CN111944016B - 一种醋酸艾替班特的制备方法 - Google Patents

一种醋酸艾替班特的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种醋酸艾替班特的制备方法，属于药物合成技术领域。所述制备方法包括：采用固相合成法，按照醋酸艾替班特主链肽顺序依次将N端和侧链有保护基团的氨基酸和二肽片段连接到树脂固相载体上，得到树脂肽，其中精氨酸的胍基被硝基保护，甘氨酸N端连接了2,4‑二甲氧基苄基；利用裂解试剂裂解树脂肽，分离出裂解肽链，再用钯碳催化脱去硝基，得到艾替班特粗品，纯化后制得醋酸艾替班特。本发明采用硝基保护基对精氨酸残基进行保护，大大降低了合成成本；合成过程中相应的氨基酸位置上利用二肽片段、骨架修饰肽，减少缺失肽和插入肽杂质，制备工艺简单、稳定且商业上可行。

Description

一种醋酸艾替班特的制备方法
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种制备醋酸艾替班特的方法。
背景技术
艾替班特是一种对缓激肽B2受体有选择性的竞争性拮抗剂，其亲和力与缓激肽相似。缓激肽是一种血管扩张剂，被认为是导致局部肿胀、炎症和疼痛的典型遗传性血管水肿症状的原因。艾替班特抑制缓激肽与B2受体结合，从而治疗遗传性血管水肿急性发作的临床症状。艾替班特是由五种非蛋白质氨基酸组成的合成十肽。2011年，由Shire OrphanTherapies公司开发的艾替班特作为皮下注射剂在美国获得初步批准。
专利文献US5648333A公开了艾替班特及其制备方法。
专利文献CN107417770A公开了通过使用新型偶联试剂，如：2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯(O-NosylOXY)来抑制消旋肽杂质D-Thi6-艾替班特和D-Ser7-艾替班特，从而提高收率和纯度的合成方法。然而，用该试剂合成醋酸艾替班特在商业上是不可行的，而且该试剂的合成、储存和使用对使用者和环境都不友好。
专利文献CN103992383A公开了一种固相多肽合成法制备醋酸艾替班特的方法，其中，最后两个氨基酸采用二肽片段Boc-D-Arg-Arg-OH.2HCl来偶联，以抑制des-D-Arg1-艾替班特和des-Arg2-艾替班特这两个缺失肽。然而这个二肽片段需要通过液相合成制备，精氨酸的盐酸盐不是合成二肽片段的合适原料，而且这种二肽片段Boc-D-Arg-Arg-OH的固相偶联也很冗长。
在固相多肽合成中，使用有适当保护基的氨基酸和偶联剂是关键。通常，采用构建模块Fmoc-Arg(Pmc/Pbf)-OH进行合成，但是这种构建模块非常昂贵且商业上不易获得。
专利文献EP3478704A1公开了采用液相合成法合成醋酸艾替班特的过程，其中在液相中合成了五肽片段、二肽片段和三肽片段，并将这些片段逐一偶联得到艾替班特十肽。但是采用液相法合成十肽比较繁琐，而且会产生多种杂质，进而使纯化变得冗长。在溶液相策略中，随着肽链长度的增加，外消旋杂质将会大幅增加。
上述制备艾替班特的方法各有缺点，这些方法由于技术复杂，成本高，不适合大规模生产。因此工艺不具有商业可行性或实际操作问题依然存在。
研究者在固相合成过程中，观察到多肽有强烈的聚集趋势。原因如下：生长的肽序列易形成β片状结构，导致多肽树脂崩塌。在这种情况下，试剂在多肽树脂中的分散受到限制，偶联和脱保护反应迟钝、不完全，从而产生缺失、加成，消旋肽杂质，纯化困难，导致产率低。
因此，开发一种高产率、可放大、成本效益高、环境友好和商业上可行的艾替班特制备方法，避免重复繁琐和冗长的纯化步骤是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本高效益的方法来合成低消旋化的醋酸艾替班特，以克服现有技术存在的工艺繁琐、纯度低等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种醋酸艾替班特的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过液相合成二肽片段Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH；
(2)采用固相合成法，按照醋酸艾替班特主链肽顺序依次将N端和侧链有保护基团的氨基酸和二肽片段连接到树脂固相载体上，得到树脂肽，其中精氨酸的胍基被硝基保护，甘氨酸在N端嵌入了2,4-二甲氧基苄基；
(3)利用裂解试剂裂解树脂肽，分离出裂解肽链，再用钯碳催化脱去硝基，得到艾替班特粗品，纯化后制得醋酸艾替班特。
所述艾替班特的结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002648852580000031
上述醋酸艾替班特的制备工艺流程如图1所示。
本发明中参与固相合成的单个氨基酸使用特定的正交保护基进行保护。具体地，采用硝基保护基对精氨酸残基进行保护，即Fmoc-Arg(NO2)-OH替代现有技术中常用的昂贵且不易获得的构建模块Fmoc-Arg(Pmc/Pbf)-OH，大大降低了合成成本。
本发明在固相合成过程中相应的氨基酸位置上利用二肽片段Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH，以减少des-Arg2-艾替班特、des-Pro3-艾替班特、des-Ser7-艾替班特和des-D-Tic8-艾替班特等缺失肽；通过插入2,4-二甲氧基苄基(Dmb)保护基对甘氨酸残基进行骨架修饰，以破坏β片状结构从而抑制多肽聚集。通过上述手段减少缺失肽和插入肽杂质的产生，提升产物纯度。
作为优选，最后一个氨基酸偶联采用Boc-D-Arg(NO2)-OPfp。将OPfp酯用于固相多肽合成，可以避免使用其它偶联剂如DIC、HBTU、TBTU、PyBoP、HATU、HCTU等。通过在Arg1位置使用Boc-D-Arg(NO2)-OPfp，可以减少des-D-Arg1-艾替班特杂质。
本发明利用固相法将单个氨基酸和二肽片段按顺序偶联，具体为：先将Fmoc-Arg(NO2)-OH偶联到树脂固相载体上，脱Fmoc保护基后偶联下一个氨基酸，序列中的其他氨基酸按照以下顺序进行偶联和脱保护：Fmoc-Oic-OH、Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH、Fmoc-Thi-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Boc-D-Arg(NO2)-OPfp，得到Boc-D-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Hyp(tBu)-(Dmb)Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(NO2)-树脂固相载体。
所述树脂固相载体为wang树脂，取代度为1.0～1.2mmol/g。
在第一个氨基酸即Fmoc-Arg(NO2)-OH锚定后，用溶于DMF溶剂的20％哌啶裂解Fmoc基团，游离胺基与序列中的下一个氨基酸偶联，即Fmoc-Oic-OH。依次地，按照序列顺序脱保护和偶联。
在偶联过程中，对于C-末端含酸基的氨基酸，在DIC/HOBT体系下进行偶联。在DIC/HOBt偶合体系下，没有形成消旋杂质。
Fmoc氨基酸和偶联试剂总是过量使用。作为优选，各Fmoc氨基酸片段和肽偶联试剂的添加量均为树脂取代物的2-4倍当量。
固相合成过程中通过Kaiser试验和四氯苯醌试验监测偶合和解偶合。
本发明通过按顺序连接实现了完整的合成。该方法完成了偶联和脱保护反应，减少了外消旋，从而控制住了与目标分子非常接近的异构杂质，从而简化了肽的纯化过程。
所有氨基酸的连接完成后，使用裂解试剂将肽链从树脂上切割下来。
所述裂解试剂为三氟乙酸(TFA)、苯酚、三异丙基硅烷(TIS)和水以不同比例混合。作为优选，步骤(3)中，裂解试剂为三氟乙酸、苯酚、三异丙基硅烷和水以体积比为92.5：2.5：2.5：2.5混合所得。所需的裂解试剂和树脂肽的质量比为8～10：1。
裂解条件为0～40℃下反应2～5小时。作为优选，10～20℃下反应3～4小时。
裂解反应结束后，收集滤液，加入异丙醚和甲苯，并在20-30℃下放置以沉淀产物，将沉淀产物过滤，用异丙醚打浆洗涤2-5次并干燥。
分离得到裂解肽链后，利用Pd-C和甲酸还原硝基保护的艾替班特，从而得到艾替班特的粗品。作为优选，裂解肽链溶于甲酸中，加入Pd/C，在45℃下搅拌4-6小时。裂解肽链和Pd/C的质量比为3～4：1。
反应完成后，过滤以分离Pd/C，将滤液即溶于甲酸的艾替班特粗品直接用反相色谱来纯化。
所述纯化分两步进行，第一步：将艾替班特粗品装入C18反相柱，以0.1％TFA水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行洗脱，收集目标峰馏分；第二步：将收集的目标峰馏分装入C18反相柱，用0.15％醋酸铵溶液洗涤，然后以0.2％醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行洗脱，收集目标产物。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明采用硝基保护基对精氨酸残基进行保护，大大降低了合成成本。
(2)在艾替班特固相合成过程中相应的氨基酸位置上采用了Boc-D-Arg(NO2)-OPfp、Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH等原料，从而减少了des-D-Arg1-艾替班特、des-Arg2-艾替班特、des-Pro3-艾替班特、des-Ser7-艾替班特和des-D-Tic8-艾替班特等缺失肽。
(3)将二甲氧基苄基(Dmb)基团嵌入甘氨酸来进行骨架修饰，通过在第5位使用Fmoc-(Dmb)Gly-OH，可以破坏β片状结构从而大大减少聚集，进而大大减少缺失肽和插入肽杂质。
(4)本发明提供的制备工艺简单、稳定且商业上可行。
附图说明
图1为本发明醋酸艾替班特的制备工艺流程图。
图2为实施例1中Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH的液相合成反应示意图。
图3为实施例1中分步固相合成法制备树脂肽的反应示意图。
图4为实施例1中裂解树脂肽的反应示意图。
图5为实施例1中艾替班特粗品的合成反应示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细说明，这些示例仅用于说明，不应被解释为对发明范围的限制。
实施例中采用的原料、试剂均为市场化商品。
1、英文缩写说明如下：
Boc中文名称：叔丁氧羰基；
DIC中文名称：N,N'-二异丙基碳二亚胺；
DMAP中文名称：二甲氨基吡啶；
DMF中文名称：N,N-二甲基甲酰胺；
Fmoc中文名称：9-芴基甲氧羰基；
HOBt中文名称：1-羟基苯并三唑；
MeOH中文名称：甲醇；
HATU中文名称：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
HBTU中文名称：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
HCTU中文名称：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；
TBTU中文名称：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯；
TFA中文名称：三氟乙酸；
Pfp中文名称：五氟苯基；
tBu中文名称：叔丁基；
TIS中文名称：三异丙基硅烷；
Arg中文名称：精氨酸；
Pro中文名称：脯氨酸；
Hyp中文名称：羟脯氨酸；
Gly中文名称：甘氨酸；
Thi中文名称：3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸；
Oic中文名称：L-八氢吲哚-2-羧酸；
D-Tic中文名称：D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸。
2、艾替班特及缺失肽的氨基酸序列说明如下：
艾替班特的肽序列：H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH；
缺失肽杂质的氨基酸序列：
des-D-Arg1-艾替班特：H-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH；
des-Arg2-艾替班特：H-D-Arg-Pro-Hyp-G1y-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH；
des-Pro3-艾替班特：H-D-Arg-Arg-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH；
des-Ser7-艾替班特：H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-D-Tic-Oic-Arg-OH；
des-D-Tic8-艾替班特：H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Oic-Arg-OH；
des-Arg2-Pro3-艾替班特：H-D-Arg-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH。
实施例1
一、Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH的合成
a)Fmoc-Arg(NO2)-OSu
称量Fmoc-Arg(NO2)-OH(50.0g，113mmol)并加入到含有250mL四氢呋喃的三颈烧瓶中。将该混合物在25±2℃下搅拌5min。然后加入15.64g(135.9mmol)N-羟基丁二酰亚胺并使其搅拌5-10min。在另一个单独的圆底烧瓶中，取28.04g二环己基碳二亚胺(135.9mmol)溶在250mL四氢呋喃中，然后慢慢滴加至上述Fmoc-Arg(NO2)-OH的THF溶液中，控温27±2℃，滴加时间30-45分钟。滴加完成后，将体系升温至室温，再反应3小时。用薄层色谱法(TLC)监测原料至反应完全。将反应液过滤除去尿素，在不进一步纯化的情况下直接进行下一步反应。
b)Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH的合成
称取L-脯氨酸(15.64g，135.92mmol)并加入到装有250mL四氢呋喃和水(1:1)的三颈烧瓶中。将该混合物在25±2℃下搅拌5min，然后加入14.4g(105.9mmol)Na2CO3并使其搅拌5-10min。随后，慢慢滴入已溶于500mL四氢呋喃中的61.0g上述反应物Fmoc-Arg(NO2)-OSu(113.0mmol)，控温25±2℃，滴加时间30-45min。滴加完成后，将体系升温至室温，再反应3小时。用薄层色谱法(TLC)监测原料至反应完全。反应进程如图2所示。
反应完成后，用旋转蒸发仪将THF完全去除，并在水层中加入400ml乙酸乙酯，用10％柠檬酸溶液将pH值调节至3.5±0.5。分离水层，用乙酸乙酯进一步萃取，减压除去溶剂，得到白色固体。然后通过使用正己烷打浆洗涤纯化，得到干燥的白色固体Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH，(55.1g，产率90％)。
剩余的二肽，如Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH的制备方法同上。
二、树脂肽的制备：采用分步固相合成法制备了树脂肽
a、取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂的合成
称取50.0g取代度为1.1mmol/g的Wang树脂，加入到固相多肽合成器中。随后，用DMF洗涤树脂两次，并在DMF中溶胀30分钟。在冰水浴下将48.5g Fmoc Arg(NO2)-OH和17.11g DIC溶解在DMF中，然后装入到上述装有树脂的合成器中。5min后，加入0.1g DMAP，搅拌2小时。然后分别用DMF和DCM洗涤树脂3次，用醋酸酐/吡啶/DMF(15ml:15mL:500ml)封闭30分钟，排干。用甲醇对树脂进行收缩，甲醇干燥后得到65.0g的Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂，检测取代度为0.8mmol/g。
b、线性艾替班特wang树脂的制备
称取65.0g取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂并加到反应器中。随后，用DMF洗涤Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂两次，并在DMF中溶胀30min。用溶于DMF中的20％哌啶去除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤树脂5次。采用茚三酮法对树脂进行测试，树脂颜色的变化表明树脂中Fmoc基团的去除情况。
将46.98g Fmoc-Oic-OH(120.0mmol)、16.2g HOBt(120.0mmol)溶解于DMF中，然后装入到固相反应合成器中，再加入30.28g DIC，在室温下反应2-3小时。通过茚三酮试验确定反应终点。
上述Fmoc去保护基步骤和相应的氨基酸偶联步骤是基于醋酸艾替班特序列重复进行。Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH，Fmoc-Thi-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH，Fmoc-Hyp(tBu)-OH，Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Boc-D-Arg(NO2)-OPfp按序列顺序偶联，其中对于C端含有OPfp酯基的氨基酸，如Boc-D-Arg(NO2)-OPfp，则不需要使用如HOBT/DIC这样的偶联试剂。反应进程如图3所示。
在所有氨基酸偶联后，用甲醇对树脂进行收缩，然后将树脂干燥，得到艾替班特Wang树脂的粗品129.9g。
三、新型硝基保护线性艾替班特的合成
裂解试剂配制如下：三氟乙酸(TFA)(1202.5mL,9.25volumes)，苯酚(32.5mL,0.25volumes)，三异丙基硅烷(TIS)(32.5mL,0.25volumes)，水(32.5mL,0.25volumes)，都加入到三颈烧瓶中。将该混合液冷却至15±2℃，并搅拌5分钟，加入129.9g完全保护的艾替班特wang树脂，在15±2℃下反应3-4小时。反应结束后过滤树脂，收集滤液。树脂用少量TFA(65.0mL)洗涤。将滤液合并，并加入到另一个装有甲苯(3120mL，24volumes)和异丙醚(4680mL，36volumes)混合液的圆底烧瓶中，在27±3℃下搅拌60分钟，得到湿固体。用异丙醚(2×1300mL，10volumes)对所得到的固体进行两次打浆洗涤。
经过过滤、真空干燥，得到白色固体80.1g。产物纯度为70.0％，并含有0.3％的杂质des-D-Arg1-艾替班特。反应进程如图4所示。
四、艾替班特粗品的合成
把Pd/C(25g)、甲酸(800ml)、硝基保护的艾替班特(80.1g)加入到圆底烧瓶中，在45℃下搅拌4-6小时，用高效液相色谱法(HPLC)监测反应至完成。反应进程如图5所示。反应完成后，将反应物过滤以分离Pd/C，滤液即溶于甲酸的艾替班特粗品直接用反相色谱来纯化。
五、艾替班特粗品的纯化
第1阶段：从步骤四中获得的多肽粗品溶液通过C18反相柱，用流动相系统洗脱。流动相系统由流动相A(0.1％TFA水溶液)和流动相B(乙腈)组成，收集目标峰馏分。
第2阶段：将第1阶段得到的目标峰馏分装在反相C18柱上，用0.15％醋酸铵溶液洗涤60分钟，然后用流动相系统洗脱，其中流动相A为0.2％醋酸溶液，流动相B为乙腈。将纯度大于99％且最大单个杂质<0.1％的馏分收集并冻干，得到纯的醋酸艾替班特。
得到产物：30.3g，HPLC纯度：99.6％。其中杂质des-D-Arg1-艾替班特、des-Arg2-艾替班特、des-Pro3-艾替班特、des-Ser7-艾替班特和des-D-Tic8-艾替班特都没有检测到。
对比例1
对比例1描述了用Boc-Arg(NO2)-OH代替Boc-Arg(NO2)-OPfp合成醋酸艾替班特，从而导致des-D-Arg1-艾替班特杂质大大增加。
一、线性艾替班特wang树脂的制备
称取65.0g取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂加到反应器中。随后，用DMF洗涤Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂两次，并在DMF中溶胀30min。用溶于DMF中的20％哌啶去除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤树脂5次。采用茚三酮法对树脂进行测试，树脂颜色的变化表明树脂中Fmoc基团的去除情况。
将46.98g Fmoc-Oic-OH(120.0mmol)、16.2g HOBt(120.0mmol)溶解于DMF中，然后装入到固相反应合成器中，再加入30.28g DIC，在室温下反应2-3小时。通过茚三酮试验确定反应终点。
上述Fmoc去保护基步骤和相应的氨基酸偶联步骤是基于醋酸艾替班特序列重复进行。Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH，Fmoc-Thi-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH，Fmoc-Hyp(tBu)-OH，Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Boc-D-Arg(NO2)-OH按序列顺序偶联。
在所有氨基酸偶联后，用甲醇对树脂进行收缩，然后将树脂干燥，得到艾替班特Wang树脂的粗品124.8g。
二、硝基保护线性艾替班特的合成
裂解试剂配制如下：三氟乙酸(TFA)(1156.25mL,9.25volumes)，苯酚(31.25mL,0.25volumes)，三异丙基硅烷(TIS)(31.25mL,0.25volumes)，水(31.25mL,0.25volumes)，都加入到三颈烧瓶中。将该混合液冷却至15±2℃，并搅拌5分钟，加入124.8g完全保护的艾替班特wang树脂，在15±2℃下反应3-4小时。反应结束后过滤树脂，收集滤液。树脂用少量TFA(62.5mL)洗涤。合并滤液，加入到另一个装有甲苯(3000mL，24volumes)和异丙醚(4500mL，36volumes)混合液的圆底烧瓶中，在27±3℃下搅拌60分钟，得到湿固体。用异丙醚(2×1250mL,10volumes)对所得到的固体进行两次打浆洗涤。
经过过滤、真空干燥，得到白色固体76.1g。产品纯度为62.0％，des-D-Arg1-艾替班特的含量为3％。
杂质des-D-Arg1-艾替班特的相对保留时间约为1.06，纯化并分离出粗肽比较困难。
与对比例1相比，在实施例一步骤3中可看到，杂质des-D-Arg1-艾替班特只有0.3％。
三、艾替班特粗品的合成
把Pd/C(21g)、甲酸(760ml)、硝基保护的艾替班特(76.1g)加入到圆底烧瓶中，在45℃下搅拌4-6小时，用高效液相色谱法(HPLC)监测反应至完成。反应完成后，将反应物过滤以分离Pd/C，将滤液即溶于甲酸的艾替班特粗品直接用反相色谱来纯化。
四、艾替班特粗品的纯化
第1阶段：从上一步获得的多肽粗品溶液通过C18反相柱，用流动相系统洗脱。流动相系统由流动相A(0.1％TFA水溶液)和流动相B(乙腈)组成，收集目标峰馏分。
第2阶段：将第1阶段得到的目标峰馏分装在反相C18柱上，用0.15％醋酸铵溶液洗涤60分钟，然后用流动相系统洗脱，其中流动相A为0.2％醋酸溶液，流动相B为乙腈。
将纯馏分收集并冻干，得到19.9g纯度为98.5％的醋酸艾替班特。杂质des-D-Arg1-艾替班特的含量为0.5％。
可见，本发明的方法中即通过使用Boc-D-Arg(NO2)-OPfp，可以大大减少缺失肽杂质，即des-D-Arg1-艾替班特，这反过来又极大地帮助了后续步骤，如纯化步骤，以获得更纯的醋酸艾替班特。
对比例2
对比例2描述了通过分别在相应位置使用单个氨基酸Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-D-Tic-OH，而不是二肽Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH来合成醋酸艾替班特。从而导致des-Arg2-艾替班特、des-Pro3-艾替班特、des-Ser7-艾替班特和des-D-Tic8-艾替班特杂质得到了极大的增加。
一、线性艾替班特wang树脂的制备
称取65.0g取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂并加到反应器中。随后，用DMF洗涤Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂两次，并在DMF中溶胀30min。用溶于DMF中的20％哌啶去除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤树脂5次。采用茚三酮法对树脂进行测试，树脂颜色的变化表明树脂中Fmoc基团的去除情况。
将46.98g Fmoc-Oic-OH(120.0mmol)、16.2g HOBt(120.0mmol)溶解于DMF中，然后装入到固相反应合成器中，再加入30.28g DIC，在室温下反应2-3小时。通过茚三酮试验确定反应终点。
上述Fmoc去保护基步骤和相应的氨基酸偶联步骤是基于醋酸艾替班特序列重复进行。Fmoc-D-Tic-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thi-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH，Fmoc-Hyp(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(NO2)-OH和Boc-D-Arg(NO2)-OPfp按序列顺序偶联。
在所有氨基酸偶联后，用甲醇对树脂进行收缩，然后将树脂干燥，得到艾替班特Wang树脂的粗品130.1g。
二、硝基保护线性艾替班特的合成
裂解试剂配制如下：三氟乙酸(TFA)(1202.5mL,9.25volumes)，苯酚(32.5mL,0.25volumes)，三异丙基硅烷(TIS)(32.5mL,0.25volumes)，水(32.5mL,0.25volumes)，都加入到三颈烧瓶中。将该混合液冷却至15±2℃，并搅拌5分钟，加入130.1g完全保护的艾替班特wang树脂，在15±2℃下反应3-4小时。反应结束后过滤树脂，收集滤液。树脂用少量TFA(65.0mL)洗涤。合并滤液，加入到另一个装有甲苯(3120.0mL，24volumes)和异丙醚(4680.0mL，36volumes)混合液的圆底烧瓶中，在27±3℃下搅拌60分钟，得到湿固体。用异丙醚(2×1300mL,10volumes)对所得到的固体进行两次打浆洗涤。
经过过滤、真空干燥，得到白色固体80.2g。产品纯度为55.0％，杂质des-Arg2-艾替班特的含量为2.2％，des-Pro3-艾替班特为1.8％，des-Ser7-艾替班特为2.3％，des-D-Tic8-艾替班特为2.4％，所对应的相对保留时间分别为0.96，0.94，1.08和1.13。
与对比例2相比，在实施例一步骤三中得到的产物中杂质des-Arg2-艾替班特、des-Pro3-艾替班特、des-Ser7-艾替班特和des-D-Tic8-艾替班特都没有检测到。
三、艾替班特粗品的合成
把Pd/C(25g)、甲酸(800ml)、硝基保护的艾替班特(80.2g)加入到圆底烧瓶中，在45℃下搅拌4-6小时，用高效液相色谱法(HPLC)监测反应至完成。反应完成后，将反应物过滤以分离Pd/C，将滤液即溶于甲酸的艾替班特粗品直接用反相色谱来纯化。
四、艾替班特粗品的纯化
第1阶段：从上一步获得的多肽粗品溶液通过C18反相柱，用流动相系统洗脱。流动相系统由流动相A(0.1％TFA水溶液)和流动相B(乙腈)组成，收集目标峰馏分。
第2阶段：将第1阶段得到的目标峰馏分装在反相C18柱上，用0.15％醋酸铵溶液洗涤60分钟，然后用流动相系统洗脱，其中流动相A为0.2％醋酸溶液，流动相B为乙腈。
将纯馏分收集并冻干，得到20.8g纯度为98.2％的醋酸艾替班特。杂质des-D-Arg1-艾替班特含量为0.05％，des-Arg2-艾替班特为0.4％，des-Pro3-艾替班特为0.25％，des-Ser7-艾替班特为0.4％，des-D-Tic8-艾替班特为0.3％。
与对比例2相比，实施例一中描述的本发明的方法，即通过使用Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH，可以大大减少缺失肽杂质，即des-Arg2-艾替班特、des-Pro3-艾替班特、des-Ser7-艾替班特和des-D-Tic8-艾替班特，这反过来又极大地帮助了后续步骤，如纯化步骤，以获得更纯的醋酸艾替班特。
对比例3
对比例3描述了在相应位置使用Fmoc-Gly-OH代替Fmoc-(Dmb)Gly-OH来合成醋酸艾替班特，从而导致des-Arg2-Pro3-艾替班特，des-D-Arg1-艾替班特杂质大大增加。
一、线性艾替班特wang树脂的制备
称取65.0g取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂并加到反应器中。随后，用DMF洗涤Fmoc-Arg(NO2)-Wang树脂两次，并在DMF中溶胀30min。用溶于DMF中的20％哌啶去除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤树脂5次。采用茚三酮法对树脂进行测试，树脂颜色的变化表明树脂中Fmoc基团的去除情况。
将46.98g Fmoc-Oic-OH(120.0mmol)、16.2g HOBt(120.0mmol)溶解于DMF中，然后装入到固相反应合成器中，再加入30.28g DIC，在室温下反应2-3小时。通过茚三酮试验确定反应终点。
上述Fmoc去保护基步骤和相应的氨基酸偶联步骤是基于醋酸艾替班特序列重复进行。Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH，Fmoc-Thi-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Hyp(tBu)-OH，Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Boc-D-Arg(NO2)-OPfp按序列顺序偶联。
在所有氨基酸偶联后，用甲醇对树脂进行收缩，然后将树脂干燥，得到艾替班特Wang树脂的粗品108.1g。
二、硝基保护线性艾替班特的合成
裂解试剂配制如下：三氟乙酸(TFA)(999.0mL,9.25volumes)，苯酚(27.0mL,0.25volumes)，三异丙基硅烷(TIS)(27.0mL,0.25volumes)，水(27.0mL,0.25volumes)，都加入到三颈烧瓶中。将裂解试剂冷却至15±2℃，并搅拌5分钟，加入108.1g完全保护的艾替班特wang树脂，在15±2℃下反应3-4小时。反应结束后过滤树脂，收集滤液。树脂用少量TFA(54mL)洗涤。合并滤液，加入到另一个装有甲苯(2592.0mL，24volumes)和异丙醚(3888.0mL，36volumes)混合液的圆底烧瓶中，在27±3℃下搅拌60分钟，得到湿固体。用异丙醚(2×1080mL,10volumes)对所得到的固体进行两次打浆洗涤。
经过过滤、真空干燥，得到白色固体70.3g。产品纯度为49.0％，杂质des-Arg2-Pro3-艾替班特的含量为3.5％，des-D-Arg1-艾替班特为2.5％。
随着肽链长度的增加，偶联和脱保护反应的效率降低；同时由于聚集作用，反应完成需要更长的时间。尽管反应使用了Boc-D-Arg(NO2)-OPfp，反应还是生成了2.5％的des-D-Arg1-艾替班特杂质和其他缺失杂质，比如des-Arg2-Pro3-艾替班特。因此，在序列的第5位使用Fmoc-(Dmb)Gly-OH可以抑制肽链聚集。
三、艾替班特粗品的合成
把Pd/C(21g)、甲酸(700ml)、硝基保护的艾替班特(70.3g)加入到圆底烧瓶中，在45℃下搅拌4-6小时，用高效液相色谱法(HPLC)监测反应至完成。反应完成后，将反应物过滤以分离Pd/C，滤液中即溶于甲酸的艾替班特粗品直接用反相色谱来纯化。
四、艾替班特粗品的纯化
第1阶段：从上一步获得的多肽粗品溶液通过C18反相柱，用流动相系统洗脱。流动相系统由流动相A(0.1％TFA水溶液)和流动相B(乙腈)组成，收集目标峰馏分。
第2阶段：将第1阶段得到的目标峰馏分装在反相C18柱上，用0.15％醋酸铵溶液洗涤60分钟，然后用流动相系统洗脱，其中流动相A为0.2％醋酸溶液，流动相B为乙腈。
将纯馏分收集并冻干，得到20.2g纯度为98.5％的醋酸艾替班特。杂质des-D-Arg1-艾替班特的含量为0.4％，des-Arg2-Pro3-艾替班特为0.3％。
与对比例3相比，实施例一中描述的本发明的方法，即通过使用Fmoc(Dmb)Gly-OH使得杂质des-D-Arg1-艾替班特、des-Arg2-Pro3-艾替班特可以大大减少，这反过来又极大地帮助了后续步骤，如纯化步骤，以获得更纯的醋酸艾替班特。

Claims (5)

1.一种醋酸艾替班特的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过液相合成二肽片段Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH；
(2)采用固相合成法，按照醋酸艾替班特主链肽顺序先将Fmoc-Arg(NO2)-OH偶联到树脂固相载体上，脱Fmoc保护基后偶联下一个氨基酸，序列中的其他氨基酸按照以下顺序进行偶联和裂解：Fmoc-Oic-OH、Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-OH、Fmoc-Thi-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Arg(NO2)-Pro-OH和Boc- D-Arg(NO2)-OPfp，得到Boc-D-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Hyp(tBu) -(Dmb)Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(NO2) -树脂固相载体；
(3)利用裂解试剂裂解树脂肽，裂解试剂为三氟乙酸、苯酚、三异丙基硅烷和水以体积比为92.5：2.5：2.5：2.5混合所得，裂解试剂和树脂肽的质量比为8~10：1，10~20℃下反应3~4 小时，分离出裂解肽链；
裂解肽链溶于甲酸中，加入Pd/C催化脱去硝基，裂解肽链和Pd/C的质量比为3~4：1，在45℃下搅拌4-6小时，得到艾替班特粗品，纯化后制得醋酸艾替班特；
所述纯化分两步进行，第一步：将艾替班特粗品装入C18反相柱，以0.1%TFA水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行洗脱，收集目标峰馏分；第二步：将收集的目标峰馏分装入C18反相柱，用0.15%醋酸铵溶液洗涤，然后以0.2%醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行洗脱，收集目标产物。
2.如权利要求1所述的醋酸艾替班特的制备方法，其特征在于，所述树脂固相载体为wang树脂。
3.如权利要求1所述的醋酸艾替班特的制备方法，其特征在于，对于C-末端含酸基的氨基酸，在DIC/HOBT体系下进行偶联。
4.如权利要求1所述的醋酸艾替班特的制备方法，其特征在于，各Fmoc氨基酸片段和肽偶联试剂的添加量与树脂取代物的摩尔比为2-4：1。
5.如权利要求1所述的醋酸艾替班特的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述分离出裂解肽链为：裂解反应结束后，收集滤液，加入异丙醚和甲苯并在20-30℃下放置以沉淀产物，将沉淀产物过滤，用异丙醚洗涤2-5次并干燥。
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