度和粘附力丧失的不利作用，从而改善皮肤状况；其主要表现为表皮厚度的增加及表皮皮肤文理的修复。乙酰基四肽-2主要应用有：抗衰老、抗皱产品、药妆产品、术后护理产品、妊娠纹消除产品、指甲及头发护理产品等。
乙酰基四肽-2的制备方法目前主要采用传统经典的固相多肽合成法，以价格昂贵的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基树脂为起始树脂，以完成碳端酰胺化，所用氨基酸都为全保护氨基酸。此法合成成本高。因此，开发一种低成本合成乙酰基四肽-2的方法成为本领域急需解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服传统固相多肽合成法合成乙酰基四肽-2存在的缺点，提供一种方法简单、成本低、节能环保、易于规模化生成乙酰基四肽-2的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：采用液相合成法合成片段Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH和H-Val-m-Tyr-OMe，然后将这两个片段缩合，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe；Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe与氨甲醇酯交换后得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2；Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2脱保护得到乙酰基四肽-2粗品，粗品经纯化后得到乙酰基四肽-2纯品。
上述Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH的合成方法由下述步骤组成：
(1)合成Ac-D-Lys(Boc)-OH
以二氯甲烷为溶剂，将H-D-Lys(Boc)-OH、N,N′-二异丙基乙胺、乙酸酐在室温下进行反应，反应完后分离纯化，得到Ac-D-Lys(Boc)-OH。
(2)合成Ac-D-Lys(Boc)-COOSu
以四氢呋喃为溶剂，将Ac-D-Lys(Boc)-OH、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺在室温条件下进行反应，反应完后固液分离，得到Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液。
(3)合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
将H-Asp(OtBu)-OH和碳酸氢钠混合水溶液加入到步骤(2)得到的Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃中，室温反应，反应完后分离纯化，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH。
上述合成Ac-D-Lys(Boc)-OH步骤(1)中，所述H-D-Lys(Boc)-OH与N,N′-二异丙基乙胺、乙酸酐的摩尔比为1:(0.5～1):(1～2)，室温反应时间为0.5～2小时。
上述合成Ac-D-Lys(Boc)-COOSu步骤(2)和合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH步骤(3)中，所述Ac-D-Lys(Boc)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、H-Asp(OtBu)-OH、碳酸氢钠的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2):(1～2):(1～2.5)；在步骤(2)中，室温反应时间为4～6小时；在步骤(3)中，室温反应时间为10～12小时。
上述H-Val-m-Tyr-OMe的合成方法由下述步骤组成：
(1)合成Boc-Val-OH
将H-Val-OH、碳酸钠溶解于纯水中，然后加入二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，室温进行反应，反应完后分离纯化，得到Boc-Val-OH。
(2)合成Boc-Val-m-Tyr-OMe
以二氯甲烷为溶剂，将Boc-Val-OH、1-羟基苯丙三唑、H-m-Tyr-OMe、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)、N,N′-二异丙基乙胺在室温下进行反应，反应完后分离纯化，得到Boc-Val-m-Tyr-OMe。
(3)合成H-Val-m-Tyr-OMe
将Boc-Val-m-Tyr-OMe加入三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应完后分离纯化，得到H-Val-m-Tyr-OMe。
上述合成Boc-Val-OH步骤(1)中，所述H-Val-OH与碳酸钠、二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:(0.5～1):(1～2)，室温反应时间为20～24小时。
上述合成Boc-Val-m-Tyr-OMe步骤(2)中，所述Boc-Val-OH与1-羟基苯丙三唑、H-m-Tyr-OMe、EDCI·HCl、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:(1～2):(1～2):(1～2):(1～4)，室温反应时间为20～24小时。
上述Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH和H-Val-m-Tyr-OMe缩合的方法为：以四氢呋喃为溶剂，将Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺在室温下反应4～6小时，固液分离，得到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液；将H-Val-m-Tyr-OMe与N,N′-二异丙基乙胺依次加入到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10～12小时，分离纯化产物，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe，其中Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、H-Val-m-Tyr-OMe、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2):(1～2):(1～2.5)。
本发明以N-C延伸策略，将乙酰基四肽-2的4个氨基酸分成2个片段，分别采用液相合成法合成2个N端或侧链保护小片段肽，再将小片段进行缩合后，经酯交换得到带保护的目标产物，然后脱保护得到乙酰基四肽-2粗品，粗品经纯化后得到乙酰基四肽-2纯品。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提高了合成效率，减少了杂质累积，为有效解决乙酰基四肽-2规模化生产提供了一种新方法。
2、本发明尽可能降低成本较高的全保护氨基酸原料的使用，提高价格低廉的游离氨基酸或部分保护的氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。
3、本发明采用液相法合成，避免了固相法中价格昂贵的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基树脂的使用。
4、本发明合成时反应主要以水和四氢呋喃作溶剂，所用溶剂回收后经简单处理后可重复使用，更环保，克服了固相反应中每步必须使用保护氨基酸、试剂明显过量及溶剂难以回收的缺点，具有合成方法简单，节能环保等优点，大幅降低了生产成本。
附图说明
图1是实施例1合成的乙酰基四肽-2的质谱图。
图2是实施例1合成的乙酰基四肽-2经纯化后的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
(1)合成Ac-D-Lys(Boc)-OH
将24.6g(100mmol)H-D-Lys(Boc)-OH与180mL二氯甲烷和8.7mL(50mmol)N,N′-二异丙基乙胺混合溶解，之后加入11.3mL(120mmol)乙酸酐，室温反应1小时；将反应液浓缩后加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到17.9g Ac-D-Lys(Boc)-OH。
(2)合成Ac-D-Lys(Boc)-COOSu
将17.9g(95mmol)Ac-D-Lys(Boc)-OH、200mL四氢呋喃和12.0g(105mmol)N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入17.8g(114mmol)二环己基碳二亚胺，室温反应4小时，反应完后固液分离，得到Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液。
(3)合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
将含18.0g(95mmol)H-Asp(OtBu)-OH和8.8g(105mmol)碳酸氢钠的混合水溶液180mL加入到步骤(2)得到的Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，过滤，洗涤滤饼，40℃真空干燥，得到29.4g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH。
2、合成H-Val-m-Tyr-OMe
(1)合成Boc-Val-OH
将23.4g(200mmol)H-Val-OH、12.7g(120mmol)碳酸钠及250mL纯水混合溶解，之后加入150mL含48.0g(220mmol)二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，室温反应20小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，除水后浓缩再加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到40.1g Boc-Val-OH。
(2)合成Boc-Val-m-Tyr-Ome
将40.1g(185mmol)Boc-Val-OH与450mL二氯甲烷混匀，搅拌下依次加入32.5g(240mmol)1-羟基苯丙三唑、43.3g(222mmol)H-m-Tyr-OMe、53.1g(277mmol)EDCI·HCl、95.9mL(554mmol)N,N′-二异丙基乙胺，室温反应24小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，除水后浓缩再加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到69.2g Boc-Val-m-Tyr-OMe。
(3)合成H-Val-m-Tyr-Ome
将69.2g Boc-Val-m-Tyr-OMe加入500mL体积浓度为50％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应2小时，加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到50.6g H-Val-m-Tyr-OMe。
3、缩合合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe
将18.0g(50mmol)Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH、100mL四氢呋喃和6.3g(55mmol)N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入12.4g(60mmol)二环己基碳二亚胺，室温反应5小时，固液分离，得到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液；将14.7g(50mmol)H-Val-m-Tyr-OMe与10.4mL(60mmol)N,N′-二异丙基乙胺依次加入到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，过滤，洗涤滤饼，40℃真空干燥，得到25.4g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe。
4、酯交换合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2
将25.4g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe加入到300mL氨甲醇中，室温反应2天，固液分离，洗涤、室温真空干燥，得到18.1g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2。
5、脱保护合成Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2将18.1g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2加入到100mL脱保护溶液(三氟乙酸与水体积比9:1的混合液)中，室温反应2小时，浓缩反应液，加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到15.8g Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2，即乙酰基四肽-2粗品，收率为56％。粗品先采用反相高效液相色谱纯化(流动相A：体积分数为0.05％的三氟乙酸水溶液；流动相B：体积分数为0.05％的三氟乙酸甲醇溶液，洗脱梯度：流动相B 3％5min，3％-15％60min，15％恒流；检测波长215nm，流速30mL/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料：GEL反相聚合物)，然后采用离子交换除三氟乙酸(体积分数为2％的乙酸水溶液恒流，检测波长215nm，流速8mL/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料DEAE)，最后冷冻干燥，得到乙酰基四肽-2纯品。
采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1。由图1可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与乙酰基四肽-2的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为乙酰基四肽-2。采用液相色谱仪对纯化后的乙酰基四肽-2进行纯度测定，液相色谱图见图2，由图2可见，乙酰基四肽-2的纯度大于98％。
实施例2
1、合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
(1)合成Ac-D-Lys(Boc)-OH
将24.6g(100mmol)H-D-Lys(Boc)-OH与200mL二氯甲烷和12.1mL(70mmol)N,N′-二异丙基乙胺混合溶解，之后加入12.3mL(130mmol)乙酸酐，室温反应2小时；将反应液浓缩后加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到17.5g Ac-D-Lys(Boc)-OH。
(2)合成Ac-D-Lys(Boc)-COOSu
将17.5g(93mmol)Ac-D-Lys(Boc)-OH、200mL四氢呋喃和12.8g(112mmol)N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入18.8g(121mmol)二环己基碳二亚胺，室温反应4小时，反应完后固液分离，得到Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液。
(3)合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
将含19.4g(102mmol)H-Asp(OtBu)-OH和9.4g(112mmol)碳酸氢钠的混合水溶液200mL加入到步骤(2)得到的Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，过滤，洗涤滤饼，40℃真空干燥，得到28.4g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH。
2、合成H-Val-m-Tyr-OMe
(1)合成Boc-Val-OH
将23.4g(200mmol)H-Val-OH、14.8g(140mmol)碳酸钠及250mL纯水混合溶解，之后加入150mL含56.7g(260mmol)二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，室温反应24小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，除水后浓缩再加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到40.8g Boc-Val-OH。
(2)合成Boc-Val-m-Tyr-Ome
将40.8g(188mmol)Boc-Val-OH与500mL二氯甲烷混匀，搅拌下依次加入35.6g(263mmol)1-羟基苯丙三唑、47.7g(244mmol)H-m-Tyr-OMe、54.1g(282mmol)EDCI·HCl、97.6mL(567mmol)N,N′-二异丙基乙胺，室温反应24小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，除水后浓缩再加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到68.2g Boc-Val-m-Tyr-OMe。
(3)合成H-Val-m-Tyr-OMe
将68.2g Boc-Val-m-Tyr-OMe加入500mL体积浓度为50％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应3小时，加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到50.9g H-Val-m-Tyr-OMe。
3、缩合合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe
将18.0g(50mmol)Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH、100mL四氢呋喃和6.9g(60mmol)N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入13.4g(65mmol)二环己基碳二亚胺，室温反应5小时，固液分离，得到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液；将19.1g(65mmol)H-Val-m-Tyr-OMe与12.1mL(70mmol)N,N′-二异丙基乙胺依次加入到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，过滤，洗涤滤饼，40℃真空干燥，得到27.0g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe。
4、酯交换合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2
将27.0g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe加入到300mL氨甲醇中，室温反应2天，固液分离，洗涤、室温真空干燥，得到18.5g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2。
5、脱保护合成Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2
将18.5g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2加入到100mL脱保护溶液(三氟乙酸与水体积比9:1的混合液)中，室温反应2.5小时，浓缩反应液，加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到15.8g Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2，即乙酰基四肽-2粗品，收率为56％，粗品按照实施例1的方法纯化后得到乙酰基四肽-2纯品。
实施例3
1、合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
(1)合成Ac-D-Lys(Boc)-OH
将24.6g(100mmol)H-D-Lys(Boc)-OH与200mL二氯甲烷和13.8mL(80mmol)N,N′-二异丙基乙胺混合溶解，之后加入14.2mL(150mmol)乙酸酐，室温反应1.5小时；将反应液浓缩后加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到17.3g Ac-D-Lys(Boc)-OH。
(2)合成Ac-D-Lys(Boc)-COOSu
将17.3g(92mmol)Ac-D-Lys(Boc)-OH、200mL四氢呋喃和13.8g(120mmol)N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入20.1g(129mmol)二环己基碳二亚胺，室温反应6小时，反应完后固液分离，得到Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液。
(3)合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
将含20.9g(110mmol)H-Asp(OtBu)-OH和10.0g(120mmol)碳酸氢钠的混合水溶液200mL加入到步骤(2)得到的Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，过滤，洗涤滤饼，40℃真空干燥，得到27.5g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH。
2、合成H-Val-m-Tyr-OMe
(1)合成Boc-Val-OH
将23.4g(200mmol)H-Val-OH、17.0g(160mmol)碳酸钠及250mL纯水混合溶解，之后加入150mL含65.5g(300mmol)二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，室温反应24小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，除水后浓缩再加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到41.7g Boc-Val-OH。
(2)合成Boc-Val-m-Tyr-Ome
将41.7g(192mmol)Boc-Val-OH与500mL二氯甲烷混匀，搅拌下依次加入41.5g(307mmol)1-羟基苯丙三唑、56.2g(288mmol)H-m-Tyr-OMe、73.6g(384mmol)EDCI·HCl、99.7mL(576mmol)N,N′-二异丙基乙胺，室温反应24小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，除水后浓缩再加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到68.1g Boc-Val-m-Tyr-OMe。
(3)合成H-Val-m-Tyr-OMe
将68.1g Boc-Val-m-Tyr-OMe加入500mL体积浓度为50％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应2小时，加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到48.3g H-Val-m-Tyr-OMe。
3、缩合合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe
将18.0g(50mmol)Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH、100mL四氢呋喃和8.6g(75mmol)N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入16.5g(80mmol)二环己基碳二亚胺，室温反应5小时，固液分离，得到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液；将22.1g(75mmol)H-Val-m-Tyr-OMe与17.3mL(100mmol)N,N′-二异丙基乙胺依次加入到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10小时，浓缩反应液，用质量分数为20％的柠檬酸水溶液酸化至pH 5～6，过滤，洗涤滤饼，40℃真空干燥，得到22.1g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe。
4、酯交换合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2
将22.1g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe加入到300mL氨甲醇中，室温反应2天，固液分离，洗涤、室温真空干燥，固体，得到19.3g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2。
5、脱保护合成Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2
将19.3g Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2加入到100mL脱保护溶液(三氟乙酸与水体积比9:1的混合液)中，室温反应2小时，浓缩反应液，加乙醚打浆，过滤，洗涤滤饼，室温真空干燥，得到17.2g Ac-D-Lys-Asp-Val-m-Tyr-NH2，即乙酰基四肽-2粗品，收率为61％。粗品按照实施例1的方法纯化后得到乙酰基四肽-2纯品。。
上述的Otbu、Boc、OMe、Ac都是保护基，名称分别是叔丁氧基、叔丁氧羰基、甲酯、乙酰基。
上述序列中各个氨基酸选择的保护基可以是任意保护基，只要能够达到所希望的可以保护的技术效果即可，但发明人经过优选上述取代基效果最好。选择所述氮端和碳端是兼顾氨基酸作为碳端和氮端的反应活性以利于片段的缩合反应，同时兼顾溶解性，这样可以有效减少合成步骤、提高效率、降低成本，减少处理步骤。

Claims (8)

1.一种乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：采用液相合成法合成片段Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH和H-Val-m-Tyr-OMe，然后将这两个片段缩合，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe；Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m- Tyr-OMe与氨甲醇酯交换后得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2；Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-NH2脱保护得到乙酰基四肽-2粗品，粗品经纯化后得到乙酰基四肽-2纯品；
上述Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH的合成方法由下述步骤组成：
（1）合成Ac-D-Lys(Boc)-OH
以二氯甲烷为溶剂，将H-D-Lys(Boc)-OH、N,N´-二异丙基乙胺、乙酸酐在室温下进行反应，反应完后分离纯化，得到Ac-D-Lys(Boc)-OH；
（2）合成Ac-D-Lys(Boc)-COOSu
以四氢呋喃为溶剂，将Ac-D-Lys(Boc)-OH、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺在室温条件下进行反应，反应完后固液分离，得到Ac-D-Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃溶液；
（3）合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH
将H-Asp(OtBu)-OH和碳酸氢钠混合水溶液加入到步骤（2）得到的Ac-D- Lys(Boc)-COOSu的四氢呋喃中，室温反应，反应完后分离纯化，得到Ac-D-Lys(Boc) -Asp(OtBu)-OH；
上述H-Val-m-Tyr-OMe的合成方法由下述步骤组成：
（1）合成Boc-Val-OH
将H-Val-OH、碳酸钠溶解于纯水中，然后加入二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，室温进行反应，反应完后分离纯化，得到Boc-Val-OH；
（2）合成Boc-Val-m-Tyr-OMe
以二氯甲烷为溶剂，将Boc-Val-OH、1-羟基苯丙三唑、H-m-Tyr-OMe、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N´-二异丙基乙胺在室温下进行反应，反应完后分离纯化，得到Boc-Val-m-Tyr-OMe；
（3）合成H-Val-m-Tyr-OMe
将Boc-Val-m-Tyr-OMe加入三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应完后分离纯化，得到H-Val-m-Tyr-OMe；
上述Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe的合成方法为：以四氢呋喃为溶剂，将Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺在室温下反应4～6小时，固液分离，得到Ac-D-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)- COOSu的四氢呋喃溶液；将H-Val-m-Tyr-OMe与N,N´-二异丙基乙胺依次加入到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温反应10～12小时，分离纯化产物，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe。
2.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在 Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH的合成方法步骤（1）中，所述H-D-Lys(Boc)-OH与N,N´-二异丙基乙胺、乙酸酐的摩尔比为1:（0.5～1）:（1～2）；室温反应时间为0.5～2小时。
3.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH的合成方法步骤（2）和（3）中，所述Ac-D-Lys(Boc)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、H-Asp(OtBu)-OH、碳酸氢钠的摩尔比为1:（1～1.5）:（1～2）:（1～2）:（1～2.5）。
4.根据权利要求3所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH的合成方法步骤（2）中，室温反应时间为4～6小时。
5.根据权利要求3所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH的合成方法步骤（3）中，室温反应时间为10～12小时。
6.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在H-Val-m-Tyr-OMe的合成方法步骤（1）中，所述H-Val-OH与碳酸钠、二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:（0.5～1）:（1～2）；室温反应时间为20～24小时。
7.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在H-Val-m-Tyr-OMe的合成方法步骤（2）中，所述Boc-Val-OH与1-羟基苯丙三唑、H-m-Tyr-OMe、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N´-二异丙基乙胺的摩尔比为1:（1～2）:（1～2）:（1～2）:（1～4）；室温反应时间为20～24小时。
8.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的液相合成方法，其特征在于：在Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-m-Tyr-OMe的合成方法中，所述Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、H-Val-m-Tyr- OMe、N,N´-二异丙基乙胺的摩尔比为1:（1～1.5）:（1～2）:（1～2）:（1～2.5）。
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