DK148904B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af analgetisk virksomme enkephalin-analoge pentapeptidamider eller farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

14890A

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte enkephalin-analoge pentapeptid-amider med den i krav l's indledning anførte almene fofmel I, eller farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske syreadditionssalte deraf, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. De omhandlede forbindelser udvviser analgetisk virkning ved parenteral indgivelse.

For nylig har man ekstraheret endogene forbindelser med morfinlignende egenskaber fra pattedyrs hjerner eller cerebralspinalvæsker.

Disse forbindelser, benævnt enkephalin, er blevet identificeret af 148904 2

Hughes et al., Nature, 258 577 (1975)^ SOm pentapeptider med følgende sekvens:

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.

Disse forbindelser benævnes henholdsvis methionin-enkephalin og leu-cin-enkephalin.

Selv om disse forbindelser har vist sig at give analgetisk virkning hos mus ved intracerebroventrikulær indgivelse [Buscher et al., Nature, 261, 423 (1976)], mangler de i praksis en brugbar analgetisk virkning, når de indgives parenteralt.

Det har nu overraskende vist sig, at enkephalin-analoge pentapeptid-derivater med den i krav 1 viste almene formel I udviser betydelige og påviselige analgetiske egenskaber, når de indgives systemisk.

En foretrukken klasse af forbindelser omfatter de forbindelser, hvori W er -CH^-S-CH^.

Farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske syreadditionssalte af forbindelser med formel I omfatter organiske og uorganiske syreadditionssalte, f.eks. de, der fremstilles ud fra syrer, såsom saltsyre, svovlsyre, sulfonsyre, vinsyre, fumarsyre, hydrogenbromidsyre, gly-colsyre, citronsyre, maleinsyre, phosphorsyre, ·ravsyre, eddikesyre, salpetersyre, benzoesyre, ascorbinsyre, p-toluensulfonsyre, ben-zensulfonsyre, naphthalensulfonsyre og propionsyre. Fortrinsvis fremstilles syreadditionssaltene ud fra saltsyre, eddikesyre eller ravsyre. Ethvert af de ovennævnte salte kan fremstilles på kendt måde.

Forbindelserne med formel I er usubstituerede amider af pentapeptider. Stereokonfigurationen af forbindelserne med formel I er et væsentligt karakteristisk træk. Aminosyreresterne i pentapeptid-derivaterne med formel I nummereres af bekvemmelighedsgrunde se- 148904 3 kvensvis, idet man begynder med gruppen ved den endestillede amino-funktion. Chiraliteten af aminogrupperne, idet man læser fra position 1 til position 3, er således L, D, L, L og L. Endvidere må bemærkes, at gruppen i position 3 er defineret således, at den omfatter en glycin-del. I disse tilfælde eksisterer der naturligvis ingen chiralitet med hensyn til denne gruppe. Det er imidlertid blot vigtigt at erkende, at når position 3 definerer en a-minogruppe, der har chiralitet, må denne være L.

Hed hensyn til de enkelte grupper i pentapeptid-derivaterne med formel I gælder følgende betragtninger: (A) Stilling 1

Denne stilling repræsenterer den amino-terminale del af peptidet. Gruppen er den, der fremkommer ud fra L-tyrosin, og er N-usub-stitueret.

(B) Stilling 2

Aminosyregruppen, der er til stede i stilling 2 i peptid-derivatet med formel I, må være D-stereoisomeren og kan være valgt blandt flere aminosyregrupper. Disse omfatter grupper afledt af D-alanin (Ala) (R^ er methyl), D-a-aminosmørsyre (Abu) (R er ethyl), D-norvalin (Nva) (R^ er ri-propyl), D-valin (Val) (R^ er isopropyl), N-norleucin (Nle) (R^ er n-butyl), D-leucin (Leu) (R^ er isobu-tyl) og D-isoleucin (Ile) (R^ er sec.butyl). Fortrinsvis er gruppen afledt af D-alanin.

(C) Stilling 3

Aminosyregruppen, der befinder sig i denne stilling, er afledt af glycin (Gly) eller L-alanin. Fortrinsvis er gruppen i denne stilling i peptidet afledt af glycin.

148904 4 (D) Stilling 4

Aminosyregruppen i denne stilling er afledt af L-phenylalanin (Phe). Gruppen kan enten være usubstitueret eller substitueret véd aminonitrogenet (R^) med en methylgruppe. Fortrinsvis er gruppen N-usubstitueret (R^ er hydrogen).

(E) Stilling 5

Aminosyregruppen i stilling 5 i pentapeptidet er afledt af amidet af L-methionin (Met) (W er -C^SCH^), L-leucin (Leu) [W er -CH(CH3)2] eller L-(S-ethyl)cystin [Cys(ethyl] (W er S-ethyl). Fortrinsvis er aminosyregruppen i stilling 5 afledt af L-methioninamin eller af L-leucinamin.

Udgangsforbindelserne med formlen II fremstilles ved rutinemetoder til peptidsyntese.

Metoderne til fremstilling af udgangsforbindelserne omfatter en sammenkobling af aminosyrer eller peptidfragmenter ved at omsætte carboxylsyrefunktionen i en aminosyre eller etpeptidfrag-ment med aminofunktionen i en anden aminosyre eller et andet peptidfragment til frembringelse af en amidbinding. For effektivt at opnå denne kobling er det for det første ønskværdigt, at alle reaktive funktioner, der ikke direkte deltager i reaktionen, inak-tiveres ved anvendelse af egnede blokerede grupper, og for det andet ønskeligt, at carboxylsyrefunktionen, der skal kobles, aktiveres på passende måde for at muliggøre en fortsat kobling. At dette indebærer en nøje udvælgelse af både reaktionssekvens og 148904 5 reaktionsbetingelser samt en anvendelse af specifikke blokerende grupper, således at man opnår det ønskede peptid-derivat. Hver af de aminosyrer, der anvendes til fremstilling af forbindelserne, og som indeholder de særligt udvalgte beskyttende grupper og/eller aktiverende funktioner, fremstilles ved anvendelse af velkendt teknik inden for peptidvidenskaben.

Som amino-blokerende grupper ved fremstillingen af udgangsforbindelserne kan man anvende benzyloxycarbonyl (CBz), t-butyloxy-carbonyl (BOC), t-amyloxycarbonyl (AOC), p-methoxybenzyloxycarbo-nyl (MBOC), adamantyloxycarbonyl (AdOC) og isobornyloxycarbonyl. Endvidere anvendes benzyl (Bzl) generelt som hydroxy-beskyttende gruppe for tyrosylgruppen, selv om andre grupper, såsom p-nitro-benzyl (PNB) og p-methoxybenzyl (PMB), også kan anvendes.

De carboxylsyre-blokerende grupper, der anvendes ved fremstillingen af udgangsforbindelserne med formel II, kan være vilkårlige typiske esterblokerende grupper, for eksempel methyl, ethyl, benzyl, p-nitro-benzyl, p-methoxybenzyl eller 2,2,2-trichlorethyl.

Sammenkoblingen af den passende beskyttede N-blokerede aminosyre eller det N-blokerede peptid-fragment med en passende beskyttet carboxy-blokeret aminosyre eller et peptidfragment foretages ved at gøre den frie carboxylsyrefunktion i aminosyren eller peptid-fragmentet aktiv for koblingsreaktionen. Dette kan gennemføres ved anvendelse af kendt teknik. En sådan aktiveringsteknik omfatter omdannelse af carboxylsyrefunktionen til et blandet anhydrid.

Den fri carboxylsyrefunktion aktiveres ved reaktion med en anden syre, typisk et derivat af carbonsyre, såsom et syrechlorid deraf. Eksempler på syrechlorider, der kan anvendes til dannelse af blandede anhydrider, er ethylchlorformiat, phenylchlorformiat, see.butylchlorformiat, isobutylchlorformiat og pivaloylchlorid. Fortrinsvis anvendes isobytylchlorformiat.

En anden metode til aktivering af carboxyl funktionen består i, at den omdannes til et aktiveret ester-derivat. Sådanne aktive 148904 6 estere kan for eksempel uære en 2,4,5-trichlorphenylester, en pen-tachlorphenylester eller en p-nitrophenylester. En anden koblingsmetode, der kan anvendes, er den velkendte azid-koblingsmetode.

Den foretrukne koblingsmetode består i, at man anvender NjN'-di-cyclohexylcarbodiimid (DCC) til aktivering af den frie carboxyl-syrefunktion, hvorved koblingen kan fortsætte. Denne aktivering og kobling udføres under anvendelse af en ækvimolær mængde DCC i forhold til aminosyren eller peptidfragmentet og udføres i nærværelse af en ækvimolær mængde 1-hydroxybenzotriazol (HBT). Tilstedeværelsen af HBT undertrykker uønskede sidereaktioner, herunder muligheden for racemisering.

Spaltning af udvalgte blokerende grupper er nødvendig på bestemte steder i syntesesekvensen. Fagmanden kan let ud fra repræsentative beskyttende grupper udvælge de grupper, der er forligelige i den forstand, at en selektiv spaltning af produkter kan udføres, således at det bliver muligt at fjerne en eller flere, men ikke alle de beskyttende grupper, der er til stede på aminosyren eller peptidfragmentet. Denne teknik er velkendt. En grundigere diskussion af den teknik, der er til rådighed til selektiv fraspaltning, er anført af Schroder og Liibke, The Peptides, Volume I, Academic Press, New York (1965), se især siderne 72-75.

Fraspaltningen af carboxylsyre-beskyttende grupper kan foretages ved basisk hydrolyse. Relativt stærkt basiske betingelser, hvor der typisk anvendes et alkalimetalhydroxid, såsom natrium-hydroxid, kaliumhydroxid eller lithiumhydroxid, anvendes normalt til de-esterificering af den beskyttede carboxylgruppe, Reaktionsbetingelserne, hvorunder hydrolysen udføres, er velkendte. Carboxylsyre-beskyttende grupper kan også fjernes ved katalytisk hydrogenolyse, herunder for eksempel hydrogenolyse i nærværelse af en katalysator, såsom palladium-på-carbon. Endvidere kan fjernelsen i de tilfælde, hvor den carboxylsyre-blokerende gruppe er p-nitro-benzyl eller 2,2,2-trichlorethyl, udføres ved reduktion i nær- 7 14 8 9 Ο Λ værelse af zink og saltsyre.

l/ed fremgangsmåden ifølge opfindelsen spalter man de beskyttende grupper fra et beskyttet pentapeptid med formlen o o O Re O ch3

Rj 0NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CE-Z' (II) CH2 R4 r5 CH2 CH2 ø ø * OH .

hvori R^, R5, R6 og U har de samme betydninger som i formel I, 0 0 r* »» Z' er -C-NH2 eller -C-NH-harpiksbærer og R^g er hydrogen eller en amino-blokerende gruppe valgt blandt tert-butyloxycarbo-nyl, benzyloxycarbonyl, tert-amyloxycarbonvl, p-methoxybenzyl-oxycarbonyl, adamantyl-oxycarbonyl og ixobornyloxycarbonyl, idet Rjg er en amino-blokerende gruppe, når Z' er CONl·^.

Man foretager fraspaltningen ved hjælp af et de-blokerende middel valgt blandt trifluoreddikesyre (TFA), iseddikesyre med HCl-gas, 98515 myresyre eller flydende HF.

148904 δ I nærværende beskrivelse anvendes følgende forkortelser, hvoraf de fleste er velkendte:

Abu ; - a-aminosmørsyre

Ala - alanin

Cys - cystein

Gly - glycin

Ile - isoleucin

Leu - leucin

Met - methionin

Nle - norleucin

Nva - norvalin

Phe — phenylalanin

Tyr tyrosin

Val - valin

At - acetyl

Me - methyl

Et - ethyl

Ip - isopropyl

Pr - n-propyl

Bu - n-butyl i-Bu - isobutyl t-Bu - t-butyl s-Bu - sec-butyl BOC - t-butyloxycarbonyl

Bzl benzyl DCC - N,N'-dicyclohexylcarbodiimid HBT - 1-hydroxybenzotriazol DMF - N,N-dimethylformamid TFA - trifluoreddikesyre THF - tetrahydrofuran DEAE - diethylaminoethyl 148904 9

En foretrukken specifik metode til fremstilling af udgangsforbindelserne med formel II og derudfra de omhandlede forbindelser med formlen I består i at sammenkoble et separat fremstillet N-terminalt tripeptid med et separat fremstillet C-ter-minalt dipeptidamid, hvorefter man fjerner blokeringen fra de tiloversblevne blokerende dele. Denne generelle sekvens, der illustrerer fremstillingen af et pentapeptid-derivat med formel I, kan afbildes som vist ved den efterfølgende reaktionssekvens: I sekvensen repræsenterer symbolet AA aminosyregruppen, og tallet indikerer placeringen af aminosyren i den endelige peptidsekvens .

ίο U8904

OOC-L-Tyr-OH + H-D-(AA) -OBzl BOC-L-Phe-OH + H-L-(AA) -NH

j 2 5 2

0Bzl DCC DCC

HBT HBT

\ / \ / BX-L-Tyr-D-(AA) -OBzl Is OBzl

' u- BOC-L-Phe-L-(AA) -NH

OH 5 s \ / HCl/HOAc BOC-L-Ty r-D- (AA) 2~0H \/ OBzl H-L-(AA) -OBzl +

XC 3 Cl” H -L-Phe-L-(AA) -NH

HBT 2 5 2 \ / oh” BOC-L-Tyr-D-(AA) -L-(AA) -OBzl I 2 3 \ / OBzl

H

2

Pd/C \ / BOC-L-Tyr-D-(AA) -L-(AA) -OH H-L-Phe-L-(AA),_-NH2 » Ί i

DCC

. HBT

\ /

BOC-L-Tyr-D-(AA) -L-(AA) -L-Phe-L-(AA) -NH

I 2 3 5 «

°H ^ TFA

2) DEAE Sephadex-R-25 Acetat form \ /

AcOH »H-L-Tyr-D-(AA) -L-(AA) -L-Phe-L-(AA) -NH

I 2 S 52

OH

148904 11

Ovenstående reaktionsskema repræsenterer kun én mulig sekvens til fremstilling af forbindelser med formel II. Andre sekvenser kan også anvendes. En anden metode, der kan anvendes, omfatter således trinvis, sekvensvis addition af enkelte aminosyrer ved opbygning af peptidkæden begyndende med den carboxamid-terminale aminosyre. Man kan også benytte fastfase-peptidsyntese. Den C-terminale gruppe knyttes til en egnet polymer bærer, og peptidet forlænges med én aminosyrerest ad gangen, indtil det ønskede peptid, der stadig væk er knyttet til polymeren, er syntetiseret. Peptidet fjernes derefter fra polymeren ved hjælp af et egnet de-blokerende middel.

Det vil være klart for fagmanden, at racemisering af a-carbon-atomet kan ske under stærkt basiske betingelser. Racemiserings- graden kan variere i afhængighed af de bestemte aminosyrer, der anvendes. Racemiseringen kan gøres mindst mulig ved at holde reaktionstiden så kort som muligt.

De omhandlede forbindelser med formel I er værdifulde farmaceutiske midler. De udviser analgetisk virkning og er især nyttige ved parenteral indgivelse til pattedyr, også omfattende mennesker .

De omhandlede forbindelser kan indgives som sådanne, eller de kan blandes og formuleres til farmaceutiske præparationer i enheds-doser til parenteral indgivelse. Ved blanding eller formulering kan anvendes organiske eller uorganiske faste stoffer eller væsker, der er farmaceutisk acceptable bærestoffer. Egnede sådanne bærere er velkendte af fagmanden. Blandingerne kan foreligge i form af tabletter, pulvergranulater, kapsler, suspensioner, opløsninger eller i en anden egnet form.

148904 12

De omhandlede forbindelser med formel I vil, når de indgives i en effektiv mængde, give en analgetisk virkning. En dosis kan generelt variere fra 0,1 mg til cirka 100 mg pr. kg legemsvægt.

Et foretrukkent område er 1- 20 mg/kg legemsvægt.

De følgende eksempler illustrerer nærmere fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 1 01

Fremstilling af L-Tyrosyl-D-alariyl-glycyl-L-phenylalanyl-N -methyl-rt-methionylamid, hydrochlorid _- A. Benzyl-D-alaninat-p-toluensulfonat

Til en blanding af 100 ml benzylalkohol og 200 ml benzen indeholdende 55,1 g (0,29 mol) p-toluensulfonsyre-monohydrat sattes 25. g (0,281 mol) D-alanin. Blandingen opvarmedes til kogning med .tilbagesvaling, og vandet fjernedes azéotropisk i et Dean-Stark-apparat. Blandingen opvarmedes i 15 timer, afkøledes til stuetemperatur og fortyndedes med ether. Det fremkomne bundfald opsamledes og omkrystalliseredes fra methanol-ether til opnåelse af 55,3 g (56 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 112-115 °C.

Analyse beregnet for CjyT^NO^S" (352,42): C 58,10 - H 6,02 - N 3,99 Fundet: C 58,19 - H 6,06 - N 3,82.

QT

B. Benzyl-N -butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D- alaninat

Til 200 ml tør Ν,Ν-dimethylformamid sattes 35,1 g (0,1 mol) af produktet fra del A. Den fremkomne blanding omrørtes og afkøledes til 0 °C, og der tilsattes 11,2 g (0,1 mol) diazabicyelooc-_ . - tan (DABCO). Blandingen omrørtes i 10 minutter ved 0 °C, og der tilsattes 37,1 g (0,1 mol) N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L- 148904 13 tyrosin efterfulgt af 13,5 g (0,1 mol) 1-hydroxybenzotriazol (HBT) og 20,6 g (0,1 mol) N.N'-dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Den fremkomne blanding omrørtes ved 0 °C i 3 timer og herefter ved stuetemperatur i 24 timer. Blandingen afkøledes til 0 °C, den fremkomne suspension filtreredes, og filtratet koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens genopløstes i ethylacetat og vaskedes successivt med IN natriumhydrogencarbonat, vand, 0,75 N kold citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i varm ethanol. Krystallisation fremkom efter afkøling. Efter én omkrystallisation fra ethanol opnåedes 41,5 g (80 pct.) af det rene produkt; smeltepunkt 121-123 °C.

Analyse beregnet for C3qH3£N2°6 (520,63): C 69,21 - H 6,97 - N 5,38 Fundet: C 68,99 - H 6,75 - N 5,17.

Oi C.-N -t-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanin

Til en blanding af 200 ml tetrahydrofuran og 20 ml vand sattes 31,2 g (0,06 mol) af produktet fra del B. Den fremkomne opløsning afkøledes til 0 °C, og 13,2 ml (1,1 ækvivalent) 5N natriumhydroxid blev langsomt tilsat. Den fremkomne blanding omrørtes og opvarmedes langsomt til stuetemperatur. Efter 5 timer blev blandingen fordelt mellem vand og ether. Den vandige fase separeredes fra og afkøledes, pH indstilledes til 2 ved tilsætning af citronsyre, og blandingen ekstraheredes med ethylacetat. Ethyl-acetatekstrakten vaskedes med vand, tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og fortyndedes med ether. Det fremkomne bundfald opsamledes til opnåelse af 17,7 g (67 pct.) af titelproduktet, smeltepunkt 160 - 162 °C.

Analyse beregnet for C24^3oN2°6 (442,51): C 65,14 - H 6,83 - N 6,63 Fundet: C 64,73 - H 6,70 - N 6,20.

£X

14 148904 D. Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-Q-L-tyrosyl-D-alany1-qlycinat

Til 70 ml tør dimethylformamid sattes 6,74 g (0,02 mol) af p-toluensulfonsyresaltet af benzylglycinat. Den fremkomne blanding afkøledes til 0 °C, og 2,24 g (0,020 mol) DABC0 tilsattes. Blandingen omrørtes i nogle få minutter, og 8,84 g (0,020 mol) af produktet fra del C blev tilsat efterfulgt af 2,7 g (0,02 mol) HBT og 4,12 g (0,02 mol) DCC. Reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer ved 0 °C og herefter i 24 timer ved stuetemperatur. Den fremkomne suspension afkøledes til 0 °C og filtreredes, og filtratet blev koncentreret i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i ethylacetat og vaskedes successivt med IN natriumcar-bonat, vand, kold 0,75 N citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens krystalliseredes fra ethanol til opnåelse af 10,8 g (92 pct.) af titelproduktet, smeltepunkt 145-147 »C.

Analyse beregnet for C^H^N^O^ (589,69): C 67,22 - H 6,67 - N 7,13 Fundet: C 67,32 - H 6,83 - N 6,91.

CL

E. N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanylqlycin 60 ml DMF tilsattes 10,5 g (0,018 mol) af produktet fra delD efterfulgt af 2,5 g 5 pct. palladium-på-carbon tilsat som en opslæmning i dimethylformamid. Den fremkomne blanding gennemstrømmedes med nitrogen, og hydrogen indførtes via en gasfordelingsplade ved atmosfæretryk og stuetemperatur. Efter 3,5 timer lukkedes for hydrogenstrømmen, og katalysatoren fjernedes ved filtrering. Filtratet koncentreredes i vakuum. Behandling af remanensen med ether gav 5,4 g (75 pct.) af titelproduktet som et amorft fast stof.

Analyse beregnet for C26H26^2°5 (4^6>65): C 69,94 - H 5,87 - N 6,27 Fundet: C 70,08 - H 5,82 - N 6,16.

148904 15 Οί οι F. Ν -t-butyloxycarbonyl-N -methyl-L-methionylamid

Dicyclohexylaminsaltet af N -t-butyloxycarbony1-L-methionin (17,2 g, 0,04 mol) fordeltes mellem ethylacetat og kold 0,75 Ν citronsyre. Den fremkomne organiske fase separeredes fra, vaske-des med vand og tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og koncentreredes i vakuum til en olieagtig remanens. Denne genopløstes i en blanding af 80 ml tør tetrahydrofuran og 10 ml di-methylformamid, og 0,5 g '18-krone-6-ether blev tilsat. En kali-umhydridsuspension (svarende til 0,12 mol) omrørtes og sattes dråbevis til den fremkomne afkølede blanding i løbet af 30 minutter. Methyliodid (2,49 ml, 0,04 mol) blev tilsat, og blandingen omrørtes i 24 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen afkøledes og blev gjort sur til pH 3 med 0,75 N citronsyre og deltes herefter mellem vand og ether. Etherfasen vaskedes med vand adskillige gange og ekstraheredes med IN natriumbicarbonat.

De vandige ekstrakter kombineredes, blev gjort sure til pH 2 og ekstraheredes med ethylacetat.

Ethylacetatekstrakten tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og inddampedes i vakuum til opnåelse af 8,4 g af produktet. Produktet havde et NMR-spektrum, der stemte med den ønskede N-me-thylerede forbindelse. [^2,92, N-CH ^; S 2,11, S-CH^:<il,6 C(CHj)jj

Olien (8,4 g, cirka 0,034 mol) opløstes herefter i 60 ml DMF. Opløsningen afkøledes til 0 °C, og 4,69 g (0,035 mol) HBT og 7 g (0,034 mol) DCC blev tilsat. Blandingen omrørtes i 2 timer ved 0 °C, og vandfri ammoniak blev ledt igennem blandingen via et gasfordelingsrør i 45 minutter. Reaktionsblandingen filtreredes, og filtratet koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens overførtes til en 3 x 50 cm silicagel-kolonne (74-250 pm) og elue-redes med chloroform efterfulgt af en 9,75:0,25 blanding af chloroform og methanol. Tyndtlagskromatografi af fraktionerne fra kolonnen og påfølgende kombination på basis af TLC-profilen gav efter koncentrering i vakuum produktet, der omkrystalliseredes 148904 16 to gange fra en blanding af ether og petroleumsether til opnåelse af 4,1 g (39 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 75 - 78 °C.

NMR: 2,80, N-CH-j 2,10, S-CH3 1,48, C(CH3)3 [a]p5-29,5 (C = 0,5 CHCl-j).

Analyse beregnet for C^H22N2S03 (262,37): C 50,36 - H 8,45 - N 10,68 Fundet C 50,59 - H 8,24 - N 10,87.

G. N°i-t-butyloxycarbonyl-L-phe ny lal any l-NQ1-methyl-L-methiony lamid

En blanding af 20 ml iseddike 2 ml anisol, 2 ml triethylsilan og 3,8 g (0,0144 mol) af produktet fra del F blev fremstillet.

Vandfrit hydrogenchlorid bobledes igennem den fremkomne blanding i 30 minutter. Blandingen fortyndedes med ether. Bundfaldet, der fremkom, filtreredes fra, tørredes (2,9 g) og genopløstes i 40 ml dimethylformamid. Blandingen afkøledes til 0 °C, og 2,9 ml (0,0146 mol) dicyclohexylamin blev tilsat efterfulgt af 1,97 g (0,0146 mol) HBT, 3,87 g (0,0146 mol) Na-t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanin og 3,0 g (0,0146 mol) DCC. Den fremkomne blanding omrørtes i 2 timer ved 0 °C og herefter i 24 timer ved stuetemperatur. Blandingen afkøledes til 0 °C og filtreredes. Det fremkomne filtrat koncentreredes i vakuum. Remanensen genopløstes i ethylacetat, og opløsningen vaskedes successivt med IN natrium-bicarbonat, vand, 0,75 N citronsyre og vand. Ethylacetatopløs-ningen tørredes herefter over magnesiumsulfat og inddampedes i vakuum til opnåelse af en olie, der ikke kunne krystallisere fra petroleumsether. Remanensen påførtes herefter en 3 x 50 cm silica-gel-kolonne (74-250 jjm) og elueredes med chloroform efterfulgt af chloroform-methanol (9,8:0,2). TLC-analyse af fraktionerne fra kolonnen og påfølgende kombination på basis af TLC-profilen gav efter afdampning af kromatografivæsken en remanens, 148904 17 der krystalliseredes fra ether-petroleumsether til opnåelse af 3,1 g (52,5 pct.) af titelforbindelsen; smeltepunkt 99-103 °C.

Analyse beregnet for C20^31^3°4^ (409,55): C 58,65 - H 7,63 - N 10,26 Fundet E 58,74 - H 7,47 - N 10,45.

H. Nffl-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanylglycyl-L-phenylalanyl-N^-methyl-L-methionylamid

Til en blanding af 20 ml iseddike, 3 ml anisol og 3 ml triethyl-silan sattes 2,2 g (5,37 mmol) af produktet fra del G. Tørt hy-drogenchlorid bobledes igennem blandingen i 30 minutter. Der sattes ether til blandingen, og et fast bundfald udfældedes, fra-filtreredes og tørredes i vakuum. Det faste stof (1,75 g, 5 mmol) opløstes i 30 ml tørt dimethylformamid, og blandingen afkøledes til 0 °C. Hydrogenchloridsaltet neutraliseredes herefter ved tilsætning af 0,99 ml (5 mmol) dicyclohexylamin. Efter 5 minutter tilsattes 2,05 g (5 mmol) af produktet fra del E efterfulgt af 0,68 g (5 mmol) HBT og 1,03 g (5 mmol) DCC. Blandingen omrør-tes herefter ved filtrering, og filtratet inddampedes i vakuum.

Den fremkomne remanens genopløstes i ethylacetat, og ethylacetat-fasen vaskedes successivt med IN vandig natriumbicarbonat, kold 0,75 N citronsyre og vand. Opløsningen tørredes herefter over magnesiumsulfat, overførtes til en 3 x 50 cm silicagelkolonne og elueredes med chloroform efterfulgt af chloroformmethanol (9:1). TLC-analyse af fraktionerne fra kolonnen og påfølgende kombination på basis af TLC-profilen gav to portioner råprodukt, der vejede 0,80 g og 1,2 g. Den første portion oprensedes yderligere ved præparativ tyndtlagskromatografi på silicagel (chloroform :methanol, 9:1) til opnåelse af 0,62 g af titelforbindelsen som et amorft fast stof.

148904 18

Analyse beregnet for C^^gNgOgS (700,86): C 58,27 - H 6,90 - N 11,99 Fundet: C 58,48 - H 6,64 - N 11,97.

Aminosyreanalysen, fundet: Tyr 0,99, Ala 1,00, Gly 1,00, Phe 1,00.

Den anden portion kromatograferedes to gange på samme måde som beskrevet ovenfor til opnåelse af 0,74 g af det ønskede produkt med den korrekte grundstofanalyse og aminosyreanalyse.

j OL ί I. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionyl- ;> amid, hydrochlorid_ !

Til 5 ml iseddike indeholdende 0,2 ml anisol sattes 0,72 g (1,03 mmol) af nævnte forbindelse fra del H. Vandfrit hydrogen-chlorid ledtes herefter igennem blandingen i 20 minutter. Blandingen lyofiliseredes til opnåelse af 0,74 g af titelproduktet.

Rj, 0,3.

En analytisk prøve af produktet tørredes i vakuum ved 100 °C.

Analyse beregnet for ε29Η41Ν6°65εΐ C637»20) : \ C 54,66 - H 6,49 - N 13,19 j

Fundet C 54,36 - H 6,19 - N 13,00. j i i j

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,01, Ala 0,99, Gly 1,00, Phe I

1,00 . j EKSEMPEL 2

Fremstilling af L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N“-methyl-L-methionylamid-sesquihvdrochlorid-monoacetat_ ! ! i i 148904 19 A. Benzyl-D-leucinat-p-tolunsulfonet

Denne forbindelse fremstilledes på en måde, der præcis svarede til den i del A i eksempel 1 beskevne til fremstilling af D-alaninat-forbindelsen. Udbytte 73 pct., smeltepunkt 155-156 °C.

Analyse beregnet for C20^27N05S (393,50): C 61,05 - H 6,92 - N 3,56 Fundet: C 61,17 - H 6,68 -N 3,81.

B. Benzyl-N -butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-leucinat

Til 50 ml DMF sattes 7,86 g (0,02 mol) af produktet fra del A. Blandingen afkøledes til 0 °C, og 2,24 g (0,02 mol) DABCO tilsattes. Blandingen omrørtes i 5 minutter, og 7,42 g (0,02 mol) N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin blev tilsat efterfulgt af 2,7 g (0,02 mol) HBT og 4,12 g (0,02 mol) DCC. Den fremkomne blanding omrørtes i 2 timer ved 0 °C og herefter 24 timer ved stuetemperatur. Blandingen afkøledes derefter til 0 °C, og den fremkomne suspension filtreredes. Filtratet koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen vaskedes successivt med IN natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat og filtreredes, og filtratet koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens krystalliseredes fra varm e-thanol til opnåelse af 9,0 g (78 pct.) af nævnte forbindelse, smeltepunkt 100-103 °C.

Analyse beregnet for (574,72): C 71,06 - H 7,37 - N 4,87 Fundet C 71,30 - H 7,15 - N 4,79.

20 148904

Ot C. N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-leucin

Til 80 ml tetrahydrofuran sattes 8,0 g (0,0139 mol) af produktet fra del B. Efter tilsætning af 20 ml vand afkøledes den fremkomne blanding til 0 °C, og 7,25 ml (0,0145 mol) 2N natriumhydroxid blev langsomt tilsat. Efter endt tilsætning omrørtes blandingen ved 0 "C i 30 minutter og herefter ved stuetemperatur i 4 timer. Reaktionsblandingen blev herefter fordelt mellem vand og ether. Vandfasen frasepareredes, køledes til 0 °C, blev gjort sur til pH 2 med kold IN saltsyre og ekstraheredes med ethylacetat. Ethyl-acetatekstrakten vaskedes med vand, tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og koncentreredes i vakuum til opnåelse af en sirupagtig remanens. Remanensen krystalliseredes fra ether-petroleumsether til opnåelse af 6,4 g (95 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 90-94 °C.

Analyse beregnet for C27^36^2^6 (484,59): C 66,92 - H 7,49 - N 5,78 Fundet: C 67,14 - H 7,38 - N 5,76.

OL

D. Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-leucyl- qlycinat_

En blanding af 3,37 g (0,010 mol) af p-toluensulfonatsaltet af benzylglycinat og 1,12 g (0,010 mol) DABC0 i 25 ml tørt dimethylformamid blev fremstillet. Til blandingen sattes 4,84 (0,010 mol) af forbindelsen fra del C. Blandingen afkøledes til 0 °C, og 1,35 g (0,010 mol) HBT og 2,06 g (0,010 mol) DCC blev tilsat. Den fremkomne blanding omrørtes i 2 timer ved 0 °C og herefter i 24 timer ved stuetemperatur. Blandingen afkøledes til 0 °C og filtreredes, og filtratet blev koncentreret i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen vaskedes successivt med IN natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N citronsyre og vand. Opløsningen tørredes over magnesiumsulfat, 148904 21 filtreredes og koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens krystalliseredes fra ethanol-vand til opnåelse af 4,0 g (63 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 114-116 °C.

Analyse beregnet for ^35^45^3()7 (631,77): C 68,44 - H 7,18 - N 6,65 Fundet: C 68,17 - H 7,12 - N 6,40.

01 E. N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl-qlycin

Til 5 ml vandfri DMF sattes 3,9 g (0,006 mol) af forbindelsen fra del D efterfulgt af 1,5 g 5 pct. palladium-på-carbon. Til blandingen sattes 40 ml ethanol, blandingen gennemblæstes med nitrogen, og hydrogen blev indført i 5 timer, idet blandingen blev holdt ved atmosfæretryk og stuetemperatur. Katalysatoren filtreredes fra blandingen, og filtratet inddampedes i vakuum.

Den fremkomne remanens krystalliseredes fra ether-ethylacetat til opnåelse af 2,3 g (85 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt: 189 - 190 °C.

Analyse beregnet for ^22^33^3^1 (451,52): C 58,52 - H 7,37 - N 9,31 Fundet C 58,79 - H 7,48 - N 9,39.

F. N -butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leucyl-glycyl-L-phenyl-ala-

OL

nyl-N -methyl-L-methionylamid_._

Til 10 ml vandfri DMF sattes 0,692 g (0,002 mol) af hydrogen-chloridsaltet af L-phenylalanyl-N0i-methyl-L-methionylamid (fremstillet som i del H i eksempel 1) og 0,903 g (0,002 mol) af produktet fra del E. Den fremkomne blanding afkøledes til 0 °C, og 0,28 ml (0,002 mol) triethylamin blev tilsat. Efter 10 minutters forløb blev der tilsat 0,27 g (0,002 mol) HBT og 0,412 g (0,002 mol) DCC. Blandingen omrørtes herefter ved 0 °C i 2 timer og herefter ved 4 °C i 24 timer. Det fremkomne bundfald fjernedes ved filtrering, og filtratet koncentreredes i vakuum til en 148904 22 remanens, der opløstes i ethylacetat. Ethylacetatopløsningen .vaskedes successivt med IN natriumcarbonat, vand, kold 0,75N citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat og filtreredes, og filtratet koncentreredes i vakuum. Remanensen overførtes til to præparative tyndtlagskromatografi-plader, og pladerne elueredes med chloroform-methanol (9,24:0,75).

Det største UV-positive bånd blev udskåret fra hver plade, og produktet elueredes fra"•silicagel med chloroform-methanol. Opløsningsmidlet fjernedes i vakuum til opnåelse af 1,2 g (81 pct.) af titelproduktet som et amorft fast stof.

[a]p5 -31,5 (C = 0,5, MeOH).

Analyse beregnet for C^H^NgOgS. (742,93): C 59,82 - H 7,33 - N 11,31 Fundet: C 59,88 - H 7,06 - N 11,15.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,01, Leu 1,00, Gly 1,00, Phe 0,99.

G · L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methio-nvlamid-sesquihvdrochlorid-monoacetat

Til 5 ml iseddike indeholdende 0,3 ml anisol sattes 0,900 g (0,0012 mol) af forbindelsen frå del F. Tørt hydrogenchlorid bobledes igennem blandingen i 20 minutter. Opløsningsmidlet fjernedes herefter ved lyofilisering fra vandig eddikesyre til opnåelse af nævnte forbindelse som et amorft fast stof.

[a]p5-2,l (C = 0,0, MeOH).

Analyse beregnet for C32H47N6°6S*5HC1*C2H4°2 (757,04): C 53,93 - H 6,79 - N 11,10 - Cl 7,02 Fundet C 54,30 - H 6,64 - N 11,32 - Cl 6,96.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 0,99, Leu 1,03, Gly 0,99, Phe 0,99.

148904 23 EKSEMPEL 3

OL

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -methyl-L-pheny1- Q/ alanyl-N -methyl-L-methionylamid-hydrochlorid-trihydrat_ OL Ct A. N,N-dicyclohexylammonium-N -t-butyloxycarbony1-N -methyl-L-phenylalaninat_

Til 80 ml tør tetrahydrofuran sattes 5,3 g (0,02 mol) Na-t-bu-tyloxycarbonyl-L-phenylalanin. Den fremkomne opløsning afkøledes til 10 °C, og 10 ml tør dimethyl formamid og 0,5 g 18-krone- 6-ether tilsattes. Til den fremkomne blanding sattes langsomt 10,15 g (indeholdende 0,060 mol KH) af en oliedispersion af ka-liumhydrid. Efter endt tilsætning afkøledes blandingen til 0 °C og 1,24 ml (0,02 mol) methyliodid blev tilsat. Omrøringen fortsattes ved stuetemperatur i 24 timer. Blandingen udhældtes på knust is og ekstraheredes med ether. Den vandige fase blev gjort sur til pH 2 med citronsyre og ekstraherende med ethylacetat.

Den organiske fase vaskedes med vand, tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum til opnåelse af en sirup, der ikke krystalliserede. NMR-spektret af siruppen stemte med det forventede derivat.

NMR: <J2,72, N-CH3 S 1,35, C(CH3)3

Siruppen opløstes i ether, og 4,0 ml dicyclohexylamin blev tilsat. Krystaller dannedes ved afkøling. Bundfaldet opsamledes og omkrystalliseredes fra methanol-ether til opnåelse af 6,8 g (74 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 171-174 °C.

[a]p5 -22,0° (C = 1, methanol).

Analyse beregnet for (460,66): C 70,40 - H 9,63 - N 6,08 Fundet: C 70,60 - H 9,49 - N 6,19.

148904 24 B. Να-t-Butyloxycarbonyl-Na-methyl-L-phenylalanyl-Na-methyl- L-methionylamid_

Til en opløsning af 30 ml tør dimethylformamid indeholdende 1,98 g (0,01 mol) af hydrochloridsaltet af N -methyl-L-methionylamid sattes 4,16 g (0,01 mol) Na-t-butyloxycarbonyl-Na-methyl-L-phe-nylalanin. Den fremkomne blanding omrørtes i 5 minutter, og der afkøledes herefter til 0 °C. HBT (1,35 g, 0,01 mol) og DCC (2,06 g, 0,01 mol) blev tilsat. Den fremkomne blanding omrørtes i 2 timer ved 0 °C og herefter i 24 timer ved stuetemperatur. Det fremkomne bundfald fjernedes ved filtrering, og filtratet koncentreredes i vakuum til opnåelse af en sirup, der genopløstes i ethylacetat. Ethylacetatopløsningen vaskedes successivt med IN natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes herefter over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum til en sirup. Den fremkomne sirup genopløstes i chloroform og ledtes til en 3 x 50 cm silicagelkolonne og e-lueredes med chloroform efterfulgt af chloroform-methanol (9,75: 0,25). TLC-analyse af fraktionerne fra kolonnen og påfølgende kombination på basis af TLC-profilen gav .efter koncentrering i vakuum 1,4 g (33 pct.) af en sirup, der viste et NMR-spektrum, der stemte med den nævnte forbindelse.

NMR: <f 2,93, N-CH-jPhe i2,73, N-CH3Met f2,10, S-CH3 il,37, C(CH3)3 C. Na-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-methyl-

OL

L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid_

Til en blanding af 5 ml iseddike, 1 ml anisol og 1 ml triethyl-silan sattes 1,4 g (0,0033 mol) af produktet fra del B. Tørt hydrogenchlorid indførtes via et gasfordelingsrør i 30 minutter, og reaktionsblandingen fortyndedes med ether. Det fremkomne 148904 25 bundfald opsamledes og tørredes (1,1 g) og genopløstes i 40 ml dimethylformamid. Reaktionsblandingen afkøledes til 0 °C, og 1,27 g (0,0031 mol) af produktet fra del E i eksempel 1, 0,42 g (0,0031 mol) HBT og 0,640 g (0,0031 mol) DCC blev tilsat. Efter 10 minutter blev der tilsat 0,43 ml (0,0031 mol) triethylamin, og omrøringen fortsattes ved 0 °C i 12 timer og herefter ved 4 °C i 24 timer. Det fremkomne bundfald fjernedes ved filtrering, og filtratet koncentreredes i vakuum til en sirupagtig remanens, der genopløstes i ethylacetat. Ethylacetatopløsningen vaskedes successivt med 1 N natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N citronsyre og vand og tørredes herefter over magnesiumsulfat, filtreredes og koncentreredes i vakuum til opnåelse af 2 g af det rå produkt. Produktet opløstes i chloroform og ledtes til en 3 x 50 cm kolonne af silicagel og elueredes med chloroform efterfulgt af chloroform-methanol (9:1). TLC-analyse af fraktionen fra kolonnen og påfølgende kombination på basis af TLC-profilen gav efter koncentrering i vakuum 1,1 g (47 pct.) af det ikke-krystallinske faste stof.

Analyse beregnet for (714,88): C 58,80 - H 7,05 - N 11,76 Fundet: C 59,01 - H 6,78 - N 11,58.

D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-methy1-L-phenylalany1-Na-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid-trihydrat_

Til en blanding af 10 ml iseddike og 0,5 ml anisol sattes 0,70 g (0,001 mol) af produktet fra del C. Tørt hydrogenchlorid ind-r førtes gennem et gasfordelingsrør i 20 minutter. Reaktionsblandingen blev herefter frosset og lyofiliseret til opnåelse af 0,67 g af det hygroskopiske produkt.

Analyse beregnet for C-jgH^NgOgSCl 3H20 (705,23): C 51,08 - H 7,0 - N 11,91 Fundet: C 51,03 - H 6,97- Nil,72.

14890Λ 26

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,03, Ala 1,01, Gly 0,96.

EKSEMPEL 4

OL

Fremstilling af L-Tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid, 1,25 hydrochlorid, monoacetat_ A. Benzyl-Na-t-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alaninat_

Til en opløsning af 3,19 g (0,01 mol) af p-toluensulfonatsaltet af benzylalaninat i 30 ml tør DMF sattes 4,43 g (0,01 mol) af produktet fra del B i eksempel 1. Den fremkomne blanding afkøledes til 0 °C, og 1,12 g (0,01 mol) DABC0 blev tilsat. EFter 10 minutters forløb blev der tilsat 1,135 g (0,01 mol) HBT og 2,06 g (0,01 mol) DCC. Den fremkomne blanding omrørtes ved 0 °C i 2 timer og herefter ved stuetemperatur i 48 timer. Det fremkomne bundfald fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes i vakuum til en sirup. Denne genopløstes i ethylacetat, og ethyl-acetatopløsningen vaskedes successivt med IN natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N saltsyre og vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat og filtreredes, og filtratet koncentreredes i vakuum til opnåelse af en remanens, der ikke kunne krystallisere fra ethanol eller ether. Fortynding af etheropløsningen med petroleumsether gav en gel, der opsamledes ved filtrering og tørredes i vakuum. Det urene amorfe faste stof (4 g) ledtes til en 3 x 50. cm silicagelkolonne og elueredes med chloroform efterfulgt af chloroform-methanol (9,75:0,25). TLC-analyse af fraktionerne fra kolonne, påfølgende kombination af fraktionerne på basis af TLC-profilen og inddampning af opløsningsmidlet i vakuum gav en sirupagtig remanens. Dette materiale opløstes i eddike og genudfældedes med petroleumsether til opnåelse af 3,0 g (50 pct.) af titelforbindelsen som et amorft fast stof, smeltepunkt 100 - 104 °C.

148904 27

Analyse beregnet for (603,72): C 67,64 - Η 6,85 - N 6,96 Fundet: C 67,56 - H 6,60 - N 7,16.

B. N0i-t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanin

Til 5 ml tør dimethylformamid sattes 2,9 g (0,0048 mol) af produktet fra del A. Til blandingen sattes 1,0 g 5 pct. palladium-på-carbon efterfulgt af 50 ml ethanol. Hydrogen indførtes ved atmosfæretryk og stuetemperatur via et gasfordelingsrør i 6 timer. Reaktionsbeholderen gennemblæstes derefter med nitrogen, katalysatoren opsamledes ved filtrering, og filtratet koncentreredes i vakuum. Remanensen opløstes i ethylacetat, og opløsningen fortyndedes med vand. Det fremkomne bundfald opsamledes ved filtrering og tørredes i vakuum til opnåelse af 1,5 g (74 pct.) af titelforbindelsen som et amorft fast stof.

[a]p^25,9° (C = 5, chloroform).

Analyse beregnet for C20^29*S^7 ^^3,47): C 56,7.3 - H 6,90 - N 9,92. fundet: C 56,80 - H 6,95 - N 9,81.

Oi C. N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenyl- η alanyl-N -methyl-L-methionylamid_

Til 10 ml tør dimethylformamid sattes 0,692 g (0,002 mol) af hydrogenchloridsaltet af L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methiony1-amid (fremstillet som i del H i eksempel 1). Blandingen afkøledes til 0 DC, og 0,28 ml (0,002 mol) triethylamin blev tilsat. Reaktionsblandingen omrørtes i 10 minutter, og 0,846 g (0,002 mol) af produktet fra del B blev tilsat efterfulgt af 0,270 g (0,002 mol) HBT og 0,412 g (0,002 mol) DCC. Den fremkomne blanding omrørtes ved 0 °C i 2 timer og herefter ved stuetemperatur i 48 timer. Efter fornyet afkøling af blandingen til 0 °C filtreredes denne, og filtratet koncentreredes i vakuum. Remanensen genopløstes i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen vas- 148904 28 kedes successivt med 1 N natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes herefter over magnesiumsulfat og filtreredes, og filtratet koncentreredes i vakuum til opnåelse af 1,6 g af det rå produkt. Produktet opløstes i chloroform og overførtes til 2 præparative tyndtlagskro-matografiplader. Pladerne eluerede med chloroform-methanol (9:1). Hovedbåndet blev udskåret fra hver plade, og produktet blev udvundet fra silicagelen ved ekstraktion med chloroform-methanol.

Eluatet (1,3 g) opløstes og ledtes til en enkelt tyktlagskroma-tografiplade, hvor det kromatograferedes til opnåelse af 1,0 g (70 pct.) af titelforbindelsen som et amorft, fast stof.

[α]ρ5-25,6° (C = MeOH).

Analyse beregnet for C-^H^gNgOgS (714,88): C 58,80 - H 7,05 - N 11,76.

Fundet C 58,60 - H 6,87 - N 11,53.

D. L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L.

methionylamid-hydrochlorid-monoacetat_

Til 5 ml iseddike indeholdende 0,5 ml anisol sattes 0,88 g (0,0011 mol) af produktet fra del C. Tørt hydrogenchlorid indførtes via et gasfordelingsrør i 20 minutter. Reaktionsblandingen blev frosset og lyofiliseret til opnåelse af 0,704 g af titelforbindelsen.

[ca]25 -16,2 (C = 0,5, MeOH).

Analyse beregnet for C5QH42N606S'1,25HC1*C2H^02 (719,14): C 53,43 - H 6,45 - N 11,68 - Cl 6,16

Fundet: C 53,48 -H 6,47 - N 11,62 - Cl 6,50.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,00, Ala, 1,99, Phe 1,01.

EKSEMPEL 5

Fremstilling af L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-N01-methyl-5-ethyl-cysteinylamidacetat_ 29 148904 A. Na-t-Butyloxycarbonyl-5-ethyl-L-cystein, dicyclohexylaminsalt

Til 400 ml N,N-dimethylformamid (DMF) sattes 50 g (0,336 mol) L-(S-ethyl)cystein. Tetramethylguanidin (44,8 ml, 0,336 mol) og dicyclohexylamin (66,8 ml, 0,336 mol) sattes til reaktionsblandingen. Tert-butylazidoformiat (68 ml, 0,60 mol) sattes herefter dråbevis til reaktionsblandingen i løbet af en periode på 1 time, og blandingen omrørtes i 48 timer ved stuetemperatur.

Det udfældede dicyclohexylammoniumazid fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes i vakuum. Remanensen fordeltes mellem ether og vand. pH i den vandige fase indstilledes til 8,0. Den organiske fase separeredes fra og blev borthældt. Den vandige fase blev gjort sur til pH 2 med kold fortyndet saltsyre og ekstraheret med kold ethylacetat. Ethylacetatfasen vaskedes herefter med vand, tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum. Remanensen opløstes i ethér, og 66,8 ml (0,336 mol) dicyclohexylamin blev tilsat. Det fremkomne bundfald opsamledes og omkrystalliseredes fra ethylacetat til opnåelse af 32,8 .

g (23 pct. af det teoretiske udbytte) af nævnte produkt, · smeltepunkt 156 - 159 °C.

[a]j?5 -1,1° - (C = 1, MeOH) * . .

[α]365"7,7° (C = 1* Me0H>*

Analyse beregnet for ^22^42^2^4^ (430,6): C 61,36 - H 9,83 - N 6,51 -

Fundet: C 60,37 - H 9,98 - N 6,26.

B. Na-Butyloxycarbonyl-t^-methyl-5-ethyl-L-cysteinylamid

Til 50 ml tør tetrahydrofuran (THF) sattes 18,58 g (74,3 mmol) N -butyloxycarbony1-S-ethyl-L-cystein (fremstillet ved neutralisering af produktet fra del A og ekstraktion med ethylacetat).

Den fremkomne blanding sattes dråbevis i løbet af 30 minutter til en mekanisk omrørt suspension af 42,45 g kaliumhydrid (22,1 pct. KH i mineralolie, 0,234 mol KH) i 375 ml tetrahydrofuran 148904 30 ved O °C indeholdende 0,35 g 18-krone-6-ether. Der tilsattes dråbevis i løbet af 15-20 minutter methyliodid (9,25 ml, 0,149 mol) i 20 ml tetrahydrofuran. Blandingen omrørtes ved 0 °C i 1,5 timer, og 7,5 ml eddikesyre i 7,5 ml THF blev dråbevis tilsat efterfulgt af 5 ml ethanol. Den fremkomne reaktionsblanding ud-hældtes i is, og pH i blandingen indstilledes til 9 ved tilsætning af 2N natriumhydroxid. Den fremkomne vandige opløsning eks-traheredes med ether. pH i den vandige fase indstilledes til 3 ved tilsætning af fast citronsyre, og der ekstraheredes igen med tre 300 ml portioner ether. Etherekstrakterne kombineredes, ekstraheredes igen med vand, tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i 200 ml ether, og 9,56 ml ^4,3 mmol) d( + ) a-methylbenzylamin blev tilsat. Blandingen afkøledes, og 500 ml petroleumsether blev tilsat. Ingen krystallisation fremkom. Opløsningen koncentrere-des i vakuum og genopløstes i petroleumsether. Blandingen afkøledes til -78 °C, og en lille mængde af bundfaldet, der dannedes, blev opsamlet ved filtrering (2,74 g). Modervæsken koncentrere-des i vakuum, og remanensen genopløstes i ether. Etheropløsnin-gen ekstraheredes med IN citronsyre. Den organiske fase ekstraheredes med vand, tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum til opnåelse af 6,56 g (33 pct. af det teoretiske udbytte) af en sirup.

[a]£5 -61,1° (C = 1, EtOH) NMR (CDC13) 2,90, n-CH-j 1,45, t-Bu 4,9 - 4,5, CH.

6,5 g 0,025 mol af produktet opløstes i 80 ml DMF, og blandingen afkøledes til -15 °C. 3,6 ml (0,027 mol) isobutylchlorformiat tilsattes efterfulgt af 2,99 ml (0,027 mol) N-methylmorpholin.

Den fremkomne blanding omrørtes i 10 minutter ved -15 °C, og herefter bobledes vandfri ammoniak igennem reaktionsblandingen i 1 time. Blandingen omrørtes i yderligere 4 timer ved -15 °C og udhældtes herefter på en blanding af is og IN natriumbicar- i 31 148904 bonat. Den kolde vandige fase ekstraheredes med ether. Ether-ekstrakten ekstraheredes med kold 0,75 N citronsyre og vand, tørredes over magnesiumsulfat og tørredes i vakuum til opnåelse af en remanens, der krystalliseredes fra en blanding af ether og petroleumsether til opnåelse af 1,7 g (26 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 56 - 59 °C.

[a]p5 -127,6 (C = 0,5, CHCl^) NMR (CHClj) 2,80, N-CH-j 1,46, t-Bu 4,9 -4,5, a-CH.

Analyse beregnet for cilH21N2°3S (261,36) C 50,55 - H 8,10 - N 10,72 Fundet: C 50,56 - H 7,93 - N 10,51.

C. Na-Butyloxycarbony1-L-phenylalanyl-Na-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid_

Til 20 ml iseddike indeholdende 1 ml triethylsilan og 4 ml anisol sattes 2,5 g (9,5 mmol) NI a-t-butyloxycarbonyl-Nffi-methy1-S-ethyl-L-cysteinylamid. Tørt hydrogenchlorid bobledes igennem blandingen i 30 minutter, og ether tilsattes for at udfælde hydrogenchlorid-saltet (1,8 g). Bundfaldet opløstes i 25 ml DMF. Blandingen afkøledes til 0 °C og neutraliseredes med 1,31 ml triethylamin. Der tilsattes NIa-t-buty loxycarbonyl-L-phenyiålanin (2,65 g, 0,01 mol) efterfulgt af 1,35 g (0,01 mol) HBT og 2,06 g (0,01 mol) DCC.

Den fremkomne blanding omrørtes ved 0 °C i 2 timer og herefter ved stuetemperatur i 24 timer. Blandingen afkøledes til 0 °C, og det fremkomne bundfald fjernedes ved filtrering. Filtratet koncentreredes i vakuum til en remanens. Remanensen opløstes i e-thylacetat, og ethylacetatopløsningen ekstraheredes med 1 N na-triumbicarbonat, vand, 0,75 NI citronsyre og vand. Blandingen tørredes herefter over magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet fjernedes i vakuum til opnåelse af en sirup. Denne sirup op- 148904 32 løstes i chloroform, og opløsningen ledtes til en 3 x 45 cm kolonne indeholdende Grade 62 Grace and Davidson silicagel.

Eluering med en trinvis chloroform-methanol-gradient tCHCl^-> CHCl^/MeOH (9:1) og lokalisering af produktet ved TLC-profilen af fraktionerne gav efter kombination af de passende fraktioner og afdampning af opløsningsmidlet i vakuum 3,0 g af titelproduktet .

[a]p5 -77° (C = 0,5, MeOH).

Analyse beregnet for C£0^31N304^ (409,5): C 58,65 - H 7,63 - N 10,26 Fundet: C 58,87 - H 7,41 - N 9,81.

OL

D. N -t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alany1-glycin, dicyclo-hexylaminsalt_

Produktet fra hydrogenolyse (ifølge metoden del E i eksempel 1) af 46,80 g benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinat opløstes i 150 ml isopropylalkohol, og 16 ml (0,081 mol) dicyclohexylamin blev tilsat. Ether blev tilsat til et totalt volumen på 1,5 liter. Den halvfaste masse behandledes, indtil den blev fast, og det fremkomne bundfald opsamledes og tørredes til opnåelse af 46,04 g (98 pct.) produkt med smeltepunkt 194,5 - 197 °C. Det faste stof opløstes i 100 ml kogende methanol, og 500 ml isopropylalkohol blev tilsat. Voluminet af opløsningen blev reduceret under en nitrogenstrøm til 150 ml. Efter afkøling begyndte krystallisationen. Blandingen fik lov at stå natten over, og bundfaldet blev opsamlet og tørret til opnåelse af 41,44 g (88 pct.) af nævnte forbindelse. Smeltepunkt 198 - 200,5 °C.

[alp5 + 17,9° (C = 1, MeOH).

Analyse beregnet for ^j^gN^Oy (590,8): C 63,03 - H 8,53 - N 9,48 Fundet C 62,95 - H 8,77 - N 9,20.

148904 33 E. Na-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycy1-L-phenyl-alanyl-N^-methyi-S-ethyl-L-cysteinylamid_

Til 20 ml iseddike indeholdende 3 ml anisol og 3 ml triethyl-silan sattes 2,5 ml (6,1 mmol) af produktet fra del C. Tør hydro-genchloridgas bobledes igennem reaktionsblandingen i 25 minutter. Ether blev herefter tilsat, og blandingen afkøledes og filtreredes til opnåelse af 1,9 g (5,5 mmol) af hydrogenchlorid-saltet. Dette opløstes i 25 ml DMF. Blandingen afkøledes, og 3,2 g (5,5 mmol) N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, dicyclohexylaminsalt blev tilsat. Den fremkomne blanding omrørtes i 10 minutter. 0,74 g (5,5 mmol) HBT og 1,1 g (5,5 mmol) DCC blev tilsat, og reaktionsblandingen omrørtes ved 0 °C i 2 timer og ved 4 °C i 48 timer. Det fremkomne bundfald fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes i vakuum. Remanensen opløstes i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen ekstraheredes med IN natriumbicarbonat, vand, 0,75 N citronsyre og vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat og inddampedes i vakuum til opnåelse af 3,5 g af det rå produkt. Dette opløstes i chloroform, ledtes til en 3 x 45 cm'kolonne med Grade 62 Grace and Davidson silicagel og elueredes med en trinvis gradient af chloroform-methanol [CHCl-j * CHCl^/MeOH (9:1)]. Fraktionerne kombineredes på basis af TLC-profilen og inddampedes i vakuum til opnåelse af 2,4 g (62 pct.) af det rå produkt.

[of]p5 -30,7 0 (C = 0,5, MeOH) .

Analyse beregnet for Cj^H^gNgOgS (700,86): C 58,27 - H 6,90 - N 11,99 Fundet: C 58,14 - H 6,98 - N 11,94.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,01, Ala 1,00, Gly 1,00, Phe 0,98, NH3 1,09.

Ot F. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-N -methyl-S-ethylcysteinylamidacetat_ 34 148904

Til 20 ml iseddike indeholdende 2 ml anisol og 2 ml triethyl-silan sattes 2,2 g (3 mmol) af produktet fra del E. Tørt hydro-genchlorid bobledes igennem reaktionsblandingen i 25 minutter.

Der blev herefter sat ether til blandingen, og denne afkøledes.

Det fremkomne bundfald filtreredes og tørredes (2 g). En del af bundfaldet (1,2 g) opløstes i en tilstrækkelig mængde puffer (1 pct. pyridin og 0,05 pct. eddikesyre i vand) til opnåelse af et totalt volumen på 10 ml. Opløsningen ledtes til en 2,5 x 99 cm kolonne af DEAE-Sephadex® A 25 (acetat), der på forhånd var bragt i ligevægt med samme puffer. Eluatet blev målt ved 280 nm, og de egnede fraktioner blev kombineret og lyofilise-ret. Relyofilisering fra 10 pct. Eddikesyre efterfulgt af lyo-filisering fra en 75:25 blanding af vand og acetonitril gav 0,59 g af titelproduktet.

[a]p5 +9,9 (C = 0,5, IN HC1).

Analyse beregnet for (660,79): C 56,35 - H 6,71 - N 12,72 - S 4,85 Fundet: C 56,63 - H 6,72 - N 12,63 - 5 4,69.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,00, Ala 1,01, gly 1,00, Phe 0,98, NH3 1,09.

EKSEMPEL 6 Λ

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N me thyl-L-leucyl amid-acetat__ A. Na-t-Butyloxyca.rbonyl-Na-methyl-L-leucin, d ( + )ca-methylben-zylaminsalt_

Til 20 ml ether sattes 12,5 g (0,05 mol) Nffi-t-butyloxycarbonyl-L-leucin-hydrat. Blandingen tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum. Remanensen opløstes i 75 ml tetrahy-drofuran, og den fremkomne opløsning sattes dråbevis i løbet 148904 35 af 35 minutter til en mekanisk omrørt, afkølet (0°C) suspension af 27,9 g af en kaliumhydridsuspension (22,1 pct. suspension i mineralolie, 0,154 mol KH) i' 200 ml THF indeholdende 0,25 g 18-krone-6-ether. 6,4 ml methyliodid i 10 ml tetrahydrofuran blev herefter dråbevis tilsat i løbet af 15 minutter. Blandingen blev holdt på 0°C i 3 timer, og 5 ml eddikesyre i 5 ml tetrahydrofuran blev tilsat dråbevis efterfulgt af 5 ml ethanol. Den fremkomne blanding udhældtes i 500 ml is, og pH i blandingen indstilledes til 9 ved tilsætning af 1 N natriumhydroxid. Den vandige opløsning ekstra-heredes med ether og blev herefter gjort sur til pH 3 ved tilsætning af fast citronsyre. Den sure vandige suspension ekstraheredes herefter med ether. De kombinerede etherek-strakter vaskedes med vand, tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum til opnåelse af 13,2 g (107 pct. af det teoretiske) råt produkt. Undersøgelse af produktet ved TLC indikerede nærværelsen af noget ureageret udgangsmateriale. Produktet opløstes i ether, og 5,25 ml (0,05 mol) tert.-butylamin blev tilsat. Etheropløsningen fortyndedes med petroleumsether og afkøledes natten over. Det dannede bundfald (5,4 g) blev fjernet. Filtratet ekstraheredes med IN citronsyre og herefter med vand. Den organiske fase tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum til en remanens. Remanensen (6,45 g) opløstes i 100 ml ether, og 3,39 g (0,026 mol) d(+)a-methylbenzylamin blev tilsat. Opløsningen afkøledes natten over og filtreredes til opnåelse af 9,09 g (49 pct. af det teoretiske) af titelproduktet.

Smeltepunkt 120 - 122 °C.

[a]jp -14,1° (C = 1, MeOH).

analyse beregnet for (366,5): C 65,54 - H 9,35 - N 7,64 Fundet C 65,83 - H 9,05 - N 7,35.

36 148904 B. N^t-Butyloxycarbonyl-N^-methyl-L-leucylaniid

Til 80 ml DMF sattes 11,5 g (0,047 mol) Na-t-butyloxycar-bonyl-N^-methyl-L-leucin (fremstillet ved neutralisering af produktet fra del A med citronsyre og ekstraktion med ether). Blandingen afkøledes til -15 °C. 6,7 ml (0,052 mol) isobutylchlorformiat og 7,5 ml (0,052 mol) N-methylmorpholin blev tilsat. Blandingen omrørtes i 10 minutter ved -15 °C, og vandfri ammoniak bobledes igennem reaktionsblandingen i 1 time. Omrøringen blev fortsat i 4 timer ved -15 °C. Reaktionsblandingen udhældtes i en blanding af IN natriumbicarbonat og is. Den kolde blanding ekstraheredes med ether. Etherfasen ekstraheredes med 0,75 N citronsyre og vand, tørredes over magnesiumsulfat og inddampedes i vakuum. Remanensen krystalliseredes fra en blanding af ether og petroleumsether til opnåelse af 5,5 g (48 pct.) af nævnte forbindelse, smeltepunkt 127 - 128 °C.

[alp5 -42,2° (C = 1, MeOH).

Analyse beregnet for ^12^24^2^3 (244,3): C 58,99 - H 9,90 - N 11,47 Fundet C 59,17 - H 9,66 - N 11,21.

C. N -t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-leucylamid

Til 30 ml iseddike indeholdende 3 ml anisol og 3 ml triethyl-silan sattes 5 g (0,02 mol) af produktet fra del B. Tør hy-drogénchlorid bobledes igennem reaktionsblandingen i 25 minutter. Ether blev herefter tilsat, og blandingen blev afkølet. Det fremkomne bundfald opsamledes og tørredes (3,6 g).

Det opsamlede hydrochloridsalt opløstes i 60 ml dimethylform-amid. Den fremkomne opløsning afkøledes til 0 °C, og 3,99 ml (0,02 mol) dicyclohexylamin blev tilsat. Blandingen omrørtes ved 0 °C i 10 minutter, og 5,3 g (0,02 mol) Na-t-butyloxy-carbonyl-L-phenylalanin blev tilsat efterfulgt af 2,7 g 37 U8904 (0,02 mol) HOT og 4,12 g (0,02 mol) DCC. Reaktionsblandingen om-rørtes i 2 timer ved 0 °C og herefter ved stuetemperatur i 24 timer. Blandingen afkøledes til 0 °C og filtreredes, og filtratet inddampedes i vakuum. Remanensen opløstes i ethylacetat, og ethyl-acetatopløsningen ekstraheredes med IN natriumbicarbonat, vand, 0,75 N citronsyre og vand. Opløsningen tørredes herefter over magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet inddampedes i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i chloroform og ledtes til en 3 x 45 cm kolonne med Grade 62 Grace and Davidson silicagel. Elueringen udførtes med en trinvis chloroform-methanol-gradient [CHCl^ -CHClj/MeOH (9:1)]. Fraktionerne kombineredes på basis af TLC-profilen til opnåelse af 5,7 g (73 pct.) af titelforbindelsen efter afdampning af opløsningsmidlet.

[a]p5 -49,5° (C = 0,5, MeOH).

NMR (CDC13) 1,4, t-Bu 7,25, phenyl 0,95 - 0,75, CH(CH3)2 2,7, - N-CHr G& D. N -t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycy1-L-phenyl-01 alanyl-N -methyl-L-leucylamid_

Til en blanding af 20 ml IN saltsyre i iseddike indeholdende 1 ml anisol sattes 2 g af produktet fra del C. Blandingen blev holdt ved stuetemperatur i 30 minutter, og der tilsattes ether. Blandingen afkøledes, og det fremkomne bundfald opsamledes og tørredes (1,63 g). Det opsamlede hydrochloridsalt opløstes i 30 ml DMF, og der tilsattes 2,95 g (0,05 mol) Na-t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, dicyclohexylaminsalt. Blandingen om-rørtes i 15 minutter ved 0 °C, og 0,675 g (0,005 mol) HBT og 1,3 g (0,005 mol) DCC blev tilsat. Reaktionsblandingen blev herefter omrørt i 24 timer ved 4 °C. Det fremkomne bundfald blev opsamlet, og filtratet koncentreredes i vakuum. Remanensen opløstes i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen ekstraheredes 148904 38 med IN natriumbicarbonat, vand, 0,73 N citronsyre og vand. Ethyl-acetatopløsningen tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum. Den fremkomne remanens opløstes i chloroform, og chlo-roformopløsningen ledtes til en 3 x 45 cm kolonne med Woelπί¾Γade III silicagel. Kolonnen elueredes med en trinvis chloroformme-thanol-gradient [CHCl^ -> CHCl^-MeOH (9:1)], og fraktionerne kombineredes på basis af TLC-profilen. Efter afdampning af opløsningsmidlet opnåedes 2,3 g (67 pct.) af nævnte forbindelse.

[a]p5 -17,5° (C = 0,6, MeOH).

Analyse beregnet for C35H5gNg°g (782,8): C 6,157 - H 7,38 - N 12,31 Fundet: C 61,33 - H 7,47 - N 12,08.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 0,99, Phe 1,00, NH3 1,08.

ύί E. L-Tyrosyl-D-alanyl-Glycyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-leucyl-amid-acetat_

Til 5 ml myresyre indeholdende 0,5 ml anisol og 0,1 ml triethyl-silan sattes 1*8 g (0,003 mol) af produktet fra del D. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 3 timer. Reaktionsblandingen fortyndedes med ether og fik lov til at henstå i 1 time. Ethe-ren dekanterede fra den fremkomne olie, og olie opløstes i ethanol. Tilsætning af ether gav et bundfald, der filtEeredes og tørredes til opnåelse af 0,9 g råprodukt. Produktet opløstes i en tilstrækkelig stor mængde puffer (1 pct. pyridin og 0,05 pct. myresyre i vand) til opnåelse af et volumen på i alt 5 ml. Opløsningen ledtes til en 2,5 x 100 cm kolonne indeholdende DEAE-Sephade^^-25 (formiat) og elueredes med den samme puffer. De egnede fraktioner kombineredes på basis af UV-elueringsprofilen ved 280 nm og lycrf iliseredes. Re-lyofilisering fra 10 pct. eddi-kesyreog fra en 75:25 blanding af vand og acetonitril gav 0,852 g af titelproduktet.

148904 39 [α]ρ5 +23,2 (C = 0,6, IN HC1).

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,02, Ala 1,00, Gly 1,01, Phe 0,96, NH3 1,03.

EKSEMPEL 7

Fremstilling af L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methionylamid-acetat___ a øi A. N -t-Butyloxycarbony1-N -methyl-L-methionin, d(+)a-methyl-benzylaminsalt_

Dicyclohexylaminsaltet af Na-t-butyloxycarbonyl-L-methionin (86,13 g, 0,2 mol) suspenderedes i 600 ml kold ether. Suspensionen ekstraheredes 4 gange med 100 ml kold 1,5 N citronsyre og vand. Den fremkomne- organiske fase separeredes fra, tørredes over magnesiumsulfat og koncentreredes i vakuum. Remanensen opløstes i 150 ml THF, og opløsningen sattes dråbevis i løbet af 30 minutter til en mekanisk omrørt suspension af 0,6 mol kaliumhydrid i 1000 ml tør tetrahydrofuran (0 °C) indeholdende 1,0 g 18-krone- 6-ether. Methyliodid (25 ml, 0,4 mol) blev tilsat dråbevis i løbet af 15 minutter. 2 timer efter tilsætningen af methyliodid tilsattes dråbevis en blanding af 20 ml eddikesyre og 20 ml tetrahydrof uran efterfulgt af 40 ml ethanol. Blandingen omrørtes i 30 minutter og udhældtes herefter i 2 liter is. pH i den vandige blanding indstilledes til 7 med 2N kaliumhydroxid. Den vandige blanding ekstraheredes tre gange med 400 ml ether, og herefter blev den gjort sur til pH 3 med kold citronsyre. Blandingen ekstraheredes tre gange med 500 ml ether. Etherekstrakterne kombineredes, ekstraheredes og tørredes over magnesiumsulfat og inddampedes endelig i vakuum til en sirup (44,76 g, 84 pct. af det teoretiske). Siruppen opløstes i 450 ml ethylacetat, og 25,78 ml (0,2 mol) d( + )oi-methylbenzylamin blev tilsat. Efter afkøling og skrabning fremkom krystallisation. Titelforbindelsen opsamledes ved filtrering til opnåelse af 51,05 g (66 pct.), smeltepunkt 131 - 134 °C.

40 148904 [α]ρ5 -18,9° (C = 1, EtOH).

Analyse beregnet for ^19^32^2^4^ (384,54): C 59,35 - H 8,39 - N 7,29 Fundet C 59,15 - H 8,12 - H 7,21.

Q 04 B. N -t-Butyloxycarbonyl-N -methyl-L-methionylamid 33.3 g ((0,127 mol) ND!-t-butyloxycarbonyl-Na-methyl-methionin, fremstillet ved at gøre d(+)a-methylbenzylaminsaltet fra del A surt og ekstrahere med ether, opløstes i 160 ml DMF. Opløsningen afkøledes til -15 °C, og 18,3 ml (0,14 mol) isobutylchlorformiat og 15.4 ml (0,14 mol) N-methylmorpholin blev tilsat. Blandingen om-rørtes i 10 minutter ved -15 °C, og vandfri ammoniak bobledes i-gennem blandingen i en time via et gasfordelingsrør. Reaktionsblandingen omrørtes i 1 time ved -15 °C og udhældtes i 300 ml af en kold IN natriumhydrogencarbonatopløsning. Den vandige suspension ekstraheredes med ether. Etherekstrakten vaskedes med vand, kold 0,75 N citronsyre og vand, tørredes over magensiumsulfat og inddampedes i vakuum til en sirup. Denne omkrystalliseredes fra ether-petroleumsether til 16 g (48 pct.) af nævnte forbindelse. Smeltepunkt 75 - 77 °C.

[a]p5 -117,3° (C = 0,5, CHClj).

Analyse beregnet for c;qH22N2S03 (262,37): C 50,36 - H 8,45 - N 10,68

Fundet C 50,63 - H 8,57 - N 10,45.

04 04 C. N -t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid

En blanding af 70 ml iseddike, 5 ml anisol, 7 ml triethylsilan og 13,515 g (0,05 mol) af produktet fra del B blev fremstillet.

Vandfrit hydrogenchlorid bobledes igennem den fremkomne blanding i 25 minutter. Blandingen udhældtes i ether, og det fremkomne bundfald opsamledes og tørredes (9,9 g). Hydrochloridsaltet opløstes 148904 41 i 200 ml DMF. Blandingen afkøledes til 0 °C, og 9,9 ml (0,05 mol) dicyclohexylamin blev tilsat. Efter omrøring i 10 minutter blev der tilsat 6,8 g (0,05 mol) HBT, 13,3 g (0,05 mol) Na-t-butyl-oxybenzyl-L-phenylalanin og 10,3 g (0,05 mol) DCC. Den fremkomne blanding blev omrørt i 2 timer ved 0 °C og herefter 48 timer ved stuetemperatur. Blandingen afkøledes til 0 °C og filtreredes. Det fremkomne filtrat koncentreredes derefter i vakuum til en olie.

Olien genopløstes i ethylacetat, og opløsningen vaskedes successivt med IN natriumbicarbonat, vand, 0,75 N citronsyre og vand.

Ethylacetatopløsningen tørredes herefter over magnesiumsulfat og inddampedes i vakuum til opnåelse af en remanens, der krystalliseredes fra ether til opnåelse af 16,4 g (80 pct.) af titelforbindelsen, smeltepunkt 114 - 115 °C.

[a]p5 -43,4° (C = 0,5, MeOH).

Analyse beregnet for ^20^31^3^4^ (409,55): C 58,65 - H 7,63 - N 10,36 Fundet: C 58,76 - H 7,42 - N 10,30.

D. N^-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-

Na-methyl-L-methionylamid_

Til en blanding af 20 ml iseddike, 2 ml anisol og 2 ml triethyl-silan sattes 3,5 g (8,56 mmol) af produktet fra del C. Tørt hy-drogenchlorid bobledes igennem blandingen i 25 minutter. Der tilsattes ether, og hydrochloridsaltet udfældedes. Dette filtreredes fra og tørredes i vakuum. En opløsning af 5 g (8,47 mmol) N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, dicyclohexylaminsalt i 40 ml DMF afkøledes til 0 °C, og ovennævnte hydrochloridsalt blev tilsat. Efter omrøring ved 0 “C i nogle få minutter tilsattes 1,1 g (8,47 mmol) HBT og 1,7 g (8,47 mmol) DCC. Blandingen omrørtes i 24 timer ved 0 °C. Det fremkomne uopløselige materiale fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes i vakuum. Den fremkomne remanens genopløstes i ethylacetat, og ethylacetat-fasen vaskedes successivt med IN vandig natriumbicarbonat, vand, kold 0,75 N

148904 42 citronsyre og vand. Opløsningen tørredes herefter over magnesium-sulfat og inddampedes i vakuum. Remanensen kromatograferedes på Grace and Davidson G-62 silicagel til opnåelse af 4,1 g (69 pct.) af titelforbindelsen.

[all5 -13,1° (C = 0,5, MeOH).

Analyse beregnet for C^gH^gN^OgS (700,86): C 58,27 - H 6,90 - N 11,99 Fundet: C 58,05 - H 6,62 - N 11,73.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 0,99,

Phe 1,00, ΝΗ^ 1,01.

E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N“-methyl-L-methionyl-amid-acetat_

Til 15 ml thioanisol sattes 8,3 g (0,012 mol) af produktet fra del D. Blandingen’afkøledes til 0 °C, og 50 ml kold TFA blev tilsat. Blandingen omrørtes ved 0 °C i 30 minutter og fortyndedes derefter med adskillige voluminer ether. Det fremkomne bundfald opsamledes og tørredes til opnåelse af 8 g af det rå trifluor-acetatsalt. Saltet opløstes i en tilstrækkelig mængde vandig puffer indeholdende 1 pct. pyridin og 0,05 pct. eddikesyre til et volumen på i alt 60 ml. Opløsningen ledtes til en 5 x 138 cm kolonne af DEAE SephadeifiX-25 (acetatform), der på forhånd var bragt i ligevægt med den samme puffer. UV-absorbansen ved 280 jim blev målt, og produktet, der elueredes mellem 1270 ml og 1950 ml, blev opsamlet. Pufferen blev lyofiliseret. Remanensen blev opløst i 200 ml IN eddikesyre, og opløsningen blev lyofiliseret. En endelig lyofilisering fra vand-acetonitril (3:1) gav 6,4 g (83 pct.) af nævnte forbindelse.

[a]g5+21,7 (C = 1, IN HC1).

148904 43

Analyse beregnet for C3iH44N6°gS (660,79): C 56,35 - H 6,71 - N 12,72 - 0 19,37 Fundet C 56,50 - H 6,46 - N 12,62 - 0 19,25.

Aminosyreanalyse, fundet: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 1,00,

Phe 0,99, NH3 1,03.

EKSEMPEL 8

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-

0J

N -methvl-L-methionvlamid. acetatsalt.

A. Trifluoreddikesyresaltet af L-tyrosy 1-D-alanyl-glycyl-

CL

L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylbenzhydryl-harpiks. ' R-eptid-harpiksen blev syntetiseret ved automatisk fastfase-syntese i et Beckman® 900 peptid-synteseapparat under anvendelse af 5,0 g benzhydrylamin-harpiks. Harpiksen blev neutraliseret med 4% diisopropylethylamin (DIEA) i methylen-chlorid, hvorefter den fik lov til at koble sig med Boc-(N-Me)-Met-0H og DCC i methylenchlorid til opnåelse af den Boc-(N-Me)-Met-sub'stituerede harpiks. Man inkorporerede successivt Boc-Phe-0H, Boc-Gly-0H, Boc-D-Ala-0H og Boc-Tyr-0H på peptid-harpiksen ved begyndende kobling ifølge program nr. 1 og efterfølgende genkobling af den samme aminosyre ifølge program nr.

2. Program nr. 2 blev gennemført én gang for hver af amino-syrerne med undtagelse af L-Phe-0H, hvor programmet blev gennemført tre gange. Man fjernede beskyttelsen fra den resulterende Boc-pentapeptid-harpiks ifølge trin 1 - 8 i program nr.

1 til opnåelse af 6,13 g af titelforbindelsen. Udvaskningerne i program nr. 1 og program nr. 2 blev gennemført med 10 ml væske pr. g harpiks.

Program nr. 1 1. Vask tre gange med CH2C12· 2. Behandling i 5 minutter med en 30:5:65 volumenblanding af TFA:Et3SiH:CH2Cl2.

44 148904 3. Behandling som i trin 2 i 30 minutter 4. Vask to gange med CH2C12· 5. Vask med methanol:CH2C12 (1:1) 6. Vask to gange med methanol.

7. Vask med methanol:CH2C12 (1:1)· 8. Vask to gange med CH2C12· 9. Behandling i 4 gange 2 minutter med 4% DIEA i CH2C12.

10. Gentag trin 4 til 8.

11. Behandling med 2,5 ækvivalenter af det ønskede aminosyre- derivat i CH-Cl- og 1,25 ækvivalenter DCC i 120

minutter. L

12. Vask fire gange med CI^C^.

13. Gentag trin 5 til 7.

14. Vask tre gange med CH2C12·

Program nr. 2 1. Behandling i 4 gange 2 minutter med 4¾ DIEA i CH2C12.

2. Vask to gange med CH2C1?.

3. Vask med methanol: CH'2C12 (1:1).

4. Vask to gange med methanol.

5. Vask med methanol:CH2C12 (1:1).

6. Vask to gange med CH2C12· 7. Vask tre gange med DHF:CH2C12· 8. Behandling med 2,5 ækvivalenter af det ønskede aminosyre-derivat i DMF:CH7C19 (1:1) og 1,25 ækvivalenter DCC i CH2C12 i 120 minutter 9,. Vask fire gange med DMF:CH2C12 (1:1).

10. Gentag trin 4 til 6.

B. Hydrogenfluoridsaltet af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-

OL

phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid.__

Peptid-harpiksen fra trin A blev omsat med flydende vandfrit HF i vacuum i 60 minutter ved 0 °C, idet man benyttede anisol som syrebindende middel. De flygtige bestanddele blev fjernet fra reaktionsblandingen i vacuum, og peptid-harpiksen blev tritureret med ether og filtreret til fjernelse af overskydende HF og anisol. Peptidet blev ekstraheret fra harpiksen U8904 45 ved triturering med 1035 eddikesyre, filtreret, vasket tre gange med 50 ml 10% eddikesyre og lyophiliseret til opnåelse af 940 mg af den rå titelforbindelse.

C. Chromatografisk rensning til opnåelse af slutproduktet

Den rå blanding af diastereomere (470 mg) fra del B blev chro- matograferet over en kolonne (3,8 x 58,5 cm) af silicagel i 2 omvendt fase (01β) ved lavt tryk (7,17 kg/cm ) med 25% aceto-nitril i 0,1N ammoniumacetat. Der opsamledes fraktioner med et minuts mellemrum. Fraktionerne 98 - 150 blev samlet og lyophiliseret til opnåelse af 360 mg produkt.

Resten af den rå blanding fra del B blev chromatograferet som beskrevet i det foregående til opnåelse af 360 mg produkt.

De lyophiliserede produkter blev kombineret og chromatograferet over en Sephade>®;-10 kolonne (2,5 x 10,0 cm) i 0,2N eddikesyre til fjernelse af overskydende ammoniumacetat. Fraktionerne blev lyophiliseret til dannelse af 636,7 mg af titelforbindelsen.

Γα]ρ5 + 19,7° (c = 0,5; IN HC1).

[“]365 + 71,70 (c = °’5; 1N HC1)*

Analyse beregnet for C^^H^^NgOgS: ; C 56,35; H 6,71; N 12,72; 5 4,85.

fundet: C 56,60; H 6,43; N 12,97; 5 4,92.

Aminosyreanalyse:

Ala Tyr Gly Phe NH^ % Peptid (1) 0,99 1,01 1,00 1,01 1,10 93,1 (2) 1,00 1,01 1,00 0,97 1,02 90,5 148904 46

De omhandlede forbindelser med formel I er nyttige analgetics.

Den analgetiske virkning af de omhandlede forbindelser kan demonstreres på mus ved "varmpladeprøven". Ved denne prøve anbringes en mus inden i en opretstående acrylcylinder, der som bund har en varm overflade, der holdes på 52 °C. Ved prøven indgives musen ved subcutan injektion en forudbestemt mængde af den omhandlede forbindelse opløst eller suspenderet i et egnet bærestof. En forudbestemt periode efter indgivelsen af forbindelsen får lov at hengå, og musen anbringes herefter på den varme overflade. Det tidsrum i sekunder, der forløber, indtil to separate fænomener fremkommer, opskrives. For det første noteres det tidsrum, der hengår, før musen slikker bagpoten, og for det andet noteres det tidsrum, der hengår, før musen hopper op fra den varme overflade. Et middel, der har en analgetisk virkning, giver en forlængelse af disse tidsrum i forhold til kontrolmusene, der kun modtager bærestoffet som injektion. Dette fænomen forekommer i et område, der ikke giver nogen motorisk inkoor-dination eller inkapacitation. De følgende tabeller viser resultaterne opnået ved dette forsøg sammenlignet med kontrolmus indgivet naturlig enkephalin og naturlig enkephalin omdannet til dets amid. Tabel I viser tidsrummet, der hengår, før bagpoten bliver slikket. Tabel II viser det tidsrum, der hengår, før musen hopper, og tabel III viser den procentvise andel af dyr i hver testgruppe, hvor en analgetisk virkning kunne påvises. Kriteriet for en bekræftende analgetisk virkning er som følger:

Det tidsrum, der hengår, 'før bagpoten slikkes, eller før musen hopper, må være lig med eller større end middelkontroltidsrum-met plus 2 standardafvigelser fra middelværdien. Hvert resultat anført i de følgende tabeller I og II viser middelværdierne plus/minus standardafvigelsen. Tabel III viser den procentvise analgetiske virkning fundet ud fra mindst 9 mus og op til 40 mus.

47 U8904 Η Η σ\ ε- Ο CM CM ΙΛ ....

ο I +ι +· +ι ι ι 1 I I I I

CM Η Η Η * * «ν ο la <η

ΙΟ "Μ- CO

CM CM CM

Λ ft « ο CM CM CM ....

O +1 I +1 +1 ι ι ι I I I I

H CA VO vo A *»

CA CA CO

ΚΛ tA CM

54 Η Η Η H CM

φ CM C— CA lo ri N CO 00 r£-j ·*·»·>» ·*·»·*·*

d CM CTl (Ti 1A CM CM CM CM

§ ο +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

& to I I I cn 00 Ο O VO VO 'M" E

0 * ·%·*·*·*

CQ M- CO O' 00 O t> C- O

I CO LO VO «Μ- -φ to to to

?£1m cO HHH H

2 © w> oo m to <Tv CO

ψ-\ Mj ^ HVOHCM H CM

~ S 40 O +1 +1 +1 -H +L 1 +1 2 H 5 H S H I I I o cn VO 00 -+ + jjj *k ·« «« r< *»*»

□ 3] .. LO 00 O to CO LO

Η v- φ CQ tO-M-^-'M' COCO

m W +» Ή . , .

<* o ta Η H

2 £ p O CM CM VO OO

ri &C Q ·*·>« ·»

m (rt CO CM i—1 tH CM

co I I I I cm vo in 00 cn 5 S to oo cvj 0}

Cj_| ^ N"\ ΝΛ tO tO

O LO CM

£4 ~ « ·*

ta H CM CM

>cJ Η I I I I I +1 I -Η I +1, 1

•H CO to CM

^ O LO "M-

CO CO CO

vo lo H OO H 00 00 CO H CO 00

OCM'M-HOHOH o h O H

p +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 + 1 -Μ -H

piocnHcoHCAcn to H to σν

H ev *s ·« ** *v »·> *\*V*»*V

O <T\ CO CO CA CO CO CM to CO CO CM

CM CO CO CO CO CO tO CA CA CO CO

I I

8¾ 0) 4 C S ta 0 · C_j »p-J fw] C|_»| I -p r* ra Φ tap-HinoioioioLOO to la lo 0

(tf !> H 40 Cd S Η Η H CO Η H CO

•Η P ·Η ·Η S +4 5 EH <H 40+4 to ra

O ¢0 cO

2 Φ Λ Pi CQ P) Pc HP Φ 3 Ο Φ ·Η Φ ··+

Pt Sri Sri 4

<D X X

τ> C C , cd u 5 C P4 W H <j

•HI IS

P LOP LO CO

p pc pc 1 Λ S 9 Ο Λ 48

O

O I I I I I I I

CM

o

O I I I I I I I

H

H

0Ί H 'd- ·* ·*.

W K\ CVl o +i +i +i i i i i to to in cm r ts ft

LO O

to ^ to • a ι-i η o W) in to i 'Μ- 'Ρ ,Μ ·» ·> ·>

?H o CM in H

O tio H I +1 I I +1 I +1 «Η a CD CM ^ x- > It Λ Λ *· VO O ^

CQ tO LO tO

H *rl

CQ

t-q ο η h

pq fl in cm H

pfj ft H Λ

<2 CM K\ CM

Έή ΙΟ I +J l+l I t +1 <n

ft ft «I

H tO

tO ^ to 0)

LO

λ ·*

to CM

Η I +1 I I I +1 I

o o

It * H ^ to to

H CO CO σι σι M· CM

[—I ft ft ft i> n » »

Ο Η Ο H CM to CM CM

H +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

+3 H to (7\ CO C~- O CM

JJJ ft ft ft ft ft ft A

OCOtOCMCMtnOC-(b£| to to to to to to CM

I I I

a ^ 3 ΰ m o H'HHH I -P · CQ 0 CQ ίΗ fi ce t> H hO cO ·η in m o in in in in

•Hfjrl'HS-pg H tO Η Η Η H

eh 4h wj-p ra ra o ra ra

rH

CD

^ Q UJ U-

•H

?H

O

pq 148904 49 ιΗ CM H -+ 0"\ C- ·> ^ ft o O 00 C- Η . .....

O I +1 +1 +1 I I I I I I I I

CM CO CO 00 Μ «V f« CM co in cn cn o r-)

Η H

CD "+ CM ·* ·

- O O

O m HH .....

O+l I +1 +1 I I I I I I I «

H CM CO CO

K ft ft cm in tn

oo cn O

H

Η Η H CM

H Η Η Η ιΗ tn cn CM t n H ~ tn 00 ·.·.·.-+*.

•»cm»>»> c» -+ tn ·· -+ o cn cm c- ω η η h -+ h sj tn I I I +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 φ oo oo tn o tn cm vp oo c— «Η Λ ftft ft ft ft. Λ C* frt cvj ·*Μ" ^ ΚΛ CM O 1-ΓΝ O Γ*“ p ty) co cn h -=)- co co H c-- cn # ,W H cm H H ,h φ N, Η Μ ri

M cq tifl CM Η H CO

C S 00 * o H - r

m ft Q λ ft ΚΛ CM

ri ti ·» O CD CM C— C"- Η H

,Μ o ra Η I I I +1 +1 +1 +1 +11 +1 · I

H p p ·η tn tn vo -+ cm o Q ta ---- ·.«.

H S s o c- in O cn H c- ιθ h p c— co in o cm o

ra =tj Η Η H HH

« Μ EJ H , PH

^ i S “i In m Hcm In m H -+ - - ·> ·“ br i H t- co c- cn

H tn I I I I I +1 +1 +1 +1 I +1 i I

nj ·«+ tn co r- oo ri s - - - λ ^

<5 η o H t n t n CM

-+ tn oo H o

g HH HH

1 H

cq O *· Ό0 rd — O -

.H CO CM CO

» Hl I I I I +1 I +!, 1 V- 1 1

Vi Vi «I

co cn oo cn oo co *+ CO - [— ·+ C— -+ O -+ C— -+ O C"- p—J vi Q fi ft ft ft ft ft ft ft ft ft o cn HH-CMH-CMC-- CM -+ CM C- -+ U +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 ti ti ti ti ti

-pin CM C0 O 00 O H- O 00 O H- CO

jH*i ft ft ft ft ft ft ft ft ft ·* ft o cn -+ o tn o tn cm tn o tn cm o j-q c— cd c— c— c— c— cm C'-r-c-cnc— •p

I M

S H Φ I Cd ΰ c! (Ώ !^i -p p .H H o cq m o in m in in o in in in o m m φ<η id Η H Htn Η H tn rd · {> bo •Η Η H W) S eh a W) o ra

I I

o cd cd ω Λ .3

ra Pi P

Η Φ 0) Φ ,¾ rM ω α Cl ip p si >ti <4 p pq ·Η •hi i a p inp in cd

Pc -p a -PC

o Φ ·Η Φ·Η p S H S Η 148904 5α ο

Ο I I I I I I

CM

ο

Ο I I I I I I

Η γΗ C- <Μ ·» CT\ ΚΛ « Ο Η 00 ΙΑ +1 +1 I 1 I ι Η <Μ ffk 9k 00 ίΛ ια να Η Η Η ^"Ί Η 00 c • c3 νο » ·>

® ijO ·> CM CM

+3 ,Μ o on H CM

J4 ^ rl +1 I I +1 I +1

O W) "d" 00 (TV

'h a - ~ ~ —. VO LfN σ> os Η H ia

•Η H CM H

H OS

Η Ο Η Η H

η ·Φ tA

Hi

PI CM Η O

pq H CM CM

<j tA +1 I +1 I I +1

EH Η CM

•t «V ·» tA CM 00

O CO CM

Η Η H

<1)

iH

H IA

•w ·»

CM CM

Η H

h +i ι i i +r ι

Ch IA

•h «V

σ> o

tA

H

^ ο ο o la r-

tv ·. «V *L ·> *V

o cm r- σ> vo oo vo +« +1 +1 +1 +1 +1 -P O VO tA tA 00

C? 9t IV tv (V P> K

O tA CM IA c~- CM tA

W f- CTl Η ΙΑ Η 1A

•P

I U

S ό3 ω ι <fl

β β 0Q fc-P

P'HHOJI ΙΑ Ο ΙΑ ΙΑ IA tA

IQ (D'NOS HtAHHHH

ΰ · £» W) ΉΗΉ W) S &t a ω o os o φ to H o uJ u.

<D

β

•H

s o l=t 51 14 8 9 Ο Λ i-a w σι ιλ ....

(xj I CM H CM I I I III· o o

^ A I H CO Η I I I I I I I

3 Η ΙΟ CO

f-3 O 'Φ *Φ ... i |jq I CM CM I I I I I I i o * ° α o 1-1 fb O I cvt lO I I I llll

P 3 HH

m rci O _ c -1-3 CO O O t- ΟΛ OJ CO o

O cd pJIIIHCOHlQ CO CM CO

P t tø o WJ m ^ co

•H p ^0 S I I I 00 O ΙΟ C- CO to JO H

g aw CM CD 00 lO CO H CM H

Μ Jxj HP®

ti Id ·η Ι-a O O CM O 00 CM

HF^a> S 3 lit oo oo m coi-cmI

Η M tit oo

W ra H Pi H

S I I l "φ o o co co 1 oj 1

PH φ Cd W H LO -M- LO CM CM

ttC

Η P

flro 1-3 O LO o o to

ϋ)·Η 3 I I I I CO ΙΓ\ H LO I CM I

^ CO

c, u3 <u piiiiiocoo o i h i

1¾ 3 H- CM H tO

' ·

U H r-1 H O

(51 (sq I I 1 I I CM I HI I

H

i_q

PM I I I I I I Η I Η I

a lo HH

-P

I P

g Η ω I cd β β in p -p Λ ρ ·Η H o tn co o co lo lo lo o co to co g ra (Dtp tn Η Η H co Η H to

H · j> ttD

•Η Η Ή ttOS P S 600 IB

P I

β β •Η Η Η Η ο cd cd ω Λ Λ Ό1 Pi Pt Η φ α> <i

CD ,Μ & CO CJ

β ^ Il

•H l I

fit in in Η

P -P -PH

ο ω Φ a pi s s cd 148904 52

h> 1 I I I I

P

o o

CM P

PM I I I I I

K

hD I I I I I

(¾ o

H P

e · 1 1 1 1

^ ^ t-ο to 03 O I I

m ce P to * c--

-P MO

Pi to

O \ P cm Η I I

*N M PM CM ^ H

w a ω ·» H m

Η ·Η h> I co I Ο O

H CQ P ΙΟ Ο Γ-

O Ο H

p PH

m PH ο o

pq p I to t -3- H

<J iU

EM

>-o I Η I Ο O

pq to i>- vd to p ό Ο 'Φ PI I to -d- w 0)

h> I Η I I O

P H to

H

PH O

p 1 Η I I H

W

•P

I u 5 td ω I cd ss a ra fc-p «Η H o tn ijoioo in in

m ΦΉ HI HtOHH

rtf . [> tjo

•Η Η Ή MS

6 a M o m o ω m

H

(P O LJ U.

Si

•H

P

Si o

P

53 148904 a. Medmindre andet er anført, blev forsøgene udført under anvendelse af salinkontrol. Tallene "1" og "2" indikerer, at resultatet er signifikant på 99 pct. og på 95 pct. niveau henholdsvis.

b. Forsøg og kontrol blev udført i aoacia med forbindelsen til stede som suspension.

c. Betegnelserne refererer til følgende forbindelser: A. L-Tyrosy1-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methio-nylamid, hydrochlorid. (Eksempel 1).

OS

B. L-Tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid 1,25 hydrochlorid-monoacetat. (Eksempel 4).

C. L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methio-nylamid sesquihydrochlorid-monoacetat. (Eksempel 2).

OL CL

D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -methyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid, hydrochlorid-trihydrat. (Eksempel 3).

cx E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-leucyl-amidacetat. (eksempel 6).

OL

F. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-N -methyl-S-ethyl-cysteinylamid-acetat. (Eksempel 5).

d. HPL = bagpoteslikning.

EJ = hop fra bundplade.

e. Når forbindelsen afprøvedes i en koncentration på 0,3 mg/kg, var tidsrummet, før bagpoten blev slikket 33,9 - 2,3 sekunder, og tidsrummet, før musen hoppede, var 129,0 - 11,5 sekunder, og den analgetiske respons var 10 pct. for HPL og 60 pct. for EJ.

Claims (5)

148904 Patentkrav :

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af analgetisk virksomme enkephalin-analoge pentapeptidamider med den almene formel (L) (D) (L) (L) (L) O O O R6 O CH_. O Π fl II I II J 3 || H2N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH, (I) I I I I I A ' # ch2 r4 Rs ch2 ch2 O 6 4 OH eller farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske syreadditionssalte deraf, hvori L og D definerer chiraliteten, og hvor er primær eller sekundær C^-C^-alkyl, R,- og R^ er hver for sig hydrogen eller methyl, og W er isopropyl, -CI^SCH^ eller -S-CI^CH^, kendetegnet ved, at man spalter den eller de beskyttende grupper fra det tilsvarende beskyttede pentapeptid med formlen 9. o RG O CH „ Il II II I II I 3 RjoNH-CH-C—NH-CH—C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-Z1 (IIV ' i I i i ' · ch2 r4 r5 CH2 ch2 0 0‘ OH . hvori R^, R,., R^ og W har de ovenfor angivne betydninger, R^^ er hydrogen eller en amino-blokerende gruppe valgt blandt tert-butyl oxycarbonyl, benzyloxycarbony1, tert-amyloxycarbo-nyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl og iso-borny1oxycarbonyl, 148904 0 0 tt Μ og Z' er -C-NH2 eller -C-NH-harpiksbærer, idet R1Q er en aminoblokerende gruppe, når Z' er C0NH2, ved hjælp af et deblok-erende middel valgt blandt trifluoreddieksyre, iseddikesyre med HCl-gas, 98% myresyre eller HF.

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionyl-amid hydrochlorid, kendetegnet ved, at man omsæt-ter N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-N -methyl-L-methionylamid med iseddike og tør hydrogen-chloridgas.

3. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methionyl-amid sesquihydrochlorid monoacetat, kendetegnet OL ved, at man omsætter N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N -méthyl-L-methionylamid med iseddike og tør hydrogenchloridgas efterfulgt af lyofilisering fra vandig eddikesyre.

4. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af L- OL OL tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -methy1-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid hydrochlorid trihydrat, kendetegnet OL ved, at man omsætter N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl- oi a glycyl-N -methyl-L-phenylalanyl-N -methyl-L-methionylamid med iseddike og tør hydrogenchloridgas.

5. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-Nu-nethyl-L-methionyl-amid 1,25 hydrochlorid monoacetat, kendetegnet ved, at man omsætter N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-N^-methyl-L-methionylamid med iseddike og tør hydrogenchloridgas.